Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC MS MS

75 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của các chất phân tích Phụ lục 2: Sắc ký đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính Phụ lục 3: Sắc ký đồ và kế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

THÁI KHOA BẢO CHÂU

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM

TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM

ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

THÁI KHOA BẢO CHÂU

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM

TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM

ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài Luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, sự động viên ủng hộ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập nghiên cứu là nguồn động lực lớn lao và quý giá nhất đối với tôi

Đầu tiên, xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến

PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh và NCS Ths Đào Thị Cẩm Minh, là người trực tiếp

hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành Luận văn Đặc biệt, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân

thành đến PGS TS Phạm Thị Thanh Hà đã động viên, nhiệt tình hướng dẫn và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô Trường Đại học Dược Hà Nội và đặc biệt là quý Thầy Cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các anh chị cán bộ Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội và Trung tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình sự – Bộ Công an đã không ngừng hỗ trợ về thiết bị và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện Luận văn Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, các bạn và các anh chị đồng nghiệp tại Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế đã động viên, hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong suốt quá trình thực hiện đề tài, song có thể còn có những mặt hạn chế, thiếu sót Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp và sự chỉ dẫn của các thầy cô giáo và các anh chị đồng nghiệp

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2018

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình trộn trái phép các thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông dược 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Tại Việt Nam 5

1.2 Tổng quan về các thuốc nghiên cứu 6

1.2.1 Nhóm thuốc glucocorticoid 6

1.2.2 Nhóm thuốc giảm đau, chống viêm không steroid 8

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ 11

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 12

1.3.2 Khối phổ 13

1.4 Một số nghiên cứu phát hiện nhóm thuốc giảm đau chống viêm 16

1.4.1 Trên thế giới 16

1.4.2 Tại Việt Nam 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 24

2.1.1 Hóa chất – chất chuẩn 24

2.1.2 Máy móc – trang thiết bị 25

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Thu thập mẫu 27

2.2.2 Xử lý mẫu 28

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS 28

2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng 28

2.2.5 Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được 29

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 30

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch 30

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ 30

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 43

3.2 Thẩm định quy trình phân tích 52

3.2.1 Độ phù hợp của hệ thống 52

3.2.2 Độ đặc hiệu 53

3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 55

3.2.4 Độ đúng và độ chính xác 57

3.2.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 61

3.3 Ứng dụng quy trình phân tích trên mẫu thực 65

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 70

4.1 Về xử lý mẫu 70

4.2 Về phương pháp phân tích 71

4.3 Về thẩm định phương pháp 72

4.4 Về ứng dụng phương pháp 73

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của các chất phân tích

Phụ lục 2: Sắc ký đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

Phụ lục 3: Sắc ký đồ và kết quả định danh mẫu dương tính

Phụ lục 4: Danh mục mẫu chế phẩm đông dược được phân tích

Phụ lục 5: Hình ảnh các mẫu dương tính

Phụ lục 6: Công thức các bài thuốc chọn làm nền mẫu

Phụ lục 7: Hình ảnh các nền mẫu

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt

ESI Electrospray Ionizaton Ion hóa phun điện tử

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High Performance Thin Layer

Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

ICH International Conference on

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

MRM Multiple Reaction Monitoring

NSAID Non-Steroidal Anti-Inflammatory

SIM Selected Ion Monitoring

SRM Selected Reaction Monitoring

TFA Trifluoroacetic Acid

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình trộn lẫn thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược ở Việt Nam 5

Bảng 1.2 Cấu trúc, tính chất vật lý của các thuốc glucocorticoid nghiên cứu 7

Bảng 1.3 Cấu trúc, tính chất vật lý của các thuốc giảm đau, chống viêm không steroid nghiên cứu 10

Bảng 1.4 Các phương pháp phân tích một số thuốc giảm đau chống viêm trong mẫu chế phẩm đông dược 17

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 24

Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ 31

Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ của các chất nghiên cứu 31

Bảng 3.3 Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient 38

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát dung môi loại béo và chất màu 44

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát dung môi chiết 46

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát thời gian siêu âm 48

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát giai đoạn làm sạch dịch chiết 50

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS 52

Bảng 3.9 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất nghiên cứu 56

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên nền N1 58

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên nền N2 59

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên nền N3 60

Bảng 3.13 Kết quả LOD và LOQ trên nền mẫu N1, N2 và N3 65

Bảng 3.14 Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực 68

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá các mẫu thực dương tính 69

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 12

Hình 1.2 Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

Hình 1.3 Sơ đồ tạo ion bằng nguồn ESI 14

Hình 1.4 Tứ cực chập ba gập cong trong hệ máy LC-MS/MS Bruker 15

Hình 2.1 Máy sắc ký Bruker EVOQ Qube 25

Hình 3.1 Phổ khối của paracetamol 32

Hình 3.2 Phổ khối của piroxicam 32

Hình 3.3 Phổ khối của ketoprofen 33

Hình 3.4 Phổ khối của indomethacin 33

Hình 3.5 Phổ khối của dexamethason acetat 34

Hình 3.6 Phổ khối của betamethason 34

Hình 3.7 Phổ khối của hydrocortison acetat 35

Hình 3.8 Phổ khối của prednisolon 35

Hình 3.9 Phổ khối của prednison 36

Hình 3.10 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký 37

Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ pha động 39

Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 41

Hình 3.13 Sắc ký đồ các chất phân tích ở điều kiện LC-MS/MS lựa chọn 42

Hình 3.14 Kết quả khảo sát dung môi loại béo và chất màu trên nền N1 45

Hình 3.15 Kết quả khảo sát dung môi chiết trên nền N1 47

Hình 3.16 Kết quả khảo sát thời gian siêu âm trên nền N1 49

Hình 3.17 Kết quả khảo sát giai đoạn làm sạch dịch chiết trên nền N1 51

Hình 3.18 Quy trình xử lý mẫu 51

Hình 3.19 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N1 54

Hình 3.20 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N2 54

Hình 3.21 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N3 55

Hình 3.22 Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOQ trên nền mẫu N1 62

Hình 3.23 Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOQ trên nền mẫu N2 63

Hình 3.24 Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOQ trên nền mẫu N3 64

Hình 3.25 Kết quả định danh paracetamol trong mẫu VNN156 66

Hình 3.26 Sắc ký đồ mẫu dương tính VNN156 67

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng (TPCN) có nguồn gốc từ đông dược thay thế cho các chế phẩm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược đang là một xu thế phổ biến Theo Tổ chức Y tế Thế giới có đến 80% người dân ở các nước đang phát triển

sử dụng thường xuyên các thuốc cổ truyền trong chăm sóc sức khỏe Ở Châu Âu, doanh thu đem lại từ các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược lên đến hơn 3,7 tỷ Euro hằng năm [38]

Chế phẩm đông dược có nguồn gốc từ thực vật, động vật và khoáng vật Vốn được coi là có nguồn gốc tự nhiên, kinh tế và an toàn, loại chế phẩm này thường được nhiều người ưa chuộng Tuy nhiên chế phẩm đông dược thường được chỉ định điều trị kéo dài với số lượng lớn Nhằm hấp dẫn khách hàng, một số nhà sản xuất và

cơ sở khám chữa bệnh tư nhân đã trộn không công bố vào chế phẩm đông dược một

số loại thuốc tân dược để cải thiện tác dụng và rút ngắn thời gian điều trị [35], [37] Điển hình các nhóm thuốc tân dược hay được trộn là nhóm thuốc giảm glucose máu, thuốc chống viêm nhóm glucocorticoid, thuốc giảm đau, chống viêm không steroid, thuốc hạ huyết áp, thuốc giảm béo, thuốc ức chếphosphodiesterase-5 [62], [64] Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là nhóm thuốc giảm đau chống viêm [60], [65] Các trường hợp phát hiện tập trung phần lớn ở Trung Quốc [34], [46], Singapore [50], Pakistan [25], Ấn Độ [51] và Nam Phi [67]

Dùng chế phẩm đông dược có trộn lẫn tân dược nhóm giảm đau chống viêm với liều lớn và kéo dài như với chế phẩm đông dược thông thường đã gây ra nhiều biến chứng và tác dụng phụ nguy hiểm như buồn nôn, nôn, xuất huyết dạ dày, phản ứng

da nghiêm trọng, rối loạn huyết học, suy thượng thận… [39], [42] Nhiều trường hợp sử dụng chế phẩm đông dược điều trị bệnh xương khớp nhưng bệnh càng trở nên trầm trọng hơn do tác dụng phụ khi dùng kéo dài các thuốc giảm đau chống viêm trộn lẫn trong đó [40]

Để đảm bảo an toàn cho người sử dụng, bên cạnh việc tăng cường các biện pháp xử lý của các cơ quan quản lý Nhà nước thì việc nghiên cứu phát hiện các thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép vào chế phẩm đông dược của các cơ quan

kiểm nghiệm là việc làm rất cần thiết Hiện nay ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phát hiện các thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép vào chế phẩm đông dược bằng các phương pháp như sắc ký lớp mỏng (TLC) [14], [15], sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [18], và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [9], [12], [21] Tuy nhiên với nền mẫu chế phẩm đông dược có tính chất phức tạp, các phương pháp trên có thể cho kết luận âm tính giả hoặc dương tính giả

Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS) là một phương pháp phân tích hiện đại ở Việt Nam, đang từng bước được ứng dụng rộng rãi trong phân tích và kiểm nghiệm thuốc Tập hợp khả năng phân tách chất của sắc ký lỏng (LC) và khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ (MS), phương pháp cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp trong phân tích trên nền mẫu phức tạp như chế phẩm đông dược Đây được xem là phương pháp quy chiếu, thường dùng so sánh, đối chiếu với các phương pháp khác trong việc phát hiện thuốc tân dược trộn lẫn trong chế phẩm đông dược [38], [54]

Từ các thực tế trên, nhằm phát triển một phương pháp phân tích có thể xác định đồng thời nhiều tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược ở nồng độ thấp với độ tin cậy cao, góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện và xác định các tân

dược trộn lẫn trong đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS”

Với mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời paracetamol, piroxicam, indomethacin, ketoprofen, betamethason, dexamethason acetat, hydrocortison acetat, prednisolon và prednison trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp LC-MS/MS

2 Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để xác định paracetamol, piroxicam, indomethacin, ketoprofen, betamethason, dexamethason acetat, hydrocortison acetat, prednisolon và prednison (nếu có) trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược lưu hành trên thị trường

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình trộn trái phép các thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông dược

1.1.1 Trên thế giới

Hiện nay, tình trạng chế phẩm đông dược bị trộn trái phép tân dược đang diễn

ra phổ biến, đây đang là vấn đề của nhiều nước trên thế giới Điển hình các nhóm thuốc tân dược hay được trộn vào là nhóm thuốc giảm glucose máu, thuốc glucocorticoid, thuốc giảm đau, chống viêm không steroid, thuốc hạ huyết áp, thuốc giảm béo, thuốc ức chế phosphodiesterase-5 [62], [64] Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là nhóm thuốc giảm đau chống viêm như thuốc glucocorticoid và thuốc giảm đau, chống viêm không steroid [28], [60], [65]

Ở Châu Âu, nước Anh đã phát hiện nhiều trường hợp người bệnh nhập viện điều trị do tác dụng phụ khi dùng kem dược liệu có trộn lẫn hydrocortison, clobetason butyrat, betamethason valerat, clobetason propionat [61] Ở Châu Á, tại

Ả Rập, Maciej J Bogusz và cộng sự đã tiến hành khảo sát 80 loại thuốc tân dược thuộc nhiều nhóm dược lý khác nhau, thường được trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp LC-MS/MS, kết quả phát hiện bột dược liệu Jamu Ragel từ Indonesia với chỉ định giảm đau thấp khớp chứa tân dược giảm đau chống viêm phenylbutazon và dipyron [29] Tại Ấn Độ, Akash A Savaliya và cộng sự đã tiến hành định tính 25 dược chất gồm cả giảm đau, chống viêm steroid và không steroid bằngsắc ký lỏng ghép nối khối phổ thời gian bay (LC-MS/TOF) và phát hiện mẫu đông dược chứa các thuốc giảm đau chống viêm như diclofenac, dexamethason, piroxicam [65] Tại Hàn Quốc, nghiên cứu của So-Hyun Cho và cộng sự đã khảo sát 294 chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp trên thị trường từ năm 2010 đến năm 2013, kết quả cho thấy có 30% mẫu khảo sát phát hiện có trộn các dược chất giảm đau chống viêm như dexamethason, betamethason, cortison, prednisolon, prednison [33]

Theo báo cáo tại Hội nghị Hòa hợp chế phẩm đông dược khu vực Châu Á Thái Bình Dương, vấn đề thuốc tân dược giảm đau chống viêm trộn lẫn trong chế phẩm

đông dược đang xảy ra ở nhiều quốc gia trong khu vực, nhiều mẫu chế phẩm đông dược điều trị ho, hen, thấp khớp đã phát hiện có trộn prednisolon hoặc dexamethason [56] Tại Trung Quốc, Qionglin Liang và cộng sự đã phân tích thuốc tân dược trộn trái phép trong TPCN và các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu bằng phương pháp LC-MS/MS Kết quả đã phát hiện 9 mẫu chế phẩm đông dược có ibuprofen, diazepam [54] Tại Singapore, năm 2003 Aik-Jiang Lau và cộng sự đã phát hiện phenylbutazon, oxyphenylbutazon trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS [53] Từ năm 2007 đến nay, Ủy ban Khoa học Sức khỏe Singapore liên tục công bố các chế phẩm đông dược lưu hành trên thị trường có chứa thành phần tân dược giảm đau chống viêm không được công bố trên nhãn Nguồn gốc của các thuốc này phần lớn là thuốc bán trên mạng [43], thuốc gia truyền, hàng xách tay từ Trung Quốc [39], [40], [41], một số ít có nguồn gốc từ Malaysia [44] Thuốc được quảng cáo có tác dụng giảm đau chống viêm, hiệu quả trong điều trị viêm khớp và có thành phần hoàn toàn tự nhiên, nhưng thực tế phát hiện trong thuốc có trộn một số tân dược như paracetamol [39], [44], piroxicam [41], [44], indomethacin [39], [40], [42], diclofenac [43], dexamethason [41], [42], [43], prednison [42], prednisolon [40]

Các nước như Thái Lan, Indonesia cũng tích cực trong việc xây dựng phương pháp và phát hiện các thuốc tân dược giảm đau chống viêm trộn vào chế phẩm đông dược Tại Thái Lan, Chutima Limmatvapirat và cộng sự đã dùng TLC phát hiện các thuốc nhóm glucocorticoid trộn trong chế phẩm đông dược, tỷ lệ chế phẩm phát hiện có chứa dexamethason hay prednisolon từ năm 2007 đến năm 2011 lần lượt là 28,57%; 10,39%; 3,33%; 4,41% và 6,95% [55] Tại Indonesia, Hilda A Wisnuwardhani và cộng sự đã sử dụng TLC và phát hiện có paracetamol, piroxicam trộn trong chế phẩm đông dược Jamu Pegal Linu [72]

Có thể thấy các thuốc nhóm giảm đau chống viêm có nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng và trên thế giới vẫn ghi nhận nhiều trường hợp trộn thuốc nhóm này trong chế phẩm đông dược Việc người bệnh dùng các chế phẩm đông dược trộn lẫn tân dược giảm đau chống viêm kéo dài có thể tích lũy và gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm Để bảo vệ quyền lợi và sức khỏe cho người sử dụng, đề tài được tiến

hành nhằm đưa ra giải pháp phát hiện và xác định nhanh chóng, hiệu quả nhóm thuốc này trong chế phẩm đông dược

1.1.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, chế phẩm đông dược (TPCN, thuốc đông y) có mặt trên thị trường trong nước hiện nay rất đa dạng và nhiều thành phần Tuy nhiên các chế phẩm này thường không được kiểm soát chặt chẽ, bán tràn lan trên mạng và trong siêu thị… nên có nguy cơ cao bị làm giả Nhiều chế phẩm đông dược nhập khẩu bán trôi nổi trên thị trường đã phát hiện có trộn trái phép tân dược giảm đau chống viêm như Nam Liên Truy Phong Thấu Cốt Hoàn của Trung Quốc có dexamethason acetat [56], Qing Xin Dao Chi Pian của Singapore có paracetamol [73]

Với tính chất phổ biến, dễ trộn, cùng với các tác dụng phụ nguy hiểm tiềm ẩn khi dùng kéo dài, các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm đã được quan tâm phát hiện trong chế phẩm đông dược từ lâu Một số báo cáo cho thấy thuốc và TPCN có nguồn gốc đông dược được làm giả mạo bằng cách trộn thêm các tân dược giảm

đau chống viêm được trình bày tóm tắt trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Tình hình trộn lẫn thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược ở Việt Nam

Dexamethason Cyproheptadin [13]

2007 Thuốc Dân tộc cứu

nhân vật Sản xuất tại Campuchia

Dexamethason Diazepam Paracetamol Cyproheptadin

[13]

Năm Chế phẩm Nguồn gốc Thuốc trộn lẫn Tài

liệu

2009

Thuốc Giải Biểu

Paracetamol [24] Thuốc Chỉ Thống Lương y ở Bắc Ninh

2010

Thuốc Khu Phong,

Truy Phong Tê

trị Gút

Paracetamol Indomethacin Dexamethason acetat

Như vậy có thể thấy tình hình chế phẩm đông dược trộn trái phép thuốc tân dược nhóm giảm đau chống viêm đang xảy ra rất phổ biến và được phát hiện ở các vùng miền, từ các thành phố lớn như Hà Nội, Hồ Chí Minh, Đà Nẵng đến các vùng

xa như Bắc Giang, Yên Bái, Bình Định Các đối tượng bị trộn tân dược cũng rất đa dạng và phong phú, chủ yếu là các thuốc không có số đăng ký bán trôi nổi trên thị trường, gây ra nhiều tác hại cho người tiêu dùng, gây bức xúc trong dư luận

1.2 Tổng quan về các thuốc nghiên cứu

1.2.1 Nhóm thuốc glucocorticoid

1.2.1.1 Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các glucocorticoid

Hormon vỏ thượng thận gồm 3 loại: mineral corticoid (có tác dụng trao đổi chủ yếu lên chất khoáng), glucocorticoid (có tác dụng chủ yếu lên trao đổi hydrat carbon) và các steroid sinh dục Glucocorticoid tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận sản xuất ra gồm 2 chất hydrocortison và cortison Glucocorticoid tổng hợp gồm rất nhiều chất khác nhau được nghiên cứu biến đổi công thức để cải thiện tác dụng, kéo dài thời gian tác dụng và giảm tác dụng phụ [6]

Tác dụng của glucocorticoid: Ở nồng độ sinh lý các chất này cần cho cân bằng nội môi, tăng sức chống đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác của

cơ thể như tác dụng trên chuyển hóa, trên các cơ quan và tuyến… Trong đó tác dụng chống viêm, chống dị ứng hay được áp dụng trong điều trị một số bệnh mãn tính như thấp khớp, hen phế quản, viêm xoang… [6], [7], [8]

Tác dụng không mong muốn của glucocorticoid: Phù, loét dạ dày tá tràng, suy thượng thận, tác dụng trên sự tăng trưởng của trẻ em… Những tác dụng này thường gặp ở những người dùng thuốc lâu dài hoặc dùng quá liều Tác dụng không mong muốn hay gặp là suy tuyến thượng thận do khi dùng thuốc glucocorticoid từ ngoài vào cơ thể sẽ làm ức chế tuyến thượng thận bài tiết, dẫn đến tình trạng suy giảm khả năng bài tiết glucocorticoid của chính cơ thể người đó Lúc đó cơ thể hay mệt mỏi, nôn ói, nặng hơn nữa có thể gây huyết áp thấp hay tụt huyết áp Một số tác dụng không mong muốn khác như tăng cân do giữ muối nước, cơ thể bệnh nhân mập ra, bụng to, chân tay teo lại, da mỏng dễ bầm máu, nứt da bụng, loét dạ dày tá tràng, loãng xương, gây hại cho thai nhi, làm trẻ em chậm phát triển chiều cao [6]

Chỉ định của corticoid: Điều trị thay thế khi vỏ thượng thận không tiết đủ hormon, bệnh tự miễn, dị ứng, sốc phản vệ, hen phế quản, viêm cơ khớp, viêm da… [6]

1.2.1.2 Cấu trúc, tính chất vật lý của các thuốc glucocorticoid nghiên cứu

Bảng 1.2 Cấu trúc, tính chất vật lý của các thuốc glucocorticoid nghiên cứu [3],

[30], [69]

Tên chất Công thức hóa học,

cấu trúc hóa học Tính tan, liều dùng Hydrocortison

acetat

(HYRO)

C23H32O6 (M= 404,503) Tính tan: Không tan trong

nước, khó tan trong ethanol và methylen clorid

Liều dùng: 5 – 50 mg/ngày

Tên chất Công thức hóa học,

cấu trúc hóa học Tính tan, liều dùng Prednisolon

(PREL)

C21H28O5 (M= 360,45) Tính tan: Không tan trong

nước, hơi tan trong ethanol và methylen clorid

Liều dùng: 5 – 60 mg/ngày

Prednison

(PREN)

C21H26O5 (M= 358,43) Tính tan: Không tan trong

nước, khó tan trong ethanol 96% và methylen clorid

Liều dùng: 5 – 30 mg/ngày

Betamethason

(BETA)

C22H29FO5 (M= 392,5) Tính tan: Không tan trong

nước, ít tan trong ethanol 96%, rất ít tan trong methylen clorid

Tính tan: Không tan trong

nước, tan tự do trong aceton, cồn, hơi tan trong methylen clorid

Liều dùng: 4 – 16 mg/ngày

1.2.2 Nhóm thuốc giảm đau, chống viêm không steroid

1.2.2.1 Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc giảm đau, chống viêm không steroid

Các thuốc chống viêm không steroid (NSAID) đều có tác dụng chống viêm tốt nên được dùng trong các bệnh viêm khớp mạn (viêm khớp dạng thấp) nhưng thuốc không làm thay đổi được quá trình diễn biến của bệnh Paracetamol có tác dụng

giảm đau và ít có tác dụng chống viêm nên không dùng để điều trị lâu dài các bệnh

có viêm gây đau Tuy vậy, paracetamol có thể dùng để điều trị đau do thoái hóa khớp, một bệnh ít viêm [6]

Paracetamol là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin Ở liều điều trị, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi cân bằng acid – base, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày như khi dùng salicylate Paracetamol không tác dụng trên cyclooxygenase (COX) toàn thân, chỉ tác động đến COX của hệ thần kinh trung ương Tuy nhiên khi dùng quá liều paracetamol có thể gặpphản ứng dị ứng nhưban đỏ hoặc mày đay, trầm trọng hơn

là phản ứng độc với gan do chính chất chuyển hóa của paracetamol là N - acetyl - benzoquinonimin gây ra [6]

Các NSAID ức chế COX nên ức chế tổng hợp prostaglandin và thromboxan Có hai dạng COX, COX-1 cần thiết để tổng hợp prostaglandin bảo vệ niêm mạc dạ dày

và thromboxan cần thiết cho tiểu cầu kết dính, COX-2 tham gia tạo ra prostaglandin khi có viêm Các thuốc chống viêm không chọn lọc ức chế cả hai loại COX-1 và COX-2, bao gồm ibuprofen, indomethacin, naproxen, piroxicam, diclofenac, ketoprofen Sự khác nhau giữa các NSAID chủ yếu là các biểu hiện của tác dụng không mong muốn Các thuốc có tính chọn lọc ít gây các tác dụng phụ, trong khi có tác dụng chống viêm, giảm đau giống như các thuốc không chọn lọc Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 có thể gây các tác dụng phụ ở thận giống như các thuốc không chọn lọc Ngoài ra các thuốc ức chế chọn lọc không có tác dụng ức chế tiểu cầu kết dính, còn các thuốc ức chế không chọn lọc có tác dụng ức chế kết dính tiểu cầu nhưng có thể hồi phục được, trái với acid acetylsalicylic Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 không cải thiện tiến triển dài hạn của bệnh viêm khớp dạng thấp về phương diện biến đổi cấu trúc của bệnh khi so sánh với các thuốc NSAID thông thường [6]

Tác dụng không mong muốn

Các tác dụng phụ do ức chế tổng hợp prostaglandin

Rối loạn dạ dày – ruột: Thuốc NSAID với mức độ khác nhau ức chế COX làm giảm tổng hợp prostaglandin, tạo điều kiện cho acid clohydric và pepsin của dịch vị

còn tác động trực tiếp hủy hoại các tế bào biểu mô tiêu hóa, gây thủng ổ loét do phần lớn chúng đều là những acid

Trên hệ tiết niệu: Làm giảm lưu lượng máu nuôi thận, giảm mức lọc cầu thận, giải phóng các renin, ảnh hưởng tới việc di chuyển ion và trao đổi nước, gây nên các rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm thận mô kẽ, hoại tử nhú thận, suy thận cấp và tăng kali máu

Trên hệ huyết học: Hội chứng xuất huyết, làm kéo dài thời gian chảy máu, có thể gây ra hiện tượng xuất huyết dưới da do ức chế ngưng kết tiểu cầu

Với thai phụ: Dễ gây quái thai ở 3 tháng đầu, làm tăng thời gian mang thai ở 3 tháng cuối, và có thể ảnh hưởng đến tuần hoàn và hô hấp của thai nhi [6]

Các tác dụng phụ không do ức chế tổng hợp prostaglandin

Trên hệ thần kinh có thể gây ù tai, điếc thoáng qua, say thuốc Ngoài ra thuốc

có thể gây dị ứng, gây cơn hen giả vì thuốc ức chế COX nên làm tăng các chất chuyển hóa theo đường lipooxygenase (tăng leucotrien) Thuốc còn có thể gây rối loạn chức năng gan, rối loạn về máu theo kiểu nhiễm độc tế bào (mất bạch cầu hạt), thậm chí có thể gây suy tủy Trên hệ tim mạch: Các thuốc ức chế COX-2 và liều cao các thuốc NSAID truyền thống có nguy cơ gây nhồi máu cơ tim [6]

1.2.2.2 Cấu trúc, tính chất lý hóa của các thuốc giảm đau, chống viêm không steroid Bảng 1.3 Cấu trúc, tính chất vật lý của các thuốc giảm đau, chống viêm không

steroid nghiên cứu [4], [30], [69]

Tên chất Công thức hóa học,

cấu trúc hóa học Tính tan, liều dùng Paracetamol

(PARA)

C8H9NO2 (M= 151,2) Tính tan: Hơi tan trong nước, tan

nhiều hơn trong nước sôi; rất khó tan trong cloroform, ether; dễ tan trong dung dịch kiềm, ethanol 96%, methylen clorid

Liều dùng: 325 – 650 mg, cứ 4 – 6

giờ một lần, không quá 4 g một ngày

Tên chất Công thức hóa học,

cấu trúc hóa học Tính tan, liều dùng Indomethacin

(INDO)

C19H16ClNO4 (M= 357,8) Tính tan: Không tan trong nước, tan

trong ethanol, aceton; vững bền trong môi trường trung tính hay acid yếu, phân hủy trong dung dịch kiềm mạnh

Liều dùng: 25 mg/lần, uống 2 – 3

lần/ngày, tối đa 150 – 200 mg/ngày

Ketoprofen

(KETO)

C16H14O3 (M=254,3) Tính tan: Không tan trong nước, dễ

tan trong aceton, ethanol, và methylen clorid

C15H13N3O4S (M=331,4) Tính tan: Không tan trong nước,

methylen clorid ; hơi tan trong ethanol

Liều dùng: 20 – 40 mg/ngày

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (MS)

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS [68]

Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao Giới hạn phát hiện (LOD) có thể đến 10-14 gam Do vậy, phân tích khối phổ càng được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ như xác định các đồng vị, xác định công thức cấu tạo, định tính, định lượng các chất có trong dịch sinh học và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên Đặc biệt dùng để phân tích hàm lượng vết trong mẫu có thành phần phức tạp [2], [16]

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, loại

cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1]

1.3.1.2 Nguyên tắc

Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục (pha động) Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng [2]

1.3.1.3 Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật

để tách định lượng bằng HPLC Tuy vậy nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký

lỏng đều giống nhau, gồm các bộ phận như sau (Hình 1.2) [17]:

Hình 1.2 Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [75]

1.3.2.2 Thiết bị khối phổ

Một thiết bị khối phổ gồm các bộ phận sau:

- Bộ nạp mẫu: Chuyển mẫu cần phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối

phổ Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký

- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân

tử mang điện tích hoặc bắn phá, phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion,

các gốc mang điện tích bằng các phân tử mang năng lượng cao

Có ba kiểu hình thành ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI) Trong đó, kiểu ion hóa ESI được sử dụng phổ biến nhất, thực hiện ở áp suất khí quyển Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000 V Đồng thời, các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100000 Da [5], [26]

Hình 1.3 Sơ đồ tạo ion bằng nguồn ESI [76]

- Bộ phận phân tích khối: Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ được gia tốc và

tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi đến bộ phận phát hiện

Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap), ống đo thời gian bay (time-of-flight tube) [16], [17]

Trong đó, bộ phân tích khối tứ cực có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực

Hình 1.4 Tứ cực chập ba gập cong trong hệ máy LC-MS/MS Bruker [31]

Hiện nay, có loại thiết bị dùng bộ phân tích khối gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm

vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần

- Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện

đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

- Bộ phận ghi và xử lý số liệu:

Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, phân tích tính toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm: + Quét toàn phổ (SCAN)

Khi thao tác với chế độ SCAN, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu

dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion

mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng

để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

+ Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn,

do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

+ Selected Reaction Monitoring (SRM) và Multiple Reaction Monitoring (MRM) Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp MS/MS, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

SRM: Cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

MRM: Trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, vì thế kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên,

cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện [31]

1.4 Một số nghiên cứu phát hiện nhóm thuốc giảm đau chống viêm

1.4.1 Trên thế giới

Nghiên cứu phát hiện và xác định các thuốc tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông được đã và đang thu hút được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới Nhiều phương pháp phân tích khác nhau đã được ứng dụng để phát hiện tân dược trộn lẫn trong đông dược, từ các phương pháp thông dụng như TLC [58]; HPTLC [57]; HPLC-UV [49], [63]; LC-MS/MS [33], [45], [48], cho đến các phương pháp ít thông dụng hơn như điện di mao quản [59] hay quang phổ cận hồng ngoại [74] Các phương pháp phổ biến xác định các thuốc giảm đau chống viêm trộn trong chế

phẩm đông dược đã tham khảo được tổng hợp trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Các phương pháp phân tích một số thuốc giảm đau chống viêm trong

mẫu chế phẩm đông dược

Dạng

bào chế

Hoạt chất (LOD)

Pha động: Acid phosphoric 0,1% và acetonitril (ACN) (80:20)

Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút Nhiệt độ cột: 40°C

Detector DAD: 242 nm Viên

Tác động: Siêu âm

LC-MS/MS [33]

Cột: Waters ACQUITY UPLC C18 (100 × 2,1 mm; 1,7 µm) Pha động: 0,1% acid formic / nước cất và ACN (gradient) Nhiệt độ cột: 35oC

Thể tích tiêm: 2 µl Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút

Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút Thể tích tiêm: 5 µl

Dạng

bào chế

Hoạt chất (LOD)

Pha động: Amoni format 0,01 mol/l và MeOH (30:70) (gradient)

Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút Detector: ESI-MS

Tác động: Siêu âm

LC-MS [48]

Cột: HSS T3 C18 (100 × 2,1 mm; 1,8 μm)

Pha động: 10 mM amoni acetat / nước cất và ACN (gradient) Thể tích tiêm: 2 µl

Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút Detector: ESI-MS

Nhiệt độ cột: 40°C Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Pha động: Acid formic 1% và ACN (gradient)

Tốc độ dòng: 1 ml/phút Pha động: MeOH và amoni acetat 0,01M (gradient) Detector: MS/TOF

Dạng

bào chế

Hoạt chất (LOD)

âm, ly tâm

LC-MS/MS [54]

Cột: Megachem C18 (50 × 2,1 mm; 5 µm)

Thể tích tiêm: 20 µl Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút Pha động: MeOH : H2O : TFA (78:22:0,1) (gradient)

Detector: ESI-MS Viên

Thể tích tiêm: 25 µl Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút Pha động: ACN và đệm amoni format 10 mM (pH 3,0)

(gradient) Detector: ESI-MS

và acid formic 1%/ACN (gradient)

Tốc độ dòng: 1 ml/phút Nhiệt độ cột: 30oC

Dạng

bào chế

Hoạt chất (LOD)

1.4.2 Tại Việt Nam

Trước thực tế đặt ra, nhiều nhóm nghiên cứu tại Việt Nam đã xây dựng các phương pháp phát hiện thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược Một số nhóm nghiên cứu đã tiến hành phát hiện các thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông dược dạng thuốc bột, hoàn cứng bằng TLC Nguyễn Thị Lâm và cộng sự đã tiến hành phân tích tìm tân dược giảm đau chống viêm trên một số mẫu chế phẩm đông dược bằng phương pháp TLC và HPLC Nghiên cứu tiến hành phương pháp TLC trên bản mỏng silicagel 60 F254 với hệ dung môi: ether – toluen – n-butanol (65:10:5), soi UV ở bước sóng 254 nm

để phát hiện vết Đồng thời phương pháp HPLC được nhóm nghiên cứu tiến hành trên cột RP 18 cỡ hạt 10 µm với pha động: isopropanol – acid formic – dung dịch kali dihydrophosphat 0,1M (176:1:1000), tốc độ dòng: 1ml/phút, detector: UV –

254 nm [14] Lê Đào Khánh Long và cộng sự tiến hành định tính đồng thời một số glucocorticoid như dexamethason, betamethason, prednison, prednisolon và hydrocortison trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp TLC, sử dụng

phương pháp chiết xuất siêu âm kết hợp với chiết phân bố lỏng – lỏng để chiết corticoid ra khỏi chế phẩm Xây dựng được 5 hệ dung môi để tách các corticoid ra khỏi hỗn hợp Phát hiện bằng thuốc thử xanh tetrazolium và thuốc thử H2SO4/cồn

có formaldehyd LOD của các corticoid trong hỗn hợp mẫu thay đổi từ 0,3 μg đến 0,08 μg Trong 26 mẫu đông dược lấy từ thị trường phát hiện 7 mẫu (22%) có dexamethason hoặc betamethason [15]

Các nghiên cứu trên chỉ dừng ở mức độ phát hiện định tính trong khi đó, việc xác định hàm lượng của các tân dược trộn lẫn trong đông dược cũng có ý nghĩa quan trọng trong công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc, nhằm cảnh báo các tác dụng không mong muốn có thể gặp phải cho người sử dụng Phát hiện tân dược trộn trong chế phẩm đông dược cũng là một trong những định hướng cho mạng lưới kiểm nghiệm trong các năm tới, khi mà các trung tâm kiểm nghiệm bắt đầu được trang bị các công cụ phân tích mạnh như HPTLC, HPLC hay LC-MS [24] Hiện nay đã có một số nghiên cứu tiến hành định tính, định lượng các thuốc giảm đau chống viêm trên hệ thống HPLC

Trần Thị Hoàng Chi đã tiến hành định tính, định lượng dexamethason acetat và betamethason acetat trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC Phương pháp đã sử dụng ethyl acetat để chiết nóng trực tiếp với bột thuốc, hiệu suất thu hồi

104 – 109% Điều kiện sắc ký gồm cột C18 (250 × 4,6 mm; 5 μm), pha động gồm nước và acetonitril (55:45), bước sóng phát hiện 240 nm, điều nhiệt cột 30oC.Ứng dụng trên 8 mẫu chế phẩm đông dược và cho kết quả có 6 mẫu dương tính [9] Trịnh Thị Quy đã tiến hành phân tích 3 glucocorticoid (dexamethason, prednisolon acetat, dexamethason acetat) trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp HPLC với detector DAD Kỹ thuật xử lý mẫu khá đơn giản, dễ thực hiện Điều kiện sắc ký là cột C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm), bước sóng phát hiện 240 nm, pha động acetonitril – nước (35:65) LOD của dexamethason, prednisolon acetat, dexamethason acetat lần lượt là 0,45; 0,43 và 0,41 µg/ml Trong 12 mẫu khảo sát phát hiện có 3 mẫu trộn trái phép dexamethason và dexamethason acetat [21] Cao Công Khánh đã xây dựng được quy trình xác định đồng thời sibutramin, furosemid,

thời gian phân tích 15 phút Đối tượng là các loại TPCN dạng viên nén, viên nang

và dung dịch hỗ trợ điều trị giảm cân, hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp, gút được lấy ngẫu nhiên tại Hà Nội [12] Đào Văn Đôn và cộng sự đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời dexamethason acetat, betamethason và prednisolon bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột sắc ký Gemini C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm), detector UV, pha động ACN – H2O (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl Giới hạn định lượng (LOQ) của 3 chất dexamethason acetat, betamethason và prednisolon lần lượt là 1,0; 0,5 và 0,5 µg/ml Độ chính xác < 2%

Độ đúng 92 – 100% Quy trình có thể ứng dụng để kiểm tra các chế phẩm đông dược trên thị trường tuy nhiên chỉ giới hạn với 3 chất dexamethason acetat, betamethason và prednisolon [10]

Năm 2016, nhóm nghiên cứu tại trường đại học Dược Hà Nội đã thực hiện xây dựng phương pháp phân tích paracetamol, piroxicam, diclofenac, indomethacin trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC với hệ dung môi triển khai n-hexan – ethyl acetat – acid acetic (6:2,5:1,5), phát hiện tại bước sóng 254 nm và quét phổ UV trong khoảng 200 – 700 nm, đã xác định 1 mẫu dương tính với paracetamol hàm lượng 37,64 mg/liều trong 29 mẫu thu thập trên thị trường Quá trình nghiên cứu thực nghiệm cho thấy việc xác định một số chất giảm đau chống viêm trộn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp TLC và HPTLC có nhiều ưu điểm song bên cạnh đó cũng có những hạn chế nhất định Dùng TLC phát hiện các mẫu dương tính nhưng khi mẫu được đưa vào chồng phổ trong phương pháp HPTLC thì không trùng với phổ chất chuẩn (trường hợp dương tính giả) Đồng thời, một số mẫu được xác định bằng phương pháp HPTLC không trùng phổ với phổ chất chuẩn và kết luận âm tính nhưng khi đưa vào phân tích bằng phương pháp HPLC lại cho kết quả dương tính (trường hợp âm tính giả) [18]

Hiện nay, phương pháp phân tích sử dụng khối phổ là một phương pháp hiện đại đang từng bước được ứng dụng tại Việt Nam Chúng tôi chỉ tìm thấy 1 nghiên cứu đã công bố về phát hiện các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm trộn lẫn trong chế phẩm đông dược có sử dụng khối phổ của tác giả Nguyễn Quang Nam Nghiên cứu đã tiến hành phát hiện nhanh một số corticoid pha trộn trái phép trong

chế phẩm đông dược bằng kỹ thuật khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện vận hành thiết bị khối phổ Quatromicro API ở cả 2 chế độ ghi ESI (+) và ESI (-) từ đó xác định điều kiện chung áp dụng cho định tính phát hiện các corticoid Tuy nhiên, nền mẫu sử dụng trong nghiên cứu còn đơn giản, gồm 4 thành phần dược liệu, chưa sát với thực tế hiện nay Nghiên cứu chưa định lượng được các mẫu thực và chưa sử dụng được tỷ lệ ion định tính và ion định lượng để tăng độ tin cậy của kết quả định tính [20]

Trên nền mẫu có tính chất phức tạp như chế phẩm đông dược, các thành phần trong nền mẫu có thể không tách hoàn toàn ra khỏi pic chính chất phân tích nên dẫn đến đôi khi bị nhầm lẫn trong phân tích định tính và định lượng Nhận thấy LC-MS

là kỹ thuật phân tích có độ nhạy vượt trội, phát huy được thế mạnh của cả sắc ký lỏng (thời gian lưu) và khối phổ (phát hiện chất dựa vào tỷ số m/z) nên có tính đặc hiệu cao, kỹ thuật đã được ứng dụng nhiều trên thế giới nhưng chưa được ứng dụng nhiều trong nước để phân tích các thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông dược Chúng tôi đã bước đầu thực hiện xác định 4 thuốc giảm đau chống viêm indomethacin, ketoprofen, paracetamol, piroxicam bằng phương pháp LC-MS, phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao giúp cho kết luận có độ tin cậy cao hơn Trên cơ sở đó, trong đề tài này, chúng tôi tiếp tục mở rộng đối tượng nghiên cứu thêm 5 thuốc nhóm glucocorticoid, sử dụng phương pháp LC-MS để xác định 9 thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông dược

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

4 Indomethacin Chuẩn

QG

Chuẩn VKNTTW SKS: 0203094 HL: 99,7% HLH2O: 0,06%

5 Ketoprofen Chuẩn

QG

Chuẩn VKNTTW SKS: QT048 040813 HL: 99,54%

6 Paracetamol Chuẩn

QG

Chuẩn VKNTTW SKS: 0415019.04 HL: 100,04%

QG

Chuẩn VKNTTW SKS: 0102132 HL: 99,49% HLH2O: 0,07%

8 Prednisolon Chuẩn

QG

Chuẩn VKNTTW SKS: 0296024 HL: 99,94% HLH2O: 0,2%

QG

Chuẩn VKNTTW SKS: WS.0217235.02 HL: 99,19%

Dung môi, hóa chất

17 Nước cất 2 lần Siêu lọc

2.1.2 Máy móc – trang thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS BRUKER EVOQ Qube – Mỹ;

Hình 2.1 Máy sắc ký Bruker EVOQ Qube

- Cân phân tích XPE105 Mettler Toledo (chính xác đến 0,01mg) – Thụy Sĩ;

- Cân kỹ thuật XP 320C PRESICA – Thụy Sĩ;

- Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức;

- Máy siêu âm DAIHAN – WUC A22H – Hàn Quốc;

- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 HANON – Đài Loan;

- Bếp cô cách thủy – Trung Quốc;

- Máy lắc xoáy VORTEX ZX3 – Italy;

- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích class A – Đức

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Nền mẫu: Dựa trên các bài thuốc cổ truyền Độc hoạt tang ký sinh thang, Đại

tần giao thang và Tam tý thang với các nhóm hoạt chất đa dạng, có tác dụng trừ phong thấp, giảm đau, dưỡng can thận, bổ khí huyết dùng điều trị, hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp, giảm đau, chống viêm [11], [19], [22] Nền mẫu được bào chế và bổ sung thêm tá dược tại phòng nghiên cứu và phát triển sản phẩm, công

ty cổ phần Traphaco

+ Nền N1 (viên nang): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Độc hoạt tang ký sinh

thang trong Dược điển Việt Nam IV, gồm 15 loại dược liệu độc hoạt, phòng phong, tang ký sinh, tế tân, tần giao, đương quy, đẳng sâm, phục linh, ngưu tất, đỗ trọng,

quế chi, sinh địa, bạch thược, cam thảo, phụ tử [11] Bổ sung thêm tá dược trơn (aerosil) tỷ lệ 1% và bào chế dưới dạng viên nang

 Cách bào chế

Điều chế bột mịn cao dược liệu: Cân các thành phần thục địa, đỗ trọng, ngưu tất theo công thức bài thuốc và thái nhỏ Thêm lượng nước ngập dược liệu, đun sôi Giảm nhiệt độ (đủ để duy trì nước sôi), tiếp tục đun sôi trong 3 giờ, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu Sau đó lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lần 1 Thêm tiếp nước vào bã dược liệu lần 1 đến ngập, đun sôi Giảm nhiệt độ

và đun sôi tiếp trong 2 giờ, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu Sau đó lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lần 2 Gộp dịch lọc lần 1 và lần 2 đem cô cách thủy đến cao đặc Sấy khô cao đặc đến khi thu được cao khô Xay và rây qua rây 200 µm thu được bột mịn cao dược liệu

Điều chế bột mịn dược liệu: Cân các thành phần độc hoạt, tang ký sinh, tế tân, tần giao, bạch linh, quế tâm, phòng phong, xuyên khung, đảng sâm, cam thảo, đương quy, bạch thược theo công thức bài thuốc và thái nhỏ Trộn đều, sấy khô rồi xay thành bột mịn, rây qua rây kích thước 200 µm, đồng nhất mẫu thu được bột mịn dược liệu

Trộn bột cao dược liệu với bột dược liệu, thêm tá dược trơn (aerosil) tỷ lệ 1% trộn đồng nhất, rây qua rây kích thước 200 µm và đóng vào nang cứng số 0

+ Nền N2 (thuốc bột): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Tam tý thang trong sách

Phụ nhân lương phương, gồm 16 loại dược liệu bạch linh, bạch thược, cam thảo, đỗ trọng, độc hoạt, đương quy, hoàng kỳ, ngưu tất, nhân sâm, phòng phong, quế tâm, sinh địa, tần giao, tế tân, tục đoạn, xuyên khung [19] Nền mẫu được bào chế ở dạng thuốc bột

 Cách bào chế

Cân từng loại dược liệu theo công thức và thái nhỏ Trộn đều, sấy khô rồi xay thành bột mịn, rây qua rây kích thước 200 µm, đồng nhất mẫu Bột được đóng gói khối lượng 1,2g/gói

+ Nền N3 (viên nén): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Đại tần giao thang trong

sách Tố Vấn bệnh cơ khí nghi Bảo mệnh tập, gồm 16 loại dược liệu bạch chỉ, bạch

linh, bạch thược, bạch truật, cam thảo, độc hoạt, đương quy, hoàng cầm, khương hoạt, phòng phong, sinh địa, tần giao, tế tân, thạch cao, thục địa, xuyên khung [22]

Bổ sung thêm tá dược độn (tinh bột), tá dược dính (hồ tinh bột), tá dược trơn (talc, magie stearat) với tỷ lệ 1% và bào chế dưới dạng viên nén

 Cách bào chế

Điều chế bột mịn cao dược liệu: Cân các thành phần dược liệu theo công thức

và thái nhỏ Thêm lượng nước ngập dược liệu, đun sôi Giảm nhiệt độ (đủ để duy trì nước sôi), tiếp tục đun sôi trong 3 giờ, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu Sau đó lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lần 1 Thêm tiếp nước vào bã dược liệu lần 1 đến ngập, đun sôi Giảm nhiệt độ và đun sôi tiếp trong 2 giờ, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu Sau đó lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lần 2 Gộp dịch lọc lần 1 và lần 2 đem cô cách thủy đến cao đặc Sấy khô cao đặc đến khi thu được cao khô.Xay và rây qua rây 200 µm thu được bột mịn cao dược liệu

Trộn bột mịn cao dược liệu với tá dược độn (tinh bột) Thêm tá dược dính (hồ tinh bột) tạo khối ẩm Xát hạt qua rây 1000 µm thu được hạt ướt Sấy hạt đến hàm

ẩm thích hợp rồi sửa lại hạt qua rây 1000 µm Thêm tá dược trơn (talc, magie stearat) với tỷ lệ 1% vào khối hạt sau đó trộn đều và dập viên

- Mẫu thử: Một số chế phẩm đông dược sử dụng trong điều trị, hoặc hỗ trợ

điều trị các bệnh về xương khớp, giảm đau, đang lưu hành trên thị trường Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Cách thức thu thập: Nhà thuốc/cửa hàng bán chế phẩm bảo vệ sức khỏe, lương

y, mạng internet, mẫu gửi

- Dạng bào chế: Rắn (gồm bột, trà túi lọc, viên nén, viên nang, viên hoàn)

- Giai đoạn loại béo và chất màu: Khảo sát 2 dung môi rửa loại tạp ether dầu hỏa và n-hexan [15], [20]

- Giai đoạn chiết chất phân tích:

+ Khảo sát dung môi chiết methanol, ethanol 96% và hỗn hợp dung môi methanol : nước với các tỷ lệ khác nhau [33], [55], [72]

+ Khảo sát thời gian siêu âm

- Giai đoạn làm sạch dịch chiết: Khảo sát quy trình sử dụng phương pháp chiết pha rắn [21], [32], [52]

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS

Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Tiến hành phân tích trên thiết bị có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập ba Lựa chọn nguồn ion, năng lượng bắn phá, điều kiện phân mảnh ion mẹ và các ion con để phân tích được đồng thời 9 chất nghiên cứu trong hỗn hợp

- Khảo sát điều kiện sắc ký: Lựa chọn pha động, cột sắc ký, tốc độ dòng để có thể tách và phát hiện đồng thời 9 chất nghiên cứu ở nồng độ ppb, sắc đồ rõ ràng, thời gian phân tích không quá dài

2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 [27] và ICH 2005 [47] trên 3 nền mẫu tự tạo với các chỉ tiêu:

- Độ đặc hiệu

- Độ phù hợp của hệ thống

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Khoảng nồng độ tuyến tính

- Độ đúng và độ chính xác

2.2.5 Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được

Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng

Sắc ký mẫu thử, phát hiện thuốc tân dược trộn trái phép trong mẫu đông dược dựa vào thời gian lưu, mảnh khối và tỷ lệ ion con định tính định lượng so với chất chuẩn Xác định nồng độ thuốc tân dược trong mẫu dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của 9 chất nghiên cứu được thiết lập trong ngày, từ đó tính được lượng thuốc tân dược trộn trái phép (nếu có) trong mẫu đông dược ban đầu

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc đơn (1 mg/ml): Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất paracetamol, piroxicam, indomethacin, ketoprofen, betamethason, dexamethason acetat, hydrocortison acetat, prednisolon và prednison cho vào các bình định mức 10 ml, hòa tan bằng dung môi methanol thu được dung dịch chuẩn đơn mỗi chất nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml

Chuẩn bị dung dịch chuẩn đơn (2000 ng/ml): Dùng micropipet hút chính xác một thể tích khoảng 100 µl dung dịch chuẩn gốc đơn nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml cho vào bình định mức 5 ml, thêm dung môi methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn đơn mỗi chất nồng độ chính xác 20 µg/ml Dùng micropipet hút chính xác 500 µl dung dịch chuẩn đơn mỗi chất nồng độ chính xác 20 µg/ml cho vào bình định mức 5 ml, thêm dung môi methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn đơn mỗi chất nồng độ chính xác 2000 ng/ml

Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp (100 ng/ml): Dùng micropipet lần lượt hút chính xác 250 µl dung dịch chuẩn đơn mỗi chất nồng độ chính xác 2000 ng/ml cho vào bình định mức 5 ml, thêm dung môi methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 9 chất nồng độ chính xác 100 ng/ml

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ

3.1.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Để phân tích các tân dược trộn lẫn trong đông dược bằng LC-MS/MS cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) đối với từng hoạt chất Với kỹ thuật ion hóa ESI ở chế độ ion dương, các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+ hay thêm hai proton [M-2H]++ Từ ion mẹ

đã xác định được, tiến hành bắn phá để lựa chọn các ion con dùng trong định tính

và định lượng

Sử dụng các dung dịch chuẩn đơn nồng độ 2000 ng/ml tiêm không qua cột vào

hệ thống MS để xác định ion mẹ và các ion con Các điều kiện phân mảnh ion, năng

lượng bắn phá phân mảnh (CE) được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ Từ kết quả tối ưu hóa, lựa chọn 2 ion con có tín hiệu lớn, trong đó ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn làm ion định lượng, ion con còn lại dùng để định tính (xem phụ lục 1) Điều kiện khối phổ lựa chọn và phổ đồ các chất phân tích được trình bày trong các hình và bảng sau:

Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ

Thông số Giá trị tối ưu (đơn vị)

Nhiệt độ ion hóa 250C

Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ của các chất nghiên cứu

Tên chất Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) CE (eV) Tỷ lệ (%)

Hình 3.1 Phổ khối của paracetamol 1A) Phổ khối MS/MS với mảnh mẹ 152,1 2A) Phổ khối MS/MS với 2 mảnh con 110,1 và 93,2

Hình 3.2 Phổ khối của piroxicam 1A) Phổ khối MS/MS với mảnh mẹ 332,1

2A) Phổ khối MS/MS với 2 mảnh con 95,2 và 121,1