Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây mài gừng (dioscorea zingiberensis c h wright), họ củ nâu ( dioscoreaceae) ở quảng ngãi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THANH MAI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY MÀI GỪNG Dioscorea zingiberensis C.H.Wright, HỌ CỦ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THANH MAI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY MÀI

GỪNG (Dioscorea zingiberensis C.H.Wright),

HỌ CỦ NÂU (Dioscoreaceae) Ở QUẢNG NGÃI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THANH MAI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY MÀI

GỪNG (Dioscorea zingiberensis C.H.Wright),

HỌ CỦ NÂU (Dioscoreaceae) Ở QUẢNG NGÃI

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn

HÀ NỘI 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong lĩnh vực cùng đồng nghiệp và gia đình

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau Đại học, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, Dược học cổ truyền và Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và các cán bộ đồng nghiệp Khoa Dược trường Cao đẳng Y tế Bắc Ninh đã tạo điều kiện cho tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn người thầy đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cám ơn PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh - Viện Công nghệ

Dược phẩm Quốc gia và PGS.TS Đỗ Thị Hà cùng ThS Nguyễn Thị Thu,

khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cám ơn các bạn trong tập thể chuyên ngành Dược liệu- Dược học cổ truyền lớp CH21 đã động viên, giúp đỡ tôi trong khi hoàn thiện luận văn này

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu săc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, người thân và bạn bè - những người luôn bên cạnh ủng hộ tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu

Bắc Ninh, ngày 30 tháng 3 năm 2018

Ngô Thanh Mai

1.5.1 Phương pháp cân 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.2.1 Định tính một số hợp chất hữu cơ trong dược liệu

3.1 Đặc điểm thực vật, dƣợc liệu 22 3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm dƣợc liệu và giám định

3.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng diosgenin trong thân

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

DEPT : Detortionless enhancement by polarisationtrasfer

LOQ : Limit of quantitation

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.3 Các loài Dioscorea quan trọng đƣợc sử dụng để sản xuất

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật của cây Mài gừng với loài có

đặc điểm gần nhất thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu

Bảng 3.11 Kết quả xác định hàm lƣợng diosgenin trong các mẫu

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.10 Sắc ký đồ cao tổng và các cao chiết phân đoạn Mài gừng 41

Hình 3.13 Quy trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ thân rễ Mài

Hình 3.22 Sắc ký đồ của mẫu diosgenin chuẩn với điều kiện sắc ký

Hình 3.23 Sắc ký đồ của mẫu thử MG3 với điều kiện sắc ký trên 55

Hình 3.24 Sắc ký đồ của mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b), mẫu thử (c),

Hình 3.26 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (mg/ml) và

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay ngành y các nước dùng khoảng hơn 100 loại chế phẩm hormon

để chữa bệnh, khoảng 50 chứng bệnh thường không chữa được bằng các thuốc khác Các chế phẩm này được sản xuất hoặc từ các hormon động vật hoặc từ các sapogenin và alcaloid steroid thực vật (diosgenin, hecogenin, solasodin…) [13] Khoảng 50 - 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin Nhiều nước trên thế giới cũng như Việt

Nam đã và đang chú ý nghiên cứu các cây cỏ thuộc chi Dioscorea, họ Củ nâu

(Dioscoreaceae) với mục đích chiết xuất diosgenin sản xuất các chế phẩm

hormon steroid Nhu cầu về lượng thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin

ngày càng lớn, trong khi đó nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin ngày càng giảm do sự khai thác quá mức [35], [37], [40] Điều này đòi hỏi cần tìm thêm những nguồn nguyên liệu khác cung cấp diosgenin Trong khi đó, chi

Dioscorea trên thế giới có khoảng 600 loài, ở Việt Nam có hơn 40 loài [5],

[10], [25] Và còn nhiều loài trong số đó chưa được nghiên cứu để xác minh hàm lượng diosgenin

Gần đây chúng tôi mới phát hiện một loài Dioscorea zingiberensis tại

Quảng Ngãi mà người dân địa phương gọi là cây Mài gừng (từ đây chúng tôi gọi loài này là Mài gừng) Trên thế giới có rất ít công trình nghiên cứu về loài này [42] Tại Việt Nam, theo tổng quan tài liệu chưa thấy có nghiên cứu về hóa học nào của cây này, nhất là thành phần saponin Năm 1999, Nguyễn Minh Khởi đã xác định hàm lượng diosgenin trong thân rễ Mài gừng từ 1,41 đến 1,92% bằng sắc ký khí [23] Tuy nhiên phương pháp này có quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp hơn so với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Mặt khác, chưa có nghiên cứu nào định lượng diosgenin trong thân

rễ Mài gừng bằng HPLC ở Việt Nam

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và

thành phần hóa học của cây Mài gừng (Dioscorea zingiberensis C.H.Wright),

họ Củ nâu (Dioscoreaceae) ở Quảng Ngãi” với mục tiêu:

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa học của cây Mài gừng thu hái ở Quảng Ngãi

- Chiết xuất, phân lập và xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 2 saponin

từ cây Mài gừng

- Xác định đƣợc hàm lƣợng diosgenin trong thân rễ Mài gừng thu hái ở Quảng Ngãi

Thực vật chí đại cương Đông Dương [70] mô tả:

Cây cỏ lâu năm hoặc hàng năm Bộ phận dưới mặt đất giàu chất dự trữ (tinh bột) Thân leo, có những loài thì thân quấn sang phải, số khác thì quấn sang trái Lá nguyên, một số ít trường hợp là lá kép; lá mọc xen kẽ hoặc mọc đối Kiểu hoa: đa phần hoa đơn tính, hiếm khi gặp kiểu hoa khác Hoa thường không có cuống hoặc có cuống rất ngắn mọc thành chùm hay bông rủ xuống

Lá đài và cánh hoa giống nhau, lá đài 3, cánh hoa 3 Hoa đực: nhị 6 hoặc 3 có khi lép hay không có và rất ngắn Hoa cái giữa các loài trong chi không khác nhau lắm, các đặc điểm không phong phú như hoa đực Bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, noãn ngược, đầu nhụy 6 tạo thành 3 cặp Quả nang chẻ ô có 3 cánh Quả mở bằng cách nứt dọc theo mép của cánh với trục quả Hạt có cánh ở tất

cả các loài

1.1.2.2 Phân bố

Chi có khoảng 600 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và ôn đới châu Á, Australia, châu Mỹ [47], [49] [57], [66] Ở Việt Nam có hơn 40 loài [6], [25], [68] Ở châu Á có khoảng 140 loài [70]

1.1.3 Các nghiên cứu về phân loại thực vật của chi Dioscorea L ở Việt Nam

Nhiều tác giả Việt Nam và nước ngoài đã nghiên cứu chi Dioscorea L ở

Việt Nam về mặt phân loại thực vật

Loureiro trong bộ “Thực vật chí Nam Bộ” đã mô tả 5 loài thuộc chi

Dioscorea L ở Nam bộ nước ta [39]

Prain và Burkill đã mô tả 51 loài thuộc chi Dioscorea L ở Đông dương,

trong đó Việt Nam có 27 loài [70] (Bảng 1.1) Đây là công trình lớn nhất và

có giá trị nhất về nghiên cứu phân loại chi Dioscorea L ở Đông dương cũng

như Việt Nam

Bảng 1.1 Số lượng các loài trong chi Dioscorea L ở Việt Nam

6 Paramecocarpa Prain et Burkill 1

Năm 1972, Phạm Hoàng Hộ trong cuốn “Cây cỏ miền Nam Việt Nam”

đã thống kê 24 loài ở Việt nam [30], tác giả đã tóm tắt nêu sự phân bố và bổ

sung thêm hình vẽ các loài mà Prain và Burkill đã công bố trong “Thực vật

chí đại cương Đông dương” [70] Đây là một tài liệu mang tính chất phổ biến

khoa học, có giá trị trong việc nhận biết các loài Năm 1993, tác giả đã đưa tổng số loài lên con số 41 loài [10]

Năm 1977, Lê Đình Bích đã thống kê và lập danh mục gồm 36 loài

thuộc chi Dioscorea, tác giả đã mô tả 8 loài trong đó có 2 loài mới đối với hệ thực vật Việt nam (Dioscorea subcalva Prain et Burkill và D collettii Hook

f.) [2] Năm 1996, kết hợp điều tra nghiên cứu thực địa với việc tra cứu các tài

liệu, tác giả và cộng sự đã đưa ra bảng gồm 41 loài thuộc chi Dioscorea ở

Việt Nam, nêu sự phân bố của các loài này ở Việt Nam và các nước lân cận [14]

Tổng hợp các tài liệu [2], [3], [10], [14], [70] chúng tôi lập được danh

sách các loài thuộc chi Dioscorea L thường được sử dụng ở các địa phương

của nước ta (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số loài Dioscocrea L ở Việt Nam

2 D membranacea Piere Từ mỏng [3], [10], [70]

3 D dissimulan et Burkill Từ dấu [3], [10], [70]

4 D hemsleyi Prain et Burkill Từ hemsley [10], [14], [70]

5 D paradoxa Prain et Burkill Từ ngược [10], [70]

6 D subcalva Prain et Burkill Cư chinh [2]

8 D zingiberensis C.H.Wright Từ tam giác [3], [10]

1.1.4 Các nghiên cứu về hóa học của chi Dioscorea

Có nhiều công trình nghiên cứu về mặt hóa học của các cây thuộc chi

Dioscorea Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần chủ yếu trong rễ củ của

chúng là tinh bột [51], [ 56] Nhiều loài được xếp vào danh sách nguyên liệu

để thu tinh bột (D allata) Tinh bột trong củ của một số loài Dioscorea không

chỉ sử dụng làm lương thực, thực phẩm mà còn làm tá dược trong sản xuất thuốc, một số loài có hàm lượng tanin cao Các nhà khoa học cũng đã chiết ra

các dẫn chất phenanthren (từ loài D delicata) [43]

Thành phần alcaloid cũng được Monroe E Wall chứng minh có trong

loài Dioscorea dumetorum (Kunth) Pax [63] Tuy nhiên, việc nghiên cứu về các alcaloid chưa được chú ý đến nhiều

Các nhà khoa học cũng tìm thấy flavonoid, lipid, tanin, đường có trong

chúng, còn ở các section khác không tìm thấy các chất này [59] Phần lớn các

công trình nghiên cứu về mặt hóa học của chi Dioscorea L thường quan tâm

đến thành phần saponin trong rễ củ và thành phần này thường được coi là hoạt chất chính Các nghiên cứu về mặt hóa học của họ Củ nâu trước đây cho thấy

có saponin steroid [48], [56], [63]

Các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ đã chứng minh các saponin steroid có nhiều trong họ Hành (Liliaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Củ Nâu (Dioscoreaceae) Đáng chú ý nhất là các loài

trong chi Dioscorea L [63] Trong công nghiệp để tổng hợp các thuốc

hormon steroid trước đây, người ta chủ yếu dùng diosgenin được chiết xuất từ

các loài thuộc chi Dioscorea L Khoảng 90% các hormon được sản xuất từ

diosgenin và các các sapogenin gần chúng 117 loài (chiếm 18% tổng số loài)

của chi Dioscorea L đã được nghiên cứu về saponin steroid, có nhiều loài có hàm lượng rất cao (Dioscorea spiculiflora Hemsl.) [2], [32] Với sự hỗ trợ

của các phương tiện phân tích người ta đã phân lập ra nhiều chất trong thân rễ của chi này [2]

Năm 1986, Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích đã nghiên cứu saponin steroid của 8 loài thuộc chi này, hàm lượng diosgenin trong thân rễ và rễ củ (tính theo trọng lượng khô) của chúng rất khác nhau [14]

Nguyễn Hoàng và cộng sự đã nghiên cứu diosgenin trong Nần gừng thu mẫu tại Quảng Nam - Quảng Ngãi, đã xác định hàm lượng 1% diosgenin trong thân rễ [20]

Năm 1985, Đống Việt Thắng đã phân lập được từ loài D deltoidea nhập

nội vào Việt Nam 2 saponin A và B, saponin A trùng với deltonin Khi thủy phân saponin A thì được diosgenin và phần đường gồm D-glucose và L-rhamnose Saponin B trùng với dioscin Thủy phân saponin B thu được diosgenin và phần đường gồm D-glucose và L-rhamnose [33]

Nguyễn Xuân Cường và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học

trong Dioscorea hispida Dennst Đã xác định hàm lượng saponin 10% trọng

lượng khô Saponin này có tác dụng trị nấm ngoài da Tác giả đã xác định và phân lập cấu trúc của genin A [29]

Các công trình nêu trên cho thấy saponin steroid có trong nhiều loài

thuộc chi Dioscorea ở nước ta Một số loài có hàm lượng diosgenin lớn có thể

nghiên cứu trồng để chiết xuất diosgenin

1.1.5 Ứng dụng của chi Dioscorea

1.1.5.1 Ứng dụng trong đời sống

- Do thân rễ chứa nhiều chất dinh dưỡng nên một số loài Dioscorea được

sử dụng làm lương thực, chế biến thức ăn, đặc biệt khi thiếu đói, giáp hạt như:

khoai mỡ (D alata), củ từ (D esculenta), khoai rạng (D glabra), củ mài (D

persimilis)…[6], [15], [25]

- Thân rễ chứa tanin, dùng để nhuộm lưới và quần áo như: củ nâu (D

cirhosa), từ ngược mùa (D intempestiva)…[6], [25]

- Thân rễ một số loài có độc, dùng để diệt chấy rận, duốc cá, tẩm mũi tên

như: củ mài gừng (D zingiberensis), từ poilane (D deltoidea), củ nần (D

hispida)…[6], [25]

1.1.5.2 Ứng dụng trong y học

Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ Ngoài ra, nhiều loài

trong chi Dioscorea được sử dụng làm thuốc Dưới đây là một số tác dụng của các loài thuộc chi Dioscorea:

- Bổ dưỡng nhất là khi cơ thể suy nhược, thận suy: D alata, D

asculenta, D glabra, D persimilis…[5], [6], [25]

- Chỉ huyết, tiêu ứ huyết: D bulbifera, D cirrhosa, D esculenta [5],

[6], [25]

- Mạnh gân xương, trị phong thấp, đau lưng, mỏi gối: D hispida, D

pentaphylla, D collettii…[5], [6], [25]

- Trị sưng tấy, vết thương phần mềm: D esculenta, D chingii, D

subcalva, D pentaphylla, D hispida…[5], [6], [25]

- Giải độc: D esculenta…[5], [6], [25]

Các loài Dioscorea có chứa phytoestrogens, các chất này có nhiều tác

dụng kháng độc tố như làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể và tăng cường

sức khỏe toàn diện nhất là ở phụ nữ [54] Gần đây, thân rễ Dioscorea được

xác định có tác dụng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm, chống loãng xương [50], [54] Thêm nữa, tác dụng chống oxy hóa của dioscorin, một

protein dự trữ trong thân rễ Dioscorea cũng được nghiên cứu rộng rãi Đã chứng minh được rằng sử dụng thân rễ Dioscorea có thể cải thiện một số bất

thường về chuyển hóa bao gồm tăng đường huyết, bất thường chức năng ruột

và chuyển hóa lipid (Jeon và cộng sự, 2006) [54]

1.2 Cây Mài gừng

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Dây leo bằng thân quấn về bên trái [3], [10], [25], [68], dài 1,5 - 3m, đường kính thân leo 0,2 - 0,3cm [3] Thân rễ hình trụ, nằm ngang, phân nhánh, vỏ ngoài màu nâu, ruột màu vàng; có nhiều rễ chùm, cứng [3], [25]

Lá mọc so le, có cuống 4 - 6 cm, gốc cuống lá có 2 gai nhỏ [5], [8], [10], ở lá non, cuống lá có màu tím đỏ nâu [8] Phiến lá hình tim vát, dài 10 - 15 cm, rộng 6 - 8 cm, đầu nhọn; gân chính 7, gân phụ rất mờ [5], [8], [10] Hoa đơn tính khác gốc, cụm hoa hình bông, mọc ở kẽ lá [3], [8], [ 10], [25] Hoa đực không cuống, bao hoa dạng ống ngắn, phía trên xẻ 6 thùy, 6 nhị Hoa cái nhỏ, không cuống; lá bắc hình tam giác, nhỏ; bao hoa có 6 cánh dời nhau, hình tam giác nhọn, bầu 3 ngăn [3], [25] Quả nang gồm 3 cánh, màu nâu; 3 hạt, có cánh mỏng [3], [8], [10]

1.2.2 Phân bố, sinh thái

Cây được phát hiện lần đầu tiên tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng (Đỗ Huy Bích, 1978) Sau đó, cây được tìm thấy thêm ở huyện Bảo Lộc, Đơn Dương (Lâm Đồng), 1979; huyện Khánh Sơn, Khánh Vĩnh (Khánh Hòa), Trà

My (Quảng Nam), 1981 và Vĩnh Thạnh, An Lão (Bình Định), 1983 [3], [8], [25] Chưa thấy có Mài gừng ở các tỉnh phía Bắc Trên thế giới, Mài gừng có

ở Trung Quốc [3], [5], [8], [25]

Thực vật chí Trung Quốc cho biết cây mọc ở rừng hỗn giao, ở độ cao

100 - 1800 m [68] Mài gừng là cây ưa ẩm, hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các đám cây bụi, cây gỗ nhỏ ở ven rừng, dọc theo thượng nguồn các bờ sông suối [3], [5], [8], [25] Cây thường mọc trên loại đất đỏ vàng phát triển trên bazan [8]

1.2.3 Thành phần hóa học

Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu, chưa có nghiên cứu nào sâu về đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột, thành phần hóa học và định lượng diosgenin bằng phương pháp HPLC của cây Mài gừng Vì vậy việc nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây Mài gừng là cần thiết, là tiền đề cho công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu Mài gừng và tăng giá trị ứng dụng của cây vào thực

tế - một nguồn nguyên liệu chiết diosgenin tiềm năng, góp phần làm phong

phú hơn những hiểu biết về hóa thực vật của các cây thuộc chi Dioscorea, bổ

sung thêm thông tin vào cơ sở dữ liệu khoa học của Việt Nam

1.3 Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin

Khoảng 90% các dẫn chất steroid dùng làm thuốc được sản xuất đều đi

từ nguyên liệu là diosgenin Mặc dù diosgenin có gặp trong họ Liliaceae (chi

Trillium), họ Zingiberaceae (chi Costus), họ Taccaceae (chi Tacca) nhưng chỉ

có họ Dioscoreaceae mới có giá trị thực tế [7], [17]

Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài

Dioscorea chứa diosgenin [54] Những loài Dioscorea có hàm lượng

diosgenin đáng kể thường có thân quấn ngược chiều kim đồng hồ [17] Phần lớn diosgenin được sản xuất trên thế giới xuất phát từ các loài Trung Mỹ, chủ

yếu là D floribunda và D composita, cả hai đều mọc hoang ở bản địa [54] Trong thân rễ của D floribunda, D composita thành phần diosgenin và

yamogenin chiếm gần 90% glycosid toàn phần, cả hai đều là những tiền chất

steroid có giá trị Sapogenin thu được từ D deltoidea không có tạp chất

pennogenin nên có giá trị cao trên thị trường steroid [62]

D nipponica và D zingiberensis chứa diosgenin và được trồng nhiều ở

Trung Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [35]

Bảng 1.3 Các loài Dioscorea quan trọng đƣợc sử dụng để sản xuất

diosgenin trong công nghiệp [40]

D composita Hemsl

Mexico

D mexacana Scheidw

D floribunda M Martens & Galeotti

D deltoidea Wall ex Griseb Ấn Độ

Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành hóa học, các loài

Dioscorea có hàm lƣợng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam, bên cạnh có

đặc điểm thân rễ và dây leo quấn trái, đều có những cặp gai cong ở cuống lá [20]

Cũng trong thời gian này Viện Dƣợc liệu [18], [33], di thực 3 loài

Dioscorea vào Việt Nam: D composita, D floribunda và D deltoidea Đã

xác định điều kiện trồng chăm sóc phù hợp với 3 loài trên Tuy nhiên

sapogenin thu đƣợc từ D composita và D floribunda đều có tạp chất

pennogenin (hàm lƣợng pennogenin trong sản phẩm từ vết đến 35% đối với

D composita, và từ 1 - 5% đối với D floribunda) Loài D deltoidea có ƣu

điểm chỉ chứa một sapogenin là diosgenin Các nhà khoa học đã nghiên cứu

xử lý tạp chất pennogenin song không thành công Nghiên cứu bán tổng hợp 16-DPA từ hỗn hợp diosgenin-pennogenin chƣa biết tỷ lệ thành phần, chiết

xuất từ D composita và D floribunda cho thấy hiệu suất chỉ bằng 1

/2 so với

điều chế từ diosgenin có hàm lƣợng trên 90% [12], [18]

Các nhà khoa học tại Viện Dƣợc liệu đã xây dựng quy trình chiết xuất

diosgenin từ dƣợc liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D floribunda trên quy

mô phòng thí nghiệm và quy mô bán công nghiệp Từ diosgenin chiết đƣợc đã tổng hợp 16-DPA và các dẫn chất steroid [18]

1.4 Diosgenin

1.4.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý, hóa học

Diosgenin là một sapogenin steroid, đƣợc sản xuất thông qua thủy phân

saponin bằng acid, base mạnh hoặc các enzym

- Công thức cấu tạo:

CH3C

H3

CH3

CH3

O H

O O

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của diosgenin

- Tên IUPAC: (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol

triển loãng xương [40]

- Diosgenin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và huyết khối, kéo dài thời gian thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian prothrombin (PT) Do đó, nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về tim

mạch như bệnh mạch vành và cơn đau thắt ngực [42]

- Trong các tế bào ung thư vú HER2-overexpressing, người ta thấy có sự tăng lên rõ rệt của Fatty acid synthetase (FAS) Diosgenin có khả năng ngăn chặn sự xuất hiện của FAS trong các tế bào ung thư vú Diosgenin ưu tiên ức chế sự tăng sinh và gây độc tế bào ung thư HER2-overexpressing Hơn nữa diosgenin ức chế phản ứng phosphoryl hóa Akt, mTOR và JNK Diosgenin có khả năng ức chế sự tồn tại, sự phát triển và gia tăng của các tế bào ung thư vú

[38], [46]

- Ứng dụng quan trọng của diosgenin đó là nguồn nguyên liệu bán tổng hợp ra 16-dehydro pregnenolon acetat (16-DPA), là chất trung gian để tổng hợp các dẫn chất steroid Khoảng 50 - 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin Hàng năm ước tính ngành dược cần

10.000 tấn thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin [37], [40]

- Trong số hàng trăm saponin steroid được biết cho đến nay thực tế cũng chỉ 10 chất có giá trị kinh tế lớn vì hai lý do: một là phải có nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào hoặc trồng trọt dễ có năng xuất cao Hai là hệ thống Spiroketal trong cấu trúc của chúng dễ dàng bị phá để cho ra hợp chất trung gian là dehydro pregnenolon acetat (DPA) là khung cơ bản để tổng hợp các thuốc steroid Và trong số 10 saponin steroid được biết đó, diosgenin là chất

có ưu thế nhất trên 2 phương diện trên [27]

1.5 Các phương pháp định lượng diosgenin

1.5.1 Phương pháp cân

Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó bốc hơi dung môi, sấy, cân [32]

1.5.2 Phương pháp đo quang

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó tiến hành sắc ký lớp mỏng để xác minh diosgenin Diosgenin được chiết bằng chloroform, lên màu bằng FeCl3 và H3PO4 - H2SO4 (10:1) (tt/tt), đo ở bước sóng 485 nm [32]

1.5.3 Phương pháp sắc ký khí

Bột dược liệu được ủ men, thủy phân, trung tính hóa, sấy khô, hòa tan trong dung môi với chất nội chuẩn cholesterol rồi phân tích bằng máy sắc ký khí [24]

1.5.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan cắn trong chloroform Chấm sắc ký của mẫu, cùng với dãy diosgenin đối chiếu Sau đó đo mật độ quang vết sắc ký bằng Densitometer [1], [35]

1.5.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Bột dược liệu được thủy phân, trung tính hóa, sấy khô, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan trong methanol rồi phân tích bằng máy HPLC [58]

Trong 4 phương pháp trên, phương pháp cân đòi hỏi lượng mẫu nhiều và gặp sai số lớn trong quá trình chiết tách mẫu Phương pháp đo quang phụ thuộc vào độ bền màu của diosgenin với hỗn hợp thuốc thử Phương pháp sắc

ký khí có quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp Phương pháp HPTLC kết hợp với máy Densitometer cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và kết quả khá chính xác thích hợp cho định lượng sơ bộ Phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm hơn

cả, cho kết quả có độ chính xác cao, quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, điều kiện phân tích khá dễ dàng, được sử dụng phổ biến hiện nay [56]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Cây Mài gừng được thu hái ở xã Trà Phong, Tây Trà, Quảng Ngãi vào thời điểm tháng 2/2017 (MG1); 4/2017 (MG2); 7/2017 (MG3)

Một phần thân, lá, thân rễ được bảo quản trong cồn 60% để nghiên cứu đặc điểm vi phẫu

Một phần thân, lá, thân rễ được rửa sạch, loại bỏ rễ con, thái lát mỏng, sấy khô ở 60oC, nghiền thành bột thô, bảo quản nơi khô thoáng

Mẫu tiêu bản cây Mài gừng đã được lưu tại Bảo tàng thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội - Đại học Quốc gia Hà Nội, số hiệu tiêu bản: HNU/023995 (Phụ lục 1)

2.1.2 Hóa chất, thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Acid sulfuric, acid hydroclorid, natri hydroxyd, natri carbonat…

- Các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính: TT Mayer, Dragendorff, Buchardat, Diazo, vanillin trong acid sulfuric đặc, dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% …

- Cloramin, cloralhydrat, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn

- Dung dịch đệm phosphat - natri clorid

- Dung môi: chloroform, methanol (MeOH) công nghiệp, methanol

(MeOH) Merck, ethanol 80%, ethyl acetat (EtOAc), n-hexan, butanol

(BuOH), aceton, nước cất, acetonitril (Merck), acid phosphoric (Merck), nước cất 2 lần

2.1.2.3 Thiết bị

- Bếp điện, bếp đun cách thủy Memmert, sinh hàn hồi lưu, soxhlet

- Tủ sấy Memmert, tủ sấy Binder-FD115, máy cất quay Rotavapor

R-200 (Buchi), máy siêu âm Power sonic 405

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR

- Máy đo quang phổ UV-VIS Halo DB-20S (Dynamica, Thụy Sỹ), kính hiển vi Leica

- Máy HPLC Ultimate 3000 (Thermo Scientific, Mỹ) trang bị detector UV-VIS

- Máy xác định độ ẩm MB 25 (OHAUS, Mỹ), tủ lạnh

- Máy đo độ nóng chảy Stuart -SMP 3

- Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR được ghi trên máy FT-IR Affinity-1S Shimadzu tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội - Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer với chất chuẩn nội là TMS của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

- Máy đo phổ khối APCI-MS Varian Agilent 1100LC-MSD mass spectrometer của Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

2.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi

- Đặc điểm vi phẫu: Vi phẫu lá, thân, thân rễ cây Mài gừng được cắt bằng máy cắt cầm tay, tẩy và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh dưới kính hiển vi [4], [28]

- Đặc điểm bột: Lá, thân, thân rễ sấy khô ở 60oC, nghiền nhỏ thành bột mịn bằng cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi [28]

2.2.1.3 Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm của bộ phận sinh sản, so sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản lưu trữ tại một số phòng tiêu bản mẫu khô, đối chiếu với khóa phân loại thực vật trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật [3], [5], [15], [25], [58], [68], cùng với sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật để xác định tên khoa học của loài

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.2.1 Định tính một số hợp chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

Định tính các nhóm chất trong dược liệu theo phương pháp nghiên cứu hóa thực vật và hóa học cây thuốc [16], [17] Định tính các nhóm chất alcaloid, anthranoid, acid hữu cơ, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycosid tim, đường khử

2.2.2.2 Sắc ký lớp mỏng

Định tính bằng SKLM theo theo phụ lục 5.4 Dược điển Việt Nam IV [31]: SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck) Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366 nm hoặc dùng thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc

2.2.2.3 Chiết xuất, phân lập các hợp chất tinh khiết trong thân rễ Mài gừng

+ Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck) Dung môi khai triển là các dung môi hữu cơ có thành phần và các tỷ lệ khác nhau theo khảo sát từ SKLM Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM để gộp thành các phân đoạn có chứa cùng các hoạt chất Kết tinh các chất trong dung môi hay hệ dung môi phù hợp [22]

2.2.2.4 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý (thể chất, nhiệt độ nóng chảy) và các dữ liệu phổ bao gồm: phổ hồng ngoại

(IR), phổ khối (APCI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều, đồng thời đối chiếu với các dữ liệu phổ chuẩn

2.2.3 Định lượng diosgenin trong thân rễ Mài gừng

Phương pháp chuẩn bị mẫu

Dung dịch chuẩn gốc diosgenin: Cân chính xác khoảng 10 mg diosgenin

chuẩn vào bình định mức 10 ml, thêm methanol Merk, lắc để hòa tan, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Bảo quản ở 2 - 8o

C dùng trong 1 tháng

Dung dịch chuẩn: Hút chính xác 3,0 ml dung dịch chuẩn gốc diosgenin

vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45µm để tiêm sắc ký

Dung dịch thử: Qua tham khảo tài liệu [18], [26], [53], [58] chúng tôi đã

lựa chọn được quy trình xử lý mẫu như sau: Cân chính xác khoảng 0,8 g bột dược liệu (độ ẩm 12,06%) vào bình cầu 250 ml nối với sinh hàn hồi lưu, thêm

25 ml dung dịch H2SO4 2M, đun hồi lưu cách thủy trong 5 giờ Lọc qua hai lớp giấy lọc, rửa bằng nước cất tới trung tính, lấy phần chất rắn bên trên giấy lọc đem sấy khô ở 60°C Chiết dược liệu thân rễ Mài gừng bằng methanol trong Soxhlet trên nồi cách thủy trong 5 giờ Gộp dịch chiết, cô dịch chiết đến cao đặc Cho cao đặc thân rễ Mài gừng vào bình định mức 50 ml, thêm methanol tới vạch, siêu âm cho tan hoàn toàn Lọc qua màng lọc kích thước 0,45µm trước khi tiến hành sắc ký

Dung dịch mẫu trắng: methanol

Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký

Tham khảo các tài liệu [42], tiến hành khảo sát một số hệ pha động khác nhau với dung dịch diosgenin chuẩn (0,3119 mg/ml, dung môi pha mẫu là methanol), bằng thực nghiệm, các điều kiện sắc ký phù hợp đã được lựa chọn

Tiến hành phân tích trên 3 mẫu thân rễ Mài gừng thu hái tại Quảng Ngãi

tại 3 thời điểm khác nhau

Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học có sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm thực vật, dược liệu

3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm dược liệu và giám định tên khoa học của Mài gừng

3.1.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật

Dây leo bằng thân quấn về bên trái, dài 5 - 10 m (Hình 3.1.A), thân leo nhẵn, không lông, có những đốm màu tía nằm rải rác dọc thân và dày dần ở gốc cuống lá (Hình 3.1.E,H) Thân leo hình trụ, nhỏ, đường kính 2,5 - 3,5 mm (Hình 3.1.H)

Thân rễ dài 15 - 30 cm, đường kính 2 - 3,5 cm, nạc, nằm ngang, có thể phân nhánh, lớp vỏ ngoài sần sùi, màu vàng nâu, ruột màu vàng, vị đắng (Hình 3.1.B) Thân rễ có những u lồi, đường kính khoảng 2mm; rễ con cứng phân bố đều trên mặt củ (Hình 3.1.B)

Lá đơn, mọc so le, có cuống dài 4 - 6 cm, thiết diện tròn, không lông, có đốm màu tía; phần cuống lá sát gốc lá dầy lên, hơi tròn, dài khoảng 6 mm; phần cuống lá sát với thân, tròn, hơi lõm, có kích thước lớn hơn phần cuống giữa, dài khoảng 8 mm (Hình 3.1.G) Gốc cuống lá có một cặp gai cong, nhọn, dài 1 - 2 mm (Hình 3.1.E) Phiến lá hình tim vát, ngọn lá nhọn, gốc hình tim, kích thước 10 - 15 x 6 - 8 cm, màu xanh lục, mặt dưới màu sậm hơn, cả 2 mặt đều không có lông, mép lá nguyên; có 7 gân chính tỏa ra từ gốc, gân chính hơi lõm ở mặt trên, lồi lên ở mặt dưới (Hình 3.1.C,D)

Cụm hoa hình bông, mọc ở kẽ lá Hoa nhỏ, đều, kích thước khoảng 4 x 3

mm, màu đỏ tía, có cuống rất ngắn, đơn tính khác gốc (Hình 3.1.A, D, I, J, K) Hoa đực không cuống, bao hoa dạng ống ngắn, phía trên xẻ 6 thùy, 6 nhị Quả nang gồm 3 cánh, màu nâu; 3 hạt, có cánh mỏng

Mùa hoa tháng 5 - 8, mùa quả tháng 9 - 12

Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái của cây Mài gừng

A– Đoạn thân có lá, hoa; B– Thân rễ; C,D– Lá; E– Cặp gai cong ở gốc cuống lá; F, G–

Cuống lá; I, J, K– Hoa đực; H– Cận cảnh đoạn thân

3.1.1.2 Giám định tên khoa học

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật của cây Mài gừng với loài có đặc

điểm gần nhất thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu (Dioscoreaceae)

hoặc hình tim, chóp nhọn

Hình tam giác, kích thước 5 x 5

cm, đáy cắt ngang

Hình trứng tam giác, kích thước 4,5 - 10

Quấn trái, dài

5 - 10 m

Quấn qua

mặt, không lông

Quấn trái,

trơn, nhẵn

Loài

Đặc điểm

nhỏ, đường kính 2,5 - 3,5

mm

ngang, có thể phân nhánh,

dài 15 - 30 cm, đường kính 2 - 3,5 cm, có u lồi, đường kính khoảng 2 mm,

vỏ ngoài màu vàng nâu, ruột màu vàng Rễ con cứng phân

bố đều trên mặt

củ

Hình trụ, nằm ngang, phân nhánh, vỏ ngoài màu vàng nâu, ruột màu vàng

Thân rễ nằm ngang, chia nhánh

-lát cắt màu vàng.

Qua phân tích các đặc điểm hình thái mẫu cây Mài gừng thu được; kết hợp với bảng so sánh; cùng với việc tra cứu các tài liệu khóa phân loại thuộc chi

Dioscorea L., căn cứ vào tài liệu [9], [10], [15], [25], [58], [68]; so sánh mẫu

tiêu bản cây Mài gừng với mẫu tiêu bản thực vật số hiệu BM001049242 của Bảo tàng lịch sử tự nhiên London - Natural History Museum Data Portal (online) và với sự giúp đỡ của GS-TS Phan Kế Lộc, chúng tôi kết luận mẫu

Mài gừng thu hái tại Quảng Ngãi là một loài thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu (Dioscoreaceae) và tên khoa học của cây là Dioscorea zingiberensis

C.H.Wright

- Mẫu tiêu bản cây Mài gừng đã được lưu tại Bảo tàng thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội - Đại học Quốc gia Hà Nội, số hiệu tiêu bản: HNU/023995 (Phụ lục 1)

3.1.1.3 Mô tả bộ phận dùng

Bộ phận dùng là thân rễ đã được sấy khô của cây Mài gừng (Dioscorea

zingiberensis C.H.Wright), họ Củ nâu (Dioscoreaceae)

Mô tả: Thân rễ không có hình dạng nhất định, thường hình trụ, nằm ngang, phân nhánh, chiều dài khoảng từ 15 - 30 cm, dày khoảng 2 - 3,5 cm Ở tận cùng các nhánh có những lớp bần tụ thành từng đám vẩy màu đen; vỏ ngoài có màu vàng nâu hoặc xám, xù xì, lồi lõm, mang rất nhiều rễ con dạng sợi cứng, đường kính vài milimet, dài 8 - 15 cm, phần sát với thân rễ có vết tích của lớp bần bị bong ra, tạo thành những ống ôm lấy rễ con, rễ con chỉ tồn tại ở những phần thân rễ còn non, ở những phần già rễ con tự rụng đi làm cho

bề mặt thân rễ thường nhẵn hơn, có màu vàng nâu rõ hơn Mặt cắt màu vàng, thể chất cứng và dai Dược liệu cứng và dai, mùi thơm nồng đặc biệt, vị đắng

3.1.2 Hình ảnh, đặc điểm vi phẫu của lá, cuống lá, thân, thân rễ cây Mài gừng

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá

Phần gân lá: mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi nhiều Biểu bì trên (1) là

một lớp tế bào tròn, nhỏ, đều đặn xếp thành một hàng Sát biểu trên là mô dày trên (2) gồm 1 lớp tế bào hình tròn, vách dày làm nhiệm vụ nâng đỡ Bó libe

gỗ gân giữa gồm những mạch gỗ to (6) xếp ngẫu nhiên ở giữa, libe (5) tạo thành những đám nhỏ ở phía ngoài các mạch gỗ Mô mềm dự trữ (4) gồm các

tế bào hình đa giác tròn, màng mỏng, sắp xếp lộn xộn Mô dày dưới (8) gồm 4

- 5 lớp tế bào hình tròn, thành dày xếp thành từng hàng Biểu bì dưới (7) là 1 lớp tế bào hình tròn xếp thành hàng đều đặn

Phần phiến lá: tế bào biểu bì trên (1) to hơn tế bào biểu bì dưới (7) Mô

mềm đồng hóa (3) gồm những tế bào hình tròn hay nhiều cạnh xếp lộn xộn với nhau

Hình 3.2 Vi phẫu lá Mài gừng

1 Biểu bì trên; 2 Mô dày trên; 3 Mô mềm đồng hóa; 4 Mô mềm dự trữ; 5 Libe; 6

Gỗ; 7 Biểu bì dưới; 8 Mô dày dưới

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu cuống lá

Vi phẫu cuống lá có mặt cắt hình ngũ giác; phần cuống lá sát thân và sát gốc lá dầy lên có mặt cắt ngang gần tròn

Hình 3.3 Vi phẫu cuống lá Mài gừng

1 Biểu bì; 2 Mô mềm vỏ; 3 Nội bì; 4 Trụ bì hóa mô cứng; 5 Gỗ; 6 Libe; 7 Mô

mềm ruột; 8 Mô dày Phần cuống lá: chia 2 phần rõ rệt Phần vỏ: lớp biểu bì (1) gồm 1 hàng tế bào hình đa giác xếp đều đặn Lớp mô dày (8) đặt ở dưới những chỗ lồi lên của biểu bì và làm nhiệm vụ nâng đỡ Tiếp theo là lớp mô mềm vỏ (2) gồm 3

- 4 hàng tế bào hình đa giác sắp xếp lộn xộn Nội bì (3) là một hàng tế bào xếp đều đặn thành vòng tròn có thành tế bào một phần hóa gỗ Phần trụ giữa gồm: trụ bì hoá mô cứng (4) gồm 4 - 5 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp thành

dãy không đều nhau Libe (6) bao quanh gỗ (5) tạo thành các bó libe - gỗ Mô mềm ruột (7) gồm những tế bào hình tròn hay đa giác, thành mỏng

Hình 3.4 Vi phẫu phần cuống lá dày lên sát thân

1 Biểu bì; 2 Mô dày; 3 Mô mềm vỏ; 5 Libe; 6 Gỗ; 4,7 Mô mềm ruột Phần cuống lá sát thân và sát gốc lá: Cấu tạo tương tự nhau Ngoài cùng

là lớp biểu bì (1) có cấu tạo bởi một lớp tế bào sống hình gần tròn xếp đều đặn Mô dày (2) gồm những tế bào hình tròn, vách dày Mô mềm vỏ (3) gồm

5 - 6 lớp tế bào tròn hoặc gần tròn, vách mỏng, to hơn tế bào biểu bì, kích thước không đều Các bó libe (5), bó gỗ (6) xếp theo kiểu bó chồng, libe ở phía ngoài, gỗ ở phía trong Mô mềm ruột: gồm 2 lớp tế bào Lớp ngoài (4) là những tế bào hình đa giác tròn, nằm bao quanh bó libe - gỗ, kích thước nhỏ Lớp trong (7) gồm những tế bào hình đa giác tròn, kích thước lớn hơn, sắp xếp lộn xộn