Nghiên cứu tạo sản phẩm liên hợp oxytocin peg để làm thuốc có khả năng bảo vệ được oxytocin trong đường tiêu hóa

Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh Pegyl hóa Oxytocin làm tăng độ bền phân tử trong điều kiện bảo quản, kéo dài thời gian tác dụng giúp làm giảm liều dùng.. Đồng thời, đánh giá đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THANH NGHỊ

NGHIÊN CỨU TẠO SẢN PHẨM LIÊN HỢP OXYTOCIN - PEG ĐỂ LÀM THUỐC CÓ KHẢ NĂNG BẢO VỆ ĐƯỢC OXYTOCIN TRONG ĐƯỜNG TIÊU HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THANH NGHỊ

NGHIÊN CỨU TẠO SẢN PHẨM LIÊN HỢP OXYTOCIN - PEG ĐỂ LÀM THUỐC CÓ KHẢ NĂNG BẢO VỆ ĐƯỢC OXYTOCIN TRONG ĐƯỜNG TIÊU HÓA

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi những lời cảm ơn

chân thành nhất tới PGS.TS Nguyễn Văn Rư - trưởng bộ môn Hóa Sinh dược,

trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp

đỡ tôi trong quá trình làm luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo bộ môn Hóa Sinh dược, trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, bộ môn Dược trường Cao đẳng Y tế Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Tôi cũng chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Sau đại học trường Đại học Dược Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong trường đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình

và bạn bè đã luôn bên cạnh chăm lo, động viên và khích lệ tôi những lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 26 tháng 03 năm 2018

LÊ THANH NGHỊ

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 OXYTOCIN 2

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo và tính chất 2

1.1.2 Tác dụng dược lý của Oxytocin 3

1.1.3 Sự kém bền của phân tử Oxytocin trong chế phẩm thuốc 4

1.2 PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN CỦA PHÂN TỬ OXYTOCIN 5

1.2.1 Tạo các chất có tác dụng tương tự Oxytocin 5

1.2.2 Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfid trên Oxytocin 5

1.2.3 Tạo hệ đệm chứa ion kim loại trong chế phẩm thuốc 6

1.2.4 Chế phẩm dạng bột đông khô 7

1.2.5 Nghiên cứu gắn phân tử polyethylen glycol vào protein và Oxytocin 7

1.3 PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA PROTEIN DÙNG LÀM THUỐC 10

1.3.1 Polyethylen glycol 10

1.3.2 Phương pháp Pegyl hóa protein dược dụng 10

1.4 PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA OXYTOCIN 15

1.4.1 Gắn kết vào các nhóm amin của Oxytocin 15

1.4.2 Gắn kết vào cầu nối disulfid của Oxytocin 16

1.4.3 Các vị trí liên hợp khác 18

1.5 PEGYL HÓA ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÁC DỤNG CỦA OXYTOCIN 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 21

2.1.1 Nguyên vật liệu 21

2.1.2 Dụng cụ máy móc 21

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu, phương pháp xử lý số liệu 22

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 23

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 23

2.3.2 Pha dung dịch đệm dùng trong nghiên cứu 23

2.3.3 Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin 25

2.3.4 Xác định sự hình thành hợp chất liên hợp Oxytocin PEG bằng phương pháp điện đi 27

2.3.5 Đánh giá hiệu quả hình thành và tinh chế hợp chất liên hợp Oxytocin PEG bằng phương pháp sắc ký lọc gel 30

2.3.6 Phương pháp định lượng Oxytocin và hợp chất liên hợp 33

2.3.7 Phương pháp đông khô 34

2.3.8 Phương pháp đánh giá độ bền protein trong hợp chất liên hợp 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH HỢP CHẤT LIÊN HỢP 37

3.1.1 Tổng hợp sản phẩm liên hợp Oxytocin-PEG 37

3.1.2 Phát hiện phức hợp của phản ứng bằng điện di 37

3.1.3 Xây dựng phương trình tương quan giữa logarit khối lượng phân tử protein và thể tích rửa giải (Ve) trong sắc ký lọc gel 38

3.1.4 Xác định khối lượng phân tử hợp chất liên hợp trong phản ứng Pegyl hóa bằng sắc ký lọc gel 42

3.1.5 Xác định hiệu quả hình thành sản phẩm trong các mẫu phản ứng 43

3.2 Ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới hiệu suất hình thành và khả năng phân tách Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel 45

3.3 Tinh chế hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG dạng bột đông khô 47

3.4 Đánh giá độ bền của Oxytocintrong phân tử Oxytocin-PEG 48

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 51

4.1.Về phản ứng gắn kết tạo phức hợp Oxytocin-PEG 51

4.2 Xác định khối lượng của sản phẩm Oxytocin-PEG sau phản ứng liên hợp 52

4.3 Về đánh giá hiệu quả hình thành và phân tách hợp chất liên hợp từ phản ứng 53 4.4 Đông khô Oxytocin-PEG ở dạng bột 53

4.5 Về đánh giá độ bền của Oxytocin và Oxytocin-PEG trong các dịch sinh học giả 54

KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APS: Ammonium persulfate

Asn5: acid amin Asparagine ở vị trí số 5

Cys1: acid amin Cysteine ở vị trí số 1

Cys6: acid amin Cysteine ở vị trí số 6

D: Độ hấp thụ quang

DCC: Dicyclohexyl carbodiimide

DNA: Deoxyribonucleic acid

DTT: dithiothreitole

FDA: Food and drug Administation

Gln4: acid amin Glutamine ở vị trí số 4

Gly9: acid amin Glycine ở vị trí số 9

mPEG aldehyde: Methoxy polyethylen propion glycol

NHS: N-Hydroxysuccinimidyl

PEG: Polyethylen glycol

Pegyl hóa: Thực hiện gắn kết polyethylene glycol

SDS: Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE: điện di trên gel polyacrylamide sử dụng Sodium dodecyl sulfate TEMED: tetramethylenediamine

Tris: tris(hydroxylmethyl)aminomethane

Tyr2: acid amin Tyrosine ở vị trí số 2

UV: Ultraviolet

Ve: thể tích rửa giải

VR: các phân đoạn rửa giải

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo không gian của Oxytocin 2

Hình 1.2 Sự hình thành disulfid từ Oxytocin 4

Hình 1.3 Cấu trúc của desamino-oxytocin và carbetocin 5

Hình 1.4 Các liên kết vào cầu nối disulfid trên Oxytocin 6

Hình 1.5 Protein đƣợc Pegyl hóa 11

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của những dẫn chất PEG hoạt hóa dùng cho phản ứng Pegyl hóa vào nhóm amin 12

Hình 1.7 Phản ứng của NHS ester và một peptid 15

Hình 1.8 Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff 16

Hình 1.9 Liên hợp với các nhóm Cacboxylic 16

Hình 1.10 Gắn hợp chất dibromo và dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid 17

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 23

Hình 2.2 Gắn mPEG aldehyd vào phân tử Oxytocin 25

Hình 2.3 Nguyên tắc của phản ứng liên hợp 26

Hình 3.1 Kết quả điện di ở pH 7,5 37

Hình 3.2 Kết quả điện di ở pH 4,5 38

Hình 3.3 Đồ thị mật độ quang của các phân đoạn rửa giải dung dịch Insulin 39

Hình 3.4 Đồ thị mật độ quang của các phân đoạn rửa giải dung dịch Chymotrypsin 39

Hình 3.5 Đồ thị mật độ quang của các phân đoạn rửa giải dung dịch Casein 40

Hình 3.6 Đồ thị mật độ quang của các phân đoạn rửa giải dung dịch Oxytocin 40

Hình 3.7 Đồ thị hồi quy tuyến tính giữa logMW và Ve 41

Hình 3.8 Biểu đồ mật độ quang các phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG aldehyd ở pH 4,5 42

Hình 3.9 Biểu đồ mật độ quang các phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG aldehyd với pH 7,5 43

Hình 3.10 Bột đông khô Oxytocin-PEG 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các sản phẩm Pegyl hóa đã sử dụng trên thị trường 14

Bảng 2.1 Các dung dịch đệm dùng trong nghiên cứu 23

Bảng 3.1 Tổng hợp kết quả rửa giải các protein bằng phương pháp lọc gel 41

Bảng 3.2 Mật độ quang (D) của các phân đoạn lọc gel với phản ứng pH 4,5 43

Bảng 3.3 Mật độ quang (D) của các phân đoạn lọc gel với phản ứng pH 7,5 44

Bảng 3.4 Lượng sản phẩm liên hợp thu được trong dung dịch sau lọc gel 44

Bảng 3.5 Mật độ quang các phân đoạn rửa giải phản sau sắc ký lọc gel 45

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng với tỷ lệ Oxytocin-PEG hình thành trong các phân doạn sau lọc gel 46

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi dạng bột đông khô hợp chất Oxytocin-PEG 47

Bảng 3.8 Tỷ lệ thu hồi dạng bộc đông khô và lượng Oxytocin-PEG trong dung dịch sau lọc gel 48

Bảng 3.9 Độ hấp thụ ánh ở bước sóng 280mm của dịch ruột chứa Oxytocin và Oxytocin-PEG 48

Bảng 3.10 Độ hấp thụ ánh ở bước sóng 280nm của dịch dạ dày giả chứa Oxytocin và Oxytocin-PEG 49

Bảng 3.11 Độ hấp thụ ánh ở bước sóng 280nm của dịch nước bọt Oxytocin và Oxytocin-PEG 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Oxytocin là một hormon peptid nội sinh của thùy sau tuyến yên Ngày nay, người ta đã tổng hợp được nó bằng con đường tái tổ hợp để làm thuốc phổ biến được sử dụng trong sản khoa Với chỉ định quan trọng là thúc đẻ và cầm máu sau sinh Trong cơ thể, Oxytocin bị phá hủy nhanh bởi enzym peptidase nên thời gian bán thải là 5 phút, gây khó khăn khi sử dụng với tác dụng cầm máu hoặc dự phòng chảy máu sau sinh [2] Các nhược điểm khác trong sử dụng Oxytocin như gây đau khi tiêm bắp, sử dụng liều cao và khó kiểm soát tốc độ tiêm hoặc truyền tĩnh mạch trong điều trị Khi sử dụng đường uống Oxytocin bị phá hủy hoàn toàn trong đường tiêu hóa [1]

Polyethylen glycol (PEG) có kích thước phân tử từ 500 Da đến 20 kDa Với các đặc điểm trung tính, thân nước, không gây độc PEG đã được FDA (Mỹ) cho phép dùng làm tá dược của nhiều loại thuốc tiêm và thuốc uống [5], [70] PEG đang được các nhà khoa học sử dụng để bảo vệ cấu trúc protein, khắc phục một số nhược điểm khi sử dụng các protein này làm thuốc điều trị trên lâm sàng

Kỹ thuật Pegyl hóa protein giúp gắn các phân tử PEG vào phân tử protein thuốc mang lại một số ưu điểm như: làm tăng độ bền phân tử cho các protein thuốc, kéo dài tác dụng giảm liều điều trị [22], [41]

Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh Pegyl hóa Oxytocin làm tăng

độ bền phân tử trong điều kiện bảo quản, kéo dài thời gian tác dụng giúp làm giảm liều dùng Oxytocin được Pegyl hóa đang được đánh giá ứng dụng làm thuốc có tác dụng kéo dài Để sử dụng an toàn hơn trên các bệnh nhân dự phòng hoặc cầm máu sau sinh, khi phải dùng với liều cao và thời gian kéo dài hơn [41]

Để thực hiện được kỹ thuật Pegyl hóa vào việc cải biến Oxytocin dược dụng ở Việt Nam Đồng thời, đánh giá được khả năng làm tăng độ bền phân tử

của Oxytocin trong các dịch sinh học trên invitro, góp phần nhằm thay đổi

đường dùng của Oxytocin, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo sản phẩm liên hợp Oxytocin - PEG để làm thuốc có khả năng bảo vệ được Oxytocin trong đường tiêu hóa” với các mục tiêu sau:

1 Tạo được phức hợp Oxytocin-PEG và xác định hiệu quả hình thành

2 Phân tách và đánh giá được độ bền của protein trong phân tử

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 OXYTOCIN

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo và tính chất

Oxytocin là hormon hậu tuyến yên có công thức phân tử C43H66N12O12S2, phân tử lượng 1007 Da Cấu tạo phân tử là một polypeptid vòng:

S S

H2N-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 Cấu tạo không gian [32]:

Hình 1.1 Cấu tạo không gian của Oxytocin

Oxytocin được Henry Hallett Dale phát hiện lần đầu tiên vào năm 1906 Trong các cơn co thắt có sự giải phóng của nó ra khỏi tuyến yên Cho tới những năm 1950 nghiên cứu của Vincent du Vigneaud đã làm sáng tỏ cấu trúc của Oxytocin Ngay sau đó Oxytocin được tổng hợp về mặt sinh học và là polypeptid đầu tiên được tổng hợp và đoạt giải Nobel năm 1955 về hóa học

Với cấu trúc của protein bậc I, phân tử Oxytocin có chứa các liên kết peptid của các acid amin và một cầu nối disulfur trong phân tử Giữa các phân tử còn liên kết với nhau bằng các liên kết hydro hay liên kết ion Cách sắp xếp của acid amin trong chuỗi polypeptid quyết định cấu trúc không gian và tính chất sinh học của Oxytocin [9]

Các liên kết trong phân tử Oxytocin đều là liên kết yếu Khi tiếp xúc với

các yếu tố tấn công của môi trường (pH, nhiệt độ…) các liên kết này sẽ dễ bị phá vỡ, làm thay đổi cấu trúc ban đầu của Oxytocin Do đó, cần có biện pháp thích hợp bảo vệ cấu trúc để tăng hiệu quả điều trị mong muốn của thuốc

Oxytocin cũng là những hormon đầu tiên được tổng hợp thành công với

các tính chất hóa dược với các tính chất:

- Oxytocin là bột vô định hình trắng hoặc gần như trắng

- Dễ hút ẩm, rất dễ tan trong nước, trong acid acetic và ethanol [9]

1.1.2 Tác dụng dược lý của Oxytocin

- Trên cơ tử cung: làm tăng co bóp cơ trơn tử cung theo nhịp, tần số và cả biên độ co bóp sinh lý Tính cảm thụ của cơ trơn tử cung với Oxytocin tăng dần trong suốt thời kỳ có thai, phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của Estrogen [1]

Receptor của Oxytocin trên tử cung người đã được xác định Khi gắn với Oxytocin, các receptor sẽ hoạt hóa phospholipase C làm giải phóng Ca++ nội bào đồng thời gây khử cực kênh Ca++

nhạy cảm với điện thế, làm tăng nhập Ca++ vào

tế bào Do đó, Oxytocin thể hiện tác dụng đôi là điều hòa sự co bóp của các tế bào cơ tử cung và kích thích tế bào nội mạc, tế bào màng rụng sản xuất prostaglandin [19]

Sự co lại của tử cung: Oxytocin gây co thắt trong giai đoạn sau của chuyển dạ, rất cần thiết đối với sự giãn nở cổ tử cung trước khi sinh Việc phóng thích Oxytocin trong thời gian cho con bú gây ra những cơn co thắt nhẹ nhưng thường đau trong vài tuần đầu của chu kỳ sữa Điều này cũng giúp phục hồi tử cung với tác dụng làm đông máu và giảm đái tháo đường sau sinh [40]

- Với sự chuyển tiếp từ vùng dưới đồi qua thần kinh cột sống đến tuyến

vú sẽ làm tăng bài xuất sữa khi trẻ sơ sinh bú Sự kích thích gây ra ở nơron tạo Oxytocin từ các đầu cuối sợi thần kinh thần kinh của tuyến yên [15]

- Trên hệ tim mạch: Ở mức liều gây co bóp tử cung chưa đủ ảnh hưởng đến huyết áp Ở mức liều cao gây giãn mạch rõ ràng và tạm thời làm hạ huyết

áp, tăng nhịp tim do phản xạ và nóng mặt Oxytocin và thụ thể của nó cũng được tìm thấy trong tim ở một số loài gặm nhấm, và hormon này có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi của tim bằng cách thúc đẩy sự biệt hóa về

mô tim Tuy nhiên, sự vắng mặt của Oxytocin hoặc thụ thể của nó ở chuột nhắt không gây ra tình trạng thiếu máu tim [40]

- Điều chỉnh hoạt động của tuyến thượng thận - tuyến yên - thận:

trong những trường hợp đó có thể coi nó là một chất đối kháng của vasopressin Oxytocin có tác dụng chống bài niệu nhẹ

1.1.3 Sự kém bền của phân tử Oxytocin trong chế phẩm thuốc

Một vấn đề lớn trong sử dụng các chế phẩm dạng dung dịch chứa Oxytocin để điều trị là độ bền hạn chế của nó trong các dung dịch này Các chế phẩm chứa Oxytocin thường kém ổn định trong bảo quản Ở nhiệt độ cao, Oxytocin sẽ mất hoạt tính sinh học để làm thuốc Để đảm bảo độ bền của phân

tử Oxytocin và tác dụng của nó trong chế phẩm dạng tiêm (dung dịch nước) cần bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80

C Thời hạn sử dụng của chế phẩm Oxytocin bảo quản dưới 80

C là 2 năm còn đối với chế phẩm được bảo quản trong điều kiện không làm lạnh (dưới 250 C) ít hơn 6 tháng [30], [75]

Nguyên nhân của vấn đề trên là sự biến đổi về cấu trúc Oxytocin, hay xảy

ra ở một số vị trí trên cấu trúc peptid dễ bị phá hủy [33], [75] Các acid amin Cys1, Gln4, Asn5 và Gly9 đều dễ bị oxy hóa, thủy phân trong môi trường acid, nhiệt độ và ánh sáng thông qua sự hình thành các chất trung gian Đây là các acid amin có chứa N bậc một dễ tham gia các phản ứng hóa học hay thủy phân trong môi trường phân ly và điều kiện không phù hợp [37], [47]

Mặt khác, liên kết disulfid Cys1

-Cys6 cũng là vị trí hay gây ra sự biến đổi cấu trúc, đa số các quá trình biến đổi này xảy ra sau khi loại bỏ liên kết ở cacbon

β ở Cys1, tạo ra enamin N và cysteine persulfid Tạo điều kiện cho sự hình thành trisulfid và tetrasulfid Oxytocin hoặc thúc đẩy sự hình thành dimer Oxytocin và các sản phẩm khác [68]

Hình 1.2 Sự hình thành disulfid từ Oxytocin

1.2 PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN CỦA PHÂN TỬ OXYTOCIN

1.2.1 Tạo các chất có tác dụng tương tự Oxytocin

Các chất có ái lực trên cùng một thụ thể với Oxytocin thông dụng nhất là desamino-oxytocin và carbetocin, tác dụng trên cùng receptor với Oxytocin và

gây ra các cơn co thắt cùng một cơ chế Cả hai carbetocin và desamin-oxytocin đều có thời gian bán thải trong máu cao hơn nhiều so với Oxytocin do sự thay đổi cấu trúc [23],[36] Desamino-oxytocin và carbetocin khác với Oxytocin do thiếu nhóm amino tự do ở cuối Mặt khác phân tử carbetocin cũng thay thế một trong số các sulfur tại cầu disulfid bằng các nhóm CH2

Hình 1.3 Cấu trúc của desamino-oxytocin và carbetocin

Việc tăng thời gian bán thải và duy trì tác dụng co hồi tử cung của hai chất tương tự Oxytocin này, cho thấy nhóm amin cuối trong Oxytocin không cần thiết cho hoạt động sinh học và làm giảm sự bền vững của nó trong huyết tương Cầu nối disulfid cũng không ảnh hưởng đến tác dụng mà ảnh hưởng tới độ bền vững của Oxytocin Đối với carbetocin, tăng thời gian bán thải từ 4 đến 10 lần

so với Oxytocin, nên chỉ dùng một lần tiêm thay vì truyền kéo dài Carbetocin được chấp thuận cho sử dụng trong y tế và thú y thay thế Oxytocin [56]

1.2.2 Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfid trên Oxytocin

Là vị trí hay xảy ra thoái hoá trên phân tử Oxytocin, liên kết disulfid đã được nghiên cứu nhiều nhằm thay thế liên kết này bằng các nhóm nguyên tử khác bền vững hơn Mục đích để tránh sự loại bỏ liên kết trong cacbon β ở Cys

ở vị trí 1 và liên kết disulfid Cys1

-Cys6 không phải là vị trí liên quan trực tiếp với thụ thể, nên không làm mất tác dụng sinh học của Oxytocin[68]

Đã được đánh giá vào những năm 1960 và 1970, để xác định hoạt tính có được duy trì hay không nếu một hoặc cả hai thiol trong liên kết disulfid được thay đổi thành các nhóm CH2, như trong carbetocin [17],[62] Kết quả thu được cho thấy hoạt tính quan sát được giảm không đáng kể Nguyên nhân được xác

cầu nối disulfid không phải là một điều kiện tiên quyết cho việc duy trì hoạt động sinh học của Oxytocin

Các nghiên cứu gần đây của Alewood và các đồng nghiệp đã tập trung vào việc thay thế disulfid bằng các cầu thioether, selenylsulfid, diselenid và ditellurid, và tổng hợp được nhiều chất tương tự Oxytocin đã làm thay đổi liên kết disulfid Tiếp tục đánh giá hoạt tính tại thụ thể cũng như sự thay đổi tính ổn định chuyển hóa trong huyết tương của các chất này[27], [52]

Hình 1.4 Các liên kết vào cầu nối disulfid trên Oxytocin [52]

Các chất tương tự Oxytocin, với sự thay thế cầu nối disulfid được nghiên cứu tác dụng trên thụ thể và sự ổn định huyết tương của Alewood Kết quả cho thấy sự giảm kích thước vòng ([-S] -OT) làm giảm đáng kể (1000 lần) ái lực tại thụ thể do đó giảm hoạt động sinh học Nếu thay thế nguyên tử S trong cysteinbằng CH2 (-[CH2-S ] -OT) duy trì ái lực và hoạt động Việc thay thế cystein bằng selenocystein hoặc tellurocystein không có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học, nhưng lại giảm 10 lần lực liên kết trong phân tử khi thay thế cả hai hoặc chỉ thay thế một cystein [52]

1.2.3 Tạo hệ đệm chứa ion kim loại trong chế phẩm thuốc

Oxytocin được biết đến là ổn định nhất ở pH hơi acid (pH ~ 4.5) Ở pH có

độ acid cao (pH <3), peptid sẽ thủy phân Nghiên cứu của Avanti đánh giá ổn định của dung dịch Oxytocin trong nước bằng cách sử dụng hệ đệm để lưu trữ (citrat, axetat hoặc aspartat, pH 4,5) kết hợp với các ion kim hóa trị I (Na+

40C, tuy nhiên sự cải thiện ở nhiệt độ cao không đáng kể Sử dụng ion kim loại hóa trị hai và dung dịch đệm citrat được xác định cải thiện đáng kể sự ổn định ở nhiệt độ cao (550 C), với nồng độ ion kim loại khoảng 2 mM [25] Kết quả tương

1.2.4 Chế phẩm dạng bột đông khô

Phương pháp tiếp cận khác được đánh giá để tăng sự ổn định nhiệt cho các chế phẩm chứa Oxytocin là tạo ra chế phẩm ở dạng bột khô để sử dụng qua đường hô hấp thay cho đường truyền tĩnh mạch thông thường Oxytocin có thể được sấy khô ở dạng bột siêu mịn hoặc ở dạng tiểu phân nano Vị trí hấp thu của

nó trong đường hô hấp nhằm giải quyết sự kém bền trong dung dịch Nghiên cứu của Mc Intosh xác định các thành phần chế phẩm bao gồm hỗn hợp glycine, leucine và mannitol tạo các hạt có kích thước từ 1 đến 5 μm [58]

Công thức trên đã chứng minh hiệu quả trong nghiên cứu kết hợp mô cơ thể ex-vivo (mẫu tử cung của con người và bò cái), với kết quả tương đương ở dạng khô phun so với peptid tự nhiên và không gây tác dụng co bóp ở mô khí quản Công thức này duy trì ổn định ở nhiệt độ thử nghiệm khá cao (500

C) [43]

1.2.5 Nghiên cứu gắn phân tử polyethylen glycol vào protein và Oxytocin

* Các nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về PEG hóa protein đã được quan tâm từ rất lâu Đến hiện nay, các tác giả ngày càng quan tâm nhiều hơn đến lĩnh vực này đặc biệt là các ứng dụng trong ngành Dược và sản phẩm nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc

Ranganath năm 2015, đã nghiên cứu so sánh tác dụng của interleukin-6

và hợp chất Pegyl hóa interleukin-6 (Peginterleukin-6) Kết quả cho thấy Peginterleukin-6 có tác dụng của interleukin-6 và kéo dài thời gian bán thải ở loài gặm nhấm và khỉ Một peptid có chứa một glycol polyethylene glycol (PEG) 40 kDa và interleukin-6 có thời gian bán thải kéo dài 23 và 36 giờ thử

tiếp cận mới để kích thích tín hiệu gây ra bởi IL-6 và biểu hiện liên quan đến sinh lý bệnh [71]

Kletzl và cộng sự đã thử nghiệm năm 2017 tác dụng Insulin tái tổ hợp bằng PEG trên 62 tình nguyện viên Kết quả cho thấy thời gian bán thải của thuốc từ 14 - 20 giờ, không xảy ra hạ đường huyết sau sử dụng Sự bài tiết hormon tăng trưởng (GH) bị ức chế khi dùng insulin, trong khi isulin tái tổ hợp chỉ làm giảm GH khiêm tốn ở liều cao nhất [57]

Lee PW, Isarov SA và các cộng sự năm 2017, nghiên cứu đáp ứng miễn dịch với sự liên hợp polymer hòa tan trong nước với protein Phép biến đổi polymer sử dụng methoxypoly ethylene glycol (mPEG) gắn kết với các protein, sản phẩm của quá trình polymer hóa đã chứng minh sự che chắn hiệu quả từ sự nhận biết của các kháng thể [18]

Các nghiên cứu hiện nay tập trung vào xu hướng chính là gắn kết các đại phân tử vào Oxytocin, không chỉ nhằm mục đích cải thiện tính bền vững của phân tử mà còn làm tăng tác dụng và giảm liều sử dụng trong điều trị

Cavallaro và cộng sự sử dụng Oxytocin gắn với hợp chất đại phân tử chứa chất chống oxy hóa [28] N-succinyl-oxytocin đã được chức năng hóa ở amin N-cuối với α, β-poly (N-2-hydroxyethyl)-DL-aspartamid-poly (ethylene glycol)

2000 (PHEA- PEG2000) kết quả tổng hợp được PHEA-PEG2000- succinyl Các nghiên cứu thủy phân trên in vitro cho thấy hợp chất trên ổn định

oxytocin-ở pH 7,4 và trong huyết tương, các đánh giá hoạt tính tế bào trong ống nghiệm cho thấy việc kết hợp Oxytocin với thụ thể cải thiện hơn so với chất ban đầu

Các hướng nghiên cứu sử dụng β-cyclodextrin, oligosaccharide cyclic liên hợp với Oxytocin bằng cách sử dụng hợp chất cacboxy cầu nối (kích hoạt bằng 1-hydroxybenzotriazole và dicyclohexylcarbodiimide) Các liên hợp β-CD-OT được đánh giá về hiệu lực trên cơ tử cung Tuy nhiên tác dụng giảm so với Oxytocin, mặc dù vẫn tạo các cơn co thắt ở nồng độ dưới μM Tác dụng phụ gây

ra các cơn hen và được sử dụng làm với các chỉ định khác [21]

Một hướng khác Hudnut và Cook sáng chế vào năm 2004 kết hợp Oxytocin (và một số chất tương tự) vào các viên nang siêu nhỏ poly (lactic-co-glycolide) [38]

Các nghiên cứu trên đã chứng minh hiệu quả điều trị cũng như tiềm năng của phương pháp Pegyl hóa các protein Để tạo thành các tiền thuốc đưa vào sử dụng trong điều trị bệnh Tuy nhiên, đây là kỹ thuật khó thực hiện và các nghiên cứu PEG hóa Oxytocin mới được thực hiện gần đây Jennifer Collins và nhóm nghiên cứu đã thực hiện tổng hợp PEG hóa Oxytocin và thử một số đặc tính trong bảo quản của nó năm 2016 Kết quả cho thấy lượng Oxytocin còn lại sau

28 ngày ở 500C là 2,5%, trong khi đối với các hợp chất polymer thì 93,5% và 86,5% tương ứng với các phức hợp Oxytocin-NHS và Oxytocin- mPEG còn lại Điều này rất quan trọng trong việc xác định sự phân hủy liên hợp polyme không xảy ra, thay vì nếu các sản phẩm phân huỷ xuất hiện ở một thời gian lưu giữ tương tự của Oxytocin Xác định được độ bền của các sản phẩm PEG hóa Oxytocin trong quá trình bảo quản và tác dụng sinh học của sản phẩm Oxytocin-PEG hóa trên mô phân lập [41]

* Các nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam gần đây đã có một số nhà nghiên cứu quan tâm tới vấn đề Pegyl hóa các protein làm tiền thuốc Nâng cao độ ổn định cũng như tác dụng điều trị của thuốc

Nguyễn Văn Rư (2017) đã lựa chọn được nguyên liệu là Insulin tụy lợn

và mPEG-CHO với điều kiện phản ứng thích hợp (tỷ lệ tối ưu, xúc tác NaCNBH3, pH 4,5 và 30oC), xây dựng được quy trình kỹ thuật đơn giản thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, cho hiệu xuất gắn kết sản phẩm (INB1-mPEG) đạt 96,9 % Đồng thời tinh chế, đông khô được 835 mg INB1-mPEG dạng bột Xác định được khối lượng phân tử của sản phẩm INB1-mPEG là 17,8 kDa, kết quả của một phân tử mPEG aldehyd 12,0 kDa gắn kết vào vị trị -NH2 nhạycảm

ở đầu chuỗi B của một Insulin tự nhiên 5,8kDa Khảo sát được độ bền protein của INB1-mPEG ở 3 môi trường là dịch nước bọt, dịch vị và dịch tụy nhân tạo,

sau 3 giờ sự thủy phân protein trong khoảng 10 - 25% so với sự thủy phân của Insulin tự nhiên là 100% [10]

Nghiên cứu tổng hợp Oxytocin-PEG hiện chưa có nghiên cứu được thực hiện tại Việt Nam Các nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện tổng hợp Oxytocin-PEG và thử nghiệm các đặc tính trong bảo quản Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài này

1.3 PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA PROTEIN DÙNG LÀM THUỐC

1.3.1 Polyethylen glycol

Polyethylen glycol (PEG) là hợp chất cao phân tử có công thức cấu tạo

PEG là một polyme trơ, hòa tan trong nước, không gây độc, không gây đáp ứng miễn dịch khi vào cơ thể, được tạo ra bằng cách liên kết nối nhiều tiểu đơn vị ethylen oxid Các phân tử PEG hiện có khác nhau về hình thể (ở dạng thẳng hoặc phân nhánh) và trọng lượng phân tử thường từ 500 Da-20.000 Da PEG có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ có đặc tính sinh lý khác nhau Thí dụ như PEG ở dạng tinh khiết, không kết hợp, nhỏ là dạng dầu (ví dụ PEG 200), trong khi PEG lớn hơn (ví dụ PEG 8000) ở dạng rắn như sáp

PEG là chất lý tưởng để sử dụng trong y học và công nghệ dược phẩm với nhiều ứng dụng khác nhau Tuy nhiên, ảnh hưởng lớn nhất của PEG trong y học bắt nguồn từ việc sử dụng những thuốc có nguồn gốc từ protein được biến đổi từ quá trình Pegyl hóa [29],[76]

1.3.2 Phương pháp Pegyl hóa protein dược dụng

Pegyl hóa được Frank Davies, Abraham Abuchowsky và các đồng nghiệp thực hiện thành công lần đầu tiên vào thập niên 70 khi nghiên cứu sự gắn kết PEG với albumin huyết thanh, catalase [28] Từ đó công nghệ Pegyl hóa được thiết lập và phát triển

Pegyl hóa là quá trình gắn PEG vào nhiều loại đối tượng khác nhau như chuỗi polypeptid, protein, tế bào và nhiều loại vật liệu có chức năng sinh học

khác để cải thiện đặc tính và hiệu quả điều trị [69] Bản chất quá trình Pegyl hóa

là tạo liên kết đồng hóa trị của phân tử PEG với phân tử tham gia liên kết [67]

Hình 1.5 Protein được Pegyl hóa

* Nguyên lý của phương pháp Pegyl hóa protein dược dụng

Để gắn kết PEG với 1 phân tử, cần thiết phải hoạt hóa PEG bằng cách tạo

ra các dẫn chất có một nhóm chức năng ở một hoặc cả 2 đầu của phân tử PEG Việc chọn nhóm chức năng dựa trên loại nhóm có khả năng phản ứng sẵn có trên phân tử sẽ Pegyl hóa Đối với Pegyl hóa protein, các acid amin thường có khả năng phản ứng gồm: lysin, cystein, histidin, arginin, acid aspetic, acid glutamic, serin, threnin, tyrosin, đầu N-tận (α-NH2) và đầu C-tận (-COOH) [62] Tuy nhiên, cách thức phổ biến nhất tạo liên kết PEG-protein là hoạt hóa PEG với nhóm chức năng thích hợp cho phản ứng với lysin (-NH2) và đầu N-tận (α-NH2) [25], [62] Trong trường hợp này, PEG có thể được hoạt hóa bằng nhiều con đường biến đổi hóa học khác nhau như hình 1.6 [69]

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của những dẫn chất PEG hoạt hóa dùng cho

phản ứng Pegyl hóa vào nhóm amin

(a) là dichlorotriazin, (b) tresylat, (c)aldehyd, (d) succinimidyl succinat, (e) PEG-imidazol carbonat, (f) PEG-phenyl carbonat, (g) PEG-succinimidyl carbonat, (h) PEG-benzotriazol carbonat và (i) PEG hoạt hóa kiểu ester

Dẫn chất PEG hoạt hóa phản ứng với protein trong những điều kiện xác định để tạo ra liên kết protein-PEG Nguyên lý tổng quát của phản ứng này nhƣ sau:

P H C

O

C H

Trong đó: R1 là nhóm thế, R2 là nhóm chức tham gia liên kết, R3 là liên kết

 Ưu nhược điểm của protein được Pegyl hóa (protein-PEG)

Trong Pegyl hóa protein dƣợc dụng, những đặc tính đặc biệt của PEG làm thay đổi một số đặc điểm của phân tử protein nhƣ: sự thay đổi về hình thể, tính tan, sự đáp ứng miễn dịch… [69] Điều này tạo nên những ƣu điểm của protein-PEG nhƣ sau:

- Các nhóm hydroxyl của PEG kéo các phân tử nước của môi trường vào hợp chất, làm tăng quá trình solvat hóa của protein Mặt khác, PEG còn có phần hữu cơ nên làm tăng khả năng hòa tan của protein trong nhiều dung môi phân

cực và không phân cực Như vậy, Pegyl hóa làm tăng độ hòa tan và tính linh

động của protein trong máu và các dịch sinh lý Do đó hiệu quả điều trị của

thuốc protein-PEG cao hơn so với sử dụng protein tự nhiên với hàm lượng tương tự [69]

- Trong môi trường lỏng, một tiểu đơn vị ethylen oxid kết hợp khá bền vững với 2-3 phân tử nước, như vậy chuỗi polymer sẽ di động và chính sự di động này làm phân tử PEG có thể tích quét (chiếm chỗ) lớn, tạo khoảng không giữa protein với môi trường Do đó, protein được bảo vệ tránh khỏi hiện tượng tiêu hủy do các tác nhân hóa lý (nhiệt độ, pH…), các enzyme tiêu hóa protein, các đại thực bào và các kháng thể, tránh được sự nhận diện của các tế bào miễn dịch

Bởi vậy, độ ổn định của protein được cải thiện [29],[69]

- Thể tích quét làm cho protein Pegyl hóa tác dụng gấp 5-10 lần một protein

hòa tan có trọng lượng phân tử tương tự Sự gia tăng thể tích này làm tăng

cường tác dụng dược động học và dược lực học của protein-PEG [29]

- Sự kết hợp giữa PEG với các phân tử nước gây khó khăn cho hệ thống miễn dịch trong việc nhận biết PEG là vật lạ Khi phân tử protein gắn kết với chuỗi PEG lưu hành trong máu cũng sẽ không bị hệ thống miễn dịch nhận biết là

vật thể lạ Như vậy, PEG có thể làm giảm tính sinh miễn dịch của protein[29]

- PEG làm tăng kích thước phân tử protein, giúp phân tử protein-PEG khó

lọt qua mao quản thận hơn Do vậy việc thải trừ thuốc khỏi thận bị giảm xuống,

hợp chất được giữ lại trong cơ thể lâu hơn [69]

Những ưu điểm kể trên của thuốc được Pegyl hóa làm tăng hiệu quả điều trị của thuốc; làm giảm liều dùng, tăng khoảng liều đưa thuốc vào cơ thể dẫn đến việc sử dụng các thuốc có nguồn gốc protein được thuận lợi hơn

Hợp chất protein-PEG cũng có những nhược điểm PEG bảo vệ cấu trúc protein, và trong một số trường hợp nó “che kín” cả trung tâm hoạt động và vị trí kết hợp với receptor, ngăn cản thuốc liên kết với receptor Điều này làm giảm

hoặc thậm chí mất tác dụng của thuốc Khắc phục nhược điểm này bằng việc điều chỉnh thay đổi vị trí Pegyl hóa ra xa phần hoạt động của protein [69]

 Hiện nay FDA chấp nhận các hợp chất được Pegyl hóa

Kể từ khi giới thiệu các chất gắn kết cộng hóa trị của PEG với protein, đã

có nhiều báo cáo về sự gắn kết Pegyl với các protein khác nhau và ứng dụng trong điều trị Phương pháp Pegyl hóa đã có thể cải thiện một loạt các đặc tính cho phân tử sinh học bao gồm cả tác dụng dược lý Kết quả là một số protein Pegyl hóa nhận được sự chấp thuận của Tổ chức Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) Mỹ Hiện nay đang có nhiều nghiên cứu khác và các thử nghiệm lâm sàng tìm kiếm sự chấp thuận của FDA Thống kê đến năm 2011 về các sản phẩm Pegyl hóa được FDA cho phép sử dụng trên thị trường, cho thấy triển vọng của lĩnh vực Pegyl hóa protein [12]

Bảng 1.1 Các sản phẩm Pegyl hóa đã sử dụng trên thị trường [12]

His

His

Phe

134)

1.4 PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA OXYTOCIN

1.4.1 Gắn kết vào các nhóm amin của Oxytocin

Các amin bậc một trong các acid amin Cys1, Gln4, Asn5 và Gly9 đều dễ bị oxy hóa và thủy phân trong môi trường acid, nhiệt độ và ánh sáng thông qua sự hình thành các chất trung gian Đặc biệt là các nhóm ở đầu cuối trong các acid amin Cys1 và Gly9, chúng dễ tham gia các phản ứng hóa học hay thủy phân trong môi trường phân ly và điều kiện không phù hợp [37], [47] Đây cũng là nguyên nhân chính của sự biến đổi về cấu trúc Oxytocin, làm mất tác dụng của

nó Do đó, bảo vệ các nhóm amin này có tác dụng quan trọng trong bảo vệ cấu trúc và tác dụng của Oxytocin

- Este hóa với N-Hydroxysuccinimidyl (NHS)

Sử dụng N-Hydroxysuccinimidyl (NHS) nhằm este hóa gốc amin của Oxytocin Đây là phương pháp liên hợp được sử dụng nhiều nhất để liên hợp các nhóm amin Các thuốc thử NHS este phản ứng với các nucleophil (như amin nucleic), với việc giải phóng N-hydroxy succinimid dẫn đến liên kết amid ổn định với peptid hoặc protein [32]

Hình 1.7 Phản ứng của NHS ester và một peptid

Tuy nhiên, chất phản ứng NHS bị thủy phân nhanh trong nước dẫn đến khó khăn trong hình thành nhóm succinimidyl ester, với thời gian bán thải giảm đáng kể khi gia tăng pH Bằng cách thêm một nhóm sulfonat, phản ứng xảy ra chậm, làm tăng khả năng hòa tan trong nước, cho phép phản ứng ghép được thực hiện trong điều kiện nước tạo Sulfonat NHS este Cũng có báo cáo rằng thuốc thử succinimidyl có thể không phản ứng với các amin cụ thể, đặc biệt phản ứng với các amin acid như tyrosin, histidin và serin [22], [31], [48]

- Sử dụng PEG aldehyd

Các PEG aldehyd dễ dàng phản ứng với các nhóm amin, ban đầu thông qua sự hình thành các sản phẩm của imin (Schiff base) Các bazơ Schiff có khả

năng đảo ngược dễ dàng thành các amin bậc hai ổn định trong dung dịch có một tác nhân khử như natri borohydrid (NaBH4) hoặc natri cyanoborohydrid (NaCNBH3), quá trình này được gọi là amination khử NaCNBH3 thường được

ưa chuộng hơn do làm phản ứng xảy ra nhanh hơn và có chọn lọc làm giảm hợp chất trung gian Schiff và không làm giảm aldehyd hoặc cacbonyl ít phản ứng khác có trong dung dịch [53], [58]

Hình 1.8 Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff

pH là yếu tố rất quan trọng trong quá trình tổng hợp, trong đó tác nhân khử imin thành amin (NaCNBH3) tốt nhất ở pH 6,5-8,5 Mặc dù điều chỉnh pH đến điều kiện acid nhẹ (pH 4,5) là điều kiện phản ứng thích hợp của aldehyd và amin, cho phép sự kết hợp chọn lọc của amin đầu và cuối [22], [46]

- Acid cacboxylic

Sự liên kết của các nhóm carboxylat với các amin để tạo thành các liên kết amit Sử dụng các hợp chất carbodiimid như 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid.HCl (EDC) hoặc dicyclohexylcarbodiimid (DCC) kích hoạt các nhóm carboxyl để thay thế bằng các amin phản ứng [58]

Hình 1.9 Liên hợp với các nhóm Cacboxylic

Phản ứng qua trung gian carbodiimid giữa nhóm amin và các chất phản ứng có nhóm acid carboxylic Phản ứng xảy ra trong pH acid làm giảm độ bền của protein nên hiệu suất thấp cũng như ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm sau phản ứng tổng hợp [58]

1.4.2 Gắn kết vào cầu nối disulfid của Oxytocin

Việc tác động vào cầu nối disulfid không phải lúc nào cũng thuận lợi để tăng lực liên kết disulfid trong protein hoặc peptid, vì nó là yếu tố quan trọng để duy trì cấu trúc của protein hoặc tác dụng sinh học Gần đây đã có một số

phương pháp liên hợp được báo cáo cho phép bảo tồn được cầu nối disulfid với

2 hoặc 3 cầu disulfid cacbon và ít gây ra những thay đổi trong cấu trúc của protein và peptid [64], [68]

- Sử dụng dibromo hoặc dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid

Dibromomaleimid là chất khá phù hợp để tạo phức hợp với Oxytocin tại cầu nối disulfid, bằng cách chèn thêm một cầu nối vào disulfid [63] Phức hợp này trong các điều kiện thử nghiệm invitro giải phóng ra và bảo tồn cấu trúc Oxytocin Mặt khác, phức hợp này làm tăng độ bền của phân tử Oxytocin Sử dụng Dibromomaleimid để Pegyl hóa là một chất phản ứng thuận lợi nhưng khó khăn trong giải phóng disulfid từ phức hợp PEG với của protein [55]

Hình 1.10 Gắn hợp chất dibromo và dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid

Phương pháp tạo cầu nối disulfid của Oxytocin được mở rộng khi tạo phức với hợp chất dithiomaleimid, phản ứng xảy ra tương tự với quá trình tạo phức hợp của dibromomaleimid với Oxytocin [44], [61]

- Phức hợp disulfid với các hợp chất asen

Phương pháp được phát triển gần đây là sử dụng các phân tử PEG có chứa asen làm các chất kết nối với cầu disulfid Các phản ứng dựa vào ái lực của nhóm As (III) với các thiol tạo thành chelat khá chặt chẽ Làm tăng lực liên kết

ở cầu disulfid và tăng độ bền phân tử Oxytocin Đây là phương pháp thay thế cho phương pháp tạo phức với các hợp chất cầu nối dibromo/ dithiomaleimid Các phức hợp arsenic này đã được chứng minh là có thể đảo ngược trong sự hiện diện của các dithiol khác để tạo chelat chéo, như giảm lipoic acid, cho phép

cơ chế giải phóng Oxytocin được thực hiện Tuy nhiên, tác dụng của các hợp chất asen giải phóng trong cơ thể chưa được đánh giá [71]

- Liên hợp cầu nối ba nguyên tử cacbon Vinyl sulfone/ bis-sulfon

Vinyl sulfon là một nhóm các chất phản ứng ở các vị trí đặc biệt Phản

các liên kết β-thioether ổn định [49], [51] Năm 2006 phương pháp chọn lọc để gắn các nhóm vào liên kết disulfid, thông qua liên kết giữa mạch ba carbon dựa trên các phản ứng của thiols với vinyl sulfon [15], [25]

Một chất phản ứng bis-sulfon được tổng hợp có thể được sử dụng để cải tiến peptid tại một vị trí đặc hiệu, và đặc biệt trong trường hợp các liên kết disulfid yếu, theo cách tương tự như dibromo/ dithiophenolmaleimides Sau khi giảm lực liên kết disulfid theo quy trình, việc loại bỏ thêm β'-monosulfon α, β không bão hòa được thực hiện với chất thiol đầu tiên Điều này lần lượt tạo ra một liên kết đôi thứ hai mà có thể trải qua bổ sung khác với thiol thứ hai Sự liên hợp này tạo ra một cây cầu ba cacbon qua vị trí của disulfid giữ lại cấu trúc của peptid và ngăn ngừa làm mất hoạt tính của Oxytocin Đây là một kỹ thuật liên hợp khó thực hiện do kỹ thuật phức tạp, và khó tinh chế được hợp chất tinh khiết sau phản ứng [64]

1.4.3 Một số vị trí liên hợp khác

Ngoài sự liên hợp tại các chức năng amin đầu cuối và disulfid trên các peptid hoặc protein, các acid amin khác cũng có thể là vị trí để cho sự liên hợp Các acid amin hay xảy ra sự liên hợp với các PEG đã được nghiên cứu là tyrosin, tryptophan và histidin so với các acid amin khác (44)

Tyrosin cũng là acid amin được quan tâm nghiên cứu trong chuỗi peptid của Oxytocin nhằm làm tăng độ bền vững của hoạt chất Mannich và cộng sự đã gắm thêm dicarboxylates hoặc dicarboxamides và acid amin này Tuy nhiên, đã không duy trì được tác dụng sinh học của Oxytocin, cho thấy được ý nghĩa sinh học quan trọng của nó trong phân tử Oxytocin [16]

Asparagine trước đây cũng được chú ý, trong các nghiên cứu gắn thêm phenylglyoxal và các chất tương tự, Tuy nhiên, các chiến lược liên hợp Asparagine bị giới hạn bởi khả năng tiếp cận với acid amin này hoặc xảy ra hiện tượng proton hóa ở các pH sinh lý Hiện nay người ta quan tâm hơn tới sự liên hợp phenylglyoxal và các chất tương tự với acid amin lysine

Để liên hợp được vào các acid amin cần có kỹ thuật để tiếp cận vào các trung tâm phản ứng của chúng Việc che chắn làm cho việc tiếp cận vào các

trung tâm phản ứng của các acid amin rất khó khăn Đã có nhiều nghiên cứu phát triển trong lĩnh vực phản ứng liên hợp tiềm năng này [16],[45]

Cystein đã được cải tiến ưu tiên cho phương pháp tiếp cận chọn lọc của các tác nhân liên hợp, làm tăng sự tiện lợi cho một số phản ứng cao kết hợp Ngay cả trong các protein chứa nhiều cystein dư lượng, thường có một lượng nhỏ các sulfhydryl tự do có thể tiếp cận được trên bề mặt protein này Như vậy, cần có một cách tiếp cận cụ thể hơn để có thể phân phối các tác nhân liên hợp với các nhóm amin của các acid amin trong protein [71]

Phương pháp phổ biến nhất hiện nay là liên hợp vào các nhóm amin đầu cuối trên peptid hoặc protein Phương pháp này khá thuận lợi do sự phong phú của nhóm này trong phân tử protein cũng như trên Oxytocin Do sự dễ dàng tiếp cận của các tác nhân liên hợp vào các nhóm amin này trong cấu trúc của phân tử của các protein [71]

1.5 PEGYL HÓA ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÁC DỤNG CỦA OXYTOCIN

Oxytocin được sử dụng chủ yếu cho tác dụng co cơ tử cung để khởi phát chuyển dạ, hoặc để phòng ngừa chảy máu sau sinh Do đó, để đánh giá tác dụng của các hợp chất sau polymer hóa Oxytocin là đánh giá trên hai tác dụng chính này Cơ chế co lại của tế bào ban đầu được kích thích bởi việc kết hợp Oxytocin với thụ thể, tồn tại trên bề mặt của nhiều tế bào bên trong cơ thể (không chỉ trong mô tử cung) Ile3

, Gln4, Pro7 và Leu8 là các acid amin quan trọng cần thiết cho Oxytocin để gắn kết với thụ thể, trong khi Asn5 và Tyr2 rất quan trọng cho

sự kích hoạt dẫn đến tử cung co thắt [33],[72]

Một nghiên cứu phân tích thống kê kiểm tra tác dụng của Oxytocin liên hợp với Methoxy polyethylen glycol aldehyd (mPEG aldehyd) 5 kDa so với Oxytocin về biên độ, tần số và thời gian làm co thắt cơ tử cung Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt giữa tác dụng của hợp chất liên hợp với Oxytocin

tự nhiên [41]

Sự khác biệt quan sát thấy đối với hợp chất liên hợp của Oxytocin với mPEG aldehyd và Oxytocin được xác định sau khoảng 4 phút khi mà Oxytocin tạo ra sự co lại tối đa thì các hợp chất liên hợp chỉ có tác dụng khoảng 61 ± 11%

so với Oxytocin (p <0,05) Xét về biên độ các cơn co thắt ở thời điểm 4 phút, hợp chất liên hợp cho thấy đáp ứng giảm hơn so với Oxytocin đạt 74 ± 8% so với Oxytocin, p <0,05 Sau thời gian hơn 10 phút đƣa vào mô hợp chất liên hợp này cho thấy đáp ứng nhiều hơn so với Oxytocin (178 ± 26%, p <0,05) Điều này cho thấy khả năng hợp chất liên hợp giải phóng dần Oxytocin theo thời gian hoặc kéo dài tác dụng của Oxytocin Kết luận rằng Oxytocin liên hợp với mPEG aldehyd có thời gian tác dụng co thắt cơ tử cung kéo dài hơn so với Oxytocin dƣợc dụng [41]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

Công thức: CH3O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-CHO

Xuất xứ: Đức (hãng sigma aldrich)

Code: JKA3039

* Hóa chất

- Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3), Acrylamid, Bis - acrylamide, Tris(hydroxymehtyl) aminomethan, Sodium dodecyl sulfat, Sephadex G50, chymotrypsin, α - amylase, pepsin, pancreatin, Alpha-lactalbumin, Insulin, Chymotrypsin, Lactoglobulin và Cytochrome C đạt TC DĐVN4

- Hydroxylamin hydrochlorid, acid acetic, ethyl acetat, aceton, toluen, acid chlohydric, ethyl ether, natri hydrocarbonat, natri phosphat, dichloromethan, natri sulfat, ethyl natri sulfat, dicyclohexyl carbodiimid (DCC), kali dihydrophosphat, ammonium persulfat, dithiothreitol (DTT), glycerol, bromophenol blue, glycine, coomassie blue, acid acetic, methanol, natri dihydrophosphat monohydrat, tetramethylethylenediamin (TEMED), natri hydroxyd, natri carbonat được sản xuất tại Trung Quốc

- Cồn tuyệt đối sản xuất tại Việt Nam

2.1.2 Dụng cụ máy móc

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA (Đức)

- Bơm hút chân không KNF (Đức)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Nồi đun cách thủy HH.11-2-II (Trung Quốc)

- Máy đo quang UV- Vis UVD 2950 (Mỹ)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204S (Thụy Sỹ)

- Máy đông khô Christ (Đức)

- Cột sắc ký buret 25ml

- Máy điện di đứng Omni PAGE Mini Wide (Anh)

- Nhiệt kế thủy ngân (Trung Quốc)

- Tủ lạnh Hitachi (Nhật Bản)

- Dụng cụ thủy tinh khô và sạch: bình cầu 1 cổ loại 25ml, 50ml, 100ml; bình cầu 2 cổ loại 50ml; bình cầu 3 cổ loại 100ml, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, đĩa petri, ống nghiệm, đũa thủy tinh, …

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu, phương pháp xử lý số liệu

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Dược, trường Cao đẳng Y tế Thái Nguyên

- Phương pháp xử lý số liệu: số liệu được xử lý trên phần mềm Exel 2010

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tiến hành phản ứng Pegyl hóa Oxytocin, xác định sản phẩm hình thành bằng phương pháp điện di

- Xây dựng phương trình tuyến tính giữa logarit khối lượng phân tử của các protein và thể tích rửa giải của chúng trong sắc ký lọc gel

- Xác định khối lượng phân tử hợp chất Oxytocin đã được Pegyl hóa trong phản ứng bằng sắc ký đồ lọc gel và phương trình tuyến tính

- Đánh giá sự ảnh hưởng pH đến tỷ lệ hợp chất Oxytocin-PEG có trong dung dịch rửa giải sau sắc ký lọc gel so với nguyên liệu tham gia phản ứng

- Xác định ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng đến tỷ

lệ hợp chất Oxytocin-PEG có trong dung dịch rửa giải sau sắc ký lọc gel

- Đông khô dung dịch sau sắc ký lọc gel để thu Oxytocin-PEG ở dạng bột

- Đánh giá độ bền vững của Oxytocin và Oxytocin-PEG hóa trong các dung dịch tương tự như dịch nước bọt, dịch vị và dịch ruột non

2.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.3.2 Pha dung dịch đệm dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.1 Các dung dịch đệm dùng trong nghiên cứu

thu hồi sản phẩm liên hợp

Đông khô Oxytocin-PEG dạng bột

Đo quang ở bước sóng 280 nm

Xác định

độ bền trong dịch

dạ dày giả

Xác định

độ bền trong dịch tương tự nước bọt

Xác định

độ bền trong dịch tương tự ruột non

2 Dung dịch đệm phosphat 0,2 M pH 7,5 Hòa tan 27,22 g kali

dihydrophosphat (TT) trong 930 ml nước Chỉnh pH đến 7,5 bằng dung dịch kali hydroxyd 30 % (TT) và thêm nước vừa đủ 1000 ml [3]

3 Dung dịch đệm 50 mM Tris pH khoảng 8,0 Pha 6,057 gam tris với vừa đủ 1000ml nước [3] Đây là đệm sử dụng làm pha động trong sắc ký lọc gel

4 Dung dịch acrylamide 30% (gồm bis - acrylamide): Acrylamide 60g, bis - acrylamide 1,6g, nước cất vừa đủ 200ml Pha và sử dụng luôn hoặc bảo quản từ 0 đến 40

7 Dithiothreitol (DTT), 1M: Hòa tan 15,45g DTT trong 100ml nước cất

8 Dung dịch nhuộm protein: Comassie blue 0,25 g, Methanol 400 ml, Acid acetic 70 ml, bổ sung nước vừa đủ 1lít

9 Đệm điện di (Tris-Glycine, 0,5% SDS, pH 8,3): Tris base 6 g, Glycine 28,8

g, SDS 5 g Hòa tan trong nước cất vừa đủ 1lít Bảo quản ở 0 -40 C, lấy 1

ml pha với nước cất vừa đủ 10 ml trước khi sử dụng

10 Đệm gel cô Tris HCl, pH 6,8: Tris base 12,12 g, SDS 0,4 g, nước cất 60ml, chỉnh pH 6,8 với HCl 1N, thêm nước cất vừa đủ 100ml Pha và sử dụng luôn hoặc bảo quản từ 0 đến 40

13 TEMED (Tetramethylethylenediamine chất dạng lỏng) với vai trò cùng với APS xúc tác acrylamide tạo polyacrylamide

14 Dung dịch rửa màu (rửa chất nhuộm chỉ có protein bắt màu nhuộm), Methanol 400 ml, Acid acetic 70 ml, nước cất vừa đủ 1 lít

15 Dich dạ dày giả: Hòa tan 2,0 gam Natri Clorid và 3,2 gam Pepsin trong nước, 80 ml dung dịch acid hydrochloric 1 M, nước cất vđ 1000 ml [3]

16 Pha dung dịch NaHCO3 1% Hòa tan 150 mg pancreatin trong vừa đủ 100

ml dung dịch NaHCO3 điều chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaHCO3 [67]

17 Tương tự dịch ruột non có chứa dịch tụy (pancreatin) gồm protease 4±0,5 đơn vị, trong 100 ml với NaHCO3 1%, pH 8,0 [67]

18 Dung dịch đệm phosphat pH 7,0 Hòa tan 28,4 g dinatri hydrophosphat

khan và 18,2 g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 500 ml [3]

19 Tương tự dịch nước bọt: Hút chính xác 0,1 ml α-amylase trộn đồng nhất

trong 100 ml dung dịch đệm phosphat Hút 2 ml dung dịch trên pha loãng

vđ 100 ml đệm pH 7,0 [67]

2.3.3 Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin

* Nguyên tắc: Các mPEG aldehyd liên hợp với Oxytocin trong môi trường acid acetic nồng độ thấp, để tạo thành hợp chất liên hợp polymer hóa hình lược là một base Schiff Sự liên hợp này được thực hiện trong môi trường đệm phosphat ở pH thích hợp Tác nhân khử hóa NaCNBH3 có tác dụng làm giảm polymer trung gian Schiff, tăng hiệu suất tạo thành hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG [41]

- Pha các dung dịch đệm phosphat

- Thực hiện phản ứng: Tỷ lệ phản ứng của Oxytocin/ mPEG aldehyd/ NaCNBH3 là 1: 1: 4 Hòa tan 8,3 mg Oxytocin trong vừa đủ 1 ml dung dịch đệm phophat pH 4,5 Thêm 41,5 mg mPEG aldehyd trong vừa đủ 10 ml dung dịch đệm phophat pH 4,5 đã hòa tan 250 mg NaCNBH3, khuấy đều trong 15 phút Khuấy trộn đều hai dung dịch trên trong vòng 1 giờ trước khi để phản ứng xảy

ra ở 40C trong thời gian 24 giờ (qua một ngày đêm) [65]

- Tiến hành tương tự với các thành phần như phản ứng trên trong dung dịch đệm pH 7,5 Với tỷ lệ phản ứng là 8,1 mg Oxytocin với 40,5 mg mPEG aldehyd

* Kết quả đánh giá sơ bộ bằng cảm quan xác định sự hình thành phức hợp trước khi chạy điện di

Hình 2.3 Nguyên tắc của phản ứng liên hợp

2.3.4 Xác định sự hình thành hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG bằng phương pháp điện di

* Nguyên tắc: Điện di là quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dưới tác dụng của dòng điện Trong quá trình điện di, phân tử tích điện sẽ di chuyển về điện cực có điện tích trái dấu với nó, việc phân tách của các phân tử này là theo khối lượng Một hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và được phân tách [6]

Các phân tử protein, acid nucleic có thể chạy điện di trên một khuôn đỡ như: giấy, cellulose, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel Phương pháp phù hợp để phân tách các protein với khối lượng khác nhau là điện di trên gel

polyacrylamid có sử dụng Sodium dodecyl sulfat (SDS) gọi tắt là SDS - PAGE

SDS - PAGE là một kỹ thuật được sử dụng thường xuyên trong phòng thí nghiệm Với mục đích phân tách các protein dựa trên khối lượng phân tử và tốc

độ di chuyển khác nhau của chúng qua gel polyacrylamide, dưới tác dụng của điện trường một chiều Phương pháp này còn được gọi là phương pháp điện di không liên tục và mẫu protein được gây biến tính SDS là tác nhân làm biến tính

và âm tính hóa protein Khi được xử lý bằng chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disufit là DTT (dithiotheitol) đưa cấu trúc protein bậc 2, 3, 4 về bậc 1 và tích điện âm cho protein, làm cho điện tích phân tử của chúng lớn hơn điện tích có sẵn SDS bám lên protein theo một tỷ lệ ổn định khoảng xấp xỉ 1,4 gam SDS/ 1 gam protein, làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân tử của nó [6], [10]

SDS được thêm vào thành phần gel để duy trì trạng thái biến tính của protein duỗi thẳng, tích điện âm trong suốt quá trình điện di [66]

Yếu tố duy nhất ảnh hưởng tới sự di chuyển của các phân tử protein được biến tính bởi SDS chính là kích thước phân tử của chúng Điện tích của protein không ảnh hưởng tới quá trình điện di, do các phân tử protein đã được tích điện

âm bởi SDS, và điện tích của mỗi protein lại tỷ lệ với khối lượng phân tử của chính nó Dưới tác dụng của điện trường, các phân tử protein đã được biến tính