Nghiên cứu đa hình đơn nucleotid rs7498665 gen SH2B1 và mối tương quan với bệnh béo phì ở người từ 40 64 tuổi tại tỉnh hà nam

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của béo phì Béo phì là kết quả của sự mất cân bằng giữa năng lượng đưa vào cơ thể qua thức ăn và năng lượng tiêu hao qua các hoạt động sống, khi lượng năng lượng c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID

rs7498665 GEN SH2B1 VÀ MỐI TƯƠNG QUAN

VỚI BỆNH BÉO PHÌ Ở NGƯỜI TỪ 40 – 64 TUỔI

TẠI TỈNH HÀ NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID

rs7498665 GEN SH2B1 VÀ MỐI TƯƠNG QUAN

VỚI BỆNH BÉO PHÌ Ở NGƯỜI TỪ 40 – 64 TUỔI

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ chân tình, sự động viên khích lệ của nhiều tập thể, nhiều quý Thầy Cô giáo, đồng nghiệp cùng bạn bè và gia đình

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Trần Quang Bình và PGS.TS Nguyễn Văn Rư, những người thầy tâm huyết đã định hướng và tận tình hướng dẫn cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này Tiếp theo, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Bộ môn Hóa sinh, phòng Sau Đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội, Labo Trung tâm - Viện dinh dưỡng Quốc Gia, Quỹ phát triển khoa học và Công nghệ Quốc gia (Nafosted), TT Y tế dự phòng và người dân ở 30 xã, phường, thị trấn tại tỉnh Hà Nam đã tạo mọi điều kiện, hợp tác và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Tuấn Linh, Th.S Trần Quang Thuyên, Th.S Nguyễn Ánh Ngọc, Th.S Bùi Thị Thúy Nga, những người

đã luôn chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TSKH Phùng Đắc Cam, Ban lãnh đạo khoa, các Thầy Cô giáo, đồng nghiệp trong khoa Y – Dược Trường Đại học Thành Đô đã tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình học tập, giúp tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng là lời tri ân sâu sắc nhất, tôi xin gửi tới người thân, gia đình đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 4 tháng 4 năm 2018

Phùng Thị Hương Giang

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bệnh béo phì: 3

1.1.1 Định nghĩa và phương pháp chẩn đoán: 3

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ học của béo phì: 4

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của béo phì 7

1.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của những yếu tố nguy cơ dẫn tới béo phì 8

1.1.5 Hậu quả 16

1.2 Tổng quan một số phương pháp phân tích đa hình đơn nucleotid 18

1.3 Tổng quan về nghiên cứu gen SH2B1: 22

1.3.1 Lược sử nghiên cứu về gen SH2B1: 22

1.3.2 Vị trí và cấu trúc của gen SH2B1 23

1.3.3 Protein SH2B1: 23

1.3.4 Nghiên cứu gen SH2B1 ở chuột và thiếu hụt chức năng gen SH2B1 ở người : 25

1.3.5 Sự liên quan của gen SH2B1 với bệnh béo phì: 26

1.3.6 Cơ chế ảnh hưởng của gen SH2B1 đối với bệnh béo phì 27

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.2 Hóa chất và trang thiết bị 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 33

2.3.2 Các phương pháp thu thập thông tin 34

2.3.3 Các phương pháp sinh học phân tử 34

2.3.4 Phương pháp phân tích thống kê 40

2.3.5 Đạo đức trong nghiên cứu 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42

3.1 Kết quả xây dựng quy trình phân tích đa hình đơn nucleotid rs7498665 gen SH2B1 42

3.2 Kết quả thông tin cơ bản về đặc điểm đối tượng nghiên cứu 50

3.3 Kết quả xác định kiểu gen và tần suất alen 53

3.4 Phân tích ảnh hưởng của gen SH2B1 tại SNP rs7498665 đối với nguy cơ béo phì 54

3.5 Phân tích mối liên quan về đặc điểm nhân trắc của đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen 57

3.6 Phân tích ảnh hưởng của gen SH2B1 tại SNP rs7498665 cùng các yếu tố liên quan với béo phì ở mô hình siêu trội 59

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 61

4.1 Quy trình thiết kế xác định kiểu gen và tần suất alen 61

4.2 Tần suất alen và sự phân bố kiểu gen của SNP rs7498665 gen SH2B1 61 4.3 Ảnh hưởng của gen SH2B1 tại SNP rs7498665 đối với bệnh béo phì ở người 40 – 64 tuổi tại tỉnh Hà Nam 64

4.4 Thiết kế và phương pháp nghiên cứu 65

4.5 Một số hạn chế của nghiên cứu 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AS (Allele Specific) : đặc hiệu alen

BMI (Body Mass Index) : chỉ số khối cơ thể

CDC (Centers for Disease Control and Prevention) : trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật

CNV (Copy Number Variation): biến thể số lượng bản sao

Cs : Cộng sự

GHO : Global Health Observatory

GWAS : Genome-wide Association Studies

OD (Obesity disease) : bệnh béo phì

OR (Odd Ratio) : tỷ suất chênh

PCR (Polymease Chain Reaction) : phản ứng chuỗi trùng hợp

RE (Restriction Emzyme) : enzym giới hạn

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) : đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

SH2B1 : SH2 - B adaptor protein 1

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) : đa hình đơn nucleotid

WHO (World Health Organization) : tổ chức y tế thế giới

HWE (Hardy Weinberg Equilibrium) : cân bằng Hardy Weinberg

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1: Phân loại thừa cân- béo phì ở người lớn theo BMI của WHO và

Hiệp hội đái đường các nước châu Á (IDI & WPRO) [83] 4

Bảng 3 1: Các mồi sử dụng trong phương pháp ASP 42

Bảng 3 2: Thành phần của một phản ứng PCR trong phương pháp ASP 42

Bảng 3 3: Nhận định kết quả điện di trong phương pháp ASP 44

Bảng 3 4: Cặp mồi sử dụng trong phương pháp RFLP 45

Bảng 3 5: Thành phần của một phản ứng PCR trong phương pháp RFLP 46

Bảng 3 6: Thành phần và lượng phản ứng đem ủ enzym 48

Bảng 3 7: Bảng nhận định kiểu gen tương ứng với các băng 48

Bảng 3 8: Đặc điểm các yếu tố liên quan tới bệnh của đối tượng nghiên cứu 51

Bảng 3 9: Tỷ lệ kiểu gen và tần suất alen của SNP rs7498665 gen SH2B1 53

Bảng 3 10: Các mô hình phân tích giả định ảnh hưởng của SNP rs7498665 gen SH2B1 với nhóm nghiên cứu 55

Bảng 3 11: Đặc điểm đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen SH2B1 tại SNP rs7498665 trong nhóm người béo phì 57

Bảng 3 12: Đặc điểm của đối tượng theo kiểu gen SH2B1 tại SNP rs7498665 trong nhóm người bình thường 58

Bảng 3 13: Ảnh hưởng của SNP rs7498665 gen SH2B1 cùng các yếu tố liên quan tới béo phì 59

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1: Tỷ lệ người béo phì trên toàn thế giới năm 2016 [92] 6

Hình 1 2: Những yếu tố nguy cơ chính dẫn đến béo phì 9

Hình 1 3: Sự phối hợp của các gen LEP, LEPR, POMC, AGRP, MC4R, BDNF, NTRK2 trong quá trình điều hòa lượng thức ăn ăn vào [78] 12

Hình 1 4: Các gen liên quan đến các tính trạng béo phì được tìm thấy từ nghiên cứu GWAS [20] 13

Hình 1 5: Vị trí và cấu gen SH2B1 [90] 23

Hình 1 6: Cấu trúc protein SH2B1 [35] 24

Hình 1 7: Quá trình hoạt động bình thường của SH2B1 trong con đường truyền tín hiệu leptin ở vùng dưới đồi [87] 28

Hình 2 1: Hình ảnh một số thiết bị đã dùng khi tiến hành phân tích gen 32

Hình 2 2: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 33

Hình 3 1: Chu trình nhiệt của phương pháp ASP 43

Hình 3 2: Kết quả điện đi sản phẩm PCR theo phương pháp ASP 44

Hình 3 3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR của phương pháp RFLP 47

Hình 3 4: Kết quả điện di sản phẩm theo phương pháp RFLP PCR 49

Hình 3 5: Kết quả giải trình tự gen của 3 kiểu gen AA, AG và GG 50

Hình 4 1: Tỷ lệ alen của một số cộng đồng trên thế giới [93] 63

Hình 4 2: Tỷ lệ kiểu gen của một số cộng đồng trên thế giới [93] 63

so với năm 1991 (25 triệu người) [41]

Tại Việt Nam, theo điều tra của Viện Dinh dưỡng Quốc gia hiện có gần 7 triệu người bị thừa cân, béo phì chiếm hơn 8% dân số Tại các thành phố lớn, tình trạng thừa cân, béo phì lên tới 30% Điều đáng lo ngại hơn là tuổi của người mắc thừa cân, béo phì ngày càng trẻ hóa và béo phì mức độ nặng ngày càng gia tăng Theo thống kê, người trưởng thành bị thừa cân, béo phì chiếm 25% dân số Việt Nam [2],[4]

Thừa cân, béo phì là yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh không lây nhiễm, tiêu biểu như các bệnh tim mạch (tăng huyết áp, đột quỵ, xơ vữa và tắc mạch vành, nhồi máu cơ tim); nguy cơ của bệnh đái tháo đường tuýp II và một số bệnh ung thư (ung thư túi mật, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư tiền liệt tuyến và ung thư thận) Theo WHO ước tính có ít nhất 3,4 triệu ca tử vong mỗi năm có liên quan tới béo phì trên toàn thế giới, tại Mỹ, chi phí y tế cho các bệnh liên quan đến béo phì gần 190 tỉ USD mỗi năm, chiếm tới 1/5 tổng mức chi cho dịch vụ y tế của nước này [92]

Bệnh béo phì là một bệnh phức hợp do nhiều yếu tố nguy cơ gây nên Một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng đã được biết đến là yếu tố di truyền Thật vậy, các nghiên cứu gia đình và song sinh đã chỉ ra rằng các yếu

tố di truyền chiếm 40 - 70% biến thể quần thể trong BMI [84] Nghiên cứu sự liên quan trong toàn bộ hệ gen GWAS (Genome-wide Association Studies)

năm 2007 đã phát hiện ra gen SH2B1 liên quan tới bệnh béo phì [56] Tiếp

sau đó, nhiều nghiên cứu ở các dân tộc khác cũng tìm thấy mối liên quan của

gen SH2B1 đối với bệnh béo phì [5][26][31]

Các nghiên cứu ở Châu Âu, Châu Á và Châu Phi đều chứng tỏ gen SH2B1 có

ảnh hưởng tới chứng bệnh béo phì Một phân tích tổng hợp cho thấy SNP

(Single Nucleotide Polymorphism) rs7498665 nằm trên gen SH2B1 có liên

quan tới bệnh béo phì [5] [11] Tuy nhiên tần suất alen, sự phân bố kiểu gen

của gen SH2B1 và mức độ ảnh hưởng của nó đối với bệnh béo phì ở các dân tộc khác nhau cũng khác nhau và vẫn còn thiếu số liệu ở người Việt trong các

phân tích trên Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa hình đơn

nucleotid rs7498665 gen SH2B1 và mối tương quan với bệnh béo phì ở

người từ 40 – 64 tuổi tại tỉnh Hà Nam” được tiến hành với ba mục tiêu :

1 Xây dựng quy trình phân tích đa hình đơn nucleotid rs7498665 gen

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Định nghĩa và phương pháp chẩn đoán:

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) định nghĩa :

―Béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe‖ [92]

Do béo phì là sự dư thừa mỡ trong cơ thể nên chẩn đoán béo phì dựa trên tỷ lệ

mỡ cơ thể là phương pháp chính xác nhất Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, máy móc đắt tiền như máy chụp cộng hưởng từ, máy chụp cắt lớp vi tính và hấp thu tia X năng lượng kép, do đó khó áp dụng trong các nghiên cứu cộng đồng trên số lượng mẫu lớn [6]

Có nhiều chỉ số được sử dụng để chẩn đoán béo phì như dựa vào chỉ số mỡ cơ thể, bề dày lớp da, chu vi vòng eo, chu vi vòng hông, tỷ lệ eo/hông, chỉ số BMI [44] Hiện nay chủ yếu được đánh giá theo chỉ số khối cơ thể (BMI: Body Mass Index) bởi cách tính đơn giản, dễ thực hiện

BMI là một chỉ số đơn giản được sử dụng để phân loại thiếu cân, thừa cân và béo phì ở người lớn BMI được tính bằng trọng lượng của một người tính bằng kilogam chia cho bình phương chiều cao tính bằng mét (kg / m2

) [81]

BMI = Trọng lượng (kg)/[Chiều cao (m)] 2

Bảng 1 1: Phân loại thừa cân- béo phì ở người lớn theo BMI của WHO

và Hiệp hội đái đường các nước châu Á (IDI & WPRO) [83]

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ học của béo phì:

1.1.2.1 Tình hình bệnh béo phì trên thế giới:

Trong thế kỷ XXI, béo phì đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng bởi ngày càng có nhiều người bị béo phì và có nhiều biến chứng về chuyển hóa Nó đang gia tăng nhanh chóng ở mọi lứa tuổi, mọi tầng lớp và mọi quốc gia, tạo nên gánh nặng to lớn với sự tiến bộ của toàn nhân loại

Theo WHO tỷ lệ béo phì trên toàn thế giới đã tăng gấp ba trong giai đoạn từ

1975 đến 2016 [92] Vào năm 2016, toàn thế giới có hơn 1,9 tỷ người từ 18 tuổi trở lên bị thừa cân chiếm 39% (38% nam giới và 40% phụ nữ), trong số

đó có hơn 650 triệu người bị béo phì chiếm khoảng 13% (11% nam giới và

15% nữ giới) (BMI ≥30 kg / m2) dân số thế giới [92] Cả thừa cân và béo phì đều cho thấy sự gia tăng đáng kể trong 4 thập kỷ qua Tỷ lệ béo phì ở nam giới đã tăng từ khoảng 3% và ở phụ nữ từ trên 6% vào năm 1975 trong khi khối lượng thừa cân đã tăng lên trong thời gian này với chỉ dưới 21% ở nam giới và từ dưới 23% ở nữ giới [92]

Tại Mỹ, hiện nay có khoảng 60 triệu người đang bị thừa cân hoặc béo phì, tăng gần gấp 3 lần so với năm 1991 (25 triệu người) [41] Tại Trung Quốc, tình trạng béo phì đang là gánh nặng cho ngành y tế của đất nước, theo CNHS năm 2002 tỷ lệ hiện mắc béo phì ở người trưởng thành là 2,9%, không chỉ ở các vùng, mà còn bởi các nhóm dân tộc Tỷ lệ béo phì thấp hơn ở miền Nam Trung Quốc (1,4% ở nam giới và 2,2% ở phụ nữ) so với ở miền Bắc (2,6% ở nam giới và 4,9% ở phụ nữ).Và tỷ lệ hiện nhiễm ở các vùng phía Tây của Trung Quốc (9,9%) thấp hơn so với ở các vùng phía đông (13,5%) Nhiều người dân tộc thiểu số ở Tây Nam Trung Quốc có tỷ lệ béo phì thấp hơn người Hán [79] Khu vực Bắc Phi, Trung Đông và Mỹ Latin cho thấy có một

sự gia tăng lớn về tỷ lệ thừa cân và béo phì đến một mức độ ngang bằng với châu Âu, khoảng 58%; trong khi Bắc Mỹ vẫn có tỷ lệ cao nhất của người lớn thừa cân ở mức 70%, thì các khu vực như Australia và Nam Mỹ Latin hiện nay là không xa phía sau với 63%

Hình 1 1: Tỷ lệ người béo phì trên toàn thế giới năm 2016 [92]

1.1.2.2 Tình hình bệnh béo phì ở Việt Nam

Ở Việt Nam, thừa cân và béo phì đang gia tăng nhanh chóng, đặc biệt ở các

đô thị Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân, béo phì chiếm khoảng 25% dân

số Nó trở thành một trong những thách thức lớn đối với chương trình chăm sóc sức khỏe ở quốc gia [2][4]

Từ năm 2000 đến năm 2005, tỷ lệ người thừa cân và béo phì đã tăng gấp 2 lần

ở người trưởng thành (từ 3,5% lên 6,6%) Kết quả điều tra dinh dưỡng (2011) trên 17.213 đối tượng tuổi từ 25 - 64 tại 64 tỉnh/thành phố đại diện cho 8 vùng sinh thái toàn quốc cho thấy tỷ lệ thừa cân/béo phì (BMI > 23) là 16,3%, trong đó tỷ lệ tiền béo phì là 9,7% và tỷ lệ béo phì độ I và II là 6,2% và 0,4%

Tỷ lệ thừa cân/ béo phì đang gia tăng theo tuổi, tỷ lệ ở nữ giới cao hơn so với nam giới, ở thành thị (32,5%) cao hơn so với ở nông thôn (13,8%) Tỷ lệ béo bụng (tỷ số vòng bụng/ vòng mông) là 39,75% và tăng theo tuổi ở cả nam và

nữ [4]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của béo phì

Béo phì là kết quả của sự mất cân bằng giữa năng lượng đưa vào cơ thể qua thức ăn và năng lượng tiêu hao qua các hoạt động sống, khi lượng năng lượng cung cấp qua thức ăn nhiều hơn nhu cầu của cơ thể thì phần dư thừa có thể chuyển hóa thành mô mỡ và dẫn đến tăng cân, béo phì.[16]

1.1.3.1 Cân bằng năng lượng của cơ thể

Năng lượng đưa vào: các chất chủ yếu trong thức ăn giúp cung cấp năng lượng cho cơ thể là glucid, lipid và protein; qua quá trình tiêu hóa được phân giải thành các chất đơn giản (đường đơn, glycerol, acid béo, acid amin) sau đó được hấp thu và vận chuyển qua hệ tuần hoàn cung cấp nguyên liệu cho cơ thể Các chất đơn giản này sẽ được tổng hợp thành các chất đặc trưng của cơ thể, đồng thời tích lũy năng lượng qua quá trình đồng hóa [77]

Năng lượng tiêu hao: năng lượng ATP trong cơ thể tạo ra qua quá trình

dị hóa, chủ yếu từ glucose qua quá trình đường phân, chu trình Krebs giúp cung cấp năng lượng cho các quá trình sống Khi hàm lượng glucose trong máu giảm xuống dưới mức bình thường gan sẽ biến glycogen thành glucose

để chuyển vào máu và đưa đến khắp các mô, cơ quan trong cơ thể Trong trường hợp cơ thể cần glucose, mà lượng glycogen trong gan lại thấp hoặc trong trường hợp cơ thể cần glucose khẩn cấp thì gan có thể sản xuất glucose

từ lipid hoặc protein [77]

1.1.3.2 Các dạng tồn tại của mô mỡ trong cơ thể

Mô mỡ nâu: gọi là mô mỡ nâu vì các tế bào có màu đậm do mật độ ty thể cao và giữa các tế bào có nhiều mạch máu Mô mỡ nâu thường ở vị trí sau cổ

và hai bên cột sống có nhiều ở trẻ em đặc biệt là ở trẻ sơ sinh Ở người trưởng thành tỷ lệ mô mỡ nâu rất ít và hầu như không có ở người béo phì Vai trò của mô mỡ nâu là sinh nhiệt và oxy hóa lipid [65]

Mô mỡ trắng: bao gồm các tế bào mỡ liên kết lỏng lẻo với nhau, có nhiều mạch máu và dây thần kinh Khác với tế bào mô mỡ nâu, tế bào mô mỡ

trắng có rất ít ty thể nên tế bào này có màu trắng Mô mỡ trắng được tích lũy nhiều ở các vùng dưới da, xung quanh nội tạng Tùy thuộc vào vị trí có mặt,

mô mỡ trắng có chức năng chuyên biệt Mô mỡ trắng ở những ở những cơ quan thuộc vùng bụng và ngực gọi là mỡ nội tạng, tiết adipokine viêm, liên quan đến các quá trình viêm Mô mỡ trắng ở cơ xương tiết acid béo tự do, interleukin – 6 và yếu tố hoại tử khối u (TNFα), đóng vai trò quan trọng trong

đề kháng insulin Mô mỡ trắng ở tim tiết nhiều adipokine trong các phản ứng viêm khu trú và hóa hướng viêm, điều này có thể dẫn đến sơ vữa động mạch

và tăng huyết áp Mô mỡ trắng ở thận đóng vai trò trong việc tái hấp thu Na+

và do đó có thể ảnh hưởng đến thể tích máu nội mạch và tăng huyết áp [65]

1.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của những yếu tố nguy cơ dẫn tới béo phì

1.1.4.1 Lược sử nghiên cứu nguyên nhân gây béo phì:

Nguyên nhân của béo phì đã được tìm hiểu hơn 100 năm qua theo cả hai hướng sinh học và tâm lý học Vào những năm đầu của thế kỷ XX những rối loạn chức năng ở vùng dưới đồi và tuyến yên được cho là nguyên nhân chính dẫn đến béo phì Trong những năm 1940 – 1970 ngoài khía cạnh thần kinh thì khía cạnh tâm lý cũng được cho là đóng vai trò quan trọng trong béo phì [15] Đến năm 1980 – 1990, những nghiên cứu về con nuôi và cặp sinh đôi đã cung cấp bằng chứng về vai trò của yếu tố di truyền đối với béo phì [14] Việc tạo dòng gen leptin thành công vào năm 1994 và việc điều trị thành công trẻ bị thiếu leptin bằng leptin tái tổ hợp đã lần đầu tiên cho thấy biến dị trên một gen

có thể gây nên sự thèm ăn và béo phì, điều này đã mở ra sự phát triển nhanh chóng của các nghiên cứu y sinh học, di truyền phân tử đối với béo phì [55] Giả thuyết cho rằng béo phì là một bệnh phức hợp trong đó những yếu tố nguy cơ từ môi trường, sự nhạy cảm của gen và sự tác động qua lại giữa những yếu tố này với nhau được ủng hộ rộng rãi trong những năm gần đây

[29] Một số yếu tố liên quan nữa đối với thừa cân/ béo phì là khẩu phần ăn giàu thức ăn động vật, tăng sử dụng thức ăn nhanh, lạm dụng rượu bia và ít vận động

Từ những nghiên cứu có thể tóm tắt các yếu tố nguy cơ chính dẫn đến béo phì theo sơ đồ hình 1.2

Hình 1 2: Những yếu tố nguy cơ chính dẫn đến béo phì

1.1.4.2 Mối tương quan giữa yếu tố dinh dưỡng và béo phì

Khẩu phần ăn: đã có sự thay đổi trong khẩu phần ăn ở các nước trên toàn thế giới từ nửa sau thế kỷ XX, đầu tiên ở những nước phát triển và gần đây là ở những nước đang phát triển Chế độ ăn truyền thống chủ yếu gồm thức ăn thực vật đã được thay thế bằng chế độ ăn giàu năng lượng, nhiều chất béo với thành phần chủ yếu từ động vật Nghiên cứu cho thấy chỉ cần ăn dư 70 calo

mỗi ngày sẽ dẫn đến tăng cân mặc dù số calo nhỏ này có thể không nhận ra dễ dàng, nhất là khi ăn những thức ăn giàu năng lượng Do đó khẩu phần ăn với lượng thức ăn ăn vào nhiều hơn, đặc biệt là những loại thức ăn giàu năng lượng là một trong những nguyên nhân chính dẫn tới tỷ lệ béo phì tăng cao hiện nay [46][62]

1.1.4.3 Mối tương quan giữa hoạt động thể lực và béo phì

Hoạt động thể lực có ảnh hưởng lớn đến cấu tạo cơ thể, làm thay đổi lượng

mô mỡ, mô cơ, mô xương; hoạt động thể lực tham gia vào quá trình thiết lập cân bằng năng lượng của cơ thể Những yếu tố liên quan đến hoạt động thể lực đã được báo cáo làm tăng nguy cơ béo phì gồm: thời gian xem tivi, thời gian và mức độ hoạt động thể lực, thời gian ngủ tối Nhiều nghiên cứu cắt ngang cho thấy hoạt động thể lực thường xuyên giúp chống lại sự tăng cân, trong khi lối sống tĩnh tại dẫn đến nguy cơ thừa cân, béo phì [74]

1.1.4.4 Mối tương quan giữa yếu tố di truyền và béo phì

Nghiên cứu di truyền đối với béo phì đã trải qua nhiều giai đoạn và áp dụng những phương pháp khác nhau Khởi đầu là những báo cáo mô tả trường hợp béo phì lâm sàng (case report), tiếp theo là nghiên cứu gen ứng viên (candidate gene study), nghiên cứu mối liên kết trên toàn bộ gen (genome wide linkage study), hiện nay là nghiên cứu mối liên quan trên toàn bộ gen (GWA) và nghiên cứu về epigenetic (ngoại di truyền, di truyền biểu sinh), cụ thể như sau:

- Báo cáo mô tả những trường hợp béo phì đặc biệt đã giúp phát hiện nhiều đột biến đơn gen gây nên béo phì [23][86]

- Nghiên cứu gen ứng viên dựa trên những giả thuyết và sự hiểu biết về sinh lý học của gen đối với béo phì Những gen có vai trò trong điều hòa cân bằng năng lượng ở mô hình động vật hoặc dạng đơn gen gây nên béo phì đã được đưa vào nghiên cứu để tìm mối liên quan với các tính trạng béo phì ở mức độ quần thể Trong báo cáo về bản đồ gen liên quan đến béo phì năm

2005, cho thấy có hơn 120 gen liên quan đến các tính trạng của béo phì [55]

- Nghiên cứu mối liên kết trên toàn bộ gen là nghiên cứu kiểm tra toàn

bộ genome để tìm biến thể gen mới không dự kiến trước có sự liên quan với tính trạng hoặc bệnh quan tâm Nghiên cứu này tập trung vào những đối tượng có quan hệ huyết thống với nhau và kiểm tra xem có hay không một số vùng trên nhiễm sắc thể cùng phân li với một bệnh hay tính trạng qua nhiều thế hệ Báo cáo đầu tiên dạng nghiên cứu này công bố năm 1997, cho tới năm

2013 đã phát hiện được 253 vùng từ 61 nghiên cứu trong đó có 15 vùng có kết quả lặp lại liên quan tới béo phì ở ít nhất 3 nghiên cứu [12]

- Báo cáo đầu tiên của nghiên cứu GWAS đối với béo phì được công bố vào năm 2007 Đây là dạng nghiên cứu không bị giới hạn bởi một giả định trước, với việc kiểm tra toàn bộ genome ở mức độ cao hơn và ở những vị trí trước đây chưa từng quan tâm đến để tìm sự kết hợp và cơ chế sinh lý đối với một bệnh hoặc tính trạng quan tâm Kết quả đã phát hiện được 15 SNP mới trên nhiễm sắc thể có liên quan với các tính trạng của béo phì Từ những SNP này, việc xác định các biến thể di truyền gây béo phì và cơ chế phân tử của nó vẫn cần được làm sáng tỏ [38]

Đã phát hiện hơn 170 người béo phì do đột biến đơn gen của 11 gen khác nhau và ở 50 vị trí đột biến [55] Nhiều đột biến đơn gen được xác định bằng

cách tìm các biến dị tương ứng ở người từ đột biến đơn gen ở chuột Dạng béo phì này rất hiếm gặp và thường biểu hiện nặng, xuất hiện sớm [24]

Nguyên nhân di truyền dẫn đến béo phì trong cộng đồng chủ yếu là do sự tác động của nhiều gen (đa gen) Ví dụ như sự điều hòa lượng thức ăn của cơ thể không phải chịu tác động của một gen mà còn chịu sự tác động của nhiều

gen như gen LEP, LEPR, POMC, AGRP, MC4R, BDNF, NTRK2 (Hình 1.3)

Hình 1 3: Sự phối hợp của các gen LEP, LEPR, POMC, AGRP, MC4R,

BDNF, NTRK2 trong quá trình điều hòa lƣợng thức ăn ăn vào [78]

Những nghiên cứu GWAS và phân tích tổng hợp (meta – analysis) đã phát hiện nhiều SNP có ảnh hưởng đến các tính trạng béo phì và kết quả lặp lại ở nhiều cộng đồng dân cư Châu Âu, Châu Á, Châu Phi Fall và Ingelsson đã thống kê được 88 SNP nằm trên 52 gen có liên quan đến béo phì và các tính trạng của béo phì được công bố từ nghiên cứu GWA (Hình 1.4)[22][42]

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tần suất alen của SNP ở các dân tộc và mức độ ảnh hưởng của SNP với béo phì ở các quần thể, các lứa tuổi khác nhau thì có sự khác nhau, cụ thể: có những SNP có mối liên quan mạnh đến béo phì ở người trưởng thành Châu Âu nhưng lại có mối liên quan nhỏ hoặc không liên quan ở người Châu Á và Châu Phi, có những SNP có liên quan đến béo phì người trưởng thành nhưng lại không có liên quan ở trẻ em và ngược lại [42] Biểu hiện gen phụ thuộc vào tuổi, giới, đặc điểm di truyền và đặc điểm môi trường sống của quần thể có thể là đặc điểm then chốt để giải thích sự không đồng nhất này[88]

Hình 1 4: Các gen liên quan đến các tính trạng béo phì đƣợc tìm thấy từ nghiên cứu GWAS [22]

BMI (Body Mass Index): Chỉ số khối cơ thể; Fat mass: khối mỡ; Waist: Vòng eo; WHR (Waist Hip Ratio): Tỷ lệ eo/hông

 Tiền sử gia đình:

Tiền sử gia đình cũng là một yếu tố quan trọng liên quan tới béo phì: gia đình có bố và mẹ béo phì thì con bị béo phì đến 80%, có bố hoặc mẹ béo phì thì con béo phì thấp hơn 40%, và bố mẹ không béo phì thì chỉ 7% số con bị

béo phì [40] Điều này một phần thể hiện cho vai trò của yếu tố di truyền đối với nguy cơ mắc bệnh

1.1.4.5 Ảnh hưởng của epigenetic (ngoại di truyền) đến béo phì

Epigenetic là những thay đổi trong biểu hiện và những chức năng khác của gen, những thay đổi này không liên quan đến trình tự nucleotide và có thể

di truyền được [58] Khái niệm epigenetic ra đời đã giúp giải thích cho sự khác nhau trong biểu hiện kiểu hình của cùng một kiểu gen khi điều kiện môi trường thay đổi [25]

Đối với béo phì, những thay đổi epigenetic xuất hiện phổ biến nhất trong thời gian mang thai, phát triển của trẻ sơ sinh và tuổi dậy thì Những thay đổi này dường như để mang ―bộ nhớ‖ của trải nghiệm sống sớm, có thể di truyền được qua phân chia tế bào và liên quan đến tính nhạy cảm đối với béo phì trong cuộc sống sau này [25]

Cơ chế chính xác dẫn đến những thay đổi epigenetic đối với béo phì cho đến nay vẫn là một bí ẩn lớn Các nghiên cứu mới cho thấy sự thay đổi ở điều kiện dinh dưỡng, hormone hoặc stress có thể là những yếu tố trung gian của những tín hiệu kích hoạt quá trình epigenetic như: làm thay đổi hoạt động của enzyme DNA methyltransferase và cofactor của nó, dẫn đến tăng quá trình methyl hóa DNA và/hoặc ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme xúc tác quá trình acetyl hóa histone

Bằng chứng từ những nghiên cứu trên người và động vật đã chỉ ra rằng: những thay đổi epigenetic của béo phì có thể di truyền sang thế hệ tiếp theo, ngay cả trong trường hợp những cá thể của thế hệ đó không bị phơi nhiễm với điều kiện môi trường bất lợi Tuy nhiên, nhiều bằng chứng lại cho thấy quá trình epigenetic không di truyền cứng nhắc mà có thể bị đảo ngược (khử methyl, khử acetyl dẫn đến mở hoặc đóng gen), điều này đã mở ra một hướng mới trong nghiên cứu chiến lược can thiệp giúp giảm sự gia tăng béo phì [25]

1.1.4.6 Mối tương quan của một số yếu tố khác và béo phì

Ngoài ảnh hưởng của yếu tố dinh dưỡng, hoạt động thể lực, gen, epigenetic

thì sự phát triển béo phì còn chịu ảnh hưởng của yếu tố kinh tế xã hội, một số loại thuốc và tình trạng bệnh lý

Yếu tố kinh tế xã hội ảnh hưởng đến béo phì thông qua sự tác động đến yếu tố dinh dưỡng và hoạt động thể lực Ở những nước đang phát triển, những vùng kinh tế còn nghèo, tỷ lệ béo phì thường thấp, do nguồn cung cấp thực phẩm còn hạn chế, năng lượng tiêu hao nhiều không chỉ do lao động chân tay nặng nhọc mà còn do đi lại chủ yếu bằng phương tiện thô sơ hoặc đi bộ

Một số bệnh và sử dụng thuốc: Béo phì cũng có thể là triệu chứng của một số bệnh nội tiết và sử dụng thuốc, tuy nhiên nguyên nhân này rất hiếm gặp trong quần thể Nhiều bệnh mà béo phì là triệu chứng của bệnh như: hội chứng Cushing; cường insulin, làm tăng cảm giác thèm ăn, ăn nhiều làm tăng tổng hợp và dự trữ lipid ở gan, ngăn cản quá trình phân giải mỡ; hội chứng béo phì sinh dục (béo phì ở thân, gốc chi và suy sinh dục, có thể kèm các bệnh như: đái tháo nhạt, rối loạn thị lực và tâm thần) Một số thuốc có tác dụng không mong muốn dẫn đến béo phì gồm: thuốc nhóm corticoid, nhóm thuốc tránh thai, một số thuốc thần kinh (thuốc chống trầm cảm, thuốc chống loạn thần) và một số thuốc khác [1]

1.1.5 Hậu quả

1.1.5.1 Béo phì làm tăng nguy cơ mắc nhiều bệnh

Béo phì là một yếu tố dự đoán nguy cơ của bệnh mạch vành, chỉ đứng sau tuổi và rối loạn chuyển hóa lipid Theo WHO ước tính có khoảng 1/3 bệnh nhân mắc bệnh mạch vành và các trường hợp đột quỵ do thiếu máu có nguyên nhân chủ yếu là do béo phì [82] Xơ vữa động mạch cũng là hậu quả nghiêm trọng của béo phì do mô mỡ tiết ra yếu tố hoại tử khối u (TNF-α: Tumor necrosis factor alpha) và chất ức chế kích hoạt plasminogen (plasminogen activator inhibitor – 1, PAI – 1) TNF – α làm tăng độ bám dính của bạch cầu trong nội mô, PAI – 1 ức chế sự chuyển hóa plasminogen thành plasmin (plasmin là chất cần thiết để hòa tan các cục máu đông hình thành trong lòng mạch do phản ứng viêm) Do đó béo phì làm tăng nguy cơ dẫn đến lòng mạch

bị thu hẹp và bị tắc nghẽn do cục máu đông [61]

Người thừa cân, béo phì dễ bị thoái hóa khớp, viêm khớp mạn tính do trọng lượng cơ thể gây áp lực lên xương khớp Trong đó, khớp gối, cột sống

bị tổn thương sớm nhất [35]

 Béo phì làm tăng nguy cơ bệnh nội tiết

Béo phì làm tăng nguy cơ bệnh đái tháo đường tuyp 2 Nồng độ acid béo

tự do tăng làm giảm quá trình sử dụng glucose trong cơ thể Bên cạnh đó các khối mỡ, đặc biệt mỡ ở bụng, bài tiết ra các yếu tố đề kháng insulin là nguyên nhân gây ra đái tháo đường type II ở người thừa cân, béo phì [54]

Trẻ em gái béo phì thường có dấu hiệu dậy thì sớm hơn trẻ bình thường,

mô mỡ còn làm rối loạn buồng trứng, rối loạn kinh nguyệt, dễ gây hội chứng

đa nang buồng trứng, khó thụ tinh, dễ sảy thai, tăng nguy cơ mắc ung thư vú, ung thư tử cung [37]

Mỡ bám vào cơ hoành làm thông khí giảm, gây khó thở, khiến não thiếu oxy, tạo hội chứng Pickwick (ngủ cách quãng suốt ngày đêm, lúc ngủ lúc tỉnh, rối loạn hô hấp) Người béo phì dễ bị rối loạn nhịp thở, ngủ ngáy Ngừng thở khi ngủ cũng là vấn đề hay gặp ở người béo phì nặng, nhất là khi béo bụng và cổ quá béo [50]

 Béo phì làm tăng nguy cơ bệnh tiêu hóa

Người béo phì dễ bị bệnh túi mật, có bất thường về gan, gan nhiễm mỡ,

xơ gan, nhu động ruột giảm (gây đầy hơi, táo bón), hệ mạch ở ruột bị cản trở, gây trĩ [20]

Béo phì làm gia tăng nguy cơ ung thƣ

Bệnh nhân béo phì sẽ có nguy cơ cao mắc một số bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tử cung, ung thư đại tràng, ung thư gan mật và ung thư tuyến tiền liệt [21] Polednak AP đã nghiên cứu cho thấy khoảng 6% của tất cả các loại ung thư (4% ở nam, 7% ở phụ nữ) được chẩn đoán trong năm 2007 là có liên quan tới béo phì [52]

 Béo phì làm suy giảm trí nhớ

Thừa cân, béo phì khiến trẻ em học kém và người lớn mất tập trung, dễ mắc bệnh Alzheimer [45]

1.1.5.2 Béo phì tác động đến kinh tế và xã hội

Chi phí dành cho y tế của người béo phì cao hơn 40% so với người có cân nặng bình thường Chi phí hàng năm cho béo phì hiện nay khoảng 10% tổng chi phí y tế, lên đến 147 tỷ USD theo số liệu năm 2008 của Mỹ Ngoài những ảnh hưởng trực tiếp tới kinh tế quốc gia, béo phì còn ảnh hưởng gián tiếp thông qua việc làm giảm năng suất lao động, nghỉ việc do bệnh tật, trợ cấp ốm đau [70]

1.2 Một số phương pháp phân tích đa hình đơn nucleotid

1.2.1 Phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu

PCR (Polymease Chain Reaction : phản ứng chuỗi trùng hợp) : là kỹ thuật tạo

ra (khuếch đại) theo cấp số nhân các bản sao của một trình tự DNA nhất định

từ một hoặc nhiều bản DNA ban đầu

PCR sử dụng mồi đặc hiệu (Allele-Specific PCR : AS-PCR): là một kỹ thuật chẩn đoán hay nhân bản dựa trên biến đổi đơn nucleotid, kỹ thuật này tiến hành dựa trên hai phản ứng PCR song song và riêng biệt, mỗi phản ứng sử dụng một cặp mồi đặc hiệu tại đầu 3’ để nhận biết một alen của SNP trên đoạn ADN [80]

1.2.2 Phương pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

Phương pháp RFLP–PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism PCR)

là phương pháp nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn ADN dựa trên điểm cắt của các enzym giới hạn (Restriction Enzyme, RE) Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzym cắt giới hạn đối với

vị trí nhận biết của chúng trên ADN bộ gen Khi ủ với enzym giới hạn ở dung dịch đệm, pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp, đoạn ADN bị enzym giới hạn cắt ở vị trí đặc hiệu để tạo ra những phân đoạn ADN với kích thước khác

nhau Trong đó enzym cắt giới hạn được chọn chỉ cắt một trong hai alen cần nghiên cứu Dựa vào kích thước các đoạn sau khi cắt để xác định alen và kiểu gen

1.2.3 Phân tích đa hình dạng sợi đơn SSCP

Phân tích đa hình dạng sợi đơn (Single strand conformation polymorphism - SSCP) là một kỹ thuật đơn giản và nhạy cảm để phát hiện đột biến và kiểu gen Nguyên tắc phân tích SSCP dựa trên một chuỗi DNA có một cấu trúc xác định Thay đổi cấu hình do một sự thay đổi cơ sở duy nhất trong trình tự có thể gây ra DNA sợi đơn để di chuyển khác nhau trong điều kiện điện di không biến đổi Do đó, các mẫu ADN hoang dã và đột biến hiển thị các mẫu băng khác nhau [8]

Phân tích SSCP liên quan đến bốn bước sau đây: (1) khuếch đại chuỗi trùng hợp (PCR) dùng cho chuỗi DNA quan tâm; (2) biến tính của các sản phẩm PCR sợi kép; (3) làm mát của DNA biến tính (sợi đơn) để tối đa hóa tự ủ; (4) phát hiện sự khác biệt về tính di động của các sợi DNA đơn bằng điện di trong điều kiện không biến tính [8]

1.2.4 SNP array

SNP array là một loại microarray DNA được sử dụng để phát hiện đa hình trong một quần thể Nó là sự hội tụ của sự lai ghép DNA, kính hiển vi huỳnh quang và sự thu nhận DNA bề mặt rắn

SNP array được sử dụng để nghiên cứu các biến thể nhỏ giữa toàn bộ bộ gen Các ứng dụng lâm sàng quan trọng nhất của SNP array là xác định tính nhạy cảm của bệnh và để đo hiệu quả của các liệu pháp điều trị bằng thuốc được thiết kế riêng cho cá nhân Trong nghiên cứu, các mảng SNP được sử dụng thường xuyên nhất cho các nghiên cứu liên kết trên toàn bộ hệ gen [34]

1.2.5 Real time PCR

Real time PCR hay còn được gọi là phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng là một kĩ thuật về sinh học phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR), kĩ thuật này được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích

Hai phương pháp phổ biến để xác định được sản phẩm trong real time PCR

đó là: (1) Sử dụng các dye phát huỳnh quang không đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đôi nào đó

(2) Sử dụng các đầu dò DNA đặc hiệu (taqman probe) có chứa các đoạn oligonucleotide đã được đánh dấu với chất báo cáo phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chỉ khi có sự lai giữa đầu dò với một trình tự bổ sung với

nó, nhằm định lượng được RNA thông tin (mRNA) và các RNA không mã hóa trong các tế bào cũng như các mô

1.2.6 Giải trình tự gen (DNA sequencing)

DNA sequencing: là kỹ thuật xác định trình tự nucleotid của một đoạn DNA xác định Nguyên tắc: tiến hành phản ứng PCR với một mồi và sự có mặt của dideoxynucleotid Sản phẩm tạo ra là các đoạn DNA với các kích thước khác nhau từ đó xác định trình tự mẫu DNA

 Giải trình tự theo phương pháp hóa học của Maxam – Gilbert:

Maxam và Gilert (1977) đã phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học Nguyên tắc: Phân tử ADN được đánh dấu đồng vị phóng xạ 32

P ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo ra những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ Xử lý hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotid của mạch ADN đã được đánh dấu phóng xạ, tạo ra các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotid được phát hiện bằng

điện di Kết quả các phản ứng hóa học xử lý mạch ADN được phát hiện bằng điện di trên gel polyacryamid có thể xác định được trình tự nucleotid ở mạch đơn [39]

 Giải trình tự theo phương pháp enzym của Sanger

Phương pháp enzym được Sanger và cộng sự (cs) phát minh vào năm 1977 Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA Polymerase Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotid (ddNTP) và các deoxynucleotid thông thường [66]

 Kỹ thuật giải trình tự pyrosequencing 454

Pyrosequencing 454 do 2 nhà khoa học Nyren và Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm (Thụy Điển) phát minh, và được phát triển bởi Công ty 454 Life Science, là một hệ thống giải trình tự ADN có độ tương đồng cao với dung lượng lớn hơn rất nhiều so với hệ thống giải trình tự Sanger Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý ―giải trình tự bằng tổng hợp‖ bao gồm: khởi động một sợi ADN đã được giải trình tự và giải trình tự sợi bổ sung bằng phản ứng của enzym Đây là hệ thống có thể khuếch đại một số lượng lớn các đoạn ADN trong các giếng picotiter Nguyên lý ―giải trình tự bằng việc tổng hợp‖ cũng dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide [63]

1.3 Tổng quan về nghiên cứu gen SH2B1:

1.3.1 Lược sử nghiên cứu về gen SH2B1:

Họ gen SH2B (Src 2B) gồm 3 gen SH2B1, SH2B2 và SH2B3 được phát hiện ở động vật có vú năm 1995 Trong đó gen SH2B1 là gen được quan tâm

hơn nhất vì nó liên quan tới nhiều quá trình sinh lý trong cơ thể sống [49]

SH2B1 (SH2 - B adaptor protein 1) ban đầu được xác định như là một

protein gắn kết thụ thể globulin miễn dịch ái lực cao Tiếp theo đó Riedel và

cs đã phát hiện ra SH2B1 gây tăng cường báo hiệu insulin có liên quan tới

bệnh đái tháo đường [59]

Khi thực hiện nghiên cứu các SNP trên toàn hệ gen (GWAS) đã phát hiện

ra nhiều ảnh hưởng của SH2B1 tới quá trình sinh lý của cơ thể: SH2B1

rs7498665 có liên quan với tăng nguy cơ đái tháo đường tuýp II ở Anh và

Pháp [33],[60]; Hepatic SH2B1 điều chỉnh mức lipid trong gan [67]; đột biến xóa Chromosomal 16p11.2 dẫn đến mất SH2B1, có liên quan đến giảm nhận

thức, chậm phát triển [13] và chứng tự kỷ [71] Sự xóa bỏ nhiễm sắc thể 16p11.2 cũng liên quan đến sự phát triển thận và ruột bất tường ở người [76]

SH2B1 rs4788102 (G / A) có liên quan với mức tăng triacylglycerol tuần hoàn

trong nhóm nghiên cứu sức khoẻ dân số ở Bắc Thụy Điển [76], và có liên quan đến nhồi máu cơ tim [53]

Sự liên quan của SH2B1 với bệnh béo phì cũng được công bố ở nhiều

nước (Anh, Mỹ, Trung Quốc, Bỉ, Thụy Điển, Mexico, Đức, …) Tuy nhiên có

sự khác nhau giữa các dân tộc trong cùng khu vực, cơ chế về sự liên quan này vẫn chưa được công bố cụ thể

1.3.2 Vị trí và cấu trúc của gen SH2B1

Ở người gen SH2B1 nằm trên cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể 16, tại vị

trí 16p11.2 Gồm 9 exon, có 27.614 base, từ nucleotid 28.846.600 tới nucleotid 28.874.213; trọng lượng phân tử 79366 Da

Gen SH2B1 tạo ra bốn đồng phân SH2B1 (α, β, γ, và δ) thông qua sự nối

mRNA Tất cả các đồng phân có một vùng N- đầu cuối giống hệt nhau (các acid amin 1 - 632) nhưng khác nhau ở vị trí C của chúng sau tên miền SH2

[64] Bốn đồng phân (isoform) của SH2B1 đều gồm có 3 miền là dimer hóa

(DD), PH, và SH2 (hình 1.5) Vùng DD có vai trò trong sự hình thành homodimer giữa hai protein SH2B1 hoặc heterodimer giữa SH2B1 và SH2B2 Vùng SH2 liên kết với các gốc phospho - tyrosine của các đối tác liên kết Chức năng của miền PH vẫn chưa được xác định rõ ràng [64]

Hình 1 5: Vị trí và cấu gen SH2B1 [90]

1.3.3 Protein SH2B1:

1.3.3.1 Cấu trúc:

Gen SH2B1 mã hóa và thực hiện chức năng qua protein SH2B1 Protein SH2B1

chứa 2 miền N – terminal và C – terminal, 1 miền dimerization (DD), 1 miền PH

SH2B1 điều chỉnh tín hiệu tế bào để phản ứng với nhiều hormon, các yếu

tố tăng trưởng và cytokines: Trong các tế bào nuôi cấy, SH2B1 hoạt động như một bộ phận tiếp hợp để kích hoạt các hoạt động ngược dòng lên các hiệu ứng

hạ lưu, lắp ráp một phức hợp tín hiệu nhiều protein, và / hoặc tăng cường hoạt tính xúc tác của các enzyme bị ràng buộc của nó: SH2B1 trung gian / điều chỉnh tín hiệu leptin; tăng cường báo hiệu insulin và IGF-1; điều chỉnh tín hiệu GH, prolactin và EPO [64]

SH2B1 điều chỉnh nhiều đáp ứng tế bào: điều chỉnh sự tái tổ chức tế bào

và cơ vòng của tế bào thần kinh: nó có thể điều chỉnh hình thái tế bào, sự kết

dính, và sự di chuyển thông qua việc cải tổ tổ chức lại tế bào thần kinh ở các

tế bào nuôi cấy; SH2B1 trung gian điều chỉnh GH về sự kết dính và di chuyển của tế bào; thúc đẩy sự sống còn của thần kinh và sự khác biệt thần kinh [64]

1.3.4 Nghiên cứu gen SH2B1 ở chuột và thiếu hụt chức năng gen SH2B1

ở người:

1.3.4.1 Mô hình nghiên cứu ở chuột:

Năm 2002, Ohtsuka và cs đã nghiên cứu cho thấy SH2B1 có tác dụng điều chỉnh việc sinh sản ở chuột, SH2B1 được biểu hiện rất mạnh trong tinh hoàn

và buồng trứng, và sự xóa bỏ hệ thống của SH2B1 làm suy giảm khả năng

sinh sản ở cả chuột đực và chuột cái Kích thước trứng và số nang trứng thấp

hơn ở chuột cái SH2B1 KO Tương tự, kích thước tinh trùng và số tinh trùng cũng thấp hơn ở chuột đực SH2B1 KO Thiếu SH2B1 làm suy yếu cả hormon

kích thích nang trứng và sự truyền tải tín hiệu IGF-1 trong buồng trứng, góp

phần làm giảm khả năng sinh sản ở chuột KO SH2B1 [48]

Năm 2005, Ren và cs nghiên cứu cho thấy chuột bị thiếu SH2B1 có biểu

hiện ăn nhiều không kiểm soát, tăng lipid máu, kháng insulin và đái tháo

đường týp II [19] Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy, SH2B1 ngoại biên có

liên quan tới việc điều chỉnh độ nhạy insulin và chuyển hóa glucose trong

chuột [43]; SH2B1 trong tế bào β tụy trực tiếp thúc đẩy sự phát triển tế bào β

và bài tiết insulin ở chuột [18]

1.3.4.2 Ảnh hưởng ở người bị thiếu hụt chức năng gen SH2B1:

SH2B1 quy định nhiều quá trình sinh lý ở người Thiếu hụt gen SH2B1 sẽ

dẫn đến nhiều ảnh hưởng không tốt về chức phận sinh lý trong cơ thể sống: sự thâm hụt nhận thức, chậm phát triển và chứng tự kỷ [13],[9],[71]; liên quan tới sự phát triển thận và ruột bất thường, liên quan tới nhồi máu cơ tim, liên quan tới mức tăng triacylglycerol tuần hoàn [76], tăng nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường tuýp II [43]

Vùng sát tâm động của nhiễm sắc thể 16 có nhiều trùng lặp phân đoạn có khuynh hướng sắp xếp lại thông qua sự tái tổ hợp tương đồng không alen Anne - Claude và cs đã nghiên cứu về một gia đình có 3 bé trai bị chứng tự kỷ

và cho thấy sự sắp xếp lại vị trí trong gen SH2B1 16p11.2 (29.5-30.1 Mb) có

liên quan đến chứng tự kỷ, khuyết tật trí tuệ (ID), chứng rối loạn tăng thái quá, động kinh và tâm thần phân liệt [7]

1.3.5 Sự liên quan của gen SH2B1 với bệnh béo phì:

Các nghiên cứu ở nhiều dân tộc trên thế giới đã phát hiện ra mối liên quan

của gen SH2B1 đối với bệnh béo phì Mức độ biểu hiện gen tới bệnh có sự

khác nhau giữa các dân tộc, các quốc gia, các khu vực trên thế giới

SH2B1 được đưa ra nghiên cứu đầu tiên có liên quan tới béo phì vào năm

2007 bởi Jamshidi và cs, nó có liên quan đến tăng lipid máu, tăng trọng lượng

cơ thể, tăng tổng mỡ, và tăng vòng eo hông ở một nhóm phụ nữ da trắng ở Anh [88]

Năm 2009, một số SNPs ở gen SH2B1 đã được mô tả Trong GWAS, SH2B1 rs7359397 có liên quan đến chứng béo phì ở 249796 người trưởng thành ở Châu Âu [69] và người lớn Đan Mạch [51] SH2B1 rs4788102 có liên

quan đến chứng béo phì ở các cô gái Trung Quốc [85] và ở cộng đồng người

Nhật [72] SH2B1 rs4788099 liên quan đến tăng chỉ số BMI ở người gốc Âu,

và có liên quan đến nhiều khẩu phần của các sản phẩm sữa [27] SH2B1

rs8055982 có liên quan chứng béo phì trầm trọng ở trẻ em gốc Châu Âu [26] Hai nhóm nghiên cứu độc lập của Willer và Thorleifsson cùng cs đã đưa

ra báo cáo rằng SNP rs7498665 có liên quan đến di truyền học với bệnh béo phì ở người ở các nghiên cứu liên kết gen toàn cầu (GWAS) với quần thể lớn

(2009) [73][84] Kể từ đó, rs7498665 gen SH2B1 đã được báo cáo là có liên

quan đến chứng béo phì ở người lớn ở Thụy Điển [57], người Bỉ [11], trẻ em

gốc châu Âu [26], phụ nữ Trung Quốc [68], Hồng Kông [47], đoàn hệ MONIKA / KORA [31], đoàn hệ người Mexico [36], người Mỹ gốc Phi [30], liên quan đến tăng lượng chất béo ở những phụ nữ Hà Lan [10], được nghi ngờ là mang alen nguy cơ liên quan đến béo phì ở Nhật Bản [32] và Đức [28]

1.3.6 Cơ chế ảnh hưởng của gen SH2B1 đối với bệnh béo phì

Cơ chế ảnh hưởng của gen SH2B1 với bệnh béo phì được xác định là do

có liên quan đến hoạt động truyền leptin ở vùng dưới đồi có ảnh hưởng tới việc điều chỉnh sự kiểm soát năng lượng trong cơ thể

Trong quá trình bình thường: SH2B1 gắn vào JAK/STAT3 gây ức chế NPY/AgRP và kích hoạt POMC trong con đường truyền tín hiệu leptin ở vùng dưới đồi NPY/AgRP và POMC tạo ra αMSH và βMSH Sau đó αMSH

và βMSH kích hoạt hoạt động của MC3R, MC4R để điều hòa quá trình cân bằng năng lượng của cơ thể (tăng sự tiêu hao năng lượng và giảm lượng thức

ăn ăn vào) Khi SH2B1 bị mất đi hoặc giảm chức năng thì nó sẽ làm giảm đi

sự tác động của NPY, POMC tới αMSH và βMSH; và làm đảo ngược quá trình điều hòa cân bằng năng lượng cơ thể, làm giảm sự tiêu hao năng lượng

và tăng lượng thức ăn ăn vào, là yếu tố dẫn tới béo phì (hình 1.7) [87]

SH2B1 quy định tín hiệu leptin bằng nhiều cơ chế Trong trường hợp không có leptin, SH2B1 cấu tạo tương tác với JAK2 mà không phải là tyrosyl phosphoryl hóa và do đó không hoạt động; miền SH2 của SH2B1 không bắt buộc đối với sự liên kết này; tuy nhiên, leptin tăng đáng kể sự tương tác của SH2B1 với JAK2 Leptin kích thích sự phosphoryl Tyr813 trong JAK2 nhanh

chóng và mạnh mẽ, và Tyr813 bị phosphoryl hóa sau đó bị ràng buộc vào

miền SH2 của SH2B1 [89] Sự tương tác SH2B1-JAK làm tăng hoạt tính

kinase JAK2, do đó tăng cường sự báo hiệu leptin trên toàn hệ thống

Hình 1 7: Quá trình hoạt động bình thường của SH2B1 trong con đường

truyền tín hiệu leptin ở vùng dưới đồi [87]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Đối tượng nghiên cứu:

+ Người dân tộc Kinh có độ tuổi từ 40 – 64 tuổi sinh sống tại tỉnh Hà Nam, đồng ý tham gia nghiên cứu

+ Nhóm bệnh : người có chỉ số BMI ≥ 25 kg/m2

+ Nhóm đối chứng : người có chỉ số BMI trong khoảng 18, 5 – 22,9 kg/m2

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:

- Có dùng thuốc tăng hoặc giảm cân, thuốc giảm lipid máu

- Có điều trị dài ngày bằng thuốc nhóm corticoid, hormone

- Người mắc các bệnh cấp tính, mạn tính như: lao, nhiễm HIV/AIDS, đối tượng đang mang thai, đang nuôi con bú, có vấn đề về thần kinh hoặc không thể tham gia nghiên cứu

2.1.3 Cỡ mẫu

Cỡ mẫu cho nghiên cứu bệnh - chứng được tính theo công thức:

n =  

 OR    p p r

C r





1 ln

.

12

OR: tỷ số nguy cơ mong muốn phát hiện, lấy bằng 2

p: Tỷ lệ alen nguy cơ trong quần thể theo nghiên cứu, ước tính là 0,15 (15%) r: tỷ số giữa nhóm bệnh/nhóm chứng Lấy r = 0,5 (tức là 1 bệnh 2 chứng) Thay các giá trị vào công thức trên, tính được n = 577 Như vậy cỡ mẫu tối thiểu cần lấy là 577

Theo kết quả điều tra dịch tễ học tại tỉnh Hà Nam, có 2.710 người Kinh tuổi

từ 40 – 64 đã tham gia nghiên cứu, được đo cân nặng, chiều cao và được phỏng vấn Các đối tượng trên được điều tra ngẫu nhiên từ 30 xã/phường trong toàn tỉnh, mỗi xã/phường điều tra 100 người Từ những đối tượng trên, chọn được 200 người bị béo phì (BMI ≥ 25 kg/m2) cho nhóm bệnh và 400 người có BMI bình thường (18,5 – 22,9 kg/m2) cho nhóm đối chứng

Như vậy, với cỡ mẫu gồm 200 đối tượng béo phì và 400 đối tượng bình thường đáp ứng đủ cỡ mẫu nghiên cứu

2.1.4 Thời gian và địa điểm:

- Địa điểm triển khai thực địa: Tỉnh Hà Nam

- Địa điểm phân tích mẫu máu: Phòng thí nghiệm trung tâm - Viện Dinh dưỡng Quốc gia

- Thời gian thực hiện: từ tháng 9/2017 đến tháng 4/2018

2.2 Hóa chất và trang thiết bị

2.2.1 Hóa chất

- Hóa chất tách chiết DNA: bộ kit tách chiết DNA Winzard® Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Mỹ)

- Hóa chất sử dụng để PCR: nước khử ion (Fermentas, Mỹ), Dream Taq

Green PCR Master Mix (2X) (Fermentas, Mỹ), mồi (Fermentas, Mỹ)

- Hóa chất để ủ enzyme cắt giới hạn: nước khử ion, enzyme cắt giới hạn

BseYI (Biolabs- NEB, Anh) , dung dịch đệm tương ứng

- Hóa chất để điện di: agarose (Promega, Mỹ), đệm TBE (Fermentas, Mỹ),

Redsafe (Ion, Hàn Quốc), marker ΦΧ174 HaeIII (Promega, Mỹ), nước cất

2.2.2 Trang thiết bị

Các thiết bị, máy móc sử dụng trong quy trình phân tích gen gồm: Tủ an toàn sinh học (Esco, Singapore); tủ lạnh - 40

C, - 200C (Toshiba, Nhật Bản); máy NanoDrop 2000 (Nhật Bản); bể ổn nhiệt (Nhật Bản); máy votex (Eppendorf, Đức); máy PCR mastercycler epgradient (Eppendorf); máy điện di Mulpid Exu (Nhật Bản); máy ly tâm (Nhật Bản); máy minispin (Eppendorf); lò vi sóng; máy chụp Geldoc (BioRad, Mỹ) (hình 2.1)

Vật liệu tiêu hao gồm: ống eppendorf 1,5ml, ống PCR 0,2ml, đầu côn, găng tay, khẩu trang, giấy thấm, vv

Hình 2 1: Hình ảnh một số thiết bị đã dùng khi tiến hành phân tích gen

1.Tủ an toàn sinh học 2.Máy đo nanodrop 3.Tủ lạnh – 200

C 4.Pipet các loại 5.Máy Spin 6.Máy ủ nhiệt

7.Máy PCR 8.Cân phân tích 9.Lò vi sóng đun gel 10.Máy minispin 11.Máy điện di 12.Máy chụp gel GelDoc