KHẢO SÁT TỶ LỆ DƯƠNG TÍNH VIRUS PCV2 TRÊN HEO BỊ BỆNH HÔ HẤP VÀ TỶ LỆ CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG PCV2 TRÊN HEO KHỎE TRÊN ĐỊA BÀN TP.HỒ CHÍ MINH

Chúng tôi đã khảo sát 38 mẫu bệnh phẩm của các ca heo bệnh có triệu chứng trên đường hô hấp nghi nhiễm virus PCV2 bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR để phát hiện sự hiện diện của virus PCV2 v

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

*********

KHẢO SÁT TỶ LỆ DƯƠNG TÍNH VIRUS PCV2 TRÊN HEO

Tháng 08 / 2011

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS LÊ ANH PHỤNG ThS HUỲNH THỊ THU HƯƠNG

Tháng 08/2011

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ tên sinh viên thực tập: Trần Hữu Nghĩa

Tên khóa luận: “Khảo sát tỷ lệ dương tính virus PCV2 trên heo bệnh hô hấp và tỷ

lệ dương tính kháng thể kháng PCV2 trên heo khỏe trên địa bàn Tp.Hồ Chí Minh”

Đã hoàn thành sửa chữa luận văn theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn

và các ý kiến nhận xét, đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi – Thú Y ngày

Giáo viên hướng dẫn

TS LÊ ANH PHỤNG

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y – Bộ Môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm Cùng toàn thể quí thầy, quí cô đã tận tình giúp đỡ, chỉ dạy và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi trong suốt thời gian học tập

Chân thành biết ơn

Toàn thể cô chú và các anh chị của Trạm chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị thuộc Chi Cục Thú Y Tp.Hồ Chí Minh

Bs Nguyễn Thị Lệ Hằng, Ths Huỳnh Thị Thu Hương cùng toàn thể anh chị

kỹ thuật viên bộ môn Virus Huyết Thanh đã tận tình giúp đỡ cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

Cám ơn

Tất cả các bạn trong lớp Thú Y 32 và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài “Khảo sát tỷ lệ dương tính virus PCV2 trên heo bị bệnh hô hấp và tỷ

lệ có kháng thể kháng PCV2 trên heo khỏe trên địa bàn Tp.Hồ Chí Minh” được tiến hành tại trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị thuộc Chi Cục Thú Y Tp.HCM Qua thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 12/2010 đến tháng 6/2011, trong

số các hộ, cơ sở chăn nuôi với quy mô khác nhau thuộc địa bàn thành phố Hồ Chí Minh Chúng tôi đã khảo sát 38 mẫu bệnh phẩm của các ca heo bệnh có triệu chứng trên đường hô hấp nghi nhiễm virus PCV2 bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR để phát hiện sự hiện diện của virus PCV2 và 607 mẫu huyết thanh của heo khỏe mạnh chưa tiêm phòng vaccine PCV2 bằng kỹ thuật ELSIA để phát hiện sự hiện diện của kháng thể kháng PCV2

Kết quả nghiên cứu như sau:

(1) Các ca heo bệnh hô hấp nghi nhiễm virus PCV2 được gửi về phòng thí nghiệm để xác định virus có tỷ lệ dương tính thấp

(2 Heo khỏe ở một số hộ, cơ sở chăn nuôi thuộc địa bàn thành phố Hồ Chí Minh được khảo sát chứa kháng thể kháng virus PCV2 tương đối cao (76,94 %) (3) Kháng thể kháng PCV2 đã xuất hiện ở hầu hết các hộ, cơ sở chăn nuôi được khảo sát trong địa bàn thành phố Hồ Chí Minh

(4) Sự hiện diện của kháng thể kháng virus PCV2 trong các hộ, cơ sở chăn nuôi có quy mô công nghiệp tập trung là cao nhất (91,7 %)

(5) Kháng thể kháng virus PCV2 phát hiện trên hạng heo nái với tỷ lệ cao nhất (93,57%) trong các hạng heo được theo dõi trong quá trình nghiên cứu

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt luận văn iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xi

Danh sách các sơ đồ và biểu đồ xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Đặc điểm của virus PCV2 3

2.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái 3

2.1.2 Nuôi cấy 4

2.1.3 Sức đề kháng 5

2 2 Dịch tễ học 5

2.2.1 Phân bố bệnh 5

2.2.1.1 Phân bố trên thế giới 5

2.2.1.2 Lịch sử phân bố ở Việt Nam 5

2.2.2 Động vật cảm thụ bệnh 6

2.2.3 Chất có mầm bệnh 6

2.2.4 Đường xâm nhập và lây lan 6

2.2.5 Cơ chế sinh bệnh 6

2.2.6 Tính sinh miễn dịch 7

2 3 Triệu chứng và bệnh tích 8

2.3.1 Triệu chứng 8

2.3.2 Bệnh tích 8

2.3.2.1 Bệnh tích đại thể 8

2.3.2.2 Bệnh tích vi thể 9

2 4 Chẩn đoán 9

2.4.1 Chẩn đoán lâm sàng 9

2.4.2 Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm 10

2.4.2.1 Xét nghiệm tìm kháng thể chống lại virus PCV2 10

2.4.2.2 Xét nghiệm tìm virus PCV2 10

2.5 Các kỹ thuật sữ dụng trong nghiên cứu 11

2.5.1 Kỹ thuật PCR 11

2.5.1.1 Nguyên tắc chung 11

2.5.1.2 RT – PCR 12

2.5.1.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thú y và nghiên cứu PCV2 13

2.5.2 Kỹ thuật ELISA 14

2.5.2.1 Nguyên tắc 14

2.5.2.2 Các phương pháp ELISA 14

2.5.2.3 Một số ứng dụng của ELISA trong thú y và nghiên cứu PCV2 16

2.6 Các biện pháp quản lý và ngăn ngừa bệnh 16

2.7 Các nghiên cứu về bệnh do Porcine circovirus tại Việt Nam trong những năm gần đây 18

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm 20

3.1.1 Thời gian 20

3.1.2 Địa điểm 20

3.2 Vật liệu 20

3.2.1 Mẫu xét nghiệm 20

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 20

3.3 Nội dung nghiên cứu 21

3.4 Phương pháp nghiên cứu 21

3.4.1 Bố trí và cách lấy mẫu 21

3.4.1.1 Bố trí lấy mẫu 21

3.4.1.2 Cách lấy mẫu bệnh phẩm 22

3.4.1.3 Cách lấy mẫu huyết thanh 22

3.4.2 Phương pháp pháp hiện virus PCV2 trong mẫu 23

3.4.2.1 Sơ đồ chẩn đoán 23

3.4.2.2 Các bước tiến hành xét nghiệm 24

3.4.2.3 Phân tích kết quả 26

3.4.3 Phương pháp pháp hiện kháng thể PCV2 trong mẫu huyết thanh 26

3.4.3.1 Nguyên tắc 26

3.4.3.2 Cơ chế phản ứng 27

3.4.2.3 Tiến hành xét nghiệm 28

3.4.2.4 Đọc kết quả và công thức tính toán 29

3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 30

3.6 Xử lý số liệu 30

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Tỷ lệ heo phát hiện virus 31

4.2 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 33

4.3 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo khu vực 34

4.4 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo quy mô chăn nuôi 36

4.5 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo hạng heo 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 49

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCV: Porcine Circovirus

Ctv: Cộng tác viên

DNA: Acid Deoxyribo Nucleic

PCV1: Porcine Circovirus type 1

PCV2: Porcine Circovirus type 2

PMWS: Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome - Hội chứng còi trên heo con cai sữa

ORF: Open Reading Frame – khung đọc mở

PK15: Pig Kidny Cell Line 15 - Tế bào thận heo

PDNS: Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome - Hội chứng viêm da viêm thận

PRRS: Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome - Hội chứng rối loạn sinh

sản và hô hấp ở heo

PCR: Polymerase Chain Reaction

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IHC: Immunocytochenistry - Kỹ thuật mô hóa miễn dịch tế bào

ISH:in situ hybridisisation - Kỹ thuật lai trong mô

RT – PCR: Reverse Transcriptase – Polymerase Chain reaction

Ag: Antigen – kháng nguyên (KN)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 3.1 Số mẫu bệnh phẩm được gửi đến phòng xét nghiệm 21

Bảng 3.2 Bố trí lấy mẫu huyết thanh cho xét nghiệm 22

Bảng 3.3 Phân bố vị trí mẫu huyết thanh và đối chứng trên vỉ 96 giếng 29

Bảng 4.1 Tỷ lệ dương tính virus PCV2 trong bệnh phẩm của heo 32

Bảng 4.2 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 33

Bảng 4.3 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo khu vực 35

Bảng 4.4 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo quy mô 37

Bảng 4.5 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo hạng heo 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Virus PCV2 dưới kính hiển vi điện tử 3

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen virus PCV2 với 2 ORF1 và ORF2 điện tử 4 Hình 3.1 Kết quả kỹ thuật RT-PCR trên một số mẫu bệnh phẩm khảo sát 26

Hình 4.1 Đĩa 96 giếng thực hiện xét nghiệm ELISA của một số mẫu huyết thanh 34

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 3.1 Cơ chế phản ứng ELISA tìm kháng thể kháng PCV2 27

Sơ đồ 3.2 Qui trình phát hiện kháng thể kháng PCV2 bắng kỹ thuật ELISA 28

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo khu vực 36

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo quy mô 37

Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ huyết thanh heo chứa kháng thể kháng PCV2 theo hạng heo 39

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong giai đoạn, tự do cạnh tranh kinh tế để sản phẩm nông nghiệp của nước

ta có thể cạnh tranh với các nước khác thì nông sản của nước ta phải đạt các chỉ tiêu như là nông sản sạch, thực phẩm sạch, an toàn Điều này đã và đang trở thành vấn

đề cấp thiết của các thành phố lớn, nhất là thành phố Hồ Chí Minh (Tp.HCM) – nơi tiêu thụ số lượng lớn thịt heo

Cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi truyền thống, ngành chăn nuôi heo hiện đang phát triển theo quy mô công nghiệp từ nông thôn đến thành thị Hiện nay, tình hình dịch bệnh trên heo rất phổ biến nhất là các bệnh truyền nhiễm trong

đó có hội chứng còi cọc trên heo (PMWS) do Porcine Circovirus type 2 (PCV2)

gây ra Đây là bệnh xảy ra trên heo sau thời gian cai sữa bị còi cọc, tăng trọng kém,

da bị trắng bạch hoặc vàng, tỷ lệ chết cao, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho nhà chăn nuôi Nhằm giám sát, quản lý tình hình dịch bệnh trên gia súc, gia cầm nói chung trên heo nói riêng và tạo tâm lý ổn định để người dân an cư lập nghiệp, Chi Cục Thú Y thành phố Hồ Chí Minh (CCTY Tp.HCM) thường xuyên theo dõi sát sao tình hình diễn biến của dịch bệnh để phát hiện, xử lý và phòng chống kịp thời

Xuất phát từ những thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ môn Vi Sinh - Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường đại học Nông Lâm Tp.HCM, Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm & Điều Trị thuộc CCTY Tp.HCM và dưới sự hướng dẫn của TS Lê Anh Phụng, Ths Huỳnh Thị Thu Hương, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: “KHẢO SÁT TỶ LỆ DƯƠNG TÍNH VIRUS PCV2 TRÊN HEO BỊ

BỆNH HÔ HẤP VÀ TỶ LỆ CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG PCV2 TRÊN HEO

KHỎE TRÊN ĐỊA BÀN TP.HỒ CHÍ MINH”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Đánh giá tỷ lệ dương tính PCV2 trên đàn heo tại các quận huyện thuộc địa bàn thành Tp.HCM Thiết lập cơ sở dữ liệu phục vụ cho công tác phòng chống dịch trên địa bàn Tp.HCM

1.2.2 Yêu cầu

Sử dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain reaction) để phát hiện sự có mặt virus PCV2 trong các mẫu bệnh phẩm của heo bị bệnh hô hấp được gửi đến phòng xét nghiệm của trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị thuộc CCTY Tp.HCM

Sử dụng bộ kít SERELISA® PCV2 Ab Blocking của kỹ thuật ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) để phát hiện sự có mặt kháng thể kháng PCV2 trong các mẫu huyết thanh của heo ở các hộ, cơ sở chăn nuôi tại một số quận, huyện trên địa bàn Tp.HCM

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Đặc điểm của virus PCV2

2.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái

PCV thuộc họ Circoviridae, giống Circovirus, loài Porcine Circovirus

(Lukert và ctv, 1995) PCV là virus DNA sợi đơn dạng vòng, hình cầu, kích thước rất nhỏ 17nm, không có vỏ bọc và có khả năng sống sót cao trong môi trường (Nguyễn Tiến Hà, 2008) Gồm có 2 chủng được tìm thấy ở heo là PCV1 và PCV2 PCV có tỷ trọng trong CsCl là 1,33 – 1,34 (Buhk và ctv, 1985) Độ dài bộ gen của PCV1 là 1759 bp và của PCV2 là 1768 bp (Meehan và ctv, 1997).Trong đó, PCV1 không gây bệnh cho heo, nhưng PCV2 gây ra PMWS

Hình 2.1 Virus PCV2 dưới kính hiển vi điện tử (Muirhead, 2002)

Bộ gen của PCV1 và PCV2 gồm hai khung đọc mở chính (ORF1 và ORF2) theo hướng trực tiếp đối diện nhau Độ dài ORF1 của PCV1 và PCV2 lần lượt là

936 bp và 942 bp ORF1 mã hóa một protein liên quan đến sự nhân lên của virus PCV Sự tương đồng về trình tự nucleotide trên khung ORF1 giữa PCV1 và PCV2

là khoảng 86 % Khung đọc mở ORF2 của PCV1 và PCV2 có cùng độ dài là 699 bp

và mã hóa một protein chủ yếu liên quan đến hình thành vỏ capsid của virus PCV với trọng lượng xấp xỉ 30 kDa Sự tương đồng về trình tự trên khung ORF2 giữa PCV1 và PCV2 lần lượt là 67 % và 65 % về nucleotide và thành phần axít amin (Meehan và ctv, 1997; Hamel và ctv, 1998; Mahe và ctv, 2000; Nawagitgul và ctv, 2000)

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen virus PCV2 với 2 khung đọc mở ORF1 và ORF2 điện tử

(Muirhead, 2002)

2.1.2 Nuôi cấy

Trong phòng thí nghiệm, PCV nhân lên tốt nhất trên môi trường tế bào PK15 Sự nhân lên của virus có thể đánh giá bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang hoặc nhuộm hóa mô miễm dịch đối với hầu hết các tế bào bị nhiễm PCV Bằng kỹ thuật nhuộm nhân tập trung bệnh tích thể bao hàm ưa kiềm trong tế bào chất thỉnh thoảng cũng được tìm thấy trên những heo bị nhiễm PCV2 (Clark, 1997; Harding, 1997; Allan và ctv, 1999)

2.1 3 Sức đề kháng

PCV2 đề kháng cao với nhiều chất sát trùng thông thường (ethanol, iodine, chlorhexidine và formaldehyde), có thể tồn tại trong môi trường suốt nhiều tháng, chịu đựng được sức nóng 700C/15 phút và không bị vô hoạt ở pH = 3 Virus có thể được phân lập từ các mô lưu trữ ở -700C trong nhiều tháng (Ellis và ctv, 1998) Sodium hydroxide và Virkon’S với độ pha loãng 1 % rất hiệu quả nhất trong việc bất hoạt PCV2 (Royer và ctv, 2001)

2 2 Dịch tễ học

2.2.1 Phân bố bệnh

2.2.1.1 Phân bố trên thế giới

Năm 1982, ở Đức Tischer và ctv đã khám phá ra một loại virus mới trên heo

và đặt tên là Porcine circovirus (PCV) Virus này có khả năng gây bệnh trên tế bào

thận heo (PK15), có 2 chủng là PCV1 và PCV2 PCV1 được báo cáo lần đầu vào năm 1974 nhưng đến 1982 mới có ghi nhận cụ thể về tên của nó

Năm 1991, PCV2 xuất hiện lần đầu ở Cannada (Clark, 1997; Harding và Clark,1997)

Nhiều năm tiếp theo lần lượt được thông báo tại nhiều quốc gia như: Mỹ (1996), Anh (1998), Đức (2000), Thụy Điển (2003)… Kể cả các nước Châu Á: Đài Loan (1995), Thái Lan (1999), Philippine (2003)… Bệnh do PCV2 gây ra trở thành vấn đề thời sự với số ca bệnh không ngừng tăng và đứng đầu trong chương trình nghị sự của nhiều cuộc họp thú y trên thế giới (Lê Tiến Dũng, 2006)

2.2.1.2 Lịch sử phân bố ở Việt Nam

Lâm Thị Thu Hương và ctv (2005) xét nghiệm các mẫu hạch heo thu thập từ

4 trại chăn nuôi công nghiệp của Tp.HCM và các tỉnh lân cận bằng kỹ thuật PCR, kết quả có 36 % mẫu dương tính

Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2006) đã kiểm tra kháng thể chống lại virus PCV2 trong các mẫu máu lưu qua các năm trước, kết quả đã phát hiện có kháng thể dương tính trên các mẫu từ năm 2000 và có chiều hướng tăng dần qua các năm:

2000 (38,97 %), 2003 – 2004 (84,9 %), 2005 (90,26 %)

PCV2 được tìm thấy trên cả những đàn heo khỏe mạnh và đàn có sức khỏe kém (Lê Tiến Dũng, 2006)

2.2.2 Động vật cảm thụ bệnh

Heo là loài động vật cảm thụ mạnh với bệnh Hội chứng PMWS do PCV2 thường tác động lên heo từ 6 – 12 tuần tuổi, vài trường hợp trên 20 tuần tuổi Nhiều nghiên cứu cho thấy những heo con được hấp thu lượng kháng thể cao thì không nhiễm bệnh Những đàn heo dù lớn hay nhỏ với phương thức quản lý khác nhau đều

có thể nhiễm bệnh Trong một trại, một số heo có thể mắc chứng PMWS và chết nhưng số còn lại vẫn khỏe mạnh và phát triển bình thường (Vigre và ctv, 2005), hội chứng PMWS có thể tồn tại dai dẳng, từ 4 tháng đến trên 18 tháng (Lê Tiến Dũng, 2006)

2.2.3 Chất có mầm bệnh

Virus PCV2 tồn tại trong những heo mang trùng từ 5 – 6 tháng Bài thải theo phân, nước tiểu, dịch tiết ở mũi heo còn nhỏ, nước bọt, nước mắt của heo nhiễm sau

31 ngày, tinh dịch của heo đực (Kim và ctv, 2002)

2.2.4 Đường xâm nhập và lây lan

Đường xâm nhập chủ yếu theo đường hô hấp, đường máu, nhau thai và sinh dục (Nguyễn Đức Nhân, 2009)

Bệnh chủ yếu lây truyền từ heo bệnh sang heo khỏe qua phân và đường tiết niệu, qua tiếp xúc trực tiếp miệng, mũi, hoặc qua tinh dịch từ những nọc có bề ngoài khỏe mạnh Bệnh truyền lây qua nhau thai ở heo nái bị sẩy thai (Magar và ctv, 2000; Bolin và ctv,2001)

2.2.5 Cơ chế sinh bệnh

Cơ chế gây bệnh của PCV2 trên heo đến nay vẫn chưa được biết rõ (Neumann, 2002) Tuy nhiên, qua phương pháp gây nhiễm trên heo, Misinzo và ctv (2006) đã phát hiện PCV2 có trong nhiều loại tế bào như tế bào gan, biểu mô, lympho bào, tế bào cơ trơn và nguyên sợi bào Krakowka và ctv (2001) gây nhiễm qua đường mũi hay tiêm tĩnh mạch của heo thí nghiệm, và nhận thấy có sự hiện diện của bạch cầu đơn nhân và đại thực bào trong phổi, hạch hạnh nhân, hạch

lympho, lách và những cơ quan khác trong hệ thống miễn dịch Virus PCV2 có thể được phát hiện trong mô lympho vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm, còn tại phổi, gan, thận, dạ dày – ruột và lách khoảng ngày 14 - 21 sau gây nhiễm Tình trạng nhiễm virus xuất hiện lúc 14 ngày sau gây nhiễm và kéo dài 2 đến 4 tuần Sau gây nhiễm

21 ngày, phổi của thú có nhiều vùng bị xẹp và mất chức năng, hạch lympho (đặc biệt hạch bẹn cạn) sưng lớn và chuyển sang màu nâu

Đối với hệ thống miễn dịch, PCV2 tấn công vào tế bào đích là các tế bào hình sao và tương tác với các tế bào dòng tủy (tế bào lympho B, lympho T, tế bào

NK, ngoại trừ bạch cầu đơn nhân lớn) làm giảm bạch cầu lympho tại hạch hạnh nhân và hạch lympho để lại bệnh tích vi thể rất đặc trưng Mức độ cấp tính của bệnh tích vi thể và số lượng PCV2 trong bệnh tích có liên quan chặt chẽ với mức độ nghiêm trọng của biểu hiện lâm sàng PCV2 có thể làm hư hại hệ thống miễn dịch bằng cách ức chế miễn dịch (Nguyễn Tiến Hà, 2008)

Ngoài ra, virus PCV2 còn tác động làm giảm tiểu cầu nghiêm trọng gây xuất huyết mô kéo dài Sự tấn công của virus vào gan khởi đầu làm các tế bào gan, tế bào Kupffer bị sưng và triển dưỡng nên gan to ra; sau đó các tế bào này sẽ bị dung giải nên giảm số lượng và kích thước gan teo lại, đồng thời mật có thể bị ứ lại trong các ống mật khiến gan trở nên vàng (Nguyễn Đức Nhân, 2009)

Khi nhiễm PCV2 heo sẽ rối loạn hệ thống miễn dịch Đặc biệt là các hạch lympho sưng lớn, suy yếu và có sự xâm nhập của các bạch cầu đơn nhân và ái kiềm

Đặc trưng của hội chứng PMWS là sự giảm bạch cầu Tuy nhiên, không phải tất cả heo nhiễm PCV2 đều dẫn đến PMWS (Darwich, 2002)

2 3 Triệu chứng và bệnh tích

2.3.1 Triệu chứng (Lê Tiến Dũng, 2006)

Heo sau cai sữa 1 – 2 tuần thường có biểu hiện lâm sàng với diễn biến chậm

và có thể kéo dài trong nhiều tháng Heo mắc PMWS thường bị còi cọc và viêm phổi mãn tính (thở gấp, khó thở) Heo đang bình thường trở nên xanh xao, gầy ốm nhanh trong vòng 3 – 7 ngày và xuất hiện những con gầy nhất đàn Một số heo ho nhẹ, sốt, biếng ăn, thở khó, hoàng đản, rối loạn thần kinh trung ương, viêm kết mạc

và tiêu chảy nhẹ Heo bệnh có thể chết nhưng không chết ngay, số còn lại trong đàn khỏe mạnh và phát triển bình thường Tỷ lệ heo bệnh trong đàn có thể từ 3-50 % và

tỷ lệ chết lên đến 80 % trong số những heo nhiễm

Ngoài việc gây còi, trong những trại bị PMWS có một số heo con có biểu hiện đặc trưng khác là chứng viêm da Những đốm đỏ hồng thường xuất hiện không đều ở chân trước, vùng chậu, vùng mông và bụng Nếu bệnh kéo dài, da trở nên cứng Những chấm này có khuynh hướng tụ lại ở một phần cơ thể, có thể ở tai Những heo này đa số khỏe mạnh nhưng nhiễm bệnh đột ngột với tỷ lệ bệnh và chết cao do tổn thương thận nặng Những heo qua khỏi thường biểu hiệu suy nhược Đây

là dấu hiệu của bệnh viêm da sưng thận (PDNS) cũng do PCV2 gây ra

PMWS thường kết hợp với một số bệnh như viêm phổi, viêm phổi – màng phổi, bệnh Glasser, salmonellosis…

2.3.2 Bệnh tích

2.3.2.1 Bệnh tích đại thể

Cá thể nhiễm bệnh bị gầy, vàng da, lách và nhiều hạch bạch huyết sưng to, đặc biệt là hạch vùng bẹn sưng gấp 2 - 3 lần bình thường Tuy nhiên, vẫn phải đặt nghi vấn trong những trường hợp hạch bạch huyết sưng to Thận bị sưng phồng với những đốm trắng nhỏ có thể quan sát bằng mắt từ bề mặt Phổi thường xơ cứng, dính, có đốm phù nề, có vằn và dai Ngực, mô và ổ bụng bị phù nề hay tích nước

Heo nái nhiễm PCV2 có thể bị sẩy thai, thai khô, heo con chết khi sinh và viêm cơ tim rất nặng (Sanchez và ctv, 2001)

Trường hợp viêm phổi phụ nhiễm vi khuẩn có thể bị áp xe phổi và những vùng phổi xẹp rắn chắc thường xảy ra trên heo choai và heo lớn (Lê Tiến Dũng, 2006)

2.3.2.2 Bệnh tích vi thể

Bệnh tích thường thấy tại các tổ chức lympho (hạch hạnh nhân, hạch lympho, mảng Peyer của hồi tràng), lách, phổi, gan và thận

Cấu trúc nang bị tổn thương lan rộng với sự thiếu hụt tế bào lympho B và T

và được thay bằng một khối đồng nhất hay loang lỗ, sự xâm nhập của mô bào thỉnh thoảng thấy với tế bào đa nhân khổng lồ

Có sự hiện diện một số lượng lớn tế bào ưa kiềm giống như chùm nho, thể vùi trong tế bào chất

2 4 Chẩn đoán

Theo Hội Nghị Hợp Nhất Châu âu lần thứ 6 năm 2005 (European Consortium 6th Framework, 2005) dựa trên những tiêu chí của Sorden: dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích đại thể, bệnh tích vi thể đặc trưng, phát hiện được virus trong tổn thương

2.4.1 Chẩn đoán lâm sàng

Tuổi mắc bệnh thường từ 6 – 12 tuần có thể đến 20 tuần, giảm tăng trọng, chậm lớn, còi cọc, chết đột ngột, có thể kèm với chứng khó thở hoặc hoàng đản Tích nhiều dịch trong các xoang, suy thoái các tổ chức lympho, hạch lympho sưng lớn (nhất là hạch bẹn) và viêm nhiễm tại các cơ quan

Cần chẩn đoán phân biệt với những nguyên nhân làm heo còi khác như: suy dinh dưỡng, thiếu ăn, thiếu nước, loét dạ dày, viêm phổi địa phương, viêm ruột do

E.coli, hồng lỵ trên heo, hội chứng PRRS, PDNS (Pernek và ctv, 2002)

2.4.2 Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm

2.4.2.1 Xét nghiệm tìm kháng thể chống lại virus PCV2

Có thể sử dụng nhiều phương pháp: phương pháp trung hòa virus, miễn dịch gắn enzyme gián tiếp trên tế bào một lớp, miễn dịch huỳnh quang gián tiếp và phổ biến là kỹ thuật ELISA (xem thêm phần 2.5 Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu)

2.4.2.2 Xét nghiệm tìm virus PCV2

Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction): có thể áp dụng cho nhiều loại mẫu mô khác nhau, có độ chính xác và độ nhạy cao nên cần trang thiết bị tốt và kỹ thuật viên lành nghề, tránh tạp nhiễm trong quá trình thực hiện Kỹ thuật này không tốn nhiều thời gian (xem thêm phần 2.5 Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu)

Kỹ thuật ELISA (enzyme linked immunosorbent assay): tìm sự hiện diện của virus PCV2 trong phân Ưu điểm chính của phương pháp là việc thu thập mẫu phân

dễ dàng hơn so với thu thập mẫu máu hay huyết thanh Đây là phương pháp được triển khai bởi công ty Synbiotic, Pháp

Kỹ thuật mô hóa miễn dịch tế bào (IHC – immunocytochenistry): là kỹ thuật dùng kháng thể đa dòng để phát hiện virus PCV2 trong những mô được bảo quản trong thời gian dài, được cố định bằng formol, hay được vùi trong parafine Thực tế cho thấy kỹ thuật này nhạy hơn kỹ thuật lai trong mô (McNeilly và ctv, 1999)

Kỹ thuật lai trong mô (ISH - in situ hybridisisation): người ta dùng một đoạn DNA đánh dấu (labeled DNA probe) tương ứng với một phần đặc biệt của bộ gen virus PCV2 để phát hiện PCV (qua sự đổi màu) trong mô của heo còi cọc Kỹ thuật này tốn nhiều thời gian vì phải để qua đêm và các hóa chất tương đối đắt tiền Bù lại chúng có thể phát hiện được một số virus nếu có đồng nhiễm với virus PVC2 như virus giả dại, PRRS, Parvovirus (Kim và Cae, 2004)

Phân lập virus: phương pháp này liên quan đến việc nuôi cấy trên môi trường

tế bào PK15 được ly trích từ những mô của heo không nhiễm PCV1, nhưng cách này mất nhiều ngày và không nhạy khi so với kỹ thuật IHC hoặc ISH (Sorden, 2000) Về cơ bản, phân lập virus chủ yếu phục vụ cho việc bào chế vaccine và định

type virus Người ta không ứng dụng nó vào mục đích chẩn đoán hoặc chứng minh

sự không có mặt của PCV2 hay hội chứng PMWS trong đàn

2.5 Các kỹ thuật sữ dụng trong nghiên cứu

2.5.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

2.5.1.1 Nguyên tắc chung

Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm: DNA bản mẫu, mồi xuôi, mồi ngược, dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2, Taq polymerase

Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu 3’ của mạch khuôn DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Mồi xuôi (forward primer: F) tác động lên sợi DNA theo chiều từ 3’ 5’ Mồi ngược (reverse primer: R) tác động theo chiều từ 5’ 3’ Phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai mồi này (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Phản ứng PCR cho phép khuyếch đại từ một DNA ban đầu thành một số lượng lớn DNA và được thực hiện nhờ enzyme (DNA – polymerase) không cần đến

sự hiện diện của tế bào (Lê Đức Trình, 2001) Kỹ thuật này được thực hiện trên cơ

sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo ba giai đoạn Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ

920C đến 950C, hai chuỗi DNA được tách ra để làm khuôn mẫu tổng hợp mới 2 mạch bổ sung; Giai đoại ủ bắt cặp để lai phân tử, 2 mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn của DNA ở 2 đầu nhằm chuẩn bị cho sự kéo dài; Giai đoạn kéo dài tạo thành chuỗi DNA bổ sung với chuỗi DNA gốc

Mỗi chu kỳ gồm ba bước trên sẽ lặp đi lặp lại nhiều lần, lượng DNA được nhân lên theo cấp số nhân Ba giai đoạn xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau nên cần có máy luân nhiệt kiểm soát phản ứng với tính tự động hóa một cách chính xác Số chu kỳ lặp lại khoảng 30 lần để làm tăng một gen thành một khối lượng lớn hơn rất nhiều lần so với số lượng DNA ban đầu (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.5.1.2 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain reaction)

Cùng vời các phương pháp như Real time PCR, Nested PCR thì RT-PCR là một cải biến của phương pháp PCR thông thường nhằm đáp ứng những mục đích sử dụng khác nhau

Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên người ta sử dụng kỹ thuật RT-PCR Trước hết RNA được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Mồi sử dụng trong giai đoạn này là mồi ngược của PCR gia đoạn sau Có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với đuôi poly A của mRNA), mà cũng có thể là hexabucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với 1 trình tự ngắn trên RNA Sau đó cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase.Người ta cũng có thể sử dụng Tth polymerase cho cả 2 giai đoạn Kỹ thuật RT - PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phương pháp cổ điển như Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

RT-PCR một bước: Trong kỹ thuật RT-PCR một bước quá trình tổng hợp

cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra trong cùng một phản ứng

RT – PCR hai bước : trong kỹ thuật này quá trình tổng hợp cDNA và quá

trình khuếch đại diễn ra ở phản ứng tách biệt nhau

Tổng hợp cDNA trên khuôn RNA gồm ba bước :

-Ly trích RNA tổng số, trong đó có RNA của virus

- Tổng hợp cDNA reverse transcriptase Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, primer

để tổng hợp sợi DNA đầu tiên có thể được chuyên biệt với một gen đích hay có thể kết hợp với RNA Có ba loại primer có thể dùng trong tổng hợp cDNA

(1) Oligo (dT) : kết hợp với đuôi poly A của mRNA của động vật hữu nhũ (2) Primer chuyên biệt với trình tự đã chọn trên RNA đích

(3) Random hexanucleotide : có thể khởi đầu sự tổng hợp cDNA ở nhiều điểm trên RNA mẫu tạo ra nhiều đoạn bản sao của toàn phân từ RNA Chúng hữu dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai nên sự tổng hợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi Oligo (dT) hay primer chuyên biệt Trong hầu hết trường hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và

chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích Do đó primer chuyên biệt là lựa chọn tốt nhất Tiếp đến là Oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn Random hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau được sử dụng khi những phương pháp kia không hiệu quả

Khuếch đại cDNA lên nhiều bản bằng PCR Giai đoạn này gồm có 3 bước như sau:

• Biến tính : chuyển dây đôi thành dây đơn

• Bắt cặp: primer gắn vào vị trí chuyên biệt có trình tự bổ sung với nó trên cDNA khuôn mẫu

• Kéo dài : kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase

Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thông thường : 940

C, 550C,

720C) với sự trợ giúp của enzyme polymerase Sự lặp lại của chu kỳ thường xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng các DNA muốn có khoảng 100 triệu lần

Một kỹ thuật mới phát triển là kỹ thuật in situ RT- PCR cho phép khuếch đại

các RNA ngay trên mô tế bào Kỹ thuật này có nguyên tắc như trên, được tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame

2.5.1.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thú y và nghiên cứu PCV2

Năm 1985, Kary Mullis đã khám phá ra phương pháp PCR là một bước ngoặt trong công nghệ sinh học phân tử Phương pháp này có giá trị ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực như: khảo cổ học, y học, pháp y, sinh học, nông nghiệp,v.v…

Trong lãnh vực chăn nuôi, phương pháp PCR dùng phát hiện các gen có ưu thế tốt về giống, về năng suất sinh sản hoặc xác định giới tính khi truyền cấy phôi… Riêng về thú y, PCR được ứng dụng rất nhiều trong chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, virus, ký sinh trùng hay phát hiện gen halothane gây stress trên heo và phục vụ lãnh vực nghiên cứu điều chế vaccine… Một số bệnh trong thú y có thể dùng phương pháp PCR để chẩn đoán như dịch tả heo, cúm gia

cầm, PRRS, bệnh do Mycoplasma hyopneumioniae, Streptococcus suis, E coli gây

phù đầu trên heo con, bệnh do APP, Salmonella spp… và gần đây là hội chứng còi

cọc sau cai sữa do PCV2 (Lê Tiến Dũng, 2006)

Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được ứng dụng để phát hiện PCV2 trong mô được báo cáo vào năm 1997 bởi Narar và ctv

Trên thế giới, nhiều tác giả đã ứng dụng kỹ thuật PCR để tìm hiểu đặc tính của PCV2 trong những đàn có hoặc không có hội chứng PMWS như Allan và ctv (1998), Harmel (1998), Calsamiglia (2001), Kim (2002), Segales và Morvan (2004)…

Trong chẩn đoán những bệnh liên quan với PCV2, các tác giả Mori và ctv, 2000; Lyoo và Park, 2001; Royer và ctv, 2001 đều nhận định kỹ thuật PCR là rất nhạy và đặc hiệu trong chẩn đoán xác định PCV2

Nghiên cứu về PCV2 bằng những phương pháp xét nghiệm khác nhau, Stevenson (2000) nhận định kỹ thuật PCR là nhạy nhất, kế đến là kỹ thuật lai trong

mô và thấp nhất là phân lập virus Ouardani và ctv (1999) cho biết độ nhạy của kỹ thuật PCR trong phát hiện PCV2 có thể đạt đến 5pg DNA của virus

2.5.2 Kỹ thuật ELISA (Nguyễn Minh Nam, 2010)

2.5.2.1 Nguyên tắc

ELISA là kỹ thuật huyết thanh học dùng để phát hiện kháng nguyên (Antigen-Ag) hoặc kháng thể (Antibody-Ab) trong mẫu ELISA dựa trên nguyên tắc cơ bản là sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể trong điều kiện invitro Kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu thì được gắn với 1 enzyme Enzyme này khi gặp cơ chất thích hợp sẽ tạo phản ứng màu và cho kết quả dương tính

Kỹ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia là: kháng nguyên, kháng thể và

chất tạo màu

2.5.2.2 Các phương pháp ELISA

ELISA trực tiếp (Direct ELISA)

Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA để phát hiện kháng nguyên Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá

thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất qua phản ứng tạo màu của cơ chất với enzyme đã được gắn sẵn trên kháng thể Kết quả được đo bằng máy đo màu (máy đo độ phát quang hóa học hay máy phát huỳnh quang)

Ưu điểm: Đơn giản nhất

Nhược điểm: Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất

là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope Thứ hai là phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng

ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)

Phương pháp này phức tạp hơn ELISA trực tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể

khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

Phương pháp tiến hành như sau: Đầu tiên, gắn kháng nguyên cần tìm lên giá thể (đĩa 96 giếng) Sau khi ủ và rửa đĩa thì cho kháng thể sơ cấp đặc hiệu vào đĩa Kháng thể này sẽ bắt cặp với kháng nguyên Tiếp tục, cho kháng thể thứ cấp có gắn enzyme vào đĩa Sự kết hợp giữa kháng thể thứ cấp với kháng thể sơ cấp diễn ra Và được xác định nhờ vào phản ứng tạo màu của cơ chất với enzyme gắn trên kháng thể thứ cấp Cuối cùng, kết quả được đo bằng máy đo màu (máy đo độ phát quang hóa học hay máy phát huỳnh quang)

Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng cho nhiều loại kháng

nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa

Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau Điều

này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được

ELISA kẹp chả (Sandwich ELISA)

Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Được gọi là “kẹp chả” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies) với kháng nguyên Kỹ

thuật này cũng được phân làm hai dạng là ELISA kẹp chả trực tiếp và ELISA kẹp chả gián tiếp

Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử

dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau, có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác

Nhược điểm: Nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống

nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện Mối quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm

2.5.2.3 Một số ứng dụng của ELISA trong thú y và nghiên cứu PCV2

Xác định số lượng của KT trong huyết thanh

Kiểm tra sự có mặt của KN

Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thức ăn

Xác định sự có mặt của dược phẩm

Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học

Sử dụng phương pháp ELISA cạnh tranh để phát hiện PCV2 có độ nhạy đến 99,5% và độ đặc hiệu 97,1% so với phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) va xét nghiệm miễn dịch peroxidase gián tiếp trên tế bào một lớp (IPMA)

(Walker và ctv, 2000)

Sử dụng kít ELISA để đo hiệu giá kháng thể kháng PCV2 và đáp ứng của

heo đối với vaccine phòng PMWS (Nguyễn Đức Nhân, 2009)

2.6 Các biện pháp quản lý và ngăn ngừa bệnh

Hiện nay đã có vaccine vô hoạt CIRCOVAC tiêm phòng cho heo nái nhằm truyền kháng thể thụ động qua sữa đầu cho heo con chống lại hội chứng PMWS Sau 1,5 năm thử nghiệm thành công vaccine này tại Pháp và Đức, đến nay CIRCOVAC đã trở thành vaccine thương mại bán tại Mỹ, nhiều nước Châu Âu và tại một số nước khác (Nguyễn Đức Nhân, 2009)

Đối với heo con, việc tiêm phòng vaccine chống sự nhiễm PCV2 vẫn còn trong giai đoạn thử nghiệm Kết quả bước đầu cho thấy, những heo con được tiêm vaccine có thành phần DNA của virus và protein kết hợp hoặc vaccine PCV2 sống

có chất bổ trợ đã chứng tỏ có thể bảo vệ heo con chống lại sự tấn công cường độc virus PCV2 (Charreyre và ctv, 2005)

Thông qua thử nghiệm thành công tại Pháp, Madec (2001) đã nêu ra “4 quy

luật vàng” trong việc kiểm soát bệnh PMWS:

- Một là hạn chế việc tiếp xúc giữa các đối tượng heo thông qua giảm một phần mật độ đàn

- Hai là thú bị stress là cơ hội để bệnh bộc phát Nếu hệ thống miễn dịch bị kích thích thái quá, PCV2 có thể gây bệnh

- Ba là nhu cầu dinh dưỡng phù hợp theo lứa tuổi

- Bốn là đảm bảo các điều kiện vệ sinh và an toàn sinh học

Krakowka (2006) khuyến cáo nếu áp dụng ít nhất 16 điểm trong kế hoạch

20 điểm của Madec có thể làm giảm tỷ lệ chết trong những trại có vấn đề PMWS hoặc PDNS nghiêm trọng:

Heo con theo mẹ

(1) Các chuồng nái nuôi con giữa các lứa cần dọn sạch phân, chất độn chuồng; rửa và sát trùng chuồng sạch sẽ, áp dụng biện pháp cùng vào - cùng ra

(2) Heo nái trước khi sinh cần tắm sạch sẽ và tẩy ký sinh trùng

(3) Chỉ thực hiện ghép bầy khi thật cần thiết và trong vòng 24 giờ sau khi sinh

Heo sau cai sữa

(4) Các ô chuồng nhỏ, vách ngăn kín (<13 con/ ô chuồng)

(5) Dọn sạch phân, rửa chuồng và sát trùng, áp dụng biện pháp cùng vào – cùng ra

(6) Mật độ tối đa 3 heo con/m2

(7) Chiều dài máng ăn ước tính 7cm/heo con

(8) Cải thiện mức độ thông thoáng (NH3< 10ppm, CO2 < 0,15 %)

(9) Kiểm soát nhiệt độ chuồng nuôi

(10) Không trộn lẫn các lứa heo (1 lứa trong 1 chuồng)

Heo nuôi thịt

(11) Diện tích ô chuồng nhỏ, vách ngăn kín

(12) Dọn sạch phân, chất độn chuồng, tẩy uế và sát trùng chuồng sạch sẽ,

áp dụng biện pháp cùng vào - cùng ra

(13) Không trộn lẫn heo con từ các ổ khác nhau sau cai sữa

(14) Không trộn lẫn heo giữa các ô chuồng nuôi thịt

(15) Mật độ nuôi tối đa 0,75m2

/heo

(16) Cải thiện độ thông thoáng và nhiệt độ chuồng nuôi

Các biện pháp khác

(17) Quy trình tiêm chủng phù hợp

(18) Chuồng được thiết kế sao cho tránh mưa tạt, gió lùa

(19) Đảm bảo các điều kiện vệ sinh (như cắt đuôi, cắt tai đánh số, bấm răng, tiêm chích đảm bảo vô trùng.…)

(20) Heo bệnh phải sớm chuyển sang khu vực nuôi cách ly hoặc giết hủy

2.7 Các nghiên cứu về bệnh do Porcine circovirus tại Việt Nam trong những năm gần đây

Lâm Thị Thu Hương và ctv (2005) bước đầu ghi nhận về sự hiện diện của virus PCV2 trên heo có biểu hiện còi tại 4 trại chăn nuôi công nghiệp Các tác giả thu thập 25 bộ mẫu hạch (hạch bẹn, hạch phổi và hạch ruột) heo còi và sử dụng kỹ

thuật PCR để phát hiện Kết quả 3/4 trại dương tính theo tỷ lệ từ 25 – 60 %; nếu xếp theo tuổi nhiễm thì cao nhất là từ 9 - 11 tuần với tỷ lệ chết là 40 %

Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2006) bằng kỹ thuật miễn dịch peroxidase trên

tế bào một lớp (IPMA) khảo sát hồi cứu 988 mẫu huyết thanh của heo nái và nọc ở một số tỉnh phía nam được lưu trữ từ năm 2000 và có chiều hướng tăng dần qua các năm: 2000 (38,97 %), 2003-2004 (84,9 %), 2005 (90,26 %)

Lê Tiến Dũng (2006) bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) đã phát hiện 50,77% heo còi dương tính với virus PCV2 tại 17 trên 22 trại khác nhau của 5 trên 6 địa bàn lấy mẫu Tỷ lệ heo còi dương tính với virus có biểu hiện hô hấp là 62,5%

Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008) phân tích về di truyền của virus trên mẫu hạch, huyết thanh và một số nội tạng của heo thu thập từ năm 2002 - 2007 tại

khu vực nam bộ Tác giả cho thấy sự tương đồng về trình tự gen của virus giữa 5 mẫu khảo sát Tác giả cũng thực hiện phân lập virus trên tế bào PK15 và gây bệnh thực nghiệm cho 4 heo 21 ngày tuổi Kết quả cho thấy phát hiện được DNA của virus PVC2 sớm nhất là 7 ngày sau khi gây nhiễm và có sự chuyển đổi kháng thể trong huyết thanh từ 4 ngày sau khi gây nhiễm

Nguyễn Tiến Hà (2008) sử dụng kỹ thuật PCR và IPMA cho thấy trên heo thịt tỷ lệ dương tính với virus PCV2 cao nhất là ở 120 ngày tuổi (97,73 %) Đồng thời qua phân tích trình tự nucleotide tác giả cho biết mức độ tương đồng giữa ba trình tự của các chủng Vietnam1, Vietnam2, Vietnam3 (trên 99%) và giữa các trình

tự này với Vietnam5 là 96% Khi gây bệnh thực nghiệm trên heo 35 ngày tuổi với chủng Vietnam3 đã phát hiện DNA của virus PCV2 trong huyết thanh có sự chuyển đổi kháng thể trên heo gây nhiễm