THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY MÁU HEO TRONG BÌNH KÍN CÓ CHỨA 1,32 G MUỐI NaHCO NHẰM PHỤC VỤ CHO VIỆC NGHIÊN CỨU NHIỄM SẮC THỂ 3

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y **************** NGUYỄN THỊ KIM THÙY THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY MÁU HEO TRONG BÌNH KÍN VIỆC NGHIÊN C

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y

****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY MÁU HEO TRONG BÌNH KÍN

VIỆC NGHIÊN CỨU NHIỄM SẮC THỂ

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM THÙY Lớp: DH07TA

Ngành: Chăn Nuôi Niên khóa: 2007 - 2011

Tháng 08/2011

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

****************

NGUYỄN THỊ KIM THÙY

THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY MÁU HEO TRONG BÌNH KÍN

VIỆC NGHIÊN CỨU NHIỄM SẮC THỂ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư chăn nuôi chuyên

ngành Thức ăn

Giáo viên hướng dẫn

ThS QUÁCH TUYẾT ANH ThS BÙI THỊ TRÀ MI

Tháng 08/2011

PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Kim Thùy

Tên đề tài: “Thử nghiệm nuôi cấy máu heo trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO 3 nh ằm phục vụ cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể”

Đã hoàn thành luận văn theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý

kiến nhận xét, đóng góp của hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi Thú Y ngày … tháng…… năm ……

Giáo viên hướng dẫn

ThS Bùi Thị Trà Mi

C ẢM TẠ

 Kính dâng lòng biết ơn đến

Những người đã tận tình chăm sóc, dạy bảo, an ủi, động viên và hi sinh suốt đời cho con có được ngày hôm nay

 Chân thành cảm tạ

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình

giảng dạy và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập tại đây

ThS Quách Tuyết Anh, ThS Bùi Thị Trà Mi đã tận tình giảng dạy, hướng

dẫn, động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập

và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Thầy, cô và các anh chị trong trại heo khoa Chăn Nuôi Thú Y trường Đại

Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài

Thầy Đoàn Trần Vĩnh Khánh đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

 Cảm ơn

Cảm ơn tất cả bạn bè trong và ngoài lớp Thức ăn 33 đã giúp đỡ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn Cảm ơn bạn Tú, Hưng, Hải lớp Chăn nuôi 33

Xin nhận ở tôi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất

Nguy ễn Thị Kim Thùy

TÓM TẮT

Đề tài đã được thực hiện từ tháng 2/2011 đến tháng 7/2011 tại phòng thí nghiệm Bộ Môn Di Truyền Giống Động Vật và Phòng Nuôi Cấy Vi Sinh thuộc bộ môn Vi Sinh - Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi - Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm

Tp Hồ Chí Minh với mục tiêu nghiên cứu là thử nghiệm nuôi cấy máu heo trong bình kín có chứa 1,32 g NaHCO3 nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể

Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn:

• Giai đoạn 1: Lấy mẫu máu và nuôi cấy mẫu trong vòng 72h Máu được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung các chất giúp cho sự phát triển của tế bào như huyết thanh phôi bò (FBS), phytohemaglutinin (PHA), kháng sinh penicillin - streptomycin (1X) Mẫu được nuôi ở 2 môi trường: và môi trường trong bình kín thể tích 2 l có chứa 1,32 g muối NaHCO3 và môi trường chuẩn - trong tủ

ấm CO2 với CO2 điều chỉnh tự động ở mức 5 % Ở giai đoạn này quan sát sự phát triển của mẫu dựa vào mắt thường

• Giai đoạn 2: Sau 72h nuôi cấy mẫu được xử lý và nhuộm nhiễm sắc thể bằng dung dịch Giemsa Sau đó quan sát trên kính hiển vi dưới độ phóng 400X và 1000X

và chụp hình nhiễm sắc thể

Kết quả:

• Nuôi cấy mẫu trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO3 cho kết quả khả quan về sự phát triển của tế bào lympho (80%) Điều này sẽ giúp các phòng thí nghiệm có thể chủ động nghiên cứu NST bằng quy trình nuôi cấy tế bào lympho khi không có tủ ấm có CO2 tự động

• Điều kiện ngoại cảnh có thể ảnh hưởng rất lớn đến kết quả, do đó khi thí

nghiệm cần chú ý đến vần đề này

• Trong quá trình nghiên cứu ta có thể loại bỏ mẫu căn cứ vào biểu hiện về

màu sắc, độ đông vón và nhiễm khuẩn

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Phiếu xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về heo 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý 3

2.1.3 Đặc điểm của máu heo 3

2.2 Nhiễm sắc thể 4

2.2.1 Khái niệm 4

2.2.2 Hình thái kích thước 5

2.2.3 Tính đặc trưng của NST 5

2.2.4 Cấu trúc NST 5

2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của NST 5

2.2.4.2 Cấu trúc siêu hiển vi của NST 7

2.3 Chu kì sống của tế bào 9

2.3.2 Nguyên phân 10

2.3.2.1 Kỳ đầu (prophase) 10

2.3.2.2 Kỳ giữa (metaphase) 10

2.3.2.3 Kỳ sau (anaphase) 11

2.3.2.4 Kỳ cuối (telophase) 11

2.4 Nghiên cứu về kiểu nhân của heo 12

2.5 Kĩ thuật Splash 13

2.5.1 Các nguồn nguyên liệu nuôi cấy 14

2.5.2 Chất kích thích tế bào phân chia 15

2.5.3 Chất ức chế nguyên phân 15

2.5.4 Dung dịch xử lý tế bào 16

2.6 Vai trò của khí CO2 trong sự phát triển tế bào nuôi cấy in vitro 17

2.6.1 Cacbon dioxit (CO2) 17

2.6.2 Các thuộc tính hóa lý 17

2.6.3 Đặc tính sinh học 18

2.5.4 Vai trò của CO2 trong sự phát triển của tế bào 19

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm 20

3.2 Đối tượng 20

3.3 Nội dung nghiên cứu 20

3.4 Thiết bị và hóa chất 20

3.4.1Thiết bị 20

3.4.2 Hóa chất 21

3.4.2.1 Môi trường nuôi cấy tế bào bạch cầu 21

3.4.2.2 Các dung dịch sử dụng trong quá trình nhược trương, lên tiêu bản và nhuộm NST 22

3.5 Phương pháp nuôi cấy 22

3.5.1 Phương pháp lấy máu heo 22

3.5.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 23

3.6 Kĩ thuật xử lý nhược trương, lên tiêu bản và nhuộm NST 26

3.6.1 Xử lí mẫu bằng dung dịch nhược trương và dung dịch cố định 26

3.6.2 Chuẩn bị lame và nhuộm NST 27

3.6.3 Chụp hình kì giữa và làm karyotype 27

3.7 Các chỉ tiêu khảo sát 27

3.8 Xử lý số liệu và hình ảnh 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Độ đông vón của mẫu ở 2 điều kiện nuôi cấy qua các mốc thời gian 29

4.2 Tình trạng nhiễm khuẩn của mẫu 32

4.3 Màu sắc của các mẫu ở 2 điều kiện nuôi cấy qua các mốc thời gian 33

4.4 Kết quả nhuộm NST ở 2 điều kiện nuôi cấy 35

4.5 Tình trạng bạch cầu 37

4.6 Kiểu nhân của heo 41

4.7 Một số nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy và nhuộm NST 42

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 51

DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxirybonucleic

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry RPMI Roswell Park Memorial Institute

FBS Fetal Bovine Serum

PHA Phytohaemagglutinin

DANH SÁCH CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Số lượng NST của một số loài 5

Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy 1 ml máu 22

Bảng 4.1 Độ đông vón của mẫu ở 2 điều kiện nuôi cấy qua các mốc thời gian 29

Bảng 4.2 Số lượng mẫu bị nhiễm khuẩn 32

Bảng 4.3 Màu sắc của các mẫu ở 2 điều kiện nuôi cấy qua các mốc thời gian 34

Bảng 4.4 Tỉ lệ thành công ở 2 điều kiện nuôi cấy 35

Bảng 4.5 Tỉ lệ tình trạng bạch cầu ở hai điều kiện nuôi cấy 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Nhiễm sắc thể 4

Hình 2.2 Các dạng nhiễm sắc thể 6

Hình 2.3 Cấu trúc NST 7

Hình 2.4 Cấu trúc siêu hiển vi và phân tử của nhiễm sắc thể 8

Hình 2.5 Chu kỳ tế bào 9

Hình 2.6 Kỳ đầu của quá trình nguyên phân 10

Hình 2.7 Kỳ giữa quá trình nguyên phân 11

Hình 2.8 Kỳ sau quá trình nguyên phân 11

Hình 2.9 Kỳ cuối quá trình nguyên phân 12

Hình 2.10: Kiểu nhân của heo đực (Gustavsson, 1972) 13

Hình 3.1 Phương pháp lấy máu tĩnh mạch cổ 23

Hình 3.2 (a) Chai Rough chứa môi trường nuôi cấy, (b) Chai Rough sau khi cho thêm 1ml máu vào môi trường nuôi cấy 23

Hình 3.3 Mẫu nuôi cấy trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO3 25

Hình 3.4 Mẫu nuôi cấy trong tủ ấm CO2 25

Hình 4.1 Mẫu bị đông vón thành cục máu đông 30

Hình 4.2 Mẫu bị đông vón thành từng mảng, máu bị nhạt màu 31

Hình 4.3 Mẫu bị đông vón bám trên thành bình nuôi cấy 31

Hình 4.4 Mẫu bị nhiễm khuẩn trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO3 33

Hình 4.5 Màu sắc của mẫu nuôi cấy tốt sau 72 h (a) Mẫu nuôi cấy ở tủ ấm CO2, (b) Mẫu nuôi cấy ở môi trường bình kín chứa 1,32 g muối NaHCO3 35

Hình 4.6 NST bung đều khi trong tủ ấm CO2 (1000X) 36

Hình 4.7 NST bung đều khi mẫu nuôi cấy trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO3 (1000X) 36

Hình 4.8 Bốn loại bạch cầu trong mẫu nuôi cấy tủ ấm CO2 (400X) 37

Hình 4.9 Bốn loại bạch cầu trong bình kín chứa 1,32 g muối NaHCO3 (400X) 38

Hình 4.10 Các dạng nhiễm sắc thể (1000X) 38

Hình 4.11 Bộ NST của heo cái 41

Hình 4.12 Bộ NST của heo đực 42

Hình 4.13 NST bung đều, nhưng bị co ngắn khi nuôi cấy trong bình kín (1000X)

43

Hình 4.14 NST bị co ngắn do ủ colcemid lâu khi nuôi cấy ở tủ ấm CO2 (1000X)

44

Hình 4.15 NST chưa bung màng nhân (1000X) 44

Hình 4.16 NST bị xử lý KCl quá mức nên bị tách rời ra (1000X) 45

Hình 4.17 NST bị rạn, nứt do ủ KCl lâu (1000X) 45

Hình 4.18 Hai NST nằm cạnh nhau, chưa bung đều (1000X) 46

Hình 4.19 NST bị văng ra xa, khó phân biệt toàn bộ bộ NST (1000X) 46

Hình 4.20 NST bung đều, đẹp (1000) 47

và acid ribonucleic (ARN) mang gen quy định kiểu hình của cơ thể Sự biến đổi về cấu trúc, hoặc số lượng NST có thể dẫn đến những biến đổi ở kiểu hình bên ngoài lẫn những tác động bên trong cơ thể gây ra những dị tật di truyền, kém phát triển, mất khả năng sinh sản hoặc chết

Ở nước ta, việc nghiên cứu NST trên người rất được quan tâm, tuy nhiên trên vật nuôi thì vấn đề này chưa nhận được sự quan tâm nhiều Trong khi nó lại rất cần thiết trong công tác giống gia súc, gia cầm nhất là khi sử dụng thụ tinh nhân tạo và kiểm tra đời sau Trong chọn giống, nếu phát hiện sớm những bất thường ở NST thì

có thể làm giảm bớt mức thiệt hại về kinh tế Theo 1 nghiên cứu ở Pháp (Ducos và cộng sự, 2008), ước tính mức thiệt hại kinh tế nếu sử dụng 1 con heo nọc mang NST bất thường để làm giống trong ít nhất 4 tháng là khoảng 20.000 euros

Để tiến hành nghiên cứu NST, đòi hỏi các phòng thí nghiệm phải được trang

bị đầy đủ các thiết bị hiện đại như tủ ấm CO2, buồng cấy vô trùng…, tuy nhiên không phải phòng thí nghiệm nào cũng đáp ứng được yêu cầu này

Dựa trên những điều kiện sẵn có và được sự phân công của khoa Chăn Nuôi Thú Y, dưới sự hướng dẫn của ThS Quách Tuyết Anh và ThS Bùi Thị Trà Mi

chúng tôi thực hiện đề tài: “Thử nghiệm nuôi cấy máu heo trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO 3 nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể”

Nhằm định hướng, mở rộng phương pháp nuôi cấy tế bào, phục vụ cho việc nghiên cứu NST trong các điều kiện khác nhau

1.2 Mục tiêu

Thử nghiệm nuôi cấy máu heo trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO3

nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể

1.3 Yêu cầu

• Nuôi cấy tế bào lympho đến giai đoạn trung kỳ trong bình kín trong 2 điều kiện:

o Trong điều kiện có chứa 1,32 g muối NaHCO3

o Trong điều kiện chuẩn - trong tủ ấm CO2 với CO2 điều chỉnh tự động

ở mức 5 %

• Đánh giá sự phát triển của tế bào lympho khi nuôi cấy ở hai điều kiện trên

• Tiến hành nhuộm NST bằng phương pháp nhuộm Giemsa và sắp xếp bộ NST của heo

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về heo

Heo nhà có nguồn gốc từ heo rừng Châu Âu (Sus scrofa) và heo rừng Châu

Á (Sus cristatus và Sus vittatus) Heo được thuần hóa nhiều trên thế giới Các giống heo ở Đông Nam Á được thuần hóa ở Ấn Độ Có tài liệu cho rằng heo còn được thuần hóa ở vùng Siberi và Châu Âu, ở vùng ven biển Ban Tích hay ở vùng núi Alpes (Phạm Trọng Nghĩa, 2008)

2.1.3 Đặc điểm của máu heo

Ở heo khối lượng máu chiếm khoảng 7 - 8 % trọng lượng cơ thể Lấy máu chống đông rồi cho vào ống nghiệm ly tâm, ta thấy máu phân thành 2 lớp rõ rệt Phần trên là huyết tương trong và vàng nhạt chiếm 55 - 60 % thể tích, phần dưới là

tế bào máu, đặc và đỏ thẫm, chiếm 40 - 45 % thể tích

Tế bào máu có ba loại tế bào là hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu Số lượng hồng cầu khoảng 6 - 8 triệu trong 1 mm3, chiếm hơn 90 % tế bào máu

Hồng cầu có vai trò vận chuyển O2, CO2 và tham gia điều hòa pH máu

Số lượng tiểu cầu khoảng 150.000 - 600.000 trong 1 mm3, khi mạch máu vỡ, tiểu cầu gắn vào bề mặt vết thương, giải phóng enzym thrombokinase có tác dụng làm đông máu Khi nuôi cấy tế bào máu, người ta dùng heparin để chống đông máu

Số lượng bạch cầu của heo 12.000 trong 1 mm3 có nhiệm vụ bảo vệ cơ thể

Có 5 loại bạch cầu chia làm 2 nhóm: bạch cầu có hạt và bạch cầu không hạt Bạch cầu có hạt có ba loại: trung tính, ưa acid và ưa base Bạch cầu không hạt có hai loại: đơn nhân lớn và lympho Trong đó, bạch cầu lympho có khả năng phân chia nhanh

và nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro

2.2 Nhiễm sắc thể

2.2.1 Khái niệm

Là những cấu trúc nằm trong nhân tế bào, có khả năng nhuộm màu đặc trưng bằng thuốc nhuộm màu kiềm tính NST tồn tại trong tế bào thành từng cặp, được xem là cơ sở vật chất của hiện tượng di truyền ở cấp độ tế bào, có những biến đổi hình thái và hoạt động mang tính chu kỳ trong quá trình phân bào

Hình 2.1 Nhiễm sắc thể

( Nguồn: http://www.cbs.dtu.dk/dtucourse/cookbooks/dave/Fig6_20b.JPG)

2.2.2 Hình thái và kích thước

NST của các loài có nhiều hình dạng khác nhau: dạng hạt, que, hình chữ V, hình móc Điển hình là NST có hình chữ V với 2 cánh kích thước bằng nhau hoặc khác nhau Chiều dài của NST từ 0,2 - 50 mm, đường kính 0,2 - 2 mm Kích thước các NST sai khác nhau rất lớn Giữa các loài khác nhau sự sai khác này có thể lên tới hơn 100 lần, trong khi một số NST trong một loài có kích thước hơn kém nhau khoảng 10 lần

2.2.3 Tính đặc trưng của NST

- Mỗi loài sinh vật có bộ NST đặc trưng về số lượng, hình dạng, kích thước

- Đặc trưng về số lượng, thành phần, trình tự phân bố các gen trên mỗi NST

- Đặc trưng bởi các tập tính hoạt động của NST tái sinh, phân li, tổ hợp, trao đổi đoạn, đột biến về số lượng, cấu trúc NST

Bảng 2.1: Số lượng NST của một số loài

Người (Homo Sapiens) 2n = 46

Tâm động chia thể nhiễm sắc thành hai vai, chiều dài của hai vai phụ thuộc vào vị trí tâm động Người ta thành lập chỉ số tâm động (tâm động index - Ic) để xác định vị trí của tâm động và các kiểu hình NST Ta có:

Ic = P / (P + Q)

Trong đó:

P: chiều dài vai ngắn

Q: chiều dài vai dài

Tùy theo vị trí tâm động và độ dài của vai do nó quy định mà có các kiểu NST sau:

Kiểu tâm mút (Tolocentric): tâm động nằm ở cuối NST

Kiểu tâm cận mút (Acrocentric): tâm động nằm gần một đầu mút NST

Kiểu tâm lệch (Submetacentric): tâm động nằm lệch về một phía của NST Kiểu tâm giữa (Metacentric): tâm động ở chính giữa NST

được hình thành bởi các chuỗi TTAGGG lặp lại kế tiếp nhau Ở người các chuỗi lặp lại của telomere có từ 5.000 đến 15.000 base

Khi nghiên cứu trên NST của ngô Barbara McKlintock đã chứng minh là các NST bị đứt gãy thể mút có xu thế dính kết với các đoạn NST khác bị mất thể mút và như vậy thể mút có vai trò giữ cho các NST trong bộ không dính kết với nhau Do

đó, thể mút có cấu trúc đặc biệt Những dẫn liệu về cấu trúc phân tử đã chứng minh

là thể mút có ba chức năng quan trọng: (1) ngăn cản không cho enzym deoxiribonucleaza phân giải đầu tận cùng của phân tử ADN, (2) ngăn cản không cho các NST trong bộ dính kết với nhau và (3) tạo thuận lợi cho sự tái bản ADN ở phần đầu cuối của phân tử

Hình 2.3 Cấu trúc NST

(Nguồn:http://imcurious.wikispaces.com/file/view/chromosome.jpg/53204406/chro mosome.jpg)

2.2.4.2 Cấu trúc siêu hiển vi của NST

Trong NST, ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc sợi xoắn nhiều cấp được gọi là sợi nhiễm sắc (chromonema) Sợi nhiễm sắc cơ bản có đường kính 11

nm là chuỗi hạt cườm được gọi là sợi nucleosome (nucleosome fiber)

Mỗi hạt cườm là một nucleosome có kích thước 11 nm dạng khúc giò gồm lõi được cấu tạo bởi 8 phân tử histon (2H2A, 2H2B, 2H3 và 2H4); sợi xoắn kép ADN cuốn xung quanh lõi histon với một 3/4 vòng, chứa khoảng 146 đôi nucleotide Các nucleosome nối với nhau qua sợi xoắn kép ADN dài khoảng 60

nucleotide Các sợi nucleosome 11 nm gấp khúc, cuộn lại nhờ các histon H1 để tạo thành các sợi nhiễm sắc lớn hơn có đường kính 30 nm được gọi là sợi solenoid

Sợi nhiễm sắc 30 nm sẽ gấp khúc tạo nên sợi có cấp độ đường kính lớn hơn (khoảng 300 nm) chứa các vòng bên (looped domains) Mỗi vòng bên chứa khoảng 20.000 - 80.000 cặp nucleotide Các sợi 300 nm sẽ cuộn lại tạo nên các sợi nhiễm sắc ở cấp độ lớn hơn từ 700 - 1400 nm tức là các nhiễm sắc tử và nhiễm sắc thể thấy

rõ ở trung kỳ của phân bào

Hình 2.4 Cấu trúc siêu hiển vi và phân tử của nhiễm sắc thể

(Nguồn:http://www.mediafire.com/imgbnc.php/0d2aa2b17926b849ee21f352386fc4

2.3 Chu kỳ sống của tế bào

Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào được hình thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thúc bởi sự phân bào để hình thành tế bào mới Một chu kỳ tế bào bao gồm hai giai đoạn chính: gian kỳ và kỳ phân bào (mitosis: M)

Hình 2.5 Chu kỳ tế bào

(Nguồn:http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2001/cellcycle_eng.j pg)

2.3.1 Gian kỳ (interphase)

Là thời kỳ nằm giữa hai lần phân chia liên tiếp, đây là giai đoạn tế bào diễn

ra các hoạt động chuyển hóa cao độ, tổng hợp và tái bản vật chất di truyền - ADN, chuẩn bị tích cực cho tế bào bước vào nguyên phân Tuỳ theo đặc điểm chức năng người ta chia gian kỳ ra ba pha:

Pha G1: kéo dài từ sau khi tế bào phân chia đến khi bắt đầu sao chép vật chất

di truyền Sự tích lũy vật chất nội bào đến một lúc nào đó đạt điểm tới hạn thì tế bào bắt đầu tổng hợp ADN

Pha S: là pha tổng hợp ADN Cuối pha này số lượng ADN tăng gấp đôi Pha G2: là giai đoạn được nối tiếp sau pha S đến bắt đầu phân chia tế bào Khoảng thời gian gồm G1, S và G2 tế bào không phân chia và được gọi là kỳ trung

gian Trong kỳ này tế bào thực hiện các hoạt động sống chủ yếu khác và sao chép

bộ máy di truyền Ví dụ, thời gian tương ứng với bốn giai đoạn G1, S, G2 và M đối với các tế bào máu trắng của người đang phân chia là 11, 7, 4 và 2 giờ

Một số tế bào trưởng thành, như tế bào thần kinh và tế bào cơ vẫn giữ nguyên ở kỳ trung gian, thực hiện các chức năng đã được biệt hóa cho đến lúc chết

và không phân chia nữa, gọi là pha G0 Tuy nhiên, một số tế bào có thể từ pha G0 quay lại đi vào chu kỳ tế bào Mặc dù hầu hết các tế bào lympho trong máu người ở pha G0, nhưng khi có kích thích phù hợp, chúng có thể quay lại chu kỳ tế bào Pha G0 chỉ ra sự vắng mặt của các tín hiệu cho nguyên phân và còn là một sự ức chế hoạt tính của các gene cần thiết cho nguyên phân Các tế bào ung thư không thể đi vào pha G0 và được định trước để lặp lại chu kỳ tế bào một cách vô hạn

2.3.2 Nguyên phân

2.3.2.1 Kỳ đầu (prophase)

Các trung thể chuyển động về 2 cực của nhân, các NST co lại thành sợi Mỗi NST gồm 2 sợi chromatid gắn nhau nhờ tâm động Các sợi vô sắc tỏa ra từ tâm động và trung thể Màng nhân và hạch nhân biến mất dần

Hình 2.6 Kỳ đầu của quá trình nguyên phân

(Nguồn:http://thomson.fosterscience.com/Biology/UnitCellsAndCellProcesses/Mito sisDiagram2.jpg)

2.3.2.2 Kỳ giữa (metaphase)

Tâm động của mỗi NST kép gắn với thoi vô sắc và xếp ở mặt phẳng xích đạo

Như vậy tâm động là điểm chia cuối cùng của NST Điều này có ý nghĩa rất quan trọng, nhờ đó chất di truyền được chia đều và đồng bộ cho các tế bào con

Hình 2.7 Kỳ giữa của quá trình nguyên phân

(Nguồn:http://thomson.fosterscience.com/Biology/UnitCellsAndCellProcesses/Mito sisDiagram2.jpg)

2.3.2.3 Kỳ sau (anaphase)

Hai NST đơn tách nhau, và chuyển động về một cực tế bào Các sợi vô sắc

co ngắn lại kéo các NST Sự phân chia tế bào chất thường bắt đầu ở kì này

Hình 2.8 Kỳ sau của quá trình nguyên phân

(Nguồn:http://thomson.fosterscience.com/Biology/UnitCellsAndCellProcesses/Mito sisDiagram2.jpg)

2.3.2.4 Kỳ cuối (telophase)

Các nhiễm sắc thể bắt đầu tháo xoắn, nhân và màng nhân xuất hiện trở lại,

quá trình phân bào bắt đầu, nếp gấp bắt đầu xuất hiện

Hình 2.9 Kỳ cuối của quá trình nguyên phân

Nguồn:http://thomson.fosterscience.com/Biology/UnitCellsAndCellProcesses/Mitos isDiagram2.jpg

2.4 Nghiên cứu về kiểu nhân của heo

NST được quan sát đầu tiên bởi Nageli năm 1842, nhưng đến năm 1888, NST mới được Waldeyer đặt tên là “chromosome” (“chromo” có nghĩa là bắt màu

còn “ some” có nghĩa là một thể )

NST heo được nghiên cứu hoàn thiện trong thế kỉ XIX (Wodsedalek, 1913)

Số lượng NST heo 2n = 38 được nghiên cứu từ năm 1931 nhưng không được công nhận cho mãi đến những năm 50 khi có nhiều công trình nghiên cứu hơn và kĩ thuật nuôi cấy mô được giới thiệu

Kiểu nhân băng biết đến đầu tiên vào năm 1972 (Gustavsson và cộng sự, 1972; Hansen, 1972) Từ đó nhiều kĩ thuật nhuộm băng đã được áp dụng trên NST heo Bằng kỹ thuật nhuộm như: nhuộm giemsa, nhuộm huỳnh quang, nhuộm màu kết hợp với xử lý bằng enzyme, hoặc bằng nhiệt sẽ làm xuất hiện các băng vạch trên NST, kỹ thuật này được gọi là “banding” Các kỹ thuật banding thường dùng là: băng G, băng R, băng C, băng Q, băng T… Những kĩ thuật này làm tăng khả năng xác định từng NST cũng như thực hiện các nghiên cứu về số lượng, cấu trúc NST

Ở heo, kỹ thuật nhuộm bạc (Silver staining), dùng AgNO3 cũng phát hiện ra

ở Việt Nam, đã tiến hành nhuộm băng G nhiễm sắc thể và kiểu nhân heo Móng Cái, heo Đại Bạch, và heo lai Đại Bạch x Móng Cái

Dựa theo vị trí của tâm động chia NST heo ra làm bốn dạng là metacentric, submetacentric, acrocentric và tolocentric Mỗi nhóm được sắp xếp theo kiểu hình

và chiều dài giảm dần

Hình 2.10 Kiểu nhân của heo đực (Gustavsson, 1972) 2.5 Kĩ thuật splash

Kĩ thuật này được sử dụng từ lâu Nguyên tắc kĩ thuật splash là cố định những

tế bào nằm trên lame kính Kĩ thuật này làm nhân bung ra, NST thoát ra và gắn chắc trên lame kính sau khi dung dịch cố định khô đi Cho đến nay, đã có nhiều thay đổi trong kĩ thuật này nhưng phần lớn phụ thuộc vào mức độ yêu cầu để làm bung nhân

và tạo ra một NST nằm rời rạc không chồng chéo lên nhau Kĩ thuật này có ưu điểm

là đơn giản, nhanh và là một phương pháp đáng tin cậy được dùng để nghiên cứu NST

2.5.1 Các nguồn nguyên liệu nuôi cấy

Có 3 loại nguyên liệu được sử dụng:

Loại nguyên liệu thứ nhất là những mẫu chủ động phân chia trong cơ thể sống Ví dụ như tủy xương, lách, biểu mô đường ruột, các nguyên bào sợi ở động vật hữu nhũ, lưỡng thê và chim Loại nguyên liệu này có 2 thuận lợi chính:

• Thứ nhất là sinh sôi rất nhanh Việc nuôi cấy là không cần thiết

• Thứ hai là không có những kết quả giả là những kết quả được tạo ra trong quá trình nuôi cấy tế bào

Tuy nhiên loại nguyên liệu này lại có điểm bất lợi, là chỉ có một số lượng nhỏ những loại mô này đang phân chia nhanh chóng đủ để sử dụng và thậm chí trong số đó, số lượng những tế bào đang phân chia chủ động có thể cũng nhỏ

Nguyên liệu thứ 2 là những mẫu không thường xuyên phân chia trong cơ thể nhưng có thể nuôi cấy trong thời gian dài nên tế bào có thể sống, phát triển và nhân lên qua nhiều thế hệ Ví dụ như tim, da, gan, thận được nuôi cấy để nghiên cứu kiểu nhân, vì tế bào của những mẫu mô này có thể phát triển và phân chia mà không cần có tác nhân kích thích đặc biệt Bên cạnh đó người ta còn nuôi cấy nang noãn hay phôi nang (blastocyst) để nghiên cứu kiểu nhân

Tuy nhiên những mẫu mô trên có một số nhược điểm là tế bào phân chia chậm và thời gian nuôi cấy kéo dài từ 1 - 3 tuần để tạo ra nhiều tế bào tách biệt

Thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào từng loại tế bào, đồng thời phải bảo quản tại 4o

C trong môi trường nuôi cấy khoảng vài tuần trước khi tiến hành nuôi cấy trong thời gian dài Bên cạnh đó, tế bào cần phải có giá thể để bám thì mới tồn tại và phát triển được Trong quá trình nuôi cấy muốn tăng số lượng tế bào lên thì phải rửa tế bào bằng cách loại bỏ lớp protein nằm bên dưới rồi thu thập lớp tế bào phía trên và nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tế bào phát triển cho tới khi đủ số lượng cần dùng

Nguyên liệu thứ 3, là loại mô có nhân, bình thường nó không phân chia trong cơ thể Mẫu hiển nhiên và phổ biến của loại mô này là tế bào lympho trong máu ngoại biên của động vật có vú, chim và bò sát Trong trường hợp bình thường,

tế bào lympho không trải qua quá trình nguyên phân, nhưng khi bị kích thích bằng cách thêm các chất mitogen (tác nhân gây nguyên phân) thì chúng có thể phân chia chủ động

2.5 2 Chất kích thích tế bào phân chia

Chất kích thích tế bào phân chia là các chất mitogen, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nó làm cho những tế bào bình thường không phân chia, trải qua quá trình tổng hợp ADN và phân bào nguyên nhiễm

Các mitogen được sử dụng phổ biến nhất là phytohaemagglutunin (PHA),

chiết xuất từ đậu thận đỏ Phaseolus vulgaris Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy

PHA làm ngưng kết hồng cầu hỗ trợ việc cô lập tế bào lympho, đặc biệt nó có khả năng kích thích tế bào phân chia chủ động

Ngày nay, người ta có thể sử dụng pokeweek chiết xuất từ rễ cây Phytolacca Americana để thay thế cho PHA trong nuôi cấy tế bào bạch cầu, nhưng khả năng ngưng kết tế bào của pokeweek yếu hơn do đó nó chỉ được dùng cho loại máu đòi hỏi nồng độ PHA thấp

Việc phát hiện ra PHA giúp cho quá trình nuôi cấy tế bào bạch cầu rút ngắn lại chỉ còn từ 48 - 72 h Tế bào bạch cầu sử dụng trong nghiên cứu NST thường là các loại vật nuôi như: heo, thỏ, gà, bò, cừu…

2.5.3 Chất ức chế nguyên phân

Chất ức chế thoi vô sắc là chất làm các tế bào dừng lại ở giai đoạn kì giữa

Ba chất ức chế thoi vô sắc hay sử dụng nhất là: colchicine, colcemid và vinblastin sulphate Cả colchicine và colcemid được tách ra từ loài Colchium Khi thêm vào môi trường nuôi cấy colchicine hoặc colcemid thì nó sẽ phá vỡ các vi ống làm cho

sự phân ly của NST về hai cực của thoi vô sắc bị ức chế Các chất ức chế thoi vô sắc không chỉ làm các tế bào dừng lại ở giai đoạn kì giữa mà còn giúp NST dễ dàng tách rời sau khi được cố định do NST không còn nằm trên mặt phẳng xích đạo

Khi thời gian ủ với chất ức chế thoi vô sắc kéo dài có thể làm cho các NST ở giai đoạn kì giữa bị co ngắn quá mức Thời gian tối ưu cho bước này thường phải được xác định dựa vào thực nghiệm

Sau khi ức chế sự hình thành thoi vô sắc, các tế bào sẵn sàng cho kết quả Đối với những tế bào phát triển lơ lửng trong môi trường như tế bào lympho, tế bào tủy xương phải được ly tâm để loại bỏ môi trường nuôi cấy

2.5 4 Dung dịch xử lý tế bào

Khi được xử lý bằng dung dịch nhược trương, tế bào và nhân phồng lên khiến sự phân ly NST xảy ra tốt nhất giúp cho việc cố định, nhuộm và quan sát NST bằng kĩ thuật splashing được thực hiện dễ dàng Phát hiện này được Hsu và Hughes ngẫu nhiên thực hiện trên cùng một nghiên cứu có tầm quan trọng trong giai đoạn chuẩn bị NST ở động vật có vú công bố vào năm 1952 (Hsu, 1952) Thay vì rửa tế bào nuôi cấy trong dung dịch muối đẳng trương bình thường, Hsu ngẫu nhiên dùng dung dịch muối nhược trương và nhận thấy dấu hiệu sưng phồng ở tế bào và nhân Hughes, 1952 cũng có những phát hiện tương tự trong suốt nghiên cứu về tác dụng của dung dịch nhược trương trên sự phân chia tế bào

Khi xử lý bằng dung dịch muối nhược trương quá mức thì NST sẽ tản ra và khó có thể nhận biết toàn bộ kì giữa Nhưng khi xử lý dung dịch muối nhược trương

ít thì NST không tách ra và khi quan sát ở kì giữa, sẽ có nhiều NST chồng lên nhau gây khó khăn khi phân tích NST

Kích thước của NST có thể là nhân tố quyết định xử lý nhược trương tối ưu Những tế bào động vật có NST lớn, thời gian xử lý bằng dung dịch nhược trương lâu hơn so với NST nhỏ Tuy nhiên cần phải cẩn thận vì xử lý nhược trương quá mức có thể là nguyên nhân gây phân tán NST, NST xuất hiện mờ và làm cho độ phân giải của băng gần như không thể thấy rõ

Sau khi xử lý bằng dung dịch nhược trương tế bào được ly tâm loại bỏ phần nổi và sau đó được cố định bằng dung dịch cố định Dung dịch cố định được sử dụng rộng rãi là một hỗn hợp gồm methanol và acid acetic được pha theo tỷ lệ 3:1 Điều quan trọng là dung dịch cố định phải luôn được pha mới vì dung dịch cũ sinh

ra methyl acetate sẽ không thích hợp cho việc cố định NST

Một trong những chức năng quan trọng của bước cố định là loại bỏ phần lớn các mảnh vỡ tế bào và nguyên liệu protein từ tế bào nổi lên để có NST sạch hơn

đồng thời trích xuất được số lượng lớn protein đặc biệt là histone, nhưng phần lớn là gốc ADN Những tế bào có thể giữ trong methanol - acid acetic (3:1) ở 4 o

C khoảng vài tuần, nhưng nên tiến hành kỹ thuật splash càng sớm càng tốt sau khi cố định xong Những tế bào được giữ trong dung dịch cố định phải được rửa trong dung dịch cố định mới trước khi tiến hành bước cuối cùng chuẩn bị cho splash

2.6 Vai tr ò của khí CO 2 trong sự phát triển tế bào nuôi cấy in vitro

2.6.1 Cacbon dioxit (CO 2 )

Danh pháp IUPAC Cacbon dioxit

Thán khí Anhidrit cacbonic Băng khô (rắn) Công thức phân tử CO2

Phân tử gam 44,01 g/mol

Biểu hiện Chất khí không màu, không mùi

2.6 2 Các thuộc tính hóa lý

Điôxít cacbon là một khí không màu, không mùi Khi hít thở ở nồng độ cao tạo ra vị chua trong miệng, cảm giác nhói ở mũi và cổ họng, và gây ngạt thở Các hiệu ứng này là do khí hòa tan trong màng nhầy và nước bọt, tạo ra dung dịch yếu của axít cacbonic

Tỷ trọng riêng của nó ở 25 °C là 1,98 kg m3, nặng hơn không khí khoảng 1,5 lần Phân tử điôxít cacbon (O=C=O) chứa hai liên kết đôi và có hình dạng tuyến tính Nó không có lưỡng cực điện Điôxít cacbon là hợp chất đã bị ôxi hóa hoàn toàn nên về mặt hóa học nó không duy trì sự cháy

Ở nhiệt độ dưới -78 °C, điôxít cacbon ngưng tụ lại thành các tinh thể màu trắng gọi là băng khô Điôxít cacbon lỏng chỉ được tạo ra dưới áp suất trên 5,1 barơ;

ở điều kiện áp suất khí quyển, nó chuyển trực tiếp từ các pha khí sang rắn hay ngược lại theo một quá trình gọi là thăng hoa

Nước sẽ hấp thụ một lượng nhất định điôxít cacbon, và nhiều hơn lượng này khi khí bị nén Khoảng 1 % điôxít cacbon hòa tan chuyển hóa thành axít cacbonic Axít cacbonic phân ly một phần thành các ion bicacbonat (HCO3-) và cacbonat (CO32-)

2.6.3 Đặc tính sinh học

Điôxít cacbon là sản phẩm cuối cùng trong cơ thể sinh vật có sự tích lũy năng lượng từ việc phân hủy đường hay chất béo với ôxy như là một phần của sự trao đổi chất, được biết đến như là sự hô hấp của tế bào Nó xảy ra các loài thực vật, động vật, nhiều loại nấm và một số vi khuẩn Trong các động vật bậc cao, điôxít cacbon di chuyển trong máu từ các mô của cơ thể tới phổi và ở đây nó bị thải ra ngoài

Theo nghiên cứu của USDA, sự thở của một người trung bình mỗi ngày sinh

ra khoảng 450 lít (khoảng 900 gam) điôxít cacbon

Hàm lượng điôxít cacbon trong không khí trong lành là khoảng 0,04 %, và trong không khí bị thải ra từ sự thở là khoảng 4,5 % Khi thở trong môi trường có hàm lượng cao (khoảng 5 %), nó gây độc hại đối với con người và các động vật khác

Hemoglobin (Hb), phân tử chuyên chở ôxy chính trong hồng cầu, có thể chở

cả ôxy và điôxít cacbon, mặc dù theo các cách thức hoàn toàn khác nhau Sự suy giảm liên kết với ôxy trong máu do sự tăng mức điôxít cacbon được biết đến như là hiệu ứng Haldane, và nó quan trọng trong việc vận chuyển điôxít cacbon từ các mô tới phổi Ngược lại, sự tăng áp suất thành phần của CO2 hay pH thấp hơn sẽ sinh ra

sự rút bớt ôxy từ Hb Hiệu ứng này gọi là hiệu ứng Bohr

CO2 được vận chuyển trong máu theo ba cách khác nhau Phần lớn trong chúng (khoảng 80 - 90 %) được các enzym cacbonic anhyđraz chuyển hóa thành các ion bicacbonat HCO3− trong các tế bào hồng cầu 5 - 10 % được hòa tan trong huyết tương và 5 - 10 % liên kết với Hb thành các hợp chất cacbamin Phần trăm chính xác phụ thuộc vào đó là máu ở động mạch hay tĩnh mạch

Hb liên kết với CO2 không giống như liên kết với ôxy, CO2 liên kết với các nhóm chứa N trên 4 chuỗi globin Tuy nhiên, do các hiệu ứng khác khu vực hoạt hóa trên phân tử Hb, liên kết của CO2 làm giảm lượng ôxy được liên kết đối với áp suất thành phần nhất định của ôxy

Điôxít cacbon có thể là một trong các chất trung gian để tự điều chỉnh việc cung cấp máu theo khu vực Nếu nồng độ của nó cao thì các mao mạch giãn ra để cho nhiều máu hơn đến các mô

Các ion bicacbonat là chủ yếu trong việc điều chỉnh pH của máu Do tần suất thở có ảnh hưởng tới mức CO2 trong máu, nên nhịp thở quá chậm hay quá nông sẽ sinh ra hiện tượng nhiễm axít hô hấp, trong khi nhịp thở quá nhanh sinh ra trong các chứng thở quá nhanh sẽ dẫn đến nhiễm kiềm hô hấp

Một điều thú vị là mặc dù ôxy là chất cần thiết của quá trình trao đổi chất của

cơ thể, nhưng không phải nồng độ thấp của ôxy kích thích sự hô hấp mà lại là nồng

độ cao của điôxít cacbon Kết quả là, sự hô hấp trong không khí loãng (áp suất thấp) hay hỗn hợp khí không có ôxy (ví dụ nitơ nguyên chất) dẫn đến sự bất tỉnh mà không cần có các vấn đề về hệ hô hấp của cá thể đó

2.6.4 Vai trò của CO 2 trong sự phát triển của tế bào

Vai trò của khí carbonic trong nuôi cấy tế bào động vật nói chung khá là phức tạp, do nhiều hoạt động tương hỗ giữa CO2 hoà tan, pH và nồng độ HCO3-

Hệ đệm bicarbonat giúp duy trì pH mong muốn Sản phẩm nuôi cấy chứa nhiều acid

do CO2 nội sinh cao, nắp của bình nuôi cấy cho phép CO2 thừa được thải ra ngoài đồng thời CO2 từ tủ nuôi sẽ đi vào đệm cho môi trường Mỗi hệ đệm có nồng độ

CO2 thích hợp phụ thuộc vào từng loại môi trường dùng để nuôi cấy tế bào

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài đã được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2011

Mẫu máu được lấy tại trại thực nghiệm khoa Chăn Nuôi - Thú y trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Máu heo được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Di Truyền Giống Động Vật và Phòng Nuôi Cấy Vi Sinh thuộc bộ môn Vi Sinh - Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi - Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Đối tượng

Đề tài được thực hiện trên heo cai sữa có trọng lượng 15 - 30 kg

3.3 Nội dung nghiên cứu

• Nuôi cấy tế bào lympho đến giai đoạn trung kỳ trong bình kín trong 2 điều kiện: trong điều kiện bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO3 và trong điều kiện chuẩn - trong tủ ấm CO2 với CO2 điều chỉnh tự động ở mức 5 %

• Đánh giá sự phát triển của tế bào lympho khi nuôi cấy ở hai điều kiện trên

• Tiến hành nhuộm NST bằng phương pháp nhuộm Giemsa và sắp xếp bộ NST của heo