Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn pseudomonas aeruginosa phân lập ở việt nam

- Phân loại và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn.- Cải biến được chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn để nâng cao hoạt tính kháng khuẩn - Bước đầu xác định đượ

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN

SINH VẬT -*** -

LUẬN VĂN CAO HỌC

Mã số chuyên ngành: 60420103

Đề tài:

Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có

khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam

Học viên: Nguyễn Huy Hùng

Lớp: CHST _ K16

Hướng dẫn: TS Nguyễn Xuân Cảnh

Hà Nội, 2014

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh Khoa Công nghệ sinh học Học viện Nông nghiệp Hà Nội, là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này.

-Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên,góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập

và nghiên cứu.

Tác giả

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tácvới các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

MỤC LỤC

MỤC LỤC i Danh mục hình iv Danh mục bảng .v TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3

1.1.1 Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.1.2 Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới 4

1.1.3 Cấu tạo của xạ khuẩn 5

1.1.4 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 8

1.1.5 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 9

1.1.6 Sinh tổng hợp chất kháng sinh 11

1.2 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH 13

1.2.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 13

1.2.2 Phân loại và định tên xạ khuẩn 14

2.1 VẬT LIỆU 33

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 33

2.1.2 Hóa chất 33

2.1.3 Thiết bị 33

2.1.4 Môi trường 33

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.2.1 Bảo quản giống [3] 34

2.2.2 Xác định đặc điểm sinh học 35

2.2.3 Xác định sinh khối 36

2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh [6,19] 36

2.2.6 Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh 38

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 39

3.2 Xây dựng kháng sinh đồ đối với các chủng P aeruginosa phân lập 41

3.3 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn P aeruginosa 42

3.3.1 Phân lập xạ khuẩn 42

3.3.2 Sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn P aeruginosa 43 3.4 Nghiên cứu các đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn 8.9 45

3.4.1 Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái 45

3.4.1 Đặc điểm hình thái 46

3.4.2 Một số đặc điểm sinh hóa của chủng 8.9 46

3.4.3 Mô tả đặc điểm phân loại 48

3.4.4 Phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử 50

3.5 Nghiên cứu động thái lên men của chủng xạ khuẩn 8.9 52

3.6 Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thô 54

3.6.1 Tách chiết chất kháng sinh 54

3.6.2 Độ bền nhiệt của dịch kháng thô 54

3.6.3 Ảnh hưởng của pH đến độ khuếch tán của dich kháng sinh thô 55

3.6.4 Đặc điểm sắc kí của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 trong một số hệ dung môi 55

3.7 Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9 56

PHẦN 4 KẾT LUẬN 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

Tài liệu tiếng Việt 60

Tài liệu tiếng anh 60

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

HSCC Hệ sợi cơ chất HSKS

Hệ sợi khí sinh RNA

Ribonucleic acide

DNA Deoxyribonucleic acide

RA Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu RF Cuống bào tử thẳng hay lƣợn song CSBT Cuống sinhbào tử

Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn

Hình 1.2 Bào tử xạ khuẩn

Danh mục hình

Hình 1.3 Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào ở độ phóng đại 11000 lần trên kính hiển vi điện

tử quết của chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập tại tại bệnh viện huyết học

truyền máu TW sau 02 ngày nuôi cấy ở 370C

Hình 3.2 Thử hoạt tính kháng sinh chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa của các chủng xạ

khuẩn bằng phương pháp khối thạch

Hình 3.3 Kết quả thử hoạt tính các chủng xạ khuẩn phân lập bằng phương pháp giếng thạch

với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng và màu sắc khuẩn lạc chủng 8.9 khi nuôi cấy trên môi trường ISP-1 (A) và ISP-2 (B)

Hình 3.5 Hình thái cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng xạ khuẩn NĐ

8.9 khi quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần (A) và kính hiển vi điện

tử quết ở độ phóng đại 7500 lần

Hình 3.6 Sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trường có các nguồn cacbon khácnhau

Hình 3.7 Sinh trưởng và phát triển của chủng 8.9 trên môi trường ISP-6

Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA của chủng 8.9

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại của chủng 8.9

Hình 3.10 Động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trường Gauze-1

Hình 3.11 Biểu đồ giá trị Rf của chất kháng sinh thô 8.9

Danh mục bảng

Bảng 3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tại Viện huyết học truyền máu

TW

Bảng 3.2 kết quả dựng kháng sinh đồ trên máy VITEK2 compact tại bệnh viện

Huyết học truyền máu TW

Bảng 3.3 Phân loại xạ khuẩn theo nhóm màu

Bảng 3.4 Hoạt tính kháng sinh của các chửng xạ khuẩn tuyển chọn đối với vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa

Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng 8.9

Bảng 3.6 Khả năng sử dụng nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 8.9

Bảng 3.7 So sánh đặc điểm hình thái của chủng 8.9 với chủng S parvulus Bảng 3.8.

Khả năng sử dụng nguồn cacbon của 2 chủng 8.9 và S parvulus Bảng 3.9 So sánh

trình tự gen 16S RNA trên ngân hàng gen quốc tế

Bảng 3.10 Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên các môi trường

nghiên cứu

Bảng 3.11 Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng 8.9

Bảng 3.12 Hoạt tính của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 đối với vi sinh vật kiểm

định Pseudomonas aruginosa ở các nhiệt độ khác nhau

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của pH tới sự khuếch tán của chất kháng sinh

Bảng 3.14 Giá trị Rf của dịch kháng sinh thô trên một số hệ dung môi

Bảng 3.15 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn được lựa chọn sau khi gây đột biến

đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

MỞ ĐẦU

biến gây b ệ n h ở động vật và con người Nó được tìm thấy trong đất, nước, h ệ v i s in h v ật

t r ên d a v à các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới Vi khuẩn không chỉ phát triển trongmôi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí y , ôx và do

đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo Vi khuẩn này dinh dưỡng bằngrất nhiều các hợp chất hữu cơ; ở động vật, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho phép nó lâynhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung của việc lâynhiễm thông thường là gây ra v i êm nhi ễm v à n h i ễm t r ù n g hu y ế t Nếu vi khuẩn xâm nhập vàocác cơ quan thiết yếu của cơ thể như p h ổ i , đ ư ờ n g t iết n i ệ u , và t h ậ n , sẽ gây ra những hậuquả chết người; vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể Vi khuẩn cũngđược phát hiện trên các d ụn g cụ y kh o a b ao gồm c at h e t e r , gây ra nh i ễm kh u ẩn b ệ n h v i ện v à

p hòn g m ạc h Đây cũng là nguyên nhân gây ra v i êm c h â n l ô n g

Nước ta là một nước nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho vi sinh vật nói chung và xạ khuẩnnói riêng phát triển Do đó, có thể tìm thấy nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng

sinh quý, trong đó có kháng sinh kháng lại vi khuẩn Pseudomonas aruginosa gây ra các bệnh về

nhiễm trùng

Để giải quyết những vấn đề này, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn, cải biến và

nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam”.

*/ Mục tiêu của đề tài:

- Phân lập được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ các mẫu thu thập tại một số

bệnh viện

- Sàng lọc và tuyển chọn được chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa từ bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn phân lập ở Việt Nam

- Phân loại và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn.

- Cải biến được chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn để nâng cao hoạt tính kháng khuẩn

- Bước đầu xác định được nhóm hoạt chất chính từ chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn tác động lên

vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.

- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đã phân lập được với vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa để tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính cao.

- Phân loại và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa của các

chủng xạ khuẩn tuyển chọn

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN

1.1.1 Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinomycetales) là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) phân bố rộng rãi trong

tự nhiên: trong đất, trong nước ao hồ, một phần trong bùn và trong các cơ chất hữu cơkhác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn khác và nấm mốc không phát triển được [3] Xạkhuẩn có nhiều nhất trong lớp đất bề mặt, số lượng không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà cònphụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giầu dinhdưỡng và lớp đất trên bề mặt (đến 40cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn Số đơn vị sinhkhuẩn lạc (CFU- colony forming unit) xạ khuẩn trong 1g đất canh tác thường đạt tới hàngtriệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hoá chỉ có 10-100 nghìn mầm Số lượng xạ khuẩn trong đấtcũng thay đổi theo thời gian trong năm [6, 28]

Xạ khuẩn cũng thường sống trên các cây chết, rơm rạ, thường hoại sinh nhưng có thể kísinh trên thân cây, ở củ và rễ cây Một số nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của xạ khuẩn

trong trầm tích biển như các loài Actinomyces halophila, A mortivalis và A iraquensis, Streptomyces như S antibioticus (MU106, MU107) và S rimosus (MU114) [15,16, 33] hoặc

trong các mẫu nước và bùn ao nuôi trồng thủy sản đặc biệt là ở lớp bùn, xác các hợp chất hữu

cơ lắng đọng nhiều

Ngoài ra, pH của môi trường cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự phân bố của xạ khuẩn,thường thì trong môi trường trung tính hoặc hơi kiềm, mật độ xạ khuẩn cao hơn so với cácmôi trường có độ pH quá cao hoặc quá thấp Xạ khuẩn thường hoạt động ở pH cao hơn sovới nấm [6]

Xạ khuẩn được nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan trọng trong tựnhiên: tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, trong nước,chúng có vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Chúng sửdụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất Bên cạnh đó chúng còn sảnsinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên đã

được dùng để sản xuất nhiều loại enzim như proteaza, amilaza, xenlulaza, glucoizomeraza,vitamin và các axít hữu cơ [3] Do có các loại enzim này nên chúng cũng có khả năng phân giảicác hợp chất bền vững như kitin, xenluloza, lignin… Một đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn làkhả năng sinh chất kháng sinh 60-70% xạ khuẩn phân lập được từ đất có khả năng này Trong

số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn[17] Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây bệnh, nhất là ở vùng đất kiềm, đất cát khi thời tiếtkhô hạn, làm cho củ lở loét, sần sùi ngay từ ngoài đồng ruộng Một số xạ khuẩn (thuộc chi

Frankia) có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bộ đậu và có khả năng cố định Nitơ không khí thành dạng dễ sử dụng cho cây Các chủng Streptomyces spp sinh độc tố phytotoxin

ảnh hưởng lớn tới mùa vụ, do chúng có thể tồn tại trong đất trên 10 năm [3, 6]

1.1.2 Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới

Trước đây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa cácnhà vi sinh học do nó có những đặc điểm vừa giống vi khuẩn, vừa giống nấm Trước thế kỉ

19, xạ khuẩn được xếp vào nhóm nấm Về sau, khi đã nghiên cứu sâu hơn người ta đã tìm racác bằng chứng về mối liên hệ giữa xạ khuẩn và vi khuẩn

- Xạ khuẩn chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không

có ở vi khuẩn Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa xenluloza

- Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axít của môi trường, đặc điểmnày không có ở nấm

- Các đặc điểm về sợi và nang bào tử lớn (sporangium) của chi Actinoplanes

cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp

Từ những đặc điểm trên (về nhân nguyên thuỷ, kích thước nhỏ bé ) nên người ta đã

xếp xạ khuẩn vào nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria).

Vị trí của nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) được xác định như sau: Năm 1978, Gibbbens

và Murray chia các vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành 4 ngành là ngành Gracilicutes (gồm các vi khuẩn Gram âm), ngành Tenericute (gồm xạ khuẩn và các vi khuẩn Gram dương), ngành Mendosicutes gồm các vi khuẩn không chứa Peptidoglican trong thành tế bào, và ngành Mollicutes gồm các vi khuẩn chưa có thành tế bào.

Năm 1977 và 1980, Woese và cộng sự chia vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành 2 giới là

giới vi khuẩn thật (Eubacteria) (tương đương với 3 ngành Gracilicutes, Tenericute, Mollicutes theo Gibbbens và Murray) và giới vi khuẩn cổ (Archaebacteria) (tương đương với ngành Mendosicutes)[3].

Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales,

bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi

Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm.

1.1.3 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn

bào, không có nhân thực (procariotic) và có kích thước giống vi khuẩn Cấu trúc khuẩn lạc xạ

khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài mặt môi trường thạch tạothành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ chất

(substrate mycelium) cắm sâu vào môi trường để lấy nước và thức ăn Khuẩn ty cơ chất pháttriển một thời gian thì dài ra trong không khí thành khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) Người tagọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp phát triển từ các bào

tử nảy mầm Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ

có khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty khí sinh phát triển ra ngoài không khí và thường phần cuối cáckhuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử Loại khuẩn ty không mang bào tử gọi chung làkhuẩn ty dinh dưỡng Khuẩn ty xạ khuẩn mảnh hơn khuẩn ty nấm mốc, và có đường kínhthay đổi trong khoảng từ

0,2-1,0µm đến 2-3µm Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn.Một số xạ khuẩn có bao sợi là một bao mỏng bọc bên ngoài khuẩn ty khí sinh, có thể thấy rất rõkhi phân hoá thành bào tử [3]

* Màng tế bào xạ khuẩn khá phức tạp: gồm có thành tế bào và màng tế bào:

- Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20nm, có tác dụngduy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào Căn cứ vào kết cấu hoá học người ta chia thành

tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm:

Nhóm CW I: Có chứa L, L-DAP và Glixin (Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides)

Nhóm CW II: Có chứa mezo-DAP và Glixin Nhóm

CW III: Có chứa mezo-DAP

Nhóm CW IV: Có chứa mezo- DAP, arbinoza và galactoza [3, 29]

Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu chia thành 3 lớp: lớp ngoài dày 60-120Å, khi già cóthể dày tới 150Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50Å và lớp trong dày 50Å Thành tế bào cấu tạo chủyếu từ các lớp glucopeptit gồm các gốc N-axetylglucozamin liên kết với N-axetylmuzamic bởiliên kết 1,4-glucozit Khi xử lý bằng lizozim các liên kết này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá huỷ

và màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần (protoplast).Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lý bằng hỗn hợp eter, clorofoc và các dung môi hoà tan lipit

thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit Thành tế bào xạ khuẩn không chứa

xenluloza hay kitin [3, 6, 13]

Đối với xạ khuẩn phân lập từ vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dày và độ bền cơhọc cao để có thể chống chịu với môi trường khắc nghiệt bên ngoài (nồng độ muối trung bình3-4%, pH 6,8 - 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20-35C) Ở pH trung tính và kiềm như ở biển, sovới xạ khuẩn trung tính, thành tế bào của xạ khuẩn chịu kiềm ngoài peptitdoglycan còn chứanhiều polyme axit như là axit galacturonic, axit gluconic, axit glutamic, axit asparic và axitphotphoric Với điện tích âm tạo bởi thành phần axit không thuộc peptidoglican, bề mặt tế bào

có thể hấp thụ được ion Na+ và H+

trong khi đẩy ion OH- Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp peptitdoglycan là giống nhau ở

xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhưng lại khác nhau về thành phần các hợp chất cấu thành, xạkhuẩn ưa kiềm chứa nhiều hesosamin và axit amin [25]

- Màng tế bào chất nằm dưới lớp thành tế bào, dày 7,5-10,0 nm Chúng có cấu trúc vàchức năng tương tự như màng tế bào chất của vi khuẩn: chủ yếu gồm 2 thành phần làphotpholipit và protein; màng chứa nhiều enzym có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trìnhvận chuyển và trao đổi chất qua màng [6]

* Thể trung gian (mezoxom) nằm ở phía trong màng tế bào chất, có hình phiến, hình

bọng hay hình ống Công dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bàochất và do đó tăng cường hoạt tính enzim, tăng chuyển điện tử [3]

* Các vật thể ẩn nhập nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt poliphotphat

(hình cầu, bắt mầu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt polisaccarit (bắt màu với dung dịchLugol) [3]

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), “nhân” của xạ khuẩn cùng loại với nhân của “vikhuẩn”, nhưng khác với nhóm vi sinh vật không có nhân thực khác là tỉ lệ G+C cao (>70%)trong khi đó ở vi khuẩn là 25 - 40%

Một trong những đặc điểm đáng lưu tâm của xạ khuẩn là chúng không bền vững về

di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN Điều này gây

ra một số hiện tượng kì lạ khác: tạo ra tính đa dạng của hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng [3, 6, 23].

1.1.4 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt Trên môi trường đặc xạ khuẩn phát triển thànhnhững khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loại và điều kiện hoàn cảnh Khuẩnlạc xạ khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, có cácnếp toả ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên gọi là xạ khuẩn (actinomycetes, tiếng HiLạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”) Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc (dùng que cấy không diđược khuẩn lạc của xạ khuẩn vì khuẩn ty cơ chất bám sâu trong thạch) Mặt khuẩn lạc xù xì, códạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc của xạ khuẩn không thể lẫnvới khuẩn lạc của nấm vì khuẩn ty của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc (khuẩn ty cơchất 0,8µm; khuẩn ty khí sinh 1,14µm), đường kính khuẩn ty nấm có thể lớn hơn 10 lầnđường kính khuẩn ty của xạ khuẩn [3]

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tương đốixốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh học khác nhau Cácsản phẩm trong qúa trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữucơ… được tích lũy trong mỗi lớp khác nhau Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, dacam, vàng, lam, tím tùy thuộc vào loại và điều kiện ngoại cảnh Có loại xạ khuẩn có thể tạosắc tố tan trong môi trường nuôi cấy, thường gặp các loại mang màu: xanh, tím, đỏ, da cam,vàng, lục, nâu và đôi khi màu đen Có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môihữu cơ [3, 6, 34]

Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn 1.1.5 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn

Xạ khuẩn sinh sản bằng cách tạo bào tử Khuẩn ty khí sinh phát triển ra ngoài không khí

và thường phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử Hai dạng cuống sinhbào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể riêng rẽ, có thể phânnhánh

Cuống sinh bào tử (sporophore) hình thành bào tử trần (conidia hay conidiospores) Cácchuỗi bào tử trần có thể chỉ là 1 bào tử, có thể có 2 bào tử, có thể là chuỗi ngắn hoặc dài, cóthể các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tương tự bó sợi của nấm

Cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) mang bào tử kín (sporangio-spores)

nằm trong túi (nang) bào và bào tử di động [3]

Hình thái, kích thước của cuống sinh bào tử và bào tử là một đặc điểm quan trọngnhất trong phân loại xạ khuẩn

Cuống sinh bào tử thường có dạng thẳng (R) hay hơi cong (F), dạng xoắn lò so (kí hiệu S)xoắn đơn giản hình móc câu (RA) Cuống sinh bào tử dạng xoắn có chiều dài và số vòng khácnhau Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể là dài hoặc ngắn với các dạng lông cứng hoặc cóthể thon lại, uốn cong hay kéo dài Những đặc điểm này

rất quan trọng khi định tên xạ khuẩn Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình thành bào tử

theo 3 phương thức sau:

- Phương thức phát triển toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình thành racác thành của bào tử

- Phương thức phát triển trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng

nguyên sinh chất và thành khuẩn ty Trường hợp này gặp ở Planomonospora.

- Phương thức phát triển bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham gia vào

quá trình hình thành bào tử Trường hợp này gặp ở Thermoactinomycetes [3].

- Hình thái bảo tử cũng là một đặc điểm quan trọng trong định tên xạ khuẩn Bào tửtrần (conodiospore) của xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục, hình que, hình trụ Bề mặtbào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông Bào tử trần là cơ quansinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bào tử trần được hình thành đồng thời trên tất cả chiều dàicủa cuống sinh bào tử theo hai phương thức khác nhau:

- Vách ngăn hình thành dần từ phía trong của màng tế bào và tiến dần vào trong tạo ranhững vách ngăn không hoàn chỉnh, sau đó sợi bào tử mới phân cắt thành các bào tử trần

- Thành tế bào và màng tế bào đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến dần vào phía tronglàm cho sợi bào tử phân cắt, đồng thời tạo thành chuỗi bào tử trần [3]

Muốn kích thích hình thành bào tử, trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn

ty khí sinh Ví dụ khi nghiên cứu 6 chủng S griseus, Kalakoutski và Agre (1973) nhận thấy

muốn kích thích khuẩn ty khí sinh nên sử dụng các môi trường có bổ sung pepton, NaCl vàglixerin Một số tác giả khác cho rằng việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào môi trường cũng kíchthích quá trình hình thành bào tử ở xạ khuẩn Tuy nhiên việc bổ sung các nguyên tố vào môitrường phải được nghiên cứu kỹ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định Môi trường nuôi cấynghèo dinh dưỡng sẽ kích thích hình thành bào tử ở xạ khuẩn còn môi trường nuôi cấy giàudinh dưỡng thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm Độ ẩm và nhiệt độ cũng có ảnh hưởngđến sự hình thành bào tử [6]

Ở các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh thuộc chi Streptomyces, khả năng sinh kháng

sinh liên quan đến sự hình thành bào tử được thể hiện rất rõ Trong nhiều trường hợp khi kíchthích hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng sinh giảm đi Khi nghiên cứu độtbiến và chọn lọc chủng xạ khuẩn sản xuất oxytetraxylin và streptomyxin người ta nhận thấynếu sự hình thành bào tử kém thì khă năng sinh tổng hợp kháng sinh lại tăng Đây cũng là đặcđiểm cần lưu ý khi nghiên cứu chọn lọc các chủng có hoạt tính cao Như vậy, sự hình thànhbào tử và khả năng sinh kháng sinh ở xạ khuẩn có mối quan hệ nghịch [16, 24]

Hình 1.2 Bào tử xạ khuẩn 1.1.6 Sinh tổng hợp chất kháng sinh

Xạ khuẩn là nhóm sinh vật có khả năng sinh kháng sinh cao, 60 - 70% xạ khuẩnphân lập được từ đất có khả năng này Trong số 9000 chất kháng sinh đã được biết đến trên

thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra Chi Streptomyces là chi quan trọng nhất trong

nhóm xạ khuẩn, với trên 500 loài đã được miêu tả Chi này có nhiều loài có khả năng sinh kháng

sinh, một trong số các kháng sinh rất quan trọng là Streptomycin do S griseus sinh ra Khả năng

sinh chất kháng sinh là kết quả của quá trình đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc đẩy quá trìnhtiến hoá của xạ khuẩn [17]

Chất kháng sinh là chất trao đổi bậc 2, thông thường được hình thành ở cuối phasinh trưởng, trong pha cân bằng Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệnghịch với sự hình thành bào tử Đó là điểm cần lưu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp khángsinh từ xạ khuẩn [12].

Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, người ta thường mô tả hai pha: phasinh trưởng (trophophase): khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh với nguyên sinh chất đồng nhấtlàm giảm nguồn cacbon, nitơ và pH; pha sinh tổng hợp (idiophase): sinh trưởng chậm lại đôikhi xuất hiện quá trình tự tan của khuẩn ty và sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh [6, 16].Cũng có tác giả chia sự phát triển của giống thành 4 hoặc 6 pha theo các đặc điểm sinh hoá

tế bào Trong một số trường hợp quá trình sinh học này lại diễn ra mạnh mẽ trong pha sinh

trưởng như trường hợp của chủng xạ khuẩn Saccharothrix sp SA 103 phân lập từ Sahara của

Algeria, sinh kháng sinh mutactimycin PR (Anthracycline mới) Quá trình tương tự cũng đã

thấy ở chủng Saccharothrix sp SA 233 sinh dithiolopyrrolone và chủng S clavuligerus sinh axit

clavulanic [12,30]

Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra nó cũng đa dạngnhưng quá trình sinh tổng hợp chúng dường như theo một số con đường nhất định Các conđường này chỉ là sự cải biên các con đường sinh tổng hợp của tế bào Các vật liệu ban đầucủa của qúa trình chuyển hoá chất trao đổi bậc hai (chất kháng sinh) là những chất trao đổi sơcấp Chất kháng sinh được tổng hợp từ 1, 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc nhất, hoặc có thể là trùnghợp các hợp chất bậc nhất rồi biến đổi chúng bằng các enzim Mọi con đường sinh tổng hợpchất kháng sinh đều có sự tham gia của các enzim hoặc hệ thống enzim đặc biệt Các enzim nàyđược mã hoá bởi các gen nằm trong những cụm (cluster) trên nhiễm sắc thể hoặc trên plasmit

Ví dụ tổng hợp chlotetraxyclin ở S aureofaciens có 3 hệ thống enzim (hay hệ thống gen) tham

gia: hệ thống 1 với hơn 200 gen mã cho các enzim chuyển glucoza thành axetyl-CoA; hệthống 2 chuyển axetyl-CoA thành malonyl-CoA; hệ thống 3 chuyển malonyl CoA

thành chlotetracyclin Tổng số gen ở 3 hệ thống liên quan tới tổng hợp chlotetracyclin lên tới

2000 gen [16,31,32,35]

Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn rất phong phú và đa dạng, nguyên nhân là 1 loại khángsinh có thể do nhiều loài vi sinh vật khác nhau tổng hợp ra, cũng có khi 1 loại vi sinh vật tạo ranhiều loại kháng sinh khác nhau [31, 32] Ví dụ, có tới 27 chủng xạ khuẩn khác nhau có thể

tổng hợp được kháng sinh oxytetraxyclin, hay Streptomyces rimosus cùng lúc có thể tổng

hợp được oxytetracylin và rimicidin Ngày nay số lượng chất kháng sinh được sản xuất từ xạkhuẩn tăng lên đáng kể, rất nhiều trong số đó đã được sản xuất ở quy mô thương mại, có ýnghĩa lớn trong y học và mang lại nhiều lợi nhuận

1.2 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG

SINH

1.2.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Nhu cầu về các chất kháng sinh sử dụng trong nông nghiệp hiện nay rất lớn do sự xuấthiện của nhiều tác nhân gây bệnh mới, cùng với hiện tượng kháng thuốc kháng sinh ngàycàng phổ biến Việc tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng các chủng vi sinh vậtgây bệnh trên cây trồng sẽ giúp hạn chế thuốc hóa học mà vẫn có tính an toàn cao [31,32,33]

Một trong những chính sách nhằm tách và tinh sạch các chất kháng sinh mới vớimong muốn là khám phá các hệ sinh thái đặc biệt, như ở tầng nước sâu, vùng biển có nồng độmuối cao hay vùng khí hậu khô cằn Từ năm 1975 đến 1994, một số loài xạ khuẩn mới đã

được phân lập và mô tả như Actinopolyspora halophila, Actinopolyspora mortivalis và Actinopolyspora Trong nỗ lực tìm kiếm những chất kháng sinh mới, gần đây các nhà khoa học

đã phân lập được một chủng xạ khuẩn kí hiệu Actinopolyspora AH1 ở Alibag, một vùng biển ở phía tây Ấn Độ Chủng này thuộc chi Actinopolyspora, có đặc điểm ưa mặn (sinh trưởng ở

nồng độ muối

8-15%w/v) và sinh trưởng tối ưu ở pH 7,6 Chủng này khác với tất cả các chủng trong

chi Actinopolyspore đã được mô tả trước đây nên được coi là một chủng mới [15, 20].

Năm 1928, Fleming tình cờ phát hiện ra nấm Penicilium sinh kháng sinh penicilin Nhưng ngày

nay, cũng như các loại vi sinh vật sinh chất kháng sinh khác, xạ khuẩn được tìm ra theo quytrình tuyển chọn có hệ thống và cân nhắc kỹ lưỡng, thường tuân theo sơ đồ nhất định

Tuy nhiên, hiếm khi phân loại được một chủng từ tự nhiên có khả năng sinh khángsinh cao đạt yêu cầu cho sản xuất thương mại, do đó công việc tuyển chọn giống luôn gắnliền với những thành tựu của di truyền học và đặc biệt là các phương pháp làm đột biến lí hoá,

kỹ thuật khuếch đại gen nhờ plasmit Kết quả của những nghiên cứu cơ bản này đã giúp choviệc lựa chọn những giống có hoạt lực cao trong các điều kiện nuôi cấy ổn định và hình thànhquy trình công nghệ áp dụng trong sản xuất có quy mô rộng lớn [1, 9]

1.2.2 Phân loại và định tên xạ khuẩn

Trong số xạ khuẩn đã được đặt tên thì Actinomyces Hart là loài lâu đời nhất Actinomyces israeli được coi là chủng xạ khuẩn kị khí thuần chủng đầu tiên (1889), vì trước khi

phát triển phương thức giữ giống đông khô thì khó có thể bảo quản vi sinh vật lâu dài vànhiều chủng giống đã bị thất lạc Do vậy không có chủng xạ khuẩn nào được tìm ra sớm hơncác chủng mà Waksman phát hiện và lưu trong danh mục Bộ sưu tập giống của ông (1916-1919) Cho đến nay, có thêm rất nhiều chủng xạ khuẩn được lưu trong danh mục giống xạkhuẩn [6, 14]

Ba phương pháp phân loại xạ khuẩn là phương pháp phân loại truyền thống, phươngpháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử và phân loại số

a) Phương pháp phân loại truyền thống

Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu về đặc điểm sinh lí và coi đó là mấu chốt

trong nguyên tắc phân loại để sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces Waksman và

Curtis (1916), Waksman (1919) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô tả phân loại củamình và coi đặc điểm hình thái của bào tử là đặc tính quan trọng của các cá thể Do vậy họ đãđưa ra một số loài mới có ý nghĩa Tiếp đó Millard và Burr (1926) tìm ra 17 loài, Jensen (1930-1931) – 2 loài, Dunche (1934)

– 13 loài Baldacci và cộng sự đã bắt đầu nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936 và đến năm

1953 công bố một khoá phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở màu sắc khuẩn ty khí sinh,

khuẩn ty cơ chất và một số đặc điểm trung gian khác nhau [11] Năm

1943, Waksman và Henrici đã đưa ra một số hệ thống phân loại và đến năm 1961 có sửa đổi[36] Trong hệ thống này, xạ khuẩn được xếp thành nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và

mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces Krassilnikov là một trong những chuyên

gia nổi tiếng về nghiên cứu và phát triển khoá phân loại xạ khuẩn Từ năm 1941 đến năm 1949ông đã phát triển 38 loài mới Năm 1970, ông lại công bố hệ thống phân loại mới dựa trên hệthống đã công bố năm 1949 Trong đó xạ khuẩn được phân chia thành 6 họ, gồm 26 chi Theo

ông Actinomyces được dùng như một tên gọi chung cho những loài thuộc chi Streptomyces mà

Waksman và Henrici đã phác hoạ năm 1943 [14]

Một số nhà nghiên cứu người Đức (Flaig và cộng sự, 1952; Flaig và Kutzner,

1954; Kuster và Geiuz, 1955) cho rằng chi Streptomyces là một nhóm lớn Lần đầu tiên họ sử

dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu đặc điểm bào tử của chi này Kutzner đã phát triển

một khoá phân loại Streptomyces dựa trên cơ sở hình dáng cuống sinh bào tử, cấu trúc

hiển vi điện tử của bào tử, sự tạo thành sắc tố tan, hoạt phổ kháng khuẩn và một số đặc điểmsinh lí khác [18]

Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới Hệ thống này dựa vàomàu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử Hệ thốngnày cũng được chỉnh lý và tái bản năm 1983 Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngàymột tăng trong những năm gần đây (Praceser, 1968; Kuster,

1972; Pridham, 1974; Arai; 1969; Nonomura, 1974; Szabos, 1965…) Đó là hình thức phân loạitruyền thống dựa trên đặc điểm hính thái và tính chất nuôi cấy Hình thức này hiện nay vẫnđang được sử dụng phổ biến

b) Phương pháp phân loại sinh học phân tử

Ngày nay nhờ sự phát triển cao của kỹ thuật, phương pháp phân loại phân tử đã được

sử dụng vào phân loại xạ khuẩn Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay

người ta vẫn dùng 3 phương pháp chính: lai ADN, lai ARN và phân tích rARN 16S [37, 38] Kếtquả được biểu hiện bằng số phần trăm sự đồng nhất (homology) Hiện nay, đại đa số các nhàkhoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhaudưới 70% khi tiến hành lai ADN Phân tích rARN

16S để liệt kê thứ tự các nucleotit đặc trưng của cá thể và so sánh với bảng liệt kê của cơ thểkhác để xác định mức độ giống nhau của chúng Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu

sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau trongphép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98.6% của trình tự rADN 16Sđược coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa họclấy giá trị này là 98%

Bằng phương pháp phân loại này, những kiến thức về phân loại cũng có nhiều thay đổi

Ví dụ các nhà phân loại cho rằng chi Nocardia dị nhân (heterogeneous), nên về mặt di truyền

đã xếp loài Nocardia mediterranci sinh rifamixin vào chi Streptomyces và mang tên mới là S mediterranci; hợp nhất hai chi Streptomyces và Streptoverticillium vào một chi Streptomyces hoặc chuyển loài Nocardia erythropolis vào chi Mycobacterium (mang tên mới M rodochrous)

[23]

Vì số lượng các loài xạ khuẩn mới được mô tả ngày càng nhiều và để việc phân loạinhanh, chính xác về di truyền phân tử, người ta đã sử dụng phương pháp phân loại số(dùng máy vi tính) cũng như đưa thêm các đặc điểm phân loại và phát sinh chủng loại

c) Phân loại số (Numerical taxonomy)

Phân loại số đã được Williams và cộng sự (1983) sử dụng để phân loại chi

Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng

mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặcđiểm hình thái, sinh lý – sinh hoá Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath (1973)

đề nghị tính hệ số giống nhau S (similarity) theo phương trình sau:

%S = N s x 1 00

N s  N d

Trong đó: Ns – Tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh

Nd – Tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia

Kết quả phân tích số được biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tuỳtheo mức độ giống nhau được nhóm thành từng cụm (Cluster) [26, 27] Bằng phân loại số,

người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và

13 cụm với những đại diện duy nhất Trên cơ sở nhận được, người ta đưa ra thuật toán học đểxác định những chủng xạ khuẩn chưa biết Mặc dù nguyên tắc là giảm số lượng các đặcđiểm, nhưng cũng còn tới 139 đặc điểm đã được sử dụng trong phân loại số [10, 21, 23]

Cả ba phương pháp phân loại trên hiện vẫn đang được sử dụng độc lập hoặc kết hợp vớinhau để định tên loài một cách chính xác trong phân loại xạ khuẩn hiện nay Mỗi phương pháp

có một ưu điểm nhất định, tuy nhiên vì lí do thực dụng, người ta vẫn chủ yếu dựa vàophương pháp truyền thống là chủ yếu

1.3 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh

Theo định nghĩa của Outchinnikov Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và cácsản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sựphát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp

Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander Fleming – Nhà sinhvật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10 năm 1928

Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ,penixillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành “một loại thuốc thầnkỳ” Năm 1945, A.Fleming, E.Chain và H.W.Florey đã được

nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.

Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với

hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin, tiroxidin do Rene, Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm

1941, erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952… Cùng với việc phát hiện ra

CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh,kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm củacác nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới

Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẵn diễn ra nhanh chóng, nhiều trungtâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giớivẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn

Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượngcholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh nàycòn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó là kháng sinh loposomal HA-92, được tách ra từ

xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 321.

Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới

Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp.

TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm

Aspergillus fumigalus và Candida albicans Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế

bào ung thư với giá trị Mic là

0,01 – 0,3 mg/ml

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn streptomyces sp C684 sinh CKS

laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩnkháng vancomycin

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều nghànhkhoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ Đểsản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS tự nhiên mà còn cải tạochúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biếnđịnh hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng cóHTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gianngắn

Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN, kỹ thuật tách dòng

gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những đem lại kết quả to lớn trong phát

triển chủng giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS

1.3.2 Đặc tính chung của các chất kháng sinh

Chất kháng sinh do vi sinh vật sinh ra nên có đặc tính trước hết là chống vi khuẩn Có

loại kháng sinh được vi sinh vật tiết ra môi trường xung quanh như Penicillin, Stretomycin, Tetracyclin, loại khác lại được tích lũy ở trong tế bào vi sinh vật và chỉ được giải phóng ra sau khi phá vỡ tế bào Gramycidin, Prodigiozin.

Các chất kháng sinh rất đa dạng về thành phần hóa học, chúng có thể có cấu tạo mạch vòng,

dị vòng, vòng thơm, có thể là axit, kiềm, polypeptit Nghiên cứu bản chất hóa học của chấtkháng sinh là rất cần thiết vì có thể hiểu rõ được cơ chế tác dụng của chất kháng sinh, biết đượccon đường tổng hợp chúng

Khi ở điều kiện phát triển tối ưu thì các chủng vi sinh vật tích lũy chất kháng sinh là cực đại.Như vậy, trong công nghiệp sản xuất chất kháng sinh, muốn tạo được nhiều sản phẩm thì phảitạo môi trường tối ưu

Các chất kháng sinh khác nhau có tính chất lý hóa khác nhau, như: độ hòa tan trong dungmôi, khả năng bền vững với axit, kiềm, nhiệt độ Nghiên cứu những tính chất này có ý nghĩatrong việc xác định được phương pháp tách chiết, cô đặc, tinh sạch các chất kháng sinh Độ hòatan của các chất kháng sinh rất khác nhau trong các dung môi, có loại hòa tan tốt trong nước,trong cồn, trong dung môi lipit, có loại chỉ hòa tan trong một số dung môi nhất định.

Khả năng bền vững với nhiệt độ của các chất kháng sinh cũng rất khác nhau, có loại bị phânhủy nhanh ở nhiệt độ 60oC thậm chí 100oC vẫn không bị mất hoạt tính như streptomycin, tetracyclin, chloramphenicol Tính chất này được ứng dụng trong sản xuất các chất kháng

sinh

Các chất kháng sinh hòa tan trong huyết thanh và trong dịch mô mà vẫn không

bị mất hoạt tính Đặc tính này của chất kháng sinh có ý nghĩa trong y học

Độc tố của chất kháng sinh đối với cơ thể bậc cao cũng rất khác nhau Đa số các chất khángsinh từ vi sinh vật thì ngoài tính kháng khuẩn còn gây độc cho cơ thể bậc cao Ví dụ:

chloramphenicol dùng nhiều và lâu sẽ gây suy tủy, tetracyclin dùng nhiều và lâu sẽ gây ảnh

hưởng đến gan Một số chất kháng sinh khác có độ độc trung bình, cho nên chỉ được dùng đểđiều trị các vết thương tại chỗ

Một trong những đặc tính nổi bật của chất kháng sinh là có tác động chọn lọc đối với vi sinhvật Vì vậy không thể có chất kháng sinh nào có thể tác động lên tất cả các vi sinh vật

1.3.3 Cơ chế tác động của chất kháng sinh

Cơ chế tác động của chất kháng sinh là những cách thức mà chất kháng sinh tác động lên các

vị trí đích khác nhau trong tế bào qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật Cơchế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học và nồng độ của chất khángsinh Không thể có một cơ chế chung cho sự tác động của chất kháng sinh lên tế bào vi sinhvật Nhìn chung cơ chế tác động của chất kháng sinh được biểu hiện theo các hướng cơ bảnsau:

- Ức chế tổng hợp thành tế bào

Thành tế bào được cấu trúc chủ yếu bởi thành phần peptidoglycan (PG), có chức năng giữhình dạng đặc trưng cho tế bào, bảo vệ cho tế bào khỏi vỡ dưới áp lực thẩm thấu cao ở bêntrong tế bào PG là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polisaccarit bao gồm các đơn phân

là hai loại dẫn xuất của glucoza nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách liên tục (NAG – NAM)

Để có thể sinh trưởng và phân chia, tế bào phải tổng hợp các đơn vị PG mới và vận chuyển nótới đúng vị trí sinh trưởng của thành tế bào Phần lớn các tác nhân kháng khuẩn thôngthường ddều hoạt động dựa trên sự ức chế quá trình hình thành liên kết chéo giữa các

tetrapeptit của tiểu phần NAM Nổi bật nhất giữa các chất này là các kháng sinh β-lactam mà đại diện là penixillin và cephalosporin Đây là các chất có vùng chức năng là các vòng β-lactam Các kháng sinh β-lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn với transpeptidaza là

enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuỗi PG, kìm hãm hoạt tính của

enzym này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn Các penixillin không thấm

qua được màng ngoài của vi khuẩn Gr (-) nên hiệu quả chống các vi khuẩn này rất thấp Tuy

nhiên các penixillin và cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng

ngoài vi khuẩn Gr (-)

Một số kháng sinh khác như vancomycin ức chế sự hình thành thành tế bào theo cách cản trởtrực tiếp đến sự hình thành cầu D-alanin-D-alanin liên kết tiểu phần NAM của các vi khuẩn Gr(+)

- Phá hủy màng sinh chất

Thuộc nhóm này bao gồm có các kháng sinh: colistin, polymyxin, amphotericin Các kháng

sinh này phá hủy màng sinh chất bằng cách gắn với ergosterol hay cholesterol là thành phầncủa màng sinh chất, tạo nên các lỗ trên màng và làm thất thoát nội chất ra ngoài dẫn tới gâychết tế bào Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không có sterol nên chúng có khả năng

đề kháng với amphoterixin B Tuy

nhiên chúng có thể bị phá hủy bởi polymixin Kháng sinh này gắn vào thành phần photpholipitmàng, làm thay đổi cấu trúc màng, dẫn tới làm rò rỉ một số chất của tế bào.

- Ức chế quá trình tổng hợp protein

Thuộc nhóm này có khoảng gần 70 chất kháng sinh đã được nghiên cứu Trong số đó có:

streptomycin, gentamycin, neomycin, các tetracyclin, cloramphenicol, erythromycin, Các kháng

sinh nhóm aminoglycoside gắn vào tiểu phần 30s của ribosome làm biến dạng tiểu phần này vàgây ra quá trình dịch mã không chính xác dẫn đến tổng hợp nên những protein bất thường Các

kháng sinh nhóm tetracyclin gắn vào tiểu phần 30s ngăn cản sự gắn các axit amin vào chuỗi kéo polypeptit đang được kéo dài Chloramphenicol gắn với tiểu phần 50s của ribosome ức chế

enzym peptidyltransferase, ngăn cản việc gắn kết các axit amin mới vào chuỗi peptit mới Các

kháng sinh nhóm macrolide gắn với tiểu phần 50s của ribosome, ngăn cản sự dịch chuyển của

ribosome từ codon này tới codo kế tiếp, kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự tổng hợpprotein bị dừng lại

- Ức chế tổng hợp axit nucleic

Axit nucleic (ADN, ARN) là các đại phân tử sinh học không thể thiếu đối với sự tổng hợp của

tế bào Một số chất kháng sinh đã cản trở quá trình tổng hợp axit nucleic bằng cách ức chế sựtổng hợp nucleotit, ức chế sao chép hoặc dừng phiên mã Do không thể tổng hợp vật chất ditruyền nên các vi sinh vật gây bệnh không thể sinh sản và duy trì nòi giống được

Hiện nay người ta đã biết rõ khoảng 20 chất phá hủy trao đổi chất và ức chế tổng hợp ARN,

26 chất ức chế trao đổi hoặc tổng hợp ADN

- Ức chế trao đổi chất

Các chất kháng sinh theo cơ chế này có cấu trúc gần giống với các chất trao đổi

bình thường nên được coi là các chất kháng trao đổi Chúng sẽ cạnh tranh trung

tâm hoạt động của enzym với các chất trao đổi bình thường làm cho sự sinh trưởng

và phát triển của vi sinh vật bị ức chế

Các kháng sinh thuộc nhóm này có: sunfonamit, trimethoprim có cơ chế hoạt động như một

chất kháng trao đổi Các chất kháng trao đổi có giá trị trong y học vì chúng chỉ có tác dụng ứcchế lên tế bào vi sinh vật mà không có tác dụng lên tế bào người

1.3.4 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm sinh vật có khả năng sinh kháng sinh cao, 60-70% xạ khuẩn phân lập được

từ đất có khả năng này Trong số 9000 chất kháng sinh đã được biết đến trên thế giới thì trên

80% là do xạ khuẩn sinh ra Chi Streptomyces là chi quan trọng nhất trong nhóm xạ khuẩn, với

trên 500 loài đã được miêu tả Chi này có nhiều loài có khả năng sinh kháng sinh, một số kháng

sinh rất quan trọng là streptomycin do S griseus sinh ra Khả năng sinh kháng sinh là kết quả

của quá trình đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc đẩy quá trình tiến hoá của xạ khuẩn

Chất kháng sinh là chất trao đổi bậc 2, thông thường được hình thành ở cuối pha sinhtrưởng, trong pha cân bằng Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịchvới sự hình thành bào tử Đó là điểm cần lưu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp khángsinh từ xạ khuẩn

Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, người ta thường mô tả hai pha: phasinh trưởng (trophophase) khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh với nguyên sinh chất đồngnhất làm giảm nguồn cacbon, nitơ và pH; pha sinh tổng hợp (idiophase): sinh trưởngchậm lại đôi khi xuất hiện quá trình tự tan của khuẩn ty và sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh.Cũng có tác giả chia sự phát triển của giống thành 4 hoặc 6 pha theo các đặc điểm sinh hoá

tế bào Trong một số trường hợp quá trình sinh học này lại diễn ra mạnh mẽ trong pha sinh

trưởng như trường hợp của chủng xạ khuẩn Saccharothrix sp SA 103 phân lập từ Sahara của Algeria sinh kháng sinh mutactimycin PR (Anthracycline mới) Quá trình tương tự cũng đã thấy

ở chủng Saccharothrix sp SA 233 sinh dithiolopyrrolone và chủng S clavuligerus sinh axit

clavulanic Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra nó cũng đa dạngnhưng quá trình sinh tổng hợp chúng dường như theo một số con đường nhất định Các conđường này chỉ là sự cải biên các con đường sinh tổng hợp của tế bào Các vật liệu ban đầu củacủa qúa trình chuyển hoá chất trao đổi bậc hai (chất kháng sinh) là những chất trao đổi sơ cấp.Chất kháng sinh được tổng hợp từ 1, 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc nhất, hoặc có thể là trùnghợp các hợp chất bậc nhất rồi biến đổi chúng bằng các enzim Mọi con đường sinh tổnghợp chất kháng sinh đều có sự tham gia của các enzim hoặc hệ thống enzim đặc biệt Cácenzym này được mã hoá bởi các gen nằm trong những cụm (cluster) trên nhiễm sắc thể

hoặc trên plasmit Ví dụ tổng hợp chlotetraxyclin ở S aureofaciens có 3 hệ thống enzim (hay

hệ thống gen) tham gia: hệ thống 1 với hơn 200 gen mã cho các enzim chuyển glucoza thànhaxetyl-CoA; hệ thống 2 chuyển axetyl-CoA thành malonyl-CoA; hệ thống 3 chuyển malonyl CoA

thành chlotetracyclin Tổng số gen ở 3 hệ thống liên quan tới tổng hợp chlotetracyclin lên tới

2000 gen

Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn rất phong phú và đa dạng, nguyên nhân là 1 loại kháng sinh

có thể do nhiều loài vi sinh vật khác nhau tổng hợp ra, cũng có khi 1 loại vi sinh vật tạo ranhiều loại kháng sinh khác nhau Ví dụ, có tới 27 chủng xạ khuẩn khác nhau có thể tổng

hợp được kháng sinh oxytetraxyclin, hay Streptomyces rimosus cùng lúc có thể tổng hợp được oxytetracylin và rimicidin Ngày nay số lượng chất kháng sinh được sản xuất từ xạ khuẩn

tăng lên đáng kể, rất nhiều trong số đó đã được sản xuất ở quy mô thương mại, có ý nghĩalớn trong y học và mang lại nhiều lợi nhuận

1.3.5 Các nhóm chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất khángsinh.Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới, có hơn 80% là có nguồn gốc từ xạkhuẩn Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ

khuẩn đều có phổ kháng rộng Trong số đó đã có rất nhiều chất đã và đang đƣợc sử dụng trong

biệt là chống đƣợc nhiều loài vi khuẩn đã kháng lại với penixilin và streptomycin.

Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea, có phổ kháng sinh

rộng, có tác dụng chống cả vi khuẩn Gr (+) nhƣ tụ cầu, phế cầu đã kháng lại penixilin và vikhuẩn Gr (-) nhƣ màng não cầu, lậu cầu Trong y học, chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do

nhiễm Pseudomonas.

Tetracyclin: Là các kháng sinh đƣợc tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng xạ khuẩn thuộc

chi Streptomyces, các chất kháng sinh này có phổ kháng sinh rộng, chống đƣợc cả vi khuẩnGram (-), Gr (+), ricketsia và một vài virut lớn Ngoài sử dụng trong y học, tetracyclin còn đƣợctrong chăn nuôi-thú y

Chloramphenicol: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae, đƣợc phát hiện vào

năm 1947, có hoạt tính chống lại đƣợc nhiều loài vi khuẩn Gr (+), Gr (-) Ngoài sử dụng trong yhọc, chất kháng sinh này còn đƣợc dùng trong chăn nuôi – thú y và thủy sản

Erythromycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus, là chất kháng sinh có phổ

rộng đối với các vi khuẩn Gr (+), đƣợc sử dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm phổi do

mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn.

Novobicin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và Streptomyces niveus, có

hoạt tính mạnh đối với vi khuẩn Gr (+) Đặc biệt có khả năng chống các tụ cầu đã kháng với

penixilin và một số chất kháng sinh khác.

Vancomycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces orientaliss, được dùng để điều trị các

bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gr (+), đặc biệt là các liên cầu, tụ cầu và phế cầu

1.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh

Trong lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn, các cơ chế như điều hoà cảm ứng, điềuhoà ngược, điều hoà dị hoá sẽ được sử dụng hoặc loại bỏ bằng các biện pháp dinh dưỡng, côngnghệ hoặc kỹ thuật di truyền Chủng lựa chọn cần phải phá vỡ cân bằng môi trường để làmmất sự điều hoà cần thiết, do đó có thể tổng hợp sản phẩm đáp ứng yêu cầu kinh tế Nhữnghiểu biết về thành phần môi trường lên men (nồng độ nguồn cacbon, nitơ, photphat vô cơ,các chất kích thích hoặc kìm hãm sinh tổng hợp chất kháng sinh) cũng như ảnh hưởng củacác điều kiện nuôi cấy khác (như pH, nhiệt độ, độ thông khí, đặc điểm của chủng giống) có ýnghĩa to lớn trong điều khiển quá trình lên men nhằm duy trì trạng thái hoạt động và có thểkéo dài pha sinh tổng hợp của chủng sản Ví dụ bổ sung chất dinh dưỡng nhắc lại hoặc điềuchỉnh pH bằng CaCO3 sẽ nâng hiệu suất sinh kháng sinh lên 20-30%; bổ sung thioxianat vào

môi trường lên men S aureofaciens cũng làm tăng tổng hợp chlotetraxyclin, trong khi bổ

sung xanh bromothymol lại cho tác dụng ngược lại

1.3.6.1 Thành phần môi trường

- Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp

chất kháng sinh của chủng S orientalis do nguồn cacbon không những tham gia vào cấu tạo

thành tế bào mà còn tham gia quá trình hình thành lên cấu trúc của sản phẩm

Nguồn cacbon thường sử dụng là các nguồn đường đơn như glucoza, fructoza…, các loạiđường kép như maltoza, saccaroza…, ngoài ra có thể sử dụng tinh bột, rỉ đường Đối với tinh bộtchủng có khả năng sử dụng để tạo ra chất kháng sinh bởi khả năng sinh enzym amylaza thuỷphân tinh bột sử dụng vào quá trình tổng hợp chất kháng sinh, với nguồn cacbon là glucozathì cho hoạt tính chất kháng sinh thấp do ảnh hưởng của quá trình ức chế ngược đồng thờiglucoza chỉ được sử dụng vào quá trình tăng trưởng Với nguồn cacbon là saccaroza cho hoạttính tốt nhất.

- Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô

cơ và nitơ hữu cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp thường sử dụng là cao nấm men, cao thịt,pepton, bột đậu tương,…, còn nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là các muối amon, muối nitrat.Trong đó nguồn nitơ vô cơ cho khả năng sinh chất kháng sinh không cao, còn nguồn nitơ hữu

cơ có ảnh hưởng tốt đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh do nó cung cấp các nguồn axitamin quan trọng dễ dàng đi vào chu trình tổng hợp để hình thành lên mạch heptapeptid

- Ảnh hưởng của nguồn photphat vô cơ

Photphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS Nồng độphotphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá

10mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo dàipha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến giảm hoặcngừng hẳn sinh tổng hợp CKS

- Ảnh hưởng của các yếu tố vi lượng

Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Nếu môi trường lên mendinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn Việc bổ sung các chất giàunguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiềuchủng xạ khuẩn

1.3.6.2 Điều kiện nuôi cấy