XÁC ĐỊNH THỜI GIAN VÀ LƯỢNG NƯỚC TỐI ƯU ĐỂ LẮNG GẠN CHẨN ĐOÁN MỘT SỐ GIUN SÁN PHỔ BIẾN Ở LOÀI NHAI LẠI

Kết quả ứng dụng trong xét nghiệm mẫu phân bò chứa trứng bốn loại giun sán trên cho thấy theo qui trình tiện lợi nhất là 3 lần thay nước với ½ cột nước đổ bỏ trong 1 lần thay nước và thờ

B Ộ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

****************

XÁC ĐỊNH THỜI GIAN VÀ LƯỢNG NƯỚC TỐI ƯU ĐỂ

Ở LOÀI NHAI LẠI

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ÁNH CHUNG

L ớp: DH06TY Ngành: Thú Y Niên khóa: 2006 – 2011

Tháng 8/2011

B Ộ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

****************

NGUY ỄN ÁNH CHUNG

XÁC ĐỊNH THỜI GIAN VÀ LƯỢNG NƯỚC TỐI ƯU ĐỂ

Ở LOÀI NHAI LẠI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS LÊ HỮU KHƯƠNG

Tháng 08/2011

XÁC NH ẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ tên sinh viên thực tập: NGUYỄN ÁNH CHUNG

Tên khóa luận tốt nghiệp: “Xác định thời gian và lượng nước tối ưu để lắng gạn

ch ẩn đoán một số giun sán phổ biến ở loài nhai lại”

Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp khóa 32

Giáo viên hướng dẫn

(ký tên)

TS Lê Hữu Khương

L ỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và ban

chủ nhiệm khoa Chăn nuôi Thú y đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Toàn thể quý thầy cô của khoa Chăn nuôi Thú y đã tận tình truyền đạt kiến

thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt những năm vừa qua

TS Lê Hữu Khương đã hết lòng hướng dẫn và động viên để em hoàn thành

tốt khóa luận tốt nghiệp

Chị Dương Tiểu Mai đã giành nhiều thời gian để hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lơi cho tôi thực hiện đề tài này

Xin cảm ơn

Gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẻ, giúp đỡ và động viên tinh thần giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận

TÓM T ẮT

Đề tài “Xác định thời gian và lượng nước tối ưu để lắng gạn chẩn đoán

một số giun sán phổ biến ở loài nhai lại” được thực hiện từ tháng 2/2011 đến tháng 6/2011, tại phòng thực hành Ký sinh trùng trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Tỷ lệ trứng trung bình thu được trong nước sạch sau 5 phút để lắng của sán

lá tuyến tụy là cao nhất (85 %), kế đến là sán lá dạ cỏ (71,33 %) và giun xoăn dạ

múi khế (71 %), thấp nhất là sán lá gan (67,33 %) Hầu như số trứng của bốn loại giun sán thu được sau khi lắng ở phút thứ tư và thứ năm là rất ít

Sau mỗi lần thay nước, mực nước đổ bỏ để số trứng thất thoát thấp nhất là ½

mực nước ban đầu Các chất cặn bã trong phân bò có thời gian lắng tối đa là 12 phút trong nước Sau 3 phút tỷ lệ chất lắng đạt 20 % và tăng dần (5 phút là 40 %, 8 phút 60 %)

Kết quả ứng dụng trong xét nghiệm mẫu phân bò chứa trứng bốn loại giun sán trên cho thấy theo qui trình tiện lợi nhất là 3 lần thay nước với ½ cột nước đổ bỏ trong 1 lần thay nước và thời gian mỗi lần để lắng là 4 phút

M ỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Xác nhận cửa giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Đặc điểm một số trứng giun sán thường gặp trên loài nhai lại 3

2.1.1 Trứng sán lá gan 3

2.1.2 Trứng sán lá dạ cỏ 3

2.1.3 Trứng sán lá tuyến tụy 4

2.1.4 Trứng giun xoăn dạ múi khế 4

2.2 Các phương pháp xét nghiệm phân 5

2.2.1 Phương pháp trực tiếp 5

2.2.2 Phương pháp lắng gạn 5

2.2.3 Phương pháp phù nổi 7

2.2.4 Đếm trứng giun sán 10

2.3 Một số công trình nghiên cứu về giun sán ký sinh trên loài nhai lại 11

2.3.1 Sán lá gan 11

2.3.2 Sán lá dạ cỏ 12

2.3.3 Sán lá tuyến tụy 13

2.3.4 Giun xoăn dạ múi khế 13

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian tiến hành 15

3.2 Địa điểm tiến hành 15

3.3 Đối tượng khảo sát 15

3.4 Dụng cụ 15

3.5 Nội dung nghiên cứu 15

3.5.1 Nội dung 1 15

3.5.2 Nội dung 2 17

3.5.3 Nội dung 3 19

3.5.4 Nội dung 4 20

3.6 Phương pháp thực hiện 22

3.6.1 Chuẩn bị 22

3.6.2 Phương pháp đếm trứng 23

3.6.3 Xử lý số liệu 23

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Kết quả thí nghiệm trên dung dịch nước chứa trứng 24

4.1.1 Số trứng giun sán lắng theo thời gian 24

4.1.2 Số trứng giun sán thất thoát theo thời gian lắng 28

4.2 Thời gian lắng của chất cặn bã trong phân bò 32

4.3 Kết quả xét nghiệm trên mẫu phân bò nhiễm giun sán 33

4.3.1 Kết quả xét nghiệm phân tìm trứng sán lá gan 34

4.3.2 Kết quả xét nghiệm phân tìm trứng sán lá dạ cỏ 35

4.3.3 Kết quả xét nghiệm phân tìm trứng sán lá tuyến tụy 37

4.3.4 Kết quả xét nghiệm phân tìm trứng giun xoăn 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 45

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Trang

Bảng 4.1 Số trứng sán lá gan lắng theo thời gian trong dung dịch chứa trứng 24

Bảng 4.2 Số trứng sán lá dạ cỏ lắng theo thời gian trong dung dịch chứa trứng 25

Bảng 4.3 Số trứng sán tuyến tụy lắng theo thời gian trong dung dịch chứa trứng 26

Bảng 4.4 Số trứng giun xoăn lắng theo thời gian trong dung dịch chứa trứng 27

Bảng 4.5 Số trứng sán lá gan thất thoát theo thời gian lắng và mực nước đổ bỏ 28

Bảng 4.6 Số trứng sán lá dạ cỏ thất thoát theo thời gian lắng và mực nước đổ bỏ 30

Bảng 4.7 Số trứng sán tuyến tụy thất thoát theo thời gian lắng và mực nước đổ bỏ 30 Bảng 4.8 Số trứng giun xoăn thất thoát theo thời gian lắng và mực nước đổ bỏ 31

Bảng 4.9 Tỷ lệ chất cặn trong phân bò lắng theo thời gian 33

Bảng 4.10 Số trứng sán lá gan thu được trong mẫu phân 34

Bảng 4.11 Số trứng sán lá dạ cỏ thu được trong mẫu phân 36

Bảng 4.12 Số trứng sán lá tuyến tụy thu được trong mẫu phân Error! Bookmark not defined Bảng 4.13 Số trứng giun xoăn thu được trong mẫu phân 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Các bước tiến hành nội dung 1 16

Hình 3.2 Các bước tiến hành nội dung 2 18

Hình 3.3 Các bước tiến hành nội dung 4 21

Hình 3.4 Cốc lắng gạn 22

Hình 3.5 Đĩa petri đếm trứng 23

Hình 4.1 Trứng sán lá gan trong phân 35

Hình 4.3 Trứng sán tuyến tụy trong phân 38

Hình 4.4 Trứng giun xoăn trong phân 39

Theo Lương Văn Huấn và Lê Hữu Khương (1997), thời gian lắng gạn của một số loại trứng là trong khoảng 10 – 15 phút và theo Foreyt (2001) thời gian lắng gạn của một số loại trứng là 10 phút Tuy nhiên, các tác giả chưa đưa ra con số cụ thể về ỷ lệ trứng lắng theo thời gian cũng như tỷ lệ trứng thất thoát trong quá trình

lắng gạn

Xuất phát từ vấn đề trên , chúng tôi tiến hành việc xác định thời gian lắng tối

ưu và lượng nước đổ bỏ thích hợp của một số giun sán phổ biến trên thú nhai lại , nhằm đạt k ết quả cao trong chẩn đoán, cũng như tiết kiệm thời gian k hi ứng dụng phương pháp lắng gạn trong việc xét nghiệm phân tìm trứng của các loại giun sán

ký sinh trên loài nhai lại Được sự đồng ý của B ộ môn Bệnh lý – Ký sinh thuộc Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường Đại Học Nông Lâm , dưới sự hướng dẫn của TS Lê

Hữu Khương chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định thời gian và lượng nước tối ưu

để lắng gạn chẩn đoán một số giun sán phổ biến ở loài nhai lại” trên cơ sở các

mẫu vật đã được bộ môn Bệnh lý – Ký sinh thu thập và bảo quản tại phòng thí nghiệm Ký sinh trùng trong những năm gần đây

1.2 Mục đích

Làm cơ sở ứng dụng trong phương pháp lắng gạn xét nghiệm phân tìm trứng giun sán ở loài nhai lại đạt hiệu quả cao

1.3 Yêu cầu

- Xác định thời gian lắng của trứng các loại giun sán thường gặp trên thú nhai lại

- Xác định tỷ lệ chất cặn bã lắng (lượng chất lắng) trong phân bò

- Chọn thời gian để lắng, lượng nước đổ bỏ và số lần thay nước thích hợp nhất

Trứng sán hình bầu dục, hai đầu thon đều, đầu nhỏ hơn có nắp, bên trong

chứa tế bào phôi xếp kín vỏ trứng, vỏ mỏng, màu vàng nhạt, kích thước 0,125 – 0,177 mm x 0,060 – 0,104 mm

Chu trình phát triển

Trứng theo phân ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi như nhiệt độ khoảng 22o

C, lượng oxy đầy đủ, ẩm độ và ánh sáng thích hợp thì trong trứng sẽ hình thành miracidium, sau đó miracidium phá vỡ vỏ trứng ra ngoài bơi lội trong nước Chúng chui vào vật chủ trung gian là ốc nước ngọt (giống Limnaea) rồi rụng lông và trở thành sporocyst Trong hệ thống tuần hoàn của ốc, sporocyst sinh sản vô tính cho ra

5 – 10 redia định vị ở các cơ quan như gan và tụy, tại đây chúng gia tăng kích thước

rồi redia sinh sản vô tính cho ra 15 -20 cercaria Cercaria thành thục tự chui ra khỏi

ốc, bơi lội trong nước và rụng đuôi hóa thành metacercaria bám vào cây cỏ dưới nước hay gần nước Sau khi đi vào cơ thể trâu bò metacercaria sẽ trở thành sán trưởng thành

cỏ có adolescaria, ấu trùng đi vào đường tiêu hóa, đến ruột rồi trở lại dạ cỏ phát triển thành sán trưởng thành

Chu trình phát tri ển

Quá trình phát triển của trứng cần hai ký chủ trung gian, thứ nhất là ốc trên

cạn và ốc nước ngọt, ký chủ trung gian thứ hai là các loài châu chấu và dế Sau khi theo phân ra ngoài qua ống dẫn tụy, trứng xâm nhập vào gan tụy của ký chủ trung gian thứ nhất rồi tạo ra sporocyst, sau 1 năm sporocyst sẽ tạo ra nhiều cercaria Cercaria xâm nhập tiếp vào ký chủ trung gian thứ hai tạo thành metacercaria ở cơ sau 3 tuần Ký chủ cuối cùng ăn phải ký chủ trung gian thứ hai sau 2 – 3 tháng sẽ phát triển thành sán trưởng thành ở ống dẫn tụy

2.1.4 Tr ứng giun xoăn dạ múi khế

Hình dạng

Mecistocirrus digitatus

Trứng có hình ovan, kích thước 0,101 – 0,120 mm x 0,051 – 0,063 mm, có hai màng mỏng bao bọc

Chu trình phát tri ển

Giun cái đẻ trứng, trứng được bài xuất cùng với phân ra ngoài, sau 24 – 48

giờ trứng nở ra ấu trùng 1 (L1) Ba ngày sau ấu trùng lột xác lần thứ nhất để thành

L2, ấu trùng lột xác lần thứ hai sau năm ngày để thành L3 có khả năng gây nhiễm

L3 có hai màng mỏng bao bọc và hoạt động mạnh hơn L1 và L2 Tùy theo điều kiện ngoại cảnh thích hợp L3 sẽ trở thành ấu trùng gây nhiễm rồi chúng đi qua thức ăn và nước uống vào đường tiêu hóa của vật chủ Sau ba ngày ấu trùng xâm nhập vào niêm mạc dạ múi khế L3 có thể bò lên cây cỏ, sống ở đất ẩm, giọt sương, lá cây… Khi gia súc ăn phải ấu trùng vào dạ múi khế sẽ lột xác hai lần nữa, ấu trùng 4 và 5 ở trong niêm mạc, sau đó thoát ra niêm mạc và phát triển thành trưởng thành sau

thể quan sát dưới kính hiển vi dưới độ phóng đại 100 lần Tuy nhiên, phương pháp này chỉ đạt hiệu quả đối với những con vật nhỏ, có lượng phân thải ra trong một lần

ít và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng cao Ví dụ như cầu trùng gà chủ yếu xảy ra trên gà từ

2 – 3 tuần tuổi, chúng thường thải theo phân một lượng lớn noãn nang, vì vậy có thể dùng phương pháp trực tiếp trong trường hợp này Đối với đại gia súc có khối lượng phân thải ra trong một lần lớn, trứng ký sinh thường phân tán rải rác với mật độ không cao thì phương pháp trực tiếp không có giá trị trong xét nghiệm

2.2.2 Phương pháp lắng gạn

Phương pháp lắng gạn rất đơn giản, được thực hiện dựa vào nguyên lý tỷ

trọng của trứng cao hơn tỷ trọng của nước, do đó trứng sẽ lắng xuống đáy Hiện nay, có rất nhiều dung dịch được sử dụng rộng rãi trong phương pháp này như lắng

gạn với nước sạch hay nước cất (phương pháp lắng gạn thông thường),

ether formalin và formaldehyde iodin Vì vậy, tùy thuộc vào mục đích xét nghiệm

và hiệu quả kinh tế mà lựa chọn dung dịch thích hợp

Theo Nguyễn Thị Lê (1996) phương pháp này có thể thực hiện với mẫu phân sau khi đã xét nghiệm trứng giun tròn và sán dây bằng phương pháp phù nổi, sau đó dùng phương pháp lắng gạn để xét nghiệm trứng sán lá và giun đầu gai

2.2.2.1 Phương pháp lắng gạn thông thường

Đây là một trong những phương pháp lắng gạn cơ bản nhất đạt hiệu quả kinh tế cao và rất dễ thực hiện Dung dịch được sử dụng trong phương pháp này là nước cất hay nước sạch Lấy 10 – 20 gam phân tươi cho vào cốc thủy tinh, thêm nước sạch vào cốc (1 phân/ 10 nước) khuấy đều rồi lọc qua rây có khoảng 81 lỗ/

cm2 sang một cốc có đáy hẹp miệng rộng với thể tích là 250 ml Cho nước sạch vào

cốc đến vạch 250 ml, khuấy đều rồi để yên trong 5 – 10 phút Sau đó đổ bỏ 2/3 lượng nước trong cốc, tiếp tục đổ nước sạch vào và để yên Lặp lại cho đến khi nước trong thì đổ bỏ phần nước trên chừa lại khoảng 5 – 10 ml ở đáy cốc cho ra đĩa petri và kiểm tra dưới kính hiển vi Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn nhiều thời gian để thực hiện, trứng rất dễ bị thất thoát trong quá trình lọc và lắng

gạn, vì vậy đòi hỏi phải tỉ mỉ và cẩn thận

2.2.2.2 Phương pháp lắng gạn với ether formalin

Phương pháp này được Ritchie đưa ra 1948 (Lương Văn Huấn và Lê Hữu Khương, 1997) dựa trên phương pháp lắng gạn thông thường, nhưng sử dụng dung

dịch formol 10% và ether

Ưu điểm của phương pháp là phát hiện được nhiều loại trứng giun sán Khối lượng phân dùng trong xét nghiệm không cần nhiều, vì dung dịch ether formalin có

tỷ trọng thấp nên trứng lắng nhanh, giảm thất thoát trứng khi lắng gạn Ngoài trứng

của sán lá, sán dây phương pháp còn phát hiện được trứng của Schistosoma,

Ancyloatoma, Trichoephalus, Ascaris và noãn nang c ủa Protozoa Tuy nhiên, các

bước thực hiện phương pháp khá phức tạp hơn phương pháp lắng gạn thông thường

Sau khi cho 1 gam phân vào dung dịch, khuấy đều, lọc và ly tâm với tốc độ

200 vòng/ phút trong 1 – 2 phút, kết quả cuối cùng thu được trong ống ly tâm có

bốn lớp rõ rệt Hút phần cặn cuối cùng ở đáy ống ly tâm cho lên lá kính quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần

2.2.2.3 Phương pháp lắng gạn với formaldehyde iodin

Phương pháp này được thực hiện tương tự như phương pháp trên, nhưng sử

dụng dung dịch methionate iodin formaldehyde Blagg (1955) (Lương Văn Huấn và

Lê Hữu Khương, 1997) cho biết phương pháp này có thể phát hiện được hầu hết các loài giun sán Trứng giun sán dễ phát hiện một phần do dung dịch iodin làm nền giúp ta dễ dàng tìm thấy trứng, nhưng mặt khác phương pháp này lại khá phức tạp

vì cần nhiều thời gian để pha chế dung dịch methionate iodin formaldehyde và ít

hiệu quả kinh tế

Mặc dù có rất nhiều dung dịch được sử dụng trong phương pháp lắng gạn, tuy nhiên nước sạch vẫn là lựa chọn được ưu tiên cho phương pháp xét nghiệm này

bởi rất dễ tìm thấy trong mỗi phòng thí nghiệm và có hiệu quả kinh tế cao

2.2.3 Phương pháp phù nổi

Phương pháp này dựa vào nguyên lý sử dụng nước muối bão hòa có tỷ trọng

lớn hơn trứng giun sán, noãn nang nguyên bào nhưng thấp hơn những cặn bã trong phân, do đó trứng và noãn nang sẽ được đẩy lên trên bề mặt dung dịch Đây là phương pháp tập trung trứng thường được sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm nổi bật như dễ thực hiện, tiết kiệm được nhiều thời gian, hạn chế thất thoát trứng, có thể phát hiện được phần lớn trứng giun tròn và noãn nang nguyên bào Đặt phiến kính

mỏng lên miệng lọ cho vừa tiếp xúc với dung dịch phân để trứng bám vào, để yên

20 – 30 phút rồi lấy phiến kính ra đậy lên một lá kính sạch và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần Có rất nhiều loại muối bão hòa được dùng trong phương pháp phù nổi như NaCl, ZnSO4, MgSO4, dung dịch đường, dung dịch glycerin … Những dung dịch này thường có tỷ trọng từ 1,2 đến 1,3 cao hơn so với

tỷ trọng của trứng nên trứng sẽ nổi nhanh trong dung dịch Nếu dung dịch có tỷ

trọng quá thấp số trứng sẽ nổi ít hoặc không nổi, ngược lại dung dịch có độ nhớt cao trứng nổi chậm, cặn bã của phân lại nổi nhiều Thời gian nổi của trứng cũng là yếu

tố quan trọng Nếu để trứng giun sán ngâm trong dung dịch phù nổi quá lâu trứng

có thể bị méo mó hoặc biến dạng Tùy theo tỷ trọng của trứng và tỷ trọng của dung dịch được sử dụng mà thời gian nổi của trứng sẽ khác nhau

2.2.3.1 Phương pháp phù nổi với NaCl bão hòa

Đây là phương pháp xét nghiệm cơ bản nhất trong các phương pháp phù nổi được Willis cho ra đời năm 1921 (Lương Văn Huấn và Lê Hữu Khương,1997) Các bước tiến hành khá đơn giản Lấy 1 – 2 gam phân cho vào cốc có chứa sẵn dung

dịch NaCl bão hòa (khoảng 25 ml) rồi khuấy đều và lọc qua rây có 81 lỗ/ cm sang một cốc khác Đổ dung dịch vào lọ có miệng hẹp (để trứng tập trung lại) đến đầy miệng lọ, sau đó nhẹ nhàng đặt phiến kính lên miệng lọ và để yên trong 30 phút Lấy phiến kính ra đặt vào khoảng giữa tấm kính và kiểm tra dưới kính

hiển vi

Kỹ thuật Willis đơn giản, có thể thực hiện ngay trong lọ đựng phân Tuy nhiên muốn thu kết quả tốt thì cần lấy lượng phân vừa phải và phiến kính phải sạch không nhờn Khi đặt phiến kính tiếp xúc với dung dịch chú ý không để dung dịch tràn ra ngoài làm thất thoát trứng hoặc dung dịch không tiếp xúc với phiến kính thì trứng sẽ không bám vào được Ngoài ra, phải khuấy thật đều dung dịch có chứa phân, thời gian chờ cho trứng nổi lên cũng phải vừa đủ Trứng sẽ không nổi

hết trong thời gian quá ngắn, ngược lại thời gian quá dài sẽ khiến trứng chìm trở lại

2.2.3.2 Phương pháp phù nổi với dung dịch đường

Năm 1923, Sheather (Sloss và Russer, 1987) đề nghị dùng dung dịch đường (454 gam/ 355 ml nước ấm) trong phương pháp xét nghiệm phân Dung dịch đường

có khả năng làm nổi được nhiều loại trứng giun tròn cũng như noãn nang nguyên bào Tuy nhiên, phương pháp này không thể làm nổi một số trứng sán dây, trứng các loại sán lá và trứng giun đầu gai Sán dây thường thải những đốt sán theo phân

ra ngoài, do đó có thể quan sát những đốt sán trong phân bằng mắt thường Sán lá

và giun đầu gai có thể phát hiện dễ dàng bằng phương pháp lắng gạn thông thường Khi khuấy lọc phân trong dung dịch nên khuấy nhẹ nhàng, tránh tạo những bọt khí làm cản trở khả năng quan sát dưới kính hiển vi

2.2.3.3 Phương pháp phù nổi với dung dịch MgSO 4 bão hòa

Năm 1975, Spencer và Monroe (Hygiene, 1979) cho biết khi sử dụng các dung dịch phù nổi khác nhau sẽ cho kết quả xét nghiệm trứng Toxocara canis khác

nhau Trên cùng một mẫu phân, cùng một thời gian để trứng nổi lên, dung dịch cho

kết quả tốt nhất là MgSO4 bão hòa cộng với 5% potassium iodin, tỷ trọng dung dịch

là 1,2 Với tỷ trọng cao hơn NaCl bão hòa nên ưu điểm của MgSO4 bão hòa là có thể xét nghiệm được nhiều trứng giun hơn, ví dụ trứng Metastrongylus

Phần lớn trứng giun sán khi thải ra có khả năng tồn tại trong môi trường đất sét khô, đất phù sa và trong chất bẩn Sự tích trữ của giun sán ở môi trường bên ngoài tạo điều kiện thuận lợi cho người và gia súc nhiễm giun sán Ngoài xét nghiệm phân, phương pháp phù nổi với MgSO4 còn có thể xét nghiệm mẫu đất cát

2.2.3.4 Phương pháp phù nổi với dung dịch ZnSO 4 bão hòa

Phương pháp cũng dựa trên nguyên tắc trứng nổi lên trên bề mặt dung dịch, lấy phần dung dịch nổi lên kiểm tra dưới kính hiển vi Dung dịch được sử dụng là ZnSO4 bão hòa có tỷ trọng là 1,18 (386 gam/ lít nước) Sau khi lấy phiến kính ra

khỏi dung dịch phù nổi, nhỏ một giọt iodin lên phiến kính, như vậy trứng giun sẽ dễ dàng phát hiện hơn trên nền iodin khi quan sát dưới kính hiển vi

2.2.3.5 Phương pháp Fulleborn

Cho 10 gam phân và 200 ml dung dịch NaCl bão hòa vào cốc, khuấy đều và

để yên 45 phút, sau đó dùng một que cấy có đầu uốn vòng (đường kính của vòng

uốn là 1cm), hớt phần nổi lên trên mặt nước cho lên tấm kính, kiểm tra dưới kính

hiển vi với độ phóng đại 100 lần Nếu có nhiều bã nổi lên thì hớt cho sang một cốc khác, đổ nước muối bão hòa vào đợi lắng rồi hớt phần mặt để xem

Đây là một trong những phương pháp phù nổi dễ làm và rẻ tiền Nguyên tắc

của phương pháp này là lợi dụng dung dịch muối ăn (NaCl) bão hòa có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng trứng giun sán làm cho trứng nổi lên trên bề mặt dung dịch Phương pháp Fulleborn rất tốt cho việc phát hiện trứng giun tròn, trứng sán lá cơ quan sinh

sản gia cầm và Oocyst cầu trùng

2.2.4 Đếm trứng giun sán

Với mục đích ước lượng số trứng giun sán trong 1 gam phân, từ đó suy ra số giun sán trong cơ thể gia súc nên phương pháp này chỉ có giá trị tương đối, vì không thể xác định chính xác số lượng giun sán Do số lượng trứng đẻ ra của giun sán non và trưởng thành khác nhau cũng như tỷ lệ đực cái trong quần thể giun sán

đã làm sai lệch kết quả Phương pháp này thường dùng để đánh giá hiệu lực tẩy trừ giun sán của một số thuốc trên cá thể gia súc Có hai phương pháp đếm trứng hiện nay là phương pháp Stoll và phương pháp McMaster

2.2.4.1 Phương pháp McMaster

Phương pháp này có độ chính xác cao hơn phương pháp Stoll nhờ vào buồng đếm McMaster Buồng đếm gồm hai buồng nhỏ, mỗi buồng có sáu vạch kẻ, khoảng cách giữa hai vạch vừa với chiều ngang của vi trường, do đó việc đếm trứng sẽ dễ dàng hơn và cũng hạn chế đếm sót trứng Chiều dài và chiều rộng của một buồng đếm là 1 cm cùng với chiều cao là 0,15 cm, do đó thể tích của buồng đếm là 0,15

ml Phương pháp McMaster có thể đếm được trứng hầu hết các loại giun sán nên

hiện nay được sử dụng rất phổ biến, nhất là để đếm trứng trước và sau khi sử dụng

một loại thuốc tẩy giun sán nhằm đánh giá hiệu lực của loại thuốc đó

2.2.4.2 Phương pháp Stoll

Các bước thực hiện phương pháp này tốn khá nhiều thời gian, nhưng chỉ đảm

bảo độ chính xác tương đối và có thể áp dụng trong việc ước lượng số giun sán của nhiều loài

Cho 5 gam phân vào ống có vạch đo, đổ thêm dung dịch NaOH N/10 tới

vạch 75 ml, khuấy đều rồi lọc qua rây Sau đó hút 0,15 ml dung dịch vừa lọc được cho vào giữa phiến kính và tấm kính để đếm trứng Số trứng đếm được nhân với

100 sẽ biết được số trứng có trong 1 gam phân Số trứng và ấu trùng trong 1 gam phân càng nhiều thì số giun sán trong cơ thể gia súc càng lớn Độ chính xác của phương pháp này không cao vì khó có thể quan sát hết, dễ bị trùng lắp vi trường và đếm sót trứng

2.3 M ột số công trình nghiên cứu về giun sán ký sinh trên loài nhai lại

2.3.1 Sán lá gan

Lê Thanh Hòa (2007) xét nghiệm hệ gen của các loài sán lá gan và cho biết

Việt Nam hiện nay có loài F gigantica và một dạng trung gian mang hệ gen của cả loài F gigantica và F hepatica Ở Việt Nam trâu nhiễm cao hơn bò Tỷ lệ nhiễm có

khuynh hướng tăng dần từ các tỉnh phía Nam ra phía Bắc Tuổi gia súc càng lớn thì

7 vùng sinh thái của Việt Nam đều có sự phân bố của Fasciola Tỷ lệ nhiễm có

xu hướng tăng dần từ Nam ra Bắc loài P.explanatum chỉ tìm thấy trên trâu với tỷ

lệ nhiễm thấp nhất (1,71 %) và được phân bố ở vùng ven miền trung và

miền Bắc

Sau khi khảo sát 60 trâu, 40 bò tại lò mổ tập trung thương mại Củ Chi, Tạ

Ngọc Liên (2002) đã ghi nhận tỷ lệ nhiễm như sau: sán lá dạ cỏ trên trâu là 100 %,

trên bò là 60 %, sán lá gan trên trâu là 68 %, bò nhiễm 55 %, sán lá tuyến tụy trên trâu và bò đều là 30 %

Trong mười loài giun sán được tìm thấy sau khi mổ khám 60 bò tại lò mổ trâu bò thuộc thị trấn Liên Nghĩa, huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Bùi Thị Kim

Lý (2007) cho biết tỷ lệ nhiễm Fasciola gigantica là cao nhất (63,33 %)

Theo Phạm Thị Tứ (2008), đã ghi nhận tỷ lệ nhiễm Fasciola gigantica là cao

nhất (31 %) trong ba loài giun sán tìm được sau khi khảo sát trên 100 bò ở Thành Phố Tuy Hòa

Tỷ lệ nhiễm Fasciola gigantica tại một số cơ sở giết mổ thuộc huyện Ninh

Hải, Ninh Phước và Thành Phố Phan Rang – Tháp Chàm – tỉnh Ninh Thuận được

Tạ Đình Sang (2009) ghi nhận như sau: bò nhiễm 42 %, trên dê nhiễm 34 % và trên

cừu là 26 %

Có bốn loài sán lá được Phạm Văn Bảo (2009) tìm thấy khi mổ khám 80 cừu

tại lò mổ xã Nhơn Sơn, huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận với tỷ lệ nhiễm như sau:

Fasciola gigantica 25 %, Fischoederius elongatus 7,50 %, F japonicus 7,50 % và Paramphistomum cervi 8,75 %

2.3.2 Sán lá dạ cỏ

Theo Lê Hữu Khương, Nguyễn Văn Khanh và Nguyễn Tin (2000), tỷ lệ nhiễm của các loài sán lá trên 20 cừu được khảo sát ở Ninh Thuận có kết quả như

sau: Paramphistomum cervi 75 %, Paramphistomun sp 40 %, Cotylophoron

cotylophum 35 %, Fischoederius elongatus 35 %, F japonicus 25 % và Fischoederius sp 45 %

Tại điểm giết mổ thuộc thị trấn Hồng Ngự, huyện Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp, Huỳnh Ân Giao (2002) đã mổ khám 60 con bò Tác giả có năm loại sán lá và một số loài giun tròn chiếm tỷ lệ như sau: Fischoederius elongatus 71,42 %, F

japonicus 57,14 %, Fasciola gigantica 28,57 %, Paramphistomum cervi 51,42 %,

P explanatum 25,71 %, Setaria digitata 57,14 %

Bằng phương pháp xét nghiệm phân, Đoàn Trung Kiên (2003) đã ghi nhận sán lá dạ cỏ chiếm tỷ lệ 40,45 % trong tổng số 576 bò sữa được khảo sát tại 88 hộ chăn nuôi gia đình thuộc huyện Củ Chi, Thành Phố Hồ Chí Minh

Theo Nguyễn Thị Kim Loan (2004), trong sáu loại ký sinh trùng đường ruột được tìm thấy tại một số trại bò thuộc Thành phố Hồ Chí Minh thì sán lá dạ cỏ là loài có tỷ lệ nhiễm cao nhất (59,28 %), kế đến là sán lá gan (19,52 %)

Năm 2005, Lê Thái Thuận mổ khám trên 36 bò tại lò giết mổ tập trung thị trấn Dĩ An, huyện Dĩ An, tỉnh Bình Dương Tác giả cho biết tỷ lệ nhiễm của sán lá

dạ cỏ như sau: Fischoederius elongatus 69,44 %, F japonicus 16,66 %,

Ceylonocotyle dicranocoelium 19,44 %, Paramphistomum gracile 22,22 %, P cervi

19,44 %

2.3.3 Sán lá tuy ến tụy

Ba loài sán lá tuyến tụy được Lê Quốc Việt (2002) tìm thấy sau khi mổ khám

75 bò có nguồn gốc từ tỉnh Nghệ An, Bình Thuận và Đồng Nai với tỷ lệ nhiễm như

sau: E dajii 20 %, Eurytrema pacreaticum 24 % và E coelomaticum 25,33 %

Tạ Ngọc Liên (2002) đã tìm thấy ba loài sán lá tuyến tụy ký sinh trên trâu bò được giết mổ tại trung tâm thương mại Củ Chi và ghi nhận tỷ lệ nhiễm như sau

Eurytrema pancreaticum 13 %, E coelomaticum 33 % và E.dajii 18 %

Năm 2004, Trần Anh Nhân mổ khám 150 bò có nguồn gốc từ tỉnh Đồng Tháp, Bình Dương và Phú Yên Tác giả đã định danh được 11 loài giun sán, trong

đó các loài sán lá chiếm tỷ lệ như sau sán lá gan 24,66 %, sán lá dạ cỏ 38 %, sán lá tuyến tụy 6,66 %

2.3.4 Giun xoăn dạ múi khế

Tỷ lệ nhiễm giun xoăn dạ múi khế tại lò mổ Dĩ An và Hóa Nhật thuộc tỉnh Bình Dương được Lâm Vĩnh Bình (2002) ghi nhận sau khi mổ khám 405 bò có nguồn gốc khác nhau là Mecistocirrus digitatus 22,47 %, Setaria digitata 34,81 %,

Elaeophora poeli 3,70 %

Theo Phạm Văn Dũng (2003), sau khi mổ khám 160 bò tại lò mổ thị trấn Dĩ

An có nguồn gốc từ tỉnh Bình Dương và Đồng Tháp thì có 68 bò nhiễm

Mecistocirrus digitatus, không tìm th ấy loài Haemonchus contortus và H similis Ở Bình Dương, tác giả đã khảo sát 70 bò và tỷ lệ nhiễm Mecistocirrus digitatus là

43,33 %

Qua mổ khám 38 bò có nguồn gốc từ Vĩnh Long Huỳnh Thanh Vũ (2003) cho biết qua thì tỷ lệ nhiễm Mecistocirrus digitatus là 21,10 %, không tìm thấy loài

Haemonchus contortus và Haemonchus similis Ở Trà Vinh, tác giả khảo sát 22 bò

có 12 bò nhiễm Mesitocirrus digitatus và 1 bò nhiễm Haemonchus contortus Ngoài

ra tác giả còn khảo sát trên 4 trâu ở Bình Thuận thì có 3 trâu nhiễm Mecistocirrus

digitatus

Bằng phương pháp mổ khám trên 60 bò có nguồn gốc thuộc huyện Mỏ Cày, tỉnh Bến Tre Phạm Khắc Phục (2005) cho biết tỷ lệ nhiễm Mecistocirrus digitatus

là 15 %, không tìm thấy Haemonchus contortus và H similis

Tại tại lò mổ tư nhân quận 7 Trần Trúc Anh (2006) cho biết tỷ lệ nhiễm giun xoăn dạ múi khế trên dê là cao nhất (72,22 %), kế đến là cừu (51,58 %), bò (44,44

%) và thấp nhất là trâu (51.58 %) sau khi đã mổ khám 8 trâu, 54 bò, 54 dê và

54 cừu

Tóm lại, qua các công trình nghiên cứu trên cho thấy loài nhai lại ở nước ta

thường nhiễm các loài giun sán phổ biến là sán lá dạ cỏ (Paramphistomum,

Fischoederius), sán lá gan (Fasciola), sán lá tuy ến tụy (Eurytrema) và các loài giun xoăn dạ múi khế (Mecistocirsus, Haemonchus) Để chẩn đoán khi thú còn sống,

phương pháp thường được áp dụng hiệu quả nhất là lắng gạn phân để tìm trứng các

loài giun sán này

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian tiến hành

Từ tháng 2/2011 đến tháng 6/2011

3.2 Địa điểm tiến hành

Phòng thực hành ký sinh trùng Trường Đại Học Nông Lâm

3.3 Đối tượng khảo sát

Các loại trứng giun sán thường gặp trên loài nhai lại gồm:

3.5 Nội dung nghiên cứu

3.5.1 Nội dung 1: xác định thời gian lắng của trứng bốn loại giun sán thường gặp

trong dung dịch chứa trứng bằng phương pháp lắng gạn với nước sạch ở phòng thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi: xác định số trứng lắng theo thời gian trong dung dịch chứa trứng

(5) Phần nước ở đáy mỗi cốc được đổ ra đĩa petri và quan sát dưới kính hiển vi

để đếm số lượng trứng thu được trong từng thời điểm

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Cách tính

Số trứng giun sán đếm được ở phần cặn của cốc 1 chính là số trứng lắng sau phút thứ nhất Tương tự như vậy số trứng lắng ở phút thứ hai, thứ ba, thứ tư và thứ năm tương ứng từ cốc 2 đến cốc 5 Sau 3 lần lập lại thí nghiệm chúng tôi tính được

số trứng trung bình thu được theo thời gian Tổng số trứng của năm cốc chính là số

trứng thu được sau 5 phút lắng gạn

Hình 3.1 Các bước tiến hành nội dung 1

3.5.2 Nội dung 2: xác định mực nước đổ bỏ của từng loại giun sán bằng phương

pháp lắng gạn với nước sạch ở phòng thí nghiệm

Ch ỉ tiêu theo dõi: xác định số trứng thất thoát trong từng mực nước đổ bỏ theo

thời gian

Nguyên lý

Theo thời gian trứng giun sán lắng xuống đáy cốc, ở phần nước phía trên vẫn còn một số trứng chưa lắng hết do trứng còn non, có tỷ trọng thấp nên lắng chậm Lượng trứng này sẽ bị thất thoát cùng với nước đổ bỏ sau mỗi lần thay nước Chúng tôi chọn 2 mực nước đổ bỏ là ½ lượng nước trong cốc tương đương với 125 ml nước và ¾ lượng nước trong cốc tương đương với 187 ml nước Như vậy cứ sau 1 phút chúng tôi thu lại lượng nước đổ bỏ ở 2 mực nước rồi tiếp tục lắng gạn để xác định số trứng bị thất thoát theo thời gian dưới kính hiển vi

(2) Thêm nước sạch đến vạch 250 ml vào 2 cốc trên

(3) Khuấy đều bằng đũa thủy tinh, sau khi rút đũa ra để yên trong 35 giây cho nước không còn dao động và bắt xác định thời gian lắng gạn

(4) Sau 1 phút đổ ½ phần nước phía trên của cốc thứ nhất sang cốc thứ hai và ¾ phần nước phía trên của cốc thứ ba sang cốc thứ tư

(5) Ở cốc thứ hai và thứ tư lại thêm nước sạch cho đến vạch 250 ml, khuấy đều và chờ sau 5 phút thì đổ bỏ phần nước phía trên đi chỉ chừa lại 10 ml ở đáy mỗi cốc Sau đó cho ra đĩa petri và quan sát dưới kính hiển vi

(6) Thực hiện tương tự từ bước (1) đến bước (3), ở bước (4) tăng thời gian lắng

gạn lên 2 phút, 3 phút 4 phút và 5 phút

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần ở mỗi thời điểm

Cách tính

Sau 1 phút, 2 phút, 3 phút, 4 phút và 5 phút lắng gạn lần thứ nhất chúng tôi thu lại ½ và ¾ lượng nước trong cốc rồi tiếp tục lắng gạn lần thứ hai trong 5 phút

Số trứng đếm được sau lần lắng gạn này chính là số trứng thất thoát của từng mực nước ứng với từng khoảng thời gian lắng gạn

3.5.3 N ội dung 3: xác định thời gian lắng của chất cặn bã trong phân bằng phương

pháp lắng gạn trong nước sạch ở phòng thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi: Xác định tỷ lệ chất lắng (lượng chất lắng) trong phân bò theo

(1) Lấy 10 g phân cho vào cốc thủy tinh

(2) Thêm nước sạch vào cốc khuấy đều rồi lọc qua rây (khoảng 81 lỗ/ cm2

)