KHẢO SÁT TỶ LỆ HUYẾT THANH HEO DƯƠNG TÍNH VỚI VIRUS CÚM SUBTYPE H1N1 VÀ SUBTYPE H3N2 Ở HAI HUYỆN CỦ CHI VÀ HÓC MÔN TRÊN ĐỊA BÀN TP. HỒ CHÍ MINH

Mặc dù chúng thường là dịch địa phương, nhưng dịch vùng có thể xuất hiện khi bệnh xảy ra trên những đàn heo không có miễn dịch hoặc từ sự thay đổi của môi trường chăn nuôi , sự nhiễm vi

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y

****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TỶ LỆ HUYẾT THANH HEO DƯƠNG TÍNH VỚI VIRUS CÚM SUBTYPE H1N1 VÀ SUBTYPE H3N2

Ở HAI HUYỆN CỦ CHI VÀ HÓC MÔN TRÊN

LÊ THỊ HOÀNG YẾN

KHẢO SÁT TỶ LỆ HUYẾT THANH HEO DƯƠNG TÍNH VỚI VIRUS CÚM HEO SUBTYPE H1N1 VÀ SUBTYPE H3N2

Ở HAI HUYỆN CỦ CHI VÀ HÓC MÔN TRÊN

Tháng 08/2011

ii

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ tên sinh viên: LÊ THỊ HOÀNG YẾN

Tên khóa luận: “Khảo sát tỷ lệ huyết thanh heo dương tính với virus cúm

subtype H1N1 và subtype H3N2 ở hai huyện Củ Chi và Hóc Môn trên địa bàn

TP Hồ Chí Minh”

Đã hoàn thành khóa luận theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét, đóng góp của hội đồng chấm thi tốt nghiệp khóa ngày 19/08/2011

Giáo viên hướng dẫn

TS LÊ ANH PHỤNG

Xin bày tỏ lòng biết ơn

Tiến sĩ Lê Anh Phụng và Thạc sĩ Huỳnh Thị Thu Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên, cung cấp cho tôi nhiều tài liệu quý báu để hoàn thành đề tài này

Chân thành cảm ơn

Ban lãnh đạo Trạm Chẩn Đoán, Xét nghiệm và Điều trị thuộc Chi Cục Thú Y

TP Hồ Chí Minh, các anh chị trong phòng siêu vi huyết thanh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Cảm ơn

Các bạn bè là người đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ, gắn bó với tôi suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tỷ lệ heo nhiễm virus cúm subtype H1N1 và subtype H3N2 ở hai huyện Củ Chi và Hóc Môn là khá cao (78,45% và 84,71%) Trong đó, tỷ lệ nhiễm subtype H3N2 cao hơn subtype H1N1, tỷ lệ nhiễm subtype H1N1và subtype H3N2 ở Củ Chi (90,87%; 92,02%) cao hơn ở Hóc Môn (54,41%; 70,59%)

Tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H1N1 và subtype H3N2 trên heo nái cao hơn trên heo nọc: (83,86%; 88,61%) trên heo nái và (57,83%; 69,88%) trên heo nọc Trong đó, trên heo nái ở Củ Chi (93,64%; 93,18%) cao hơn ở Hóc Môn (61,46%; 78,13%), trên heo nọc ở Củ Chi (76,74%; 86,05%) cao hơn ở Hóc Môn (37,5%; 52,5%)

Tỷ lệ heo nhiễm virus cúm subtype H1N1 và subtype H3N2 trong các trại nhỏ thấp hơn các trại lớn: (45,13%; 62,83%) trong các trại nhỏ và (91,61%; 93,36%) trong các trại lớn Trong đó, trong các trại nhỏ ở Củ Chi (80%; 68,57%) cao hơn ở Hóc Môn (29,49%; 60,26%), trong các trại lớn ở Củ Chi (92,54%; 95,61%) cao hơn

ở Hóc Môn (87,93%; 84,48%)

v

MỤC LỤC

Trang

TRANG TỰA i

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ x

Chương 1 M Ở ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Lịch sử và đặc điểm chung 3

2.1.1 Đặc điểm chung 3

2.1.2 Lịch sử 3

2.2 Căn bệnh 4

2.2.1 Phân loại 4

2.2.2 Hình dạng và cấu trúc 5

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 7

2.2.4 Sức đề kháng 7

2.3 Dịch tễ học 7

2.3.1 Lứa tuổi mắc bệnh 7

2.3.2 Các chủng virus cúm trên heo 8

2.3.2.1 Dòng H1N1 cổ điển 9

vi

2.3.2.2 “Human – like” virus 10

2.3.2.3 “ Avian – like” virus 10

2.3.3 Sự truyền lây giữa các loài 11

2.3.3.1 Sự truyền lây từ heo sang heo 11

2.3.3.2 Việc truyền lây giữa heo và người 11

2.3.3.3 Sự truyền lây giữa heo và loài cầm 12

2.3.4 Cách sinh bệnh 12

2.3.5 Chất chứa căn bệnh 13

2.4 Triệu chứng – Bệnh tích 13

2.4.1 Triệu chứng 13

2.4.2 Bệnh tích 14

2.4.2.1 Bệnh tích đại thể 14

2.4.2.2 Bệnh tích vi thể 15

2.5 Chẩn đoán 15

2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 15

2.5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 15

2.5.2.1 Kỹ thuật ELISA 16

2.5.2.2 Các phương pháp ELISA 16

2.6 Phòng bệnh 17

2.6.1 Phòng bệnh ở heo 17

2.6.2 Phòng bệnh lây sang người 18

2.7 Một số công trình nghiên cứu có liên quan 18

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm 20

3.1.1 Thời gian 20

3.1.2 Địa điểm 20

3.2 Đối tượng nghiên cứu 20

3.3 Vật liệu 20

3.3.1 Mẫu xét nghiệm 20

vii

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 21

3.3.3 Các bộ kít dùng trong chẩn đoán 21

3.4 Nội dung nghiên cứu 22

3.5 Phương pháp nghiên cứu 22

3.5.1 Bố trí lấy mẫu huyết thanh để xét nghiệm 22

3.5.2 Cách lấy mẫu 22

3.5.3 Phát hiện kháng thể chống virus cúm heo subtype H1N1 hoặc H3N2 bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp 23

3.5.3.1 Nguyên tắc và cơ chế phản ứng của kĩ thuật ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể kháng virus cúm heo subtype H1N1 và H3N2 23

3.5.3.2 Quy trình xét nghiệm 25

3.5.4 Các chỉ tiêu theo dõi, cách tính và công thức tính 28

3.5.4.1 Các chỉ tiêu theo dõi 28

3.5.4.2 Cách tính kết quả 28

3.5.4.3 Công thức tính tỷ lệ 29

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 29

Chương 4 K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Tỷ lệ heo nhiễm virus cúm subtype H1N1 và subtype H3N2 ở hai huyện Củ Chi và Hóc Môn 30

4.2 Tỷ lệ nhiễm virus cúm heo subtype H1N1 và subtype H3N2 trên heo nái và heo nọc ở Củ Chi và Hóc Môn 33

4.3 Tỷ lệ heo nhiễm virus cúm subtype H1N1 và subtype H3N2 tại các trại nhỏ và trại lớn ở Củ Chi và Hóc Môn 36

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PH Ụ LỤC 46

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ELISA: Enzyme – Linked Immunosorbent Assay

EIA: Enzyme Immuno Assay

HA: Haemagglutinin

HI: Hemagglutination Inhibition

HRPO: Horseradish Peroxidase

SI: Swine Influenza

S/P: Sample to Positive ratio

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình

Hình 2.1 Cấu trúc của virus cúm A 5

Hình 3.1 Kết quả phản ứng qua sự đổi màu trên vỉ ELISA 23

Hình 3.2 Cơ chế phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể kháng virus cúm heo subtype H1N1 hoặc subtype H3N2 24

Sơ đồ

Sơ đồ 3.1 Quy trình phát hiện kháng thể chống virus cúm heo subtype H1N1 hoặc

subtype H3N2 27

Hồ Chí Minh là nơi quá cảnh và tiêu thụ phần lớn sản phẩm động vật từ các tỉnh chuyển về, vì thế nguy cơ xuất hiện nhiều chứng bệnh trên heo là điều không thể tránh khỏi và có thể gây thiệt hại không nhỏ cho các trại heo

Mặc dù đã có nhiều bệnh được nghiên cứu và phòng chống khá hiệu quả nhưng vẫn còn nhiều bệnh đang bỏ ngỏ, trong đó có bệnh cúm heo (swine influenza: SI) Bệnh cúm heo xảy ra trên heo và còn có thể gây bệnh trên người Có nhiều subtype gây bệnh trên heo nhưng chiếm ưu thế và lưu hành rộng rãi nhiều nơi trên thế giới đó là subtype H1N1 và subtype H3N2 Cúm H1N1 đã từng làm chết 20

- 40 triệu người ở Tây Ban Nha năm 1918 (Brown, 2003) Virus cúm heo H3N2 có nguồn gốc từ virus cúm người đã gây ra đại dịch cúm Hồng Kông năm 1968 - 1969 gây tử vong 750 nghìn người Các vụ dịch trên heo xảy ra quanh năm, với tỷ lệ mắc tăng vào mùa thu và mùa đông tại các vùng khí hậu ôn hòa Bệnh làm cho đàn heo giảm sức đề kháng nên tạo điều kiện cho các vi sinh vật khác xâm nhập và phát triển

2

Nhằm hiểu biết những kiến thức thực tế, được sự đồng ý của Khoa Chăn nuôi Thú y – Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh và Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm thuộc Chi cục Thú y TP Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS Lê Anh

Phụng, ThS Huỳnh Thị Thu Hương, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo

sát tỷ lệ huyết thanh heo dương tính với virus cúm subtype H1N1 và subtype H3N2 ở hai huyện Củ Chi và Hóc Môn trên địa bàn TP Hồ Chí Minh”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

Tìm hiểu tỷ lệ huyết thanh heo dương tính với virus cúm subtype H1N1 và H3N2 để đánh giá tỷ lệ heo nhiễm virus cúm heo ở hai huyện Củ Chi và Hóc Môn nhằm cung cấp dữ liệu phục vụ cho công tác phòng bệnh cúm trên heo

Các virus cúm heo hầu hết thuộc subtype H1N1 nhưng cũng có những subtype khác lưu hành ở heo như H1N2, H3N1, H3N2 Heo cũng có thể bị nhiễm các virus cúm gà, virus cúm theo mùa của người Virus cúm heo H3N2 được coi là bắt nguồn từ người Đôi khi ở cùng một thời điểm heo có thể bị nhiễm đồng thời hai hoặc nhiều subtype virus Điều này có thể dẫn đến việc một virus cúm chứa các gen của nhiều nguồn, gọi là virus “tái tổ hợp” Mặc dù bình thường các virus cúm heo là những chủng chỉ gây bệnh đặc hiệu cho heo, nhưng đôi khi chúng có thể vượt qua hàng rào về chủng loại và gây bệnh cho người

2.1.2 Lịch sử

Cúm heo lần đầu tiên phát hiện ở Mỹ , Hungary và Trung Quốc năm 1918 trùng hợp với đại dịch ở Tây Ban Nha gây chết hơn 20 triệu người trên thế giới (Beveridge, 1977; Chun, 1919; Koen, 1919; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) Theo Dorset và công sự (1922) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm , 2007) bác sỹ thú y Koen và một số bác sĩ thú y vùng Trung Bắc nước Mỹ thấy triệu chứng

về bệnh tích trên đường hô hấp ở người bệnh và heo bệnh rất giống nhau nên họ đặt tên là bệnh cúm Đến năm 1930 thì virus mới được phân lập tại Mỹ ( Shope, 1931)

4

Sau đại dịch năm 1918 cúm heo cổ điển đã trở thành dịch ở Mỹ , những nơi khác trên thế giới chỉ có một báo cáo các đợt dịch rải rác Mãi đến năm 1976, virus này được phân lập trên một ổ dịch ở miền Bắc nước Ý Cho đến năm 1979, bệnh cúm do virus này được báo cáo ở Bỉ và ở Pháp Bệnh truyền nhanh chóng sang các quốc gia khác và được báo cáo ở Hà Lan , Đức, Đan Mạch, Thụy Điển, Anh Quốc

và trở thành dịch bệnh ở Châu Âu (HinShaw và cộng sự, 1978; do Brown trích dẫn, 2003), ở Châu Úc và một số quốc gia ở Châu Á (Trần Thanh Phong, 1996)

Theo Laval (2005), dịch cúm Tây Ban Nha 1918 do virus cúm subtype H1N1 gây ra, dịch cúm Châu Á năm 1957 do subtype H1N2, dịch cúm Hồng Kông

1968 do subtype H 3N2 gây ra Virus cúm heo và virus cúm người năm 1918 có cùng cấu trúc kháng nguyên H1 (hemagglutinine) (Lê Anh Phụng và Trần Thị Bích Liên, 1999)

Hiện nay bệnh cúm trên heo là một bệnh mang tính chất mùa vụ , xảy ra ở các vùng chăn nuôi heo tập trung có mật độ nuôi cao , đây là một trong những bệnh đường hô hấp heo phổ biến nhất , được ghi nhận trên nhiều quốc gia , gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho các nhà chăn nuôi heo và làm tăng tiêu tốn thức ăn , giảm tăng trọng và kéo dài thời gian nuôi thịt (Brown, 2003)

2.2 CĂN BỆNH

2.2.1 Phân loại

Shope (1931) đã chứng minh bệnh cúm heo gây ra bởi virus thuộc nhóm

ARN họ Orthomyxomiridae, giống Influenzavirus Có 3 type virus cúm : type A ,

type B , type C Sự phân biệt các type dựa trên bản chất kháng nguyên c ủa nucleoprotein (NP) và kháng nguyên khung M (matrix antigen)

+ Type A: gây bệnh ở người, heo, ngựa và tất cả các loại gia cầm như gà , gà tây, vịt, ngan, ngỗng và một số loài chim hoang dã

+ Type B và C: chỉ gây bệnh ở người

Trên bề mặt có các gai lồi 10 – 12mm, là 2 loại glycoprotein khác nhau : hemagglutinine (H) có dạng que và neuraminidase (N) có dạng hình nấm Các glycoprotein H và N này có đầu kỵ nước móc vào vỏ lipid H đóng vai trò gắn virus vào các thụ thể trên bề mặt tế bào và làm tan màng tế bào của vật chủ để xâm nhập Còn N thì được cho rằng có vai trò thủy phân thụ thể của tế bào để được giải phó ng các virus thế hệ con cháu ra khỏi các tế bào của vật chủ Cho đến hiện tại, người ta biết có đến 16 subtype của H (H1 đến H16) và 9 subtype của N (N1 đến N9) (Laval, 2005) Vì thế mỗi subype được định danh dựa theo bản chấ t của 2 kháng nguyên H

và N, ví dụ: H1N1, H3N2

6

Bảng 2.1 Các đoạn gen của virus cúm type A và vai trò sinh học của protein

Đoạn

gen

Protein được mã hóa Số acid amin Vai trò sinh hoc

1 PB2 759 Tiểu đơn vị polymerase: hoạt

5 NP 498 Nucleoprotein: liên kết với

ARN virus tạo phức hợp ribonucleoprotein

6 NA 454 Neuraminidase: thủy phân thụ

thể khi hạt virus chui ra khỏi

tế bào, giải phóng hạt virus

Protein không cấu trúc 2, tham gia trong việc bài xuất phức hợp RNP ra ngoài nhân (Laval, 2005)

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

Scott (1938) nuôi cấy virus trên phôi gà và đã cấy truyền 32 đời trên màng nhung niệu, sau lần cấy truyền thứ 58, virus cấy truyền trên phôi gà không gây nhiễm động vật (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Virus cúm nhân lên trong môi trường tế bào thận lợn một lớp, trong môi trường phổi (tách ra bằng tác động của trypsin catalasae)

Trong phòng thí nghiệm có thể gây bệnh trên lợn con, chuột bạch

2.2.4 Sức đề kháng

Virus cúm nhạy cảm với nhiệt độ (560

C trong 30 phút), acid (pH = 3) và các loại dung môi lipid , vì thế khá nhạy cảm với chất tẩy rửa và chất sát trùng Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại trong nước hơn 60 ngày (Stallknecht và cộng sự , 1990; dẫn bởi Laval, 2005) và có thể phân lập từ nước ao hồ bị nhiễm virus tự nhiên (Ito

8

2.3.2 Các chủng virus cúm trên heo

Virus cúm A subtype H 1N1 và subtype H3N2 đã được báo cáo là gây bệnh rộng rãi trên heo và thường có biểu hiện lâm sàng, bệnh mang tính thời vụ (bệnh địa phương) xảy ra ở tất cả các vùng chăn nuôi heo tập trung có mật độ nuôi cao Ơ Bỉ, xét nghiệm huyết thanh học trên heo thịt có tỉ lệ huyết thanh dương tính với 2 chủng H1N1 và H 3N2 lần lượt là 90% và 57%, 60% và 30% ở Hà Lan , 73% và 62% ở Nhật, 55% và 51% ở Đức (Easterday và Van Reeth , 1999) Những dòng Virus này bao gồm dòng H1N1 cổ điển, “avian – like” H1N1 và “human” – and “avian – like” H3N2 Mặc dù chúng thường là dịch địa phương, nhưng dịch vùng có thể xuất hiện khi bệnh xảy ra trên những đàn heo không có miễn dịch hoặc từ sự thay đổi của môi trường chăn nuôi , sự nhiễm vi khuẩn , virus và nhiệt độ lạnh Điều tra huyế t thanh học ở Anh Quốc cho thấy hơn 50% heo trưởng thành nhiễm một hoặc nhiều virus cúm type A trong suốt quá trình sống , khoảng 14% heo bị nhiễm với cả 2 dòng virus trên người và trên heo (Brown và cộng sự , 1995; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007)

Dòng virus lần đầu tiên được phân lập ở Bắc Mỹ năm 1930

“Avian – like” virus phân lập đầu tiên 1979

“Avian – like” virus phân lập đầu tiên 1993

“Human – like” virus phân lập đầu tiên 1970 Châu Á

“Avian – like” virus phân lập đầu tiên 1978

H1N2 Châu Âu

Châu Á

Classical/ “human – like” tái sắp xếp ở Nhật Bản Human/ “human – like” tái sắp xếp ở Anh Quốc (Brown, 2003)

2.3.2.1 Dòng H1N1 cổ điển (trích dẫn của Brown, 2003)

Sau khi bệnh cúm trên heo được thông báo cùng với đại dịch trên người năm

1918, cúm heo nổ dịch hằng năm vào những tháng mùa đông ở miền bắc và miền đông nước Mỹ trong một thời gian dài sau khi xuất hiện lần đầu tiên Tuy nhiên dòng virus này hoặc kháng thể chống lại chún g được tìm thấy nhiều nơi trên thế giới bao gồm Canada (Morin và cộng sự , 1981), Brazil (Cunha và cộng sự , 1978), Hồng Kông (Yip, 1976), Nhật Bản (Yamane và cộng sự , 1978); Ấn Độ (Das và cộng sự, 1981), Trung Quốc, Đài Loan (Shotridge và Webster, 1979); Kenya (Scott, 1957) và Iran (Samadieh và Shakeri , 1976) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007)

Ở Châu Âu việc phân lập virus được thực hiện ở Anh Quốc và

Czechoslovakia, trong khi việc phát hiện kháng thể chống lại virus cúm H 1N1 trên

10

heo được thực hiện ở Cộng Hòa Liên Bang Đức Sau các sự kiện này , virus có vẻ như không xuất hiện ở vùng này và không có dấu hiệu của bệnh ở Châu Âu gần 20 năm, mãi đến năm 1976 virus được phân lập t rên một ổ dịch ở miền bắc nước Ý , cho đến năm 1979, bệnh được báo cáo ở Bỉ vá Pháp Bệnh truyền nhanh chóng sang các quốc gia Châu Âu khác và được báo cáo ở Hà Lan , Đức, Đan Mạch, Thụy Điển

và Anh Quốc Virus này gây dị ch bệnh trên heo khắp Châu Âu với tỷ lệ huyết thanh dương tính là 20 – 25 % (Zhang và cộng sự, 1978; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) và khoảng 45% trên heo giống (Easterday, 1980; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) Riêng ở miề n Bắc nước Mỹ , tỷ lệ này lên đến 51% (Champer và cộng sự, 1991; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007)

2.3.2.2 “Human – like” virus

Heo bị nhiễm virus có nguồn gốc từ người cũng xảy ra trong tự nhiên Chủng H3N2 và kháng thể cũng được phát hiện trên heo ở nhiều nơi trên thế giới Từ năm

1984 có những dịch cúm do dòng H 3N2 có kháng nguyên tương tự như ở dòng virus gây bệnh trên người những năm 1970 và lưu hành khắp Châu Âu (Aymard và cộng sự, 1985; Haesebrouck và cộng sự, 1985; Prichard và cộng sự, 1987; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) Virus cúm H1N1 trên người cũng gây nhiễm cho heo ( Kundin và Easterday , 1972; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) Những xét nghiệm về huyết th anh học và phân lập virus ở nhiều nơi trên thế giới cho thấy dòng virus H1N1 trên người thực sự truyền lây sang heo (Roberts và cộng

sự, 1987; Brown và cộng sự, 1995; trích dẫn từ Brown, 2003)

2.3.2.3 “ Avian – like” virus

Từ năm 1979 dòng virus H1N1 trên heo ở Châu Âu chủ yếu là avian – like H1N1 virus Chúng có cấu trúc kháng nguyên và bộ gen khác biệt với dòng họ virus cúm heo cổ điển H 1N1 ở Bắc Mỹ nhưng chúng lại có quan hệ gần gũi với dòng virus H1N1 được phân lập trên vịt Gần đây một thông báo virus từ chim truyền sang người xảy ra ở Miền Nam Trung Quốc , những virus này đã được phát hiện trên heo ở miền Tây Nam Châu Á năm 1993 Ngoài ra, một vài dòng virus H 3N2 phân lập từ heo Châu Á từ năm 1970 cũng có nguồn gốc từ gia cầm và chúng đã

11

từng gây bệnh trên vịt , mặc dù vai trò của chúng trong việc gây bệnh hô hấp trên heo chưa được chứng minh

2.3.3 Sự truyền lây giữa các loài

Virus cúm type A có thể truyền lây qua nhiều loài trong tự nhiên như người , động vật hữu nhũ bao gồm cả động vật hữu nhũ dưới nước và chim Như thế, heo cũng là một trong những động vật truyền lây trong tự nhiên

2.3.3.1 Sự truyền lây từ heo sang heo

Heo bệnh bài thải virus qua đường thở , phân, niêm mạc và tiếp tục bài thải trong vòng 2 – 4 tuần sau khi khỏi bệnh (Laval, 2005) Blaskovic và cộng sự (1970) (trích dẫn từ Brown , 2003) cho rằng heo nhiễm chủng H 1N1 có thể bài thải virus kéo dài hơn 4 tháng

Bệnh lây lan chủ yếu do tiếp xúc trực tiếp giữa heo bệnh và heo khỏe Bệnh xảy ra trong điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém , khẩu phần thức ăn thiếu dinh dưỡng, chuồng trại ẩm ướt dễ t ạo điều kiện cho dịch bệnh bộc phát (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) Ngoài ra bệnh còn lây lan gián tiếp qua dụng cụ bị nhiễm , chim hoang Gió có thể mang virus đi xa đến 3 km

2.3.3.2 Việc truyền lây giữa heo và người

Đã có nhiều tiên đoán từ đại dịch năm 1918 là có sự truyền dịch từ heo sang người nhưng điều này không được chứng minh Mãi đến năm 1976 mới có bằng chứng cụ thể về việc truyền lây này Vào năm 1976, sau khi một trận dịch cúm địa phương trên heo nổ ra, virus phân lập từ heo và những người tiếp xúc đều có kháng nguyên và cấu trúc bộ gen của chủng virus cúm heo H 1N1 (Hinshaw và cộng sự , 1978; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) Những người làm việc với gia cầm và lợn, đặc biệt là những người tiếp xúc với cường độ cao có nguy cơ nhiễm

virus cúm lưu hành ở động vật cao

Heo nhiễm virus chủng H 3N2 có nguồn gốc từ người cũng đã được chứng minh Chủng H3N2 giống như chủng A /Hongkong/68 virus đã được phâ n lập từ heo ở Đài Loan (Kundin, 1970; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) Sau đó một vài dòng biến chủng của virus H3N2 trên người đã truyền lây sang heo Những

12

dòng gây bệnh dịch trên người tiếp tục được phân lập trên heo sau nhiều năm không còn thấy xuất hiện và là nguyên nhân đáng lo ngại gây bệnh dịch ở Mỹ

(Haesebrouck và cộng sự, 1985; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007)

2.3.3.3 Sự truyền lây giữa heo và loài cầm

Đã có báo cáo là virus H1N1 gây bệnh cúm trên heo truyền lây sang gà tây ở vùng Bắc Mỹ (Mohan và cộng sự, 1981; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) Một số trường hợp gà tây có biểu hiện bệnh ngay sau khi tiếp xúc heo bị nhiễm bệnh cúm, kiểm tra huyết thanh học cho thấy phát hiện kháng thể chống lại virus cúm H1 ở cả heo và gà tây Hinshaw và cộng sự báo cáo là đã phân lập được virus H1N1 trên gà tây và sau đó chúng truyền sang những kỹ thuật viên phòng xét nghiệm, gây sốt và bệnh trên đường hô hấp Ở Châu Âu virus H 1N1 trên gia cầm truyền lây sang heo tạo thành một dòng mới sau đó truyền lây sang gà tây thiệt hại nặng nề kinh tế (Ludwig và cộng sự , 1994; Wood và cộng sự , 1997) ( trích bởi Brown, 2003)

2.3.4 Cách sinh bệnh

H là protein của virus để nhận biết các thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ chuyên biệt Khi xâm nhiễm , H gắn kết với sialic acid của màng bào tương Các dòng virus khác nhau sẽ sử dụng phân t ử sialic acid ở liên kết α – 2,3 của galactose hiện diện trên bề mặt của tế bào biểu mô khí quản và ruột Ở người, virus có khả năng gắn kết tế bào tương tự nhưng ở liên kết α – 2,6 của galactose Loài heo đặc biệt hơn, có cả hai dạng thụ thể nói trên, điều này làm cho heo mẫn cảm với cả virus cúm gia cầm, cúm người và hiển nhiên là cả cúm heo , vì thế cần phải hết sức thận trọng với các trường hợp cúm heo Ở heo có khả năng các chủng vi rus cúm tái tổ hợp tạo dòng mới với động lực cao trên người và lây lan mạnh (Brown, 2003)

Để virus có thể xâm nhập vào trong tế bào vật chủ thì H phải được cắt bởi protease của tế bào , nếu không các hạt virus không thể l ây nhiễm và chu trình lây nhiễm của virus sẽ dừng lại Ở những virus độc lực thấp , H của virus chỉ bị cắt giới hạn ở một số tế bào biểu mô đường hô hấp và tiêu hóa , ngược lại, các chủng có độc lực cao có thể bị cắt bởi protease của tế bào ở nhiều loại mô và như vậy virus có thể

13

khuếch tán nhân lên trong khắp cơ thể Ngoài ra, động lực còn phụ thuộc vào số acid amin kiềm tại vị trí cắt , số acid amin kiềm tại vị cắt càng nhiều thì độ c lực của virus càng cao (Laval, 2005)

Sự nhiễm virus cúm trên heo thường giới hạn ở đường hô hấp , nhiễm trùng huyết thường ít gặp Brown và cộng sự, 1993 (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) báo cáo là phân lập virus trong m áu từ ngày 1 và ngày thứ 3 sau khi nhiễm bệnh Tuy nhiên, virus chỉ có thể phân lập trong vòng 1 ngày sau khi gây nhiễm và

số lượng virus trong huyết thanh rất thấp Virus nhân lên ở niêm mạc mũi , hạch amidan, khí quản, phổi và hạch lâm ba khí quản phổi , phổi được xem như là cơ quan đích chủ yếu của bệnh cúm

Sử dụng kỹ thuật ELISA có thể phát hiện kháng thể đặc hiệu chống bệnh cúm trong huyết thanh ở ngày thứ 3 và ở dịch mũi trong ngày thứ 4 sau khi nhiễm

2.3.5 Chất chứa căn bệnh

Phổi, hạch phổi, chất dịch đường hô hấp chứa virus, virus tồn tại trên heo bệnh cũng như heo khỏi bệnh mang trùng

Nguồn chứa virus ngoài tự nhiên virus cúm - ấu trùng giun phổi – giun đất Heo khỏi bệnh vẫn là vật mang trùng và tiếp tục bài trùng trong vài tháng (Trần Thanh Phong, 1996)

2.4 TRIỆU CHỨNG – BỆNH TÍCH

2.4.1 Triệu chứng

Bệnh xảy ra đột ngột sau 1 – 3 ngày nung bệnh , hầu hết heo trong đàn có triệu chứng bệnh cùng một lúc Heo bỏ ăn, lừ đừ, mệt mỏi, tụ lại và nằm chồng chất lên nhau Chúng không di chuyển mặc dù bị kích thích hoặc thậm chí bị đánh mạnh Thông thường chúng há mồm gắng sức thở (thể thở bụng ), co giật đặc biệt khi chúng cố gắng di chuyển Khi cố gắng di chuyển có thể làm cho cơn ho bộc phát dữ dội, sốt cao từ 40,50

C – 41,70C Viêm kết mặc mắt, viêm mũi có tiết dịch và hắt hơi, heo giảm trọng lượng và yếu ớt Tỷ lệ bệnh cao (gần 100%) nhưng tỷ lệ chết thấp trừ khi có bệnh kế phát và hoặc khi heo còn quá nhỏ Thường chúng bắt đầu hồi phục sau 5 – 7 ngày và cũng đột ngột như khi phát bệnh (Dorset và cộng sự, 1922;

14

Shope, 1931; trích dẫn bởi Easterday và Van Reeth , 1999) Bệnh cúm cấp tính như

diễn tả trên đây thì giới hạn ở những heo nhạy cảm và không có kháng thể

Một số chuyển sang thể mãn tính với triệu chứng ho kéo dài , thở khó, sinh trưởng chậm, da nở và có vẩy đen , sức khỏe rất khó hồi phục Nếu có vi khuẩn kết hợp tác động vào thì viêm khớp , sưng đầu gối , nổi mụn mủ trên da , dẫn đến heo giảm trọng lượng và yếu ớt

Đôi khi có rối loạn tiêu hóa, có lúc đi phân lỏng hoặc có lúc táo bón

Ngoài những ca bệnh cấp tính , sự nhiễm bệnh không biểu hiện triệu chứng thường xuyên xảy ra Điều này được chứng minh khi những heo nuôi trong giai đoạn vỗ béo không có dấu hiệu bệnh hô hấp lại có tỉ lệ huyết thanh dương tính cao

2.4.2 Bệnh tích

2.4.2.1 Bệnh tích đại thể

Bệnh tích trong bệnh cúm heo thường giới hạn trong thùy đỉnh và thùy tim của phổi Thông thường sẽ có một đường ngăn cách giữa mô phổi lành và mô phổi bệnh Vùng mô phổi bệnh bị sậm màu và cứng , một vài thùy nhỏ bị thủy thủng Đường dẫn khí có thể bị lấp đầy bởi máu khối , dịch có chứa fibri n kết hợp với sự tăng sinh các khí quản và các hạch lympho Trong những ca bệnh nặng , có thể gây viêm phổi có sợi huyết Tuy nhiên bệnh tích xảy ra trong tự nhiên thường phức tạp hoặc bị che đậy bởi các yếu tố phụ nhiễm , đặc biệt là nhiễm khuẩn (Shope, 1931; Nayak và cộng sự, 1965; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007)

Nhiều bệnh tích khác nhau được quan sát ở những dòng virus khác nhau lưu hành ở Anh Quốc Các dòng H1N1 và H3N2 lưu hành từ năm 1986 tạo rất ít bệnh tích đại thể , gây viêm phổi nhẹ ở thể bệnh tự nhiên và trong thực nghiệm Điều đáng lo ngại là những chủng H 1N1 biến chủng gần đây tạo bệnh tích đại thể điển hình và bệnh tích vi thể nặng nề hơn bao gổm hoại tử nặng biểu mô khí quản , phế nang chứa dịch với nhiều bạch cầu trung tính Những bệnh tích này cũng được thấy trong gây bệnh thực nghiệm Đây cũng là một trong những dấu hiệu về sự gia tăng độc lực của chủng H1N1

15

2.4.2.2 Bệnh tích vi thể

Bachmann (1989) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Năm, 2007) đã tóm tắt một

số bệnh tích vi thể chính trong bệnh cúm heo, đó là sự thoái hóa lan rộng và hoại tử

tế bào biểu mô khí quản, tiểu phế quản và phế nang Bệnh tích vi thể về sự tăng sinh

và hoại tử phổi được mô tả bởi Morin và cộng sự (1990); Girard và cộng sự (1992); Dea và cộng sự (1992) (trích dẫn bởi Easterday và Van Reeth , 1999), đó là các phế nang bị lấp đầy bởi dịch thủy thũ ng giàu protein và các đại thực bảo Phế quản viêm, hoại tử chủ yếu xảy ra ở những phế quản tận cùng Các tế bào hoại tử kết dính trong các ống phế quản và phế nang

2.5 CHẨN ĐOÁN

2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng

Có thể nghi ngờ bệnh cúm khi có sự bộc phát dấu hiệu hô hấp cấp tính xảy ra trên đàn heo, đặc biệt là trong mùa lạnh

Cúm heo phải được phân biệt với rất nhiều nguyên nhân gây bệnh hô hấp khác trên heo như tụ huyết trùng, bệnh suyễn heo, bệnh dịch tả heo

2.5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Việc phân lập virus hoặc phát hiện kháng thể đặc hiệu thì rất cần thiết cho việc chẩn đoán phân biệt cúm heo Phôi gà 10 tuổi là môi trường phù hợp và có tính kinh tế cho việc phân lập virus cúm Có nhiều môi trường tế bào có thể nuôi cấy virus cúm như tế bào thận bê , tế bào phổi phôi heo , tế bào nguyên bào phôi gà , dòng tế bào từ buồng trứng heo , dòng tế bào tinh hoàn heo (trích dẫn bởi Easterday

và Van Reeth, 1999)

Gây bệnh thực nghiệm trên chuột bạch : nhỏ vào mũi chuột huyễn dịch tổ chức phổi có nghi ngờ bệnh đã được nghiền nát trong nước sinh lý và lọc vô trùng Sau 12 ngày chuột xù lông, mổ khám thấy viêm phổi điển hình

Một số phương pháp khác để phát hiện ra virus , kháng nguyên virus hoặc kháng thể đặc hiệu là dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trên mô phổi ,

kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào biểu mô mũi, miễn dịch huỳnh

Kỹ thuật này lợi dụng đặc tính hấp phụ tự nhiên của protein lên một số chất, nhất là polystyren để gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên trên chất mang đó, rồi sau mới cho kháng thể hoặc kháng nguyên tương ứng có gắn enzyme vào tạo nên phản ứng Kháng nguyên hoặc kháng thể đã gắn enzym sẽ kết hợp với kháng thể hoặc kháng nguyên tương ứng, rồi phát hiện kết hợp này bằng kỹ thuật nhuộm đặc hiệu với từng loại enzyme (Crowther J R, 1995; trích dẫn bởi Lâm Thị Thu Hương,

2005)

2.5.2.2 Các phương pháp ELISA

(1) ELISA gián tiếp (indirect ELISA) (thường dùng để thăm dò kháng

thể): kháng nguyên được gắn lên chất mang rồi ủ với huyết thanh nghi có kháng thể Sau khi rửa loại bỏ phần huyết thanh thừa thì cho thêm cộng hợp (conjugate) (tức là kháng kháng thể gắn enzyme) Cộng hợp sẽ gắn với phức hợp kháng nguyên – kháng thể ngay trên chất mang Và được xác định nhờ vào phản ứng tạo màu của

cơ chất với enzyme (Crowther J R, 1995; trích dẫn bởi Lâm Thị Thu Hương, 2005)

Ưu điểm: kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa

Nhược điểm cơ bản: bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa

17

(2) Sandwich ELISA (thường dùng để thăm dò kháng nguyên): trong kỹ thuật này kháng thể không đánh dấu được hấp phụ lên trên chất mang rồi mới cho dung dịch nghi chứa kháng nguyên Sau đó lại cho kháng thể nói trên nhưng có gắn enzyme vào Như vậy nếu có kháng nguyên thì nó bị kẹp giữa kháng thể (Crowther

J R, 1995; trích dẫn bởi Lâm Thị Thu Hương, 2005)

Ưu điểm: có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau, có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác

Nhược điểm: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau

có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện Mối quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm

(3) ELISA cạnh tranh (thường dùng để thăm dò kháng nguyên): cho kháng

nguyên không gắn enzyme vào phức hợp kháng nguyên – kháng thể đã gắn enzyme, kháng nguyên không gắn enzyme sẽ tranh chỗ với kháng nguyên gắn enzyme

Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu Một số trường hợp, enzyme được gắn với kháng nguyên chứ không phải kháng thể (Crowther J R, 1995; trích dẫn bởi Lâm Thị Thu Hương, 2005)

Ưu điểm: đơn giản nhất

Nhược điểm: độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là

2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể

gắn vào một epitope Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối

của virus đã dẫn đến phản ứng không phù hợp với loại vaccine truyền thống

+ Loại trừ những con vật gầy yếu mang và bài xuất virus

+ Kiểm soát nghiêm ngặt động vật và sản phẩm động vật nhập tỉnh, đặc biệt là vận chuyển heo, sản phẩm của heo chưa qua chế biến

+ Tăng cường công tác giám sát dịch bệnh, khi phát hiện có heo mắc bệnh khác thường có triệu chứng của bệnh như đã nêu ở trên thì báo ngay cho cán

bộ thú y và chính quyền xã, phường, thị trấn

Cho đến hiện tại vẫn chưa có thuốc điều trị đặc trị bệnh cúm trên heo

2.6.2 Phòng bệnh lây sang người

- Thực hiện nghiêm ngặt theo hướng dẫn của ngành y tế

- Người chăn nuôi, giết mổ, chế biến, tiêu hủy heo bệnh hoặc khi tiếp xúc với heo cần sử dụng các thiết bị bảo hộ lao động tối thiểu như khẩu trang, ủng, găng tay, kính, quần áo bảo hộ Sau khi tiếp xúc cần vệ sinh tiêu độc, khử trùng, rửa chân, tay bằng nước xà phòng đề phòng mầm bệnh lây sang người

2.7 MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN

Jung và cộng sự (2002) sử dụng phản ứng ELISA kiể m tra 911 mẫu huyết thanh heo 22 – 24 tuần tuổi của 130 trại phân bố ở 5 khu vực của Hàn Quốc Kết quả là 93/130 trại (71,5%) có kháng thể kháng virus cúm subtype H1N1

Choi và cộng sự (2002) tìm hiểu sự lưu hành các subtype virus cúm trong các trại chăn nuôi ở Mỹ Bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu

(hemagglutination inhibition – HI) tác giả đã tìm thấy 22,8% (25.348/111.418) mẫu

19

huyết thanh có kháng thể kháng virus cúm , trong đó 66,7% (16.807/25.348) kháng H1 và 33,7% (8.541/25.348) kháng H3

Maldonado (2006) khảo sát sự lư u hành của virus cúm sutype H1N1, H3N2

và H1N2 ở Tây Ban Nha bằng phản ứng HI trên 600 mẫu huyết thanh heo nái được lấy ở 100 trại giống có biểu hiện hô hấp Tỷ lệ huyết thanh có kháng thể kháng virus cúm sutype H1N1, H3N2 và H1N2 lần lượt là 18,2%; 10%; 6,8%

Jung (2007) kiểm tra 742 mẫu huyết thanh heo 22 – 24 tuần tuổi ở 53 trại khác nhau bằng phản ứng HI và phản ứng trung hòa Kết quả 51,2% (380/742) mẫu huyết thanh có kháng thể kháng virus cúm subtype H1 và H3

Nguyễn Thị Kim Liên (2005) khảo sát tỷ lệ nhiễm cúm heo subtype H1N1 ở trại heo công nghiệp A và B tại thành phố Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp trên 337 mẫu huyết thanh ở các hạng heo thu được tỷ lệ huyết thanh có kháng thể kháng virus cúm sutype H1N1 là 64,98% (219/337)

Nguyễn Thị Thu Năm (2007) khảo sát tỷ lệ nhiễm cúm heo subtype H1N1 ở trại heo công nghiệp A và B tại thành phố Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp trên 485 mẫu huyết thanh ở các hạng heo thu được tỷ lệ huyết thanh có kháng thể kháng virus cúm sutype H1N1 là 67,42% (327/485)

20

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Heo nái và heo nọc không có triệu chứng lâm sàng, chưa được tiêm phòng vaccine cúm heo

Số lượng mẫu thực hiện: 399 mẫu huyết thanh heo

3.3 VẬT LIỆU

3.3.1 Mẫu xét nghiệm

Mẫu huyết thanh được lấy ngẫu nhiên trong các trại chăn nuôi ở hai huyện

Củ Chi và Hóc Môn trên địa bàn TP Hồ Chí Minh Để tính toán số mẫu cần lấy chúng tôi dựa vào phần mềm Win – episcope 2.0 với các thông số như sau: ước lượng tỷ lệ là 80%, sai số là 5%, độ tin cậy là 95% (theo Trạm Chẩn Đoán, Xét Nghiệm và Điều Trị Chi Cục Thú Y TP.Hồ Chí Minh)

21

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Máy móc: tủ lạnh âm (-15oC) đến (-20oC), tủ lạnh thường 2oC đến 8oC, tủ

ấm 37oC, máy ly tâm, máy rửa siêu âm, máy sấy khô, máy đọc ELISA Biorad Laboratories)

(Benmark-Dụng cụ: ống đong thủy tinh, ống eppendorf, máng đựng chất phản ứng, micropipette đơn, micropipette 8 kênh, đầu típ, găng tay cao su, syringe 5ml có kim 23G

3.3.3 Các bộ kít dùng trong chẩn đoán

(1) Bộ kít “ELISA swine influenza virus antibody test kit – H1N1” do công

ty IDEXX - USA cung cấp dùng để phát hiện kháng thể chống virus cúm heo subtype H1N1 Thành phần bộ kít gồm:

- Đĩa phản ứng 96 giếng phủ kháng nguyên H1N1

- Cộng hợp (Anti-Porcine HRPO conjugate): gồm kháng thể kháng IgG heo có gắn horseradish peroxidase (HRPO) được pha loãng trong dung dịch đệm

- Huyết thanh đối chứng dương H1N1: huyết thanh có kháng thể kháng virus H1N1 bảo quản trong dung dịch có sodium azide

- Huyết thanh đối chứng âm: huyết thanh không có kháng thể kháng virus H1N1 bảo quản trong dung dịch có sodium azide

- Dung dịch pha loãng mẫu (sample diluent): với chất ổn định protein và bảo quản bằng sodium azide

- Dung dịch rửa (wash concentrate): dung dịch phosphate có tween đậm đặc 10 lần, bảo quản với gentamicin

- Dung dịch tạo màu phản ứng (TMB substrate)

- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution): dung dịch sodium dodecyl sulfate

(2) Bộ kít “ELISA swine influenza virus antibody test kit – H3N2” do công

ty IDEXX - USA cung cấp dùng để phát hiện kháng thể chống virus cúm heo subtype H3N2 Thành phần bộ kít tương tự như bộ kít phát hiện kháng thể chống virus cúm heo subtype H1N1

22

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Sử dụng kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể kháng virus cúm heo subtype H1N1 và H3N2 để đánh giá tình hình nhiễm bệnh cúm heo

- Ghi nhận một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ heo nhiễm bệnh cúm (khu vực, quy mô chăn nuôi, hạng heo)

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Bố trí lấy mẫu huyết thanh để xét nghiệm

Số mẫu khảo sát được thực hiện theo Bảng 2.1

Bảng 3.1 Mẫu huyết thanh heo cần cho khảo sát bệnh cúm subtype H1N1 và H3N2

Huyện

Trại lớn Trại nhỏ

Tổng Nái Nọc Nái Nọc

Củ Chi 186 42 34 1 263

Hóc Môn 58 38 40 136

Tổng 244 42 72 41 399

• Ghi chú:

- Trại lớn: tổng đàn >1000 con, nái ≥ 100 con

- Trại nhỏ: 100 con ≤ tổng đàn ≤ 1000 con, 50 con < nái < 100 con

3.5.2 Cách lấy mẫu

- Vị trí lấy máu: ở tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch tai Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn, dùng syringe lấy khoảng 2 ml máu, kéo piston để có không khí trong syringe, đóng nắp kim, đặt syringe nằm nghiêng, tránh va lắc gây vỡ hồng cầu, bảo quản lạnh ở 2o

C – 8oC và chuyển về phòng xét nghiệm

- Tách huyết thanh sang ống eppendorf có đánh số tương ứng, li tâm 2000 vòng/phút/5 - 10 phút Hút lấy huyết thanh phía trên Mẫu huyết thanh phải trong và không dung huyết

23

3.5.3 Phát hiện kháng thể chống virus cúm heo subtype H1N1 hoặc H3N2 bằng

kỹ thuật ELISA gián tiếp

3.5.3.1 Nguyên tắc và cơ chế phản ứng của kĩ thuật ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể kháng virus cúm heo subtype H1N1 và H3N2

 Nguyên tắc:

Trong ELISA gián tiếp, cộng hợp (conjugate) là kháng thể khác loài kháng lại kháng thể có trong huyết thanh cần chẩn đoán Khi đọc kết quả có hai trường hợp xảy ra:

- Kháng thể trong huyết thanh đặc hiệu với kháng nguyên trên đĩa thì sẽ có sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể - cộng hợp Do đó, khi thêm chất hiện màu vào sẽ làm thay đổi màu trong giếng Trường hợp này được xem là dương tính

- Nếu kháng thể trong huyết thanh không đặc hiệu với kháng nguyên trên đĩa thì không có sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể, khi đó phức hợp kháng thể - cộng hợp sẽ bị rửa trôi và sẽ không còn sự hiện diện của cộng hợp trong giếng

Do đó, khi thêm cơ chất hiện màu vào sẽ không có sự thay đổi màu trong giếng Trường hợp này được xem là âm tính

Hình 3.1 Kết quả phản ứng qua sự đổi màu trên vỉ ELISA

(Nguồn tư liệu cá nhân)