Nghiên cứu phân lập và sử dụng một số dòng Trichoderma để sản xuất phân hữu cơ vi sinh từ bùn thải sinh học trong quá trình sản xuất thực phẩm

TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu phân lập và sử dụng một số dòng Trichoderma để sản xuất phân hữu cơ vi sinh từ bùn thải sinh học trong quá trình sản xuất thực phẩm” Sinh viên thực hiện : Ngô

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

B Ộ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Nghiên c ứu phân lập và sử dụng một số dòng

th ải sinh học trong quá trình sản xuất thực phẩm

H ọ và tên sinh viên : NGÔ THANH PHÚC

Niên khóa : 2007 – 2011

Tháng 08 năm 2011

Em xin chân thành cám ơn:

Quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm TPHCM, quý thầy cô bộ môn Công nghệ Hóa học đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ em trong 4 năm học vừa qua

Tp.HCM tháng 8 năm 2011

Sinh Viên

Ngô Thanh Phúc

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu phân lập và sử dụng một số dòng Trichoderma để sản xuất

phân hữu cơ vi sinh từ bùn thải sinh học trong quá trình sản xuất thực phẩm”

Sinh viên thực hiện : Ngô Thanh Phúc

Đơn vị : Lớp DH07HH, Bộ môn Công nghệ Hóa, Đại Học Nông Lâm TPHCM Thời gian từ : tháng 03 đến tháng 08/2011

Địa điểm : Phòng Hóa Nông Thổ Nhưỡng, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, Địa chỉ 121, Nguyễn Bỉnh Khiêm, P.Đa Cao, Q1 TP Hồ Chí Minh Kết quả thu được:

 Tìm ra được 9 chủng nấm Trichoderma

 Tuyển chọn chủng nấm tốt nhất để sản xuất phân hữu cơ

 Tìm ra được CT phối trộn tốt nhất để sản xuất phân hữu cơ

 Thử nghiệm thành công trong việc trồng cải trên giá thể CT

 Giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường

SUMMARY

Project “ research on subdivide and use some of Trichodermas to produce organic fertilizer from sewage sludge microbial biology which create from process of food production”

Student performs: Ngo Thanh Phuc

Unit: Class DH07HH, Department of Chemical Technology, Nong Lam

University TPHCM

Duration: from March to Augest/2011

Location: Department of Soil Chemistry and Agriculture, Institute of Southern Agriculture Science Address: 121 Nguyen Binh Khiem, Da Cao ward, District No.1, HCM city

 09 strains of Trichoderma funguses were found out

 Selection of the best fungal strains to produce organic fertilizer

 The best formula for mixing to produce organic fertilizer was found out

 Successful test in growing vegetables

 Environment pollution was solved

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

BẢNG VÀ HÌNH ẢNH viii

Chương I 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Cơ sở khoa học của đề tài 1

1.4 Ý nghĩa khoa học 1

1.5 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương II 3

TỔNG QUAN 3

2.1 Đại Cương Về Cellulose 3

2.1.1 Vị trí quan trọng của cellulose 3

2.1.2 Cấu trúc và đặc tính của cellulose 3

2.1.3 Hệ enzyme cellulose 5

2.1.4 Cơ chế tác động 5

2.1.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật.6 2.1.6 Đại Cương Về Vi Sinh Vật Phân Giải Cellulose 7

2.2 Giới thiệu nấm Trichoderma 9

2.2.1 Vị trí phân loại 9

2.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10

2.2.3 Các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm sợi 11

2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma 11

2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước 11

2.3.2 Các nghiên cứu trong nước 12

2.4 Khái niệm về phân bón hữu cơ và phân bón hữu cơ vi sinh 12

2.4.1 Phân bón hữu cơ 12

2.4.2 Phân bón hữu cơ vi sinh 13

2.5 Vai trò của phân bón hữu cơ sinh học, hữu cơ vi sinh đối với sản xuất nông nghiệp trên thế giới 14

2.6 Khái niệm về ủ chất thải và mùn 14

2.6.1 Quá trình ủ chất thải (composting) 14

2.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ chất thải 15

2.7 Các loại bùn thải 16

2.8 Hàm lượng hữu cơ, dinh dưỡng trong bùn thải hữu cơ 17

Chương III 18

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Nội dung nghiên cứu 18

3.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 18

3.2.1 Thời gian 18

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 18

3.3 Vật liệu 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Nội dung 1: Phân lập tuyển chọn và đánh giá hoạt tính của Trichoderma.20 3.4.2 Nội dung 2: Sơ chế công thức chất mang BBS + MXD + VSV 21

3.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất phân VS và phân hữu cơ VS 27

Chương IV 29

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Một số chỉ tiêu hóa học trong mạt dừa và bã bùn sữa trước quá trình xử lý 29

4.2 Kết quả phân lập nấm Trichoderma 30

4.3 Sơ bộ định danh các chủng nấm trichoderma 31

4.4 Một số chỉ tiêu theo dõi của đống ủ qua quá trình xử lý sơ bộ 36

4.4.1 Chỉ tiêu pH của đóng ủ sau xử lý sơ bộ 36

4.4.2 Sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình ủ sơ chế 37

4.4.3 Tỷ lệ C/N% của đống ủ đầu và kết thúc xử lý 38

4.4.4 Đánh giá độ chín của đống ủ (bằng Phương pháp plantest) 40

4.5 Kiểm tra mật độ nấm Trichoderma sp Trong chế phẩm phân VS 41

Chương V 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận: 43

5.2 Đề nghị: 43

PHỤ LỤC 46

HCVS1 phân hữu cơ vi sinh ủ với chế phẩm khử trùng

HCVS2 Phân hữu cơ vi sinh ủ với chế phẩm không khử trùng

BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

Hình 1 Cấu trúc hóa học của cellulose 4

Hình 2 Cấu trúc không gian ba chiều của cellulose 5

Hình 2.1 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử ( Gary, 2004) 11

Hình 2.2 Sợi nấm phát triển trên môi trường PDA 11

Bảng1 Một số chỉ tiêu hóa học trong mạt dừa và bã bùn sữa ban đầu 31

Bảng 2.0 Khả năng phân giải CMC của Trichoderma 32

Bảng 2.1 Mô tả chủng nấm phân lập 37

Bảng 2.2 pH của đóng ủ sau 21 ngày 38

Bảng 2.3 Nhiệt độ của đống ủ 39

Bảng 2.4 Kết quả phân tích chỉ tiêu C và N 40

Bảng 2.5 Trọng lượng cải tươi thu hoạch sau 7 ngày gieo 42

Bảng 2.6 Mật độ nấm sau 30 ngày ủ 43

Bảng 2.7 Mật độ nấm sau 7 ngày ủ 44

Đồ Thị 1 pH của đống ủ đầu và kết thúc xử lý sơ bộ 38

Đồ thị 2.2 tỷ lệ C/N của đống ủ điểm thời bắt đầu ủ và kết thúc ủ 40

Chương I

ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề

Như chúng ta đã biết, Việt Nam dù đang trên bước đường công nghiệp hóa, nhưng vẫn là một nước nông nghiệp với hơn 75% là nông dân, nên nhu cầu sử dụng phân bón và thuốc bảo vệ thực vật rất lớn Xu hướng sử dụng phân bón hóa học tăng nhanh là điều tất yếu để bảo đảm lương thực phẩm cho nhân loại Tuy nhiên việc lạm dụng phân hóa học đã làm cho môi trường ngày càng ô nhiễm, làm đất đai bị suy thoái, hàm lượng dư chất độc tố tăng sau nhiều năm sử dụng, Thực trạng này khá phổ biến ở phạm vi toàn cầu và nghiêm trọng ở các nước đang phát triển

Trước vấn đề vừa đảm bảo cung cấp nguồn lương thực, vừa duy trì và cải thiện

độ phì nhiêu của đất đồng thời không ngừng nâng cao chất lượng nông sản, tăng hiệu quả kinh tế và thân thiện với môi trường Vì thế nền công nghiệp thế giới đã mở ra theo hướng kết hợp đó là nền nông nghiệp thâm canh cao với nông nghiệp hữu cơ mà hạt nhân là ứng dụng công nghệ sinh học Hiện nay ứng dụng công nghệ vi sinh để sản xuất phân bón đã tạo ra một hướng đi mới trong chiến lược quản lý dinh dưỡng cây trồng Các nhà khoa học, nhà kinh doanh và nông dân đang quan tâm đến việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên nhằm biến đổi các loại phế phẩm để sản xuất các chế phẩm, phân bón vi sinh phục vụ cho nông nghiệp Xuất phát từ cơ sở khoa học

giống nấm mốc Trichoderma là vi sinh vật có khả năng phân giải các chất hữu cơ

trong đất nên được ứng dụng nhiều trong công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

Việt Nam là nước đang trên đà công nghiệp hóa hiện đại hóa đất nước nên bùn thải trong quá trình sản xuất là rất lớn, là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên trong thành phần bùn thải qua xử lý sơ bộ chất thải này có chứa một lượng lớn chất dinh dưỡng thích hợp làm phân vi sinh Vì vậy tận dụng bùn thải sinh học để sản xuất phân vi sinh hữu cơ trong công ty sản xuất thực phẩm

Mặt khác, Việt Nam là một nước nhiệt đới có diện tích trồng dừa lớn tập trung

ở các tỉnh như Bến Tre, Trà Vinh, Vĩnh Long, Khánh Hoà vv Trong đó Bến Tre là tỉnh có diện tích trồng dừa lớn nhất nước hiện nay (khoảng 40.000 ha) và củng là nơi

có nhiều làng nghề sản xuất chỉ xơ dừa Theo “Tin tức và Sự kiện” của Bộ Tài Nguyên

và Môi Trường (2007), thì việc ô nhiễm môi trường trên sông Thom tại ấp Vĩnh Khánh , xã An Thạnh, Mỏ Cày, Bến Tre đang trên mức báo động,tính đến nay mỗi ngày nơi đây có khoảng 500 tấn mụn dừa phế thải Xuất phát từ những lợi ích và tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp trên nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu phân lập và sử dụng một số dòng Trichoderma để sản xuất phân hữu cơ

vi sinh từ bùn thải sinh học trong quá trình sản xuất thực phẩm”

1.2 Cơ sở khoa học của đề tài

Bã bùn sữa có ẩm độ 70-85%, do đó khi ủ làm phân hữu cơ cần làm giảm bớt lượng nước ,tốn mặt bằng sản xuất, gây ô nhiễm môi trường Mụn xơ có nhiều tannin, lignin và cellulose khó phân hủy, cây trồng khó sử dụng nguồn hữu cơ này Đặc biệt mụn xơ dừa gây ô nhiễm môi trường, muốn phân hủy nhanh cellulose cần ngâm mụn dừa với kiềm hoặc acid sau đó cấy vi sinh vật (VSV) vào để phân giải chuyển hóa thành các dạng chất dinh dưỡng dễ tiêu cho cây trồng Từ đó phối trộn 2 nguyên liệu này với tỉ lệ thích hợp sẽ khắc phục được ô nhiễm của bã bùn sữa và nước thải sau khi

xử lý sơ bộ mụn xơ dừa

1.3 Mục tiêu nghiên cứu đề tài

Mục tiêu của đề tài là sử dụng các hoạt chất có hoạt tính kiềm và các chủng

nấm Trichoderma để xử lý, phối trộn hai nguyên liệu là bã bùn sữa và mụn xơ dừa để

làm phân bón hữu cơ phục vụ cây trồng đồng thời khắc phục ô nhiễm môi trường

1.4 Ý nghĩa khoa học

Đề tài đóng góp cơ sở cho các công trình nghiên cứu sau này về ứng dụng các chủng vi sinh có ích trong việc xử lý phụ phế phẩm của ngành nông nghiệp và công nghiệp chế biến thành phân hữu cơ vi sinh làm nguồn dinh dưỡng cho cây trồng góp phần xây dựng nên nông nghiệp sạch bền vững

1.5 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài sẽ được áp dụng trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn thải sinh học của ngành công nghiệp chế biến thực phẩm phục vụ cho nhu cầu phát triển một nền nông nghiệp hiệu quả và bền vững

Góp phần giải quyết vấn đề môi trường do bùn thải của các nhà máy công nghiệp chế biến gây ra

Chương II

2.1 Đại Cương Về Cellulose

2.1.1 Vị trí quan trọng của cellulose

Nước ta là một nước có nền kinh tế nông nghiệp là chủ yếu Do đó trong cuộc sống hằng ngày, con người không chỉ sử dụng một lượng lớn các nguyên liệu, sản phẩm từ thiên nhiên mà đồng thời phải bỏ vào môi trường một lượng lớn chất thải hữu

cơ có nguồn gốc thực vật Trong đó, cellulose chiếm khoảng 50% Trong điều kiện tự nhiên, các chất hữu cơ chứa cullulose thường là những chất khó phân hủy và thời gian phân hủy rất lâu Đây là hiện tượng gây ra ô nhiễm không khí, đất và nước

Cellulose là một nguồn nguyên liệu rất phong phú nếu có biện pháp xử lý và tận dụng thích hợp Tính đến nay, người ta đã có nhiều biện pháp xử lý, tận dụng cellulose

để phục vụ cho nghành nông ngiệp (làm năng lượng, chất đốt) nhưng cần có kỹ thuật cao, tốn kém, chưa hiệu quả nên không được áp dụng rộng rãi Trong những năm gần đây việc nghiên cứu về khả năng phân giải cellulose của vi sinh vật được phát triển rất mạnh

Việc tận dụng phụ phế phẩm này làm nguồn carbon để tạo ra các sản phẩm như:

thực phẩm, enzyme, thức ăn cho gia súc, phân bón vv… nhờ vi sinh vật đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nước trên thế giới, trong dó có Việt Nam

2.1.2 Cấu trúc và đặc tính của cellulose

Hình 1 Cấu trúc hóa học của cellulose

Hình 2 Cấu trúc không gian ba chiều của cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của vách tế bào thực vật và là hợp chất sinh học trên trái đất Cellulose có rất nhiều trong bông (khoảng 98% cellulose), trong các loại đây ,và tre nứa,vv… trong gỗ có khoảng 40-50% cellulose (Nguyễn Thị Bích Ngọc, 2003)

Về cấu trúc hóa học của cellulose là một polymer mạch thẳng do các phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside Các đơn phân glucose trong cellulose có cấu trúc dạng ghế, phân tử này quay một góc 1800 so với các phân tử kia

β-và các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang

Số lượng đơn vị glucose trong phân tử được biểu thị bằng mức độ polymer hóa Trong tự nhiên mức độ polymer hóa khoảng từ vài trăm đến 150.000, tùy theo từng loài thực vật mà cellulose có khối lượng phân tử khác nhau từ 50.000 đến 2.500.000 Chiều dài phân tử cellulose khoảng 5µm Nhiều phân tử cellulose kết hợp với nhau thành sợi nhờ lực Van der Walls

Trong tự nhiên các chuỗi β-1,4-glucan của cellulose có cấu trúc dạng sợi Đơn

vị nhỏ nhất gọi là sợi sơ cấp, có đường kính khoảng 100-300A0

và chiều dài khoảng 40-100A0 Toàn bộ cấu trúc sợi này được bao bọc bởi hemicelluloses và lignin rất chắc

Cấu trúc cellulose không đồng nhất và thường có hai vùng: vùng kết tinh có trật

tự rất cao vì thế nó rất bền vững, vùng vô định hình có cấu trúc không chặt nên kém bền hơn

Cellulose có công thức chung là (C6H10O5)n giống với tinh bột nhưng cấu tạo phức tạp hơn Trong tinh bột, các đơn vị glucose sắp xếp theo hướng giống nhau và chúng được nối với nhau bằng liên kết α Còn trong cellulose, các đơn vị kế tiếp lại

quay một vòng 1800 và chúng liên kết với nhau bằng liên kết β, chính những đặc điểm này đã tạo nên sự khác biệt giữa tinh bột và cellulose Chúng ta có thể sử dụng tinh bột nhưng không thể sử dụng cellulose vì trong cơ thể chúng ta không có enzyme phân giải cellulose mà chỉ có enzyme phân giải tinh bột Nhưng có một sinh vật có thể sử dụng cellulose như mối, các động vật ăn cỏ do trong dạ dày có hệ vi sinh vật phân giải cellulose

Cellulose không tan trong nước mà chỉ bị phồng lên do hấp thụ nước, bị phân hủy khi bị đun nóng với acid hoặc bazo ở nhiệt độ cao Cellulose có thể bị phân hủy ở nhiệt độ thường hay 40-500C nhờ các enzyme gọi chung là cellulose

2.1.3 Hệ enzyme cellulose

 Định nghĩa:

Là enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm hòa tan

Hệ enzyme cellulose gồm 3 thành phần chủ yếu: exoglucanase (EC3.2.1.91), endoglucanase (EC3.2.1.4) và b-glucosidase (EC3.2.1.21)

Exogluconase hay enzym C1 là enzym không đặc hiệu Dưới tác dụng của enzym C1, cellulose bị trương phồng lên để chuẩn bị cho các enzym khác tác động tiếp theo (Whiteker 1971)

Endoglucanase hay enzym β-1,4-glucanase hay enzym Cx, thủy phân các cellulose thành cellobiose Chữ x có nghĩa cho ta biết đây là loại enzym gồm nhiều thành phần khác nhau thường được chia thành hai nhóm:

- Endo- β-1,4glucanase xúc tác cho việc cắt liên kết β-1,4-glucoside ở bất cứ chổ nào trong phân tử cellulose exo- β-1,4-glucanase có khả năng phân tách một cách tuần tự, liên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose phân tử

- Enzym β-1,4-glucoside hay cellobiose, là enzym rất đặc hiệu, xúc tác cho quá trình thủy phân cellobiose thành D-glucose

Các enzym này có tính đặc hiệu khác nhau nhưng lại có hoạt động hỗ trợ cho nhau

2.1.4 Cơ chế tác động

Năm 1950, Reese và cộng tác viên lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải cellulose

tự nhiên thành đường hòa tan nhờ hệ phức enzym C1-Cx,

C1 Cx

Trong đó C1 là nhân tố tiền thủy phân hay enzym không đặc hiệu, có tác dụng làm trương cellulose tự nhiên thành cá chuỗi cellulose mạch ngắn, các chuỗ này lại tiếp tục tấn công bởi Cx, các vi sinh vật sinh trưởng trên cellulose hòa tan chỉ tổng hợp được Cx, trong khi các vi sinh vật trưởng cellulose có trật tự cao thì tổng hợp cả Cx và

C1 Đặc biệt là dòng trichoderma reesei, T.konigii, Fusarium solani, Sporotrichium

Những loài vi sinh vật khác thì có nguồn cảm ứng khác nhau vì từ chất cảm ứng đó

vi sinh vật sẽ tạo ra enzym có hoạt tính mạnh nhất

Ngoài cellulose, chất cảm ứng cho cellulase còn là cellobiozooctaacetat, cám mì, lactose và salixyl

Một số nguồn carbon lại có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cellulase như glucose, cellobiose, citrate,oxalate vv

2.1.5.2 Ngu ồn Nito

Hoạt tính enzym có thể thay đổi rất nhiều khi ta thay đổi các thành phần chính của môi trường trong đó có nito Nguồn nito trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp cellulase ở nấm mốc

Nguồn nito thích hợp nhất đối với vi sinh vật tổng hợp celluase là muối nitrate Muối nitrate làm cho môi trường kiềm hóa , tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase

Các hợp chất nito có tác dụng khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp cellulase, điều kiện này phụ thuộc vào điều kiện sinh lý của từng chủng Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật

Gluco

2.1.5.3 Các ngu ồn vi lượng khác

Các nguyên tố vi lượng Fe, Cu, Zn, Mn, vv… có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase Trong đó nồng độ sinh tổng hợp của Zn là 0,11-2,2 mg/l, Fe là 2-10mg/l, Mn là 3,4-27,2mg/l có tác dụng kích thích enzym này ở nhiều chủng

d.Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển của sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật Hoạt động của các loài vi sinh vật dựa trên sự chuyển hóa của loạt các phản ứng này tăng theo, nhưng nhiệt độ tăng quá một giới hạn nào đó thì tốc độ các phản ứng này sẽ giảm

Các loại khác nhau nhiệt độ hoạt động khác nhau như : Trichoderma konigi phát

triển ở nhiệt độ 25-300C

2.1.5.4 pH ban đầu

pH của môi trường cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật pH của môi trường ảnh hưởng không giống nhau đối với những loài vi

sinh vật khác nhau, nhiều loại nấm phát triển và phân giải mạnh ở pH 4-6, Fusarium

oxysporum và Trichoderma konigi có thể phân giải cellulose mạnh ở pH từ 1,8-2

2.1.6 Đại Cương Về Vi Sinh Vật Phân Giải Cellulose

Vi sinh vật phân giải cellulose bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi

pinophiraum, Phanerochate chyrosporium, Spotrichum puluverulentum và sclerotium rolfsii

Các nấm sợi ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng tổng hợp được enzym bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh celllose Nhưng hoạt tính của dịch lọc lại thấp Nấm có khả năng phân giải cellulose cực đại ở phạm vi pH 3,5-6,6 Mandels và cộng tác viên (1946) nhận thấy rõ ảnh hưởng của nguồn cacbon đối với nấm

trichoderma viride Nguồn cacbon thích hợp cho tổng hợp cellulase ở nấm Aspergilus

(A.) fumigatus ưa nấm và ưa nhiệt là giấy lọc hay rơm nghiền Ở A.terreus là giấy lọc, còn ở T.virde là hỗn hợp cám và củ cải đường Bổ sung các chất dễ đồng hóa như

glucose, cellobiose vào môi trường nuôi cấy chứa cellulose có thể làm cho pH của môi

trường giảm đi nhanh chóng và do hoạt tính celluse của Trichoderma giảm theo

Nguồn Nito trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự tạo thành cellulase của nấm Nirat là nguồn nito thích hợp để tổng hợp cellulase ở nhiều loại nấm như

Fusarium, Aspergilus, Trichoderma… còn muối của acid amon thường ức chế việc tạo thành cellulase ở A.terreus, T.lignorum, T.koningi và nhiều nấm khác Nguồn nito hữu

cơ cũng có ảnh hưởng không giống nhau tới việc sinh celluase ở các nấm, pepton gây

kích thích tạo thành cellulase ở Penicillium oxalieum, T.reesi, Helminihosporium

culop, nhưng lại ức chế việc sinh cellulase ở Myrothecium, Asperilus, Chaetomium

Jeris và cộng tác viên (2002) thường gặp các loại nấm phân giải cellulase trong

các đóng ủ như: Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Coprinus, Fomer, Fusarium,

Myrthecium, Pencillium, Polypones, Rhizopus, Trichoderma, Verticilli

b Vai trò của vi sinh vật trong việc phân hủy các hợp chất chứa cellulose

Trichoderma được xếp vào nhóm nấm bất toàn sống hoại sinh trong đất, gỗ

mục và trên xác bã thực vật Trichoderma có khả năng phân hủy cellulose và ngay cả lignin Theo Đường Hồng Dật (1979) cellulose là một trong những polimer phổ biến rộng rãi nhất trên trái đất chúng ta Nó là thành phần cơ bản của thực vật cellulose có cấu tạo dạng sợi Các sợi cellulose trong tự nhiên thường chứa khoảng 10000 –

12000 gốc gluco Trong rác thải sinh hoạt, phế thải nông nghiệp có chứa hàm lượng cellulose cao, ví dụ trong bã mía có chứa tới 46 % xenluloza (Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2003) Tuy nhiên, cellulose là loại hợp chất khá bền vững, không tan trong nước Trong thiên nhiên cellulose chỉ bị phân hủy bởi vi sinh vật Khi sử dụng các vi sinh vật phân giải hợp chất chứa cellulose thì cellulose sẽ bị các vi sinh vật phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác có trong đất tạo ra mùn Khi mùn được hình thành, vi sinh vật lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình amon hóa, sự chuyển hóa này giúp đất tích lũy NH3 Sự tạo thành NH3 trong đất xảy ra rất chậm chạp và điều này tốt cho cây trồng vì quá trình này giải phóng từ từ NH3 cho cây hấp thụ, Các vi sinh vật có

khả năng phân giải cellulose rất nhiều, có thể kể tên như niêm vi khuẩn: Aspergillus

fumigatus, Coniophora cerebella, Chrysosporium lignorum, Fusarium malinifore, Trichoderma… Trong đó Trichoderma sp là một trong những loại được sử dụng phổ

biến làm chế phẩm vi sinh để phân hủy cellulose, ứng dụng nhiều trong công nghệ sản

xuất phân bón hữu cơ sinh học và hữu cơ vi sinh Các chủng trong giống Trichoderma

có khả năng sản sinh ra một lượng lớn các enzyme ngoại bào phân giải cellulose mà điển hình là Trichoderma viride, Trichoderma lignorum, Trichoderma hazianum,

Trichoderma koningii và Trichoderma reesei N ấm Trichoderma có ít nhất 33 giống,

mỗi giống có các đặc tính riêng Hiện nay sự phân lập, và nghiên cứu chúng đang được nhiều cơ quan nghiên cứu trong nước đặc biệt quan tâm như Trung tâm công nghệ sinh học nông TP (ABC), Đại học Cần Thơ, Đại học Nông Lâm Thủ Đức…Và tại Trung tâm Công nghệ sinh học TP đã phân lập được 4 giống là Trichoderma harzianum, Tri viride, Tri lignorum, Tri koningii

2.2 Giới thiệu nấm Trichoderma

Hình 2.1 Khuẩn ty và cơ quan sinh

bào tử ( Gary, 2004)

Khuẩn ty: Khuẩn ty không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy Khuẩn lạc nấm có màu

trắng hoặc từ lục trắng đến màu lục, vàng, xanh Các chủng nấm Trichoderma phát

triển rất nhanh, chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2 - 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982)

Bào tử: Có màu xanh đặc trưng, nhưng

cũng có thể có màu trắng như T.virens hay

vàng hay xanh xám tuỳ thuộc vào dòng nấm Bào tử đơn bào, hình elip, ovan, hình cầu, hay hình chữ nhật và đa số các bào tử thì

trơn láng Kích thước bào tử của nấm Trichoderma không quá 5 µm

2.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Điều kiện sinh trưởng, phát triển của Trichoderma cũng khá giống với các nấm

khác Chúng phát triển tốt ở pH 4.5 – 6.5 Độ ẩm không khí cần thiết cho quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng dao động trong khoảng 70 – 100 % Nhiệt độ để

Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 30 0C Một vài loại phát triển tốt ở 35 0

C Một số ít phát triển được ở 40 0

C (Gary, 2004) Theo Prasun và Kanthadai (1997) hình

thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau

Ở 35 0C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường, ở 37 0C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ chế sinh sản vô tính Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được ghi nhận nhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soát sinh học Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái chủ

Hình 2.2 Sợi nấm phát triển trên môi trường PDA

(vùng xanh chứa bào tử, vùng trắng không chứa bào

tử) (Gary, 2004)

yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiều phương pháp phân loại dựa trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng Hiện nay, nấm Trichoderma được tìm thấy ít nhất 33 loài Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân chậm tan Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng

2.2.3 Các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm sợi

Theo Lương Đức Phẩm (1998) để sinh trưởng nấm sợi cần một lượng lớn các nguyên tố C, H, O, N, P, S, Ca, Fe và một lượng nhỏ các nguyên tố Mn, Na, B, Mo,

Zn, Cu, Co, Ni, Cl, Si

Môi trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng

và tạo thành sản phẩm Thông thường thì các môi trường dùng trong công nghiệp không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng vì những nguyên tố này đã có đủ trong các thành phần dinh dưỡng ở dạng tạp chất (Phạm Huỳnh Ngọc Quyên, 2005)

2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma

2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Nấm Trichoderma không chỉ tiêu diệt rất nhiều loài nấm gây bệnh cây trồng

trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hoá học của đất, đẩy mạnh sự phát triển các vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây trồng (Emxep, 1989)

Theo nghiên cứu của Sarma (1996) cho thấy rằng một số chủng phân lập từ

vùng rễ của cây tiêu như Trichoderma harzianum,Gliocladiumvirens,Verticillum

hlamydosporium, V tenerum có khả năng ức chế sự sinh trường và phát triển của

P.capsici, là tác nhân gây bệnh cho cây trồng

Theo Elisavà Manuela (1998) Trichoderma harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng và các hợp chất chlorouaiacol, hợp chất AOX (các

hợp chất halogen thấm nước) trong chất thải của các nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney, vùng Đông Nam nước Úc

2.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam việc nghiên cứu nấm Trichoderma được tiến hành từ những năm

1987- 1990

Nhiều công trình nghiên cứu đã đem lại kết quả tốt trong việc dùng nấm

Trichoderma chống bệnh cho cây trồng Theo Nguyễn Văn Lầm (1995) nghiên cứu và thu thập duy trì nguồn nấm Trichoderma, xác định khả năng ức chế của nấm

Trichoderma đối với một số nấm gây bệnh cho cây trồng, tìm phương pháp nhân sinh

khối nấm Trichoderma và tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong sản xuất rau Các chủng Trichoderma đã thu thập được có hiệu quả ức chế cao từ 67,7- 85,5% đối với các loại nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fisarium ,

Aspergilus

Theo Trần Tấn Đạt (2005) khi tiến hành nghiên cứu “Thiết lập phương pháp

nhân sinh khối nấm Metarhizum, Trichoderma, Beauveria và ứng dụng của của chế phẩm Trichoderma hạn chế bệnh chết cây con cải ngọt, tại huyện Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh” đã kết luận chế phẩm Trichoderma asperelum (Pa05) và Trichoderma

virens (T.38) hạn chế bệnh chết cây con và góp phần làm tăng năng suất trên cây cải ngọt

2.4 Khái niệm về phân bón hữu cơ và phân bón hữu cơ vi sinh

2.4.1 Phân bón hữu cơ

Phân hữu cơ là hợp chất hữu cơ để sử dụng trong nông nghiệp, chuyển hóa

từ phân người hay động vật, giúp tăng thêm độ mầu mỡ cho đất bằng cách cung cấp

thêm các chất hữu cơ và bổ dưỡng

Theo Nguyễn Đăng Nghĩa (2001), phân hữu cơ là loại phân bón trong đó có chứa nguyên tố Cacbon có liên kết với các chất hữu cơ, hay nói cách khác là những loại phân bón chế biến từ nguồn nguyên liệu hữu cơ Do chứa nhiều loại chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng nên trong quá trình phân hủy và giải phóng chất dinh dưỡng cung cấp cho cây diễn ra từ từ trong một khoảng thời gian đảm bảo cho cây hấp

thu thức ăn đều đặn Hơn nữa, phân hữu cơ còn ít gây ô nhiễm môi trường, cung cấp điều kiện và nguyên liệu cho vi sinh vật trong đất hoạt động

Theo Hoàng Đại Tuấn (2000) quá trình làm phân hữu cơ thực chất là quá trình biến đổi sinh hóa các nguyên liệu hữu cơ, dưới tác động của vi sinh vật, trong điều kiện hiếu khí hay yếm khí

Phân hữu cơ làm tăng năng suất cây trồng và còn có tác dụng cải tạo đất Kết quả một số công trình nghiên cứu cho thấy bón 1 tấn phân hữu cơ làm bội thu ở đất phù sa sông Hồng 80 – 120 kg thóc, ở đất bạc màu 40 – 60 kg thóc, ở đất phù sa đồng bằng sông Cửu Long 90 – 120 kg thóc Một số thí nghiệm cho thấy bón 6 – 9 tấn phân xanh/ha hoặc vùi 9 – 10 tấn thân lá cây họ đậu trên 1 ha có thể thay thế được 60 – 90

N kg/ha Vùi thân lá lạc, rơm rạ, thân lá ngô của cây vụ trước cho cây vụ sau làm tăng 0.3 tấn lạc xuân, 0.6 tấn thóc, 0.4 tấn ngô hạt/ha (Nguyễn Hồng Bỉnh và ctv, 2009)

2.4.2 Phân bón hữu cơ vi sinh

Theo Lê Văn Khoa và ctv (2000), phân bón hữu cơ vi sinh là phân được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ không đồng nhất (khác nhau) có chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống có chức năng khác nhau đã được tuyển chọn nhằm cung cấp các chất dinh dưỡng cho đất và cây trồng góp phần nâng cao năng suất và chất

lượng nông sản

Phân vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa các vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và (hoặc) chất lượng nông sản Phân vi sinh vật phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến ngư, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

Phân hữu cơ vi sinh vật nhìn chung được dùng như một loại phân bón đất, nghĩa là bón trực tiếp vào đất tương tự như bón phân chuồng hoặc các loại phân hữu

cơ khác Tùy theo từng loại cây và cách thức gieo trồng có thể bón trực tiếp phân hữu

cơ vi sinh vật vào đất và cày bừa đều cùng phân chuồng trước khi gieo hạt, trồng cây non hoặc bỏ phân vào các rãnh đã được đào trước xung quanh gốc cây, sau đó lấp kín

lại bằng đất Khi sử dụng phân hữu cơ vi sinh vật cùng các loại phân khoáng khác cần xem xét đến liều lượng sử dụng của phân khoáng vì hàm lượng cao các chất tan của phân khoáng có thể sẽ làm chết vi sinh vật sau khi bón

2.5 Vai trò của phân bón hữu cơ sinh học, hữu cơ vi sinh đối với sản xuất nông

nghiệp trên thế giới

Nghiên cứu của Schulz và cộng tác viên (1997) về việc bón phân hữu cơ sinh học cho bắp, lúa mì ở Luvisol (Đức) năm 1997 đã cho thấy năng suất bắp, lúa mạch tăng hơn so với đối chứng (bón phân khoáng thông thường) khi bón kết hợp phân bón hữu cơ sinh học với phân khoáng, đặc biệt là năng suất tăng 57% khi kết hợp phân bón hữu cơ sinh học với một lượng phân khoáng tối thiểu Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc cung cấp đạm dưới dạng hữu cơ sẽ làm giảm lượng đạm NO3- trong đất và giảm sự tích lũy NO3-

trong lá Theo Morris và Ma (1975) trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Á Châu đã

có những nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các loại phân bón hữu cơ sinh học đối với năng suất và phẩm chất của một số loại rau như sau:

Thí nghiệm trong năm 1974, năng suất cà chua đạt 73 tấn/ha khi bón 30 tấn phân hữu cơ/ha+ 80kg N vô cơ/ha Nhưng nếu chỉ bón 80kg N/ha thì năng suất chỉ đạt

2.6 Khái niệm về ủ chất thải và mùn

2.6.1 Quá trình ủ chất thải (composting)

Theo Trần Thị Mỹ Diệu (2002) ủ chất thải là quá trình oxi hóa sinh học tỏa nhiệt, trong đó vật liệu hữu cơ bị phân rã bởi hỗn hợp các quần thể sinh vật trong môi trường ẩm và hiếu khí Trong quá trình này các vật liệu hữu cơ phân hủy được sẽ chịu

sự biến đổi hóa học và vật lý để trở thành mùn, một loại sản phẩm được gọi là chất

hữu cơ ổn định, sản phẩm này có giá trị cao đối với nông nghiệp như là phân hữu cơ cải thiện đất trồng

Các mô hình công nghệ ủ compost quy mô lớn hiện nay trên thế giới được phân loại theo nhiều cách khác nhau Theo trạng thái của khối ủ compost tĩnh hay động, theo phương pháp thông khí khối ủ cưỡng bức hay tự nhiên, có hay không đảo trộn Dựa trên đặc điểm, hệ thống ủ compost lại được chia thành hệ thống mở và hệ thống kín, liên tục hay không liên tục Mô hình ủ compost hệ thống mở phổ biến nhất là các phương pháp ủ luống tĩnh, luống động có kết hợp thông khí cưỡng bức hoặc đảo trộn theo chu kỳ Nhược điểm của hệ thống mở là chịu ảnh hưởng bởi thời tiết và thời gian

ủ có thể kéo dài, thường chỉ áp dụng ở quy mô nông trường, trang trại có diện tích mặt bằng lớn, xa khu đô thị

Đối với ủ compost quy mô công nghiệp trong các nhà máy lớn, hiện nay trên thế giới thường áp dụng mô hình ủ compost hệ thống kín (hay hệ thống có thiết bị chứa) giúp khắc phục được các nhược điểm của hệ thống mở, vận hành và kiểm soát quá trình thuận tiện Thông thường hệ thống ủ compost kín hiện đại được thiết kế hoạt động liên tục, khí thải được xử lý bằng phương pháp lọc sinh học (biofilter)

2.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ chất thải

2.6.2.1 Nhi ệt độ

Nhiệt độ và sự biến đổi của nhiệt độ trong ngày và các mùa ảnh hưởng đến tốc

độ phân hủy chất hữu cơ Thông thường biên độ nhiệt sau đây được chú ý đến trong quá trình xử lý yếm khí:

25 ¸ 40oC: đây là khoảng nhiệt độ thích hợp cho các vi sinh vật ưa ấm

50 ¸ 65oC: nhiệt độ thích hợp cho các vi sinh vật ưa nhiệt

Nói chung khi nhiệt độ tăng tốc độ sinh khí tăng nhưng ở nhiệt độ trong khoảng

40 ¸ 45oCthì tốc độ sinh khí giảm vì khoảng nhiệt độ này không thích hợp cho cả hai loại vi khuẩn, nhiệt độ trên 60oCtốc độ sinh khí giảm đột ngột và quá trình sinh khí bị kềm hãm hoàn toàn ở 65oCtrở lên Nhiệt độ của khối ủ phụ thuộc nhiều vào kích thước khối ủ, nguyên liệu, kỹ thuật ủ Sự tạo thành nhiệt độ của khối ủ đến một giới hạn nào

đó sẽ ức chế hoạt động của vi sinh vật

2.6.2.2 Độ ẩm và sự thoáng khí

Quá trình phân giải chất hữu cơ thì độ ẩm của đống ủ có vai trò rất quan trọng

Để duy trì sống và hoạt động các vi sinh vật cần nước và không khí tự do bên ngoài đống ủ Các nguyên liệu thường có độ hút ẩm khác nhau, do đó độ ẩm thích hợp cho quá trình ủ composting cũng khác nhau Nói chung nhiệt độ ẩm tối ưu cho quá trình ủ composting dao động từ 50 – 70%

2.6.2.3 Giá tr ị pH

pH trong hầm ủ nên được điều chỉnh ở mức 6,6 -7,6, tối ưu trong khoảng 7 -7,2

vì tuy rằng vi khuẩn tạo acid có thể chịu được pH thấp khoảng 5,5 nhưng vi khuẩn tạo methane bị ức chế ở pH đó pH của hầm ủ có khi hạ xuống thấp hơn 6,6 do sự tích tụ quá độ các acid béo do hầm ủ bị nạp quá tải hoặc do các độc tố trong nguyên liệu nạp

ức chế hoạt động của vi khuẩn methane Trong trường hợp này người ta lập tức ngưng nạp cho hầm ủ để vi khuẩn sinh methane sử dụng hết các acid thừa, khi hầm ủ đạt được tốc độ sinh khí bình thường trở lại người ta mới nạp lại nguyên liệu cho hầm ủ theo đúng lượng quy định Ngoài ra người ta có thể dùng vôi để trung hòa pH của hầm

ủ

2.6.2.4 Độ xốp

Độ xốp là một yếu tố quan trọng trong quá trình chế biên phân compost Độ xốp tối ưu sẽ thay đổi tùy theo nguyên liệu ủ Độ xốp tối ưu khoảng 30 – 36% Độ xốp thấp sẽ hạn chế sự vận chuyển oxi Ngược lại độ xốp cao sẽ dẫn đến nhiệt độ trong đống ủ thấp, không đảm bảo tiêu diệt mầm bệnh

2.6.2.5 Kích thước hạt

Kích thước hạt tối ưu cho quá trình ủ compost là đường kính từ 3 đến 50 mm (Trần Linh Đăng, 2003)

2.7 Các loại bùn thải

Hiện nay có thể phân loại các loại bùn thải sau:

Bùn thải hữu cơ: gồm bùn thải phát sinh từ việc nạo vét kênh rạch và cống thoát nước và ở các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm, nước giải khát, chế biến thủy sản

Bùn thải phát sinh từ việc nạo vét kênh rạch và cống thoát nước

Bùn thải hữu cơ không nguy hại: Dòng bùn này chủ yếu phát sinh ở hệ thống

xử lý chất thải, cống rãnh thoát nước của các doanh nghiệp, nhà máy chế biến thực phẩm, nhà máy chế biến thực phẩm, thủy sản và một phần phát sinh trong quá trình sản xuất

Bùn thải hữu cơ nguy hại: loại bùn thải này bị nhiễm dầu và kim loại nặng Bùn thải vô cơ

Bùn thải vô cơ không nguy hại

Bùn thải vô cơ nguy hại

2.8 Hàm lượng hữu cơ, dinh dưỡng trong bùn thải hữu cơ

Tại các hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy sản xuất thực phẩm, sau một thời gian vận hành thì tại các bể lắng của các hệ thống này đều phát sinh rất nhiều bùn thải Dòng bùn thải này có mức độ ô nhiễm môi trường do những tính chất như: mùi hôi thối cao, nước chứa trong bùn thải có độ ô nhiễm cao sẽ rất nguy hại nếu đi vào nguồn nước Tuy nhiên trong thành phần nước thải sản xuất của các nhà máy trên chứa rất nhiều chất hữu cơ và các chất dinh dưỡng

Chương III

3.1 Nội dung nghiên cứu

 Nội dung 1: Phân lập tuyển chọn và đánh giá hoạt tính của Trichoderma

 Nội dung 2: Sơ chế công thức chất mang BBS +MXD, chọn công thức tối ưu

 Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất phân VS và phân HCVS

3.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

3.2.1 Thời gian

Thời gian thí nghiệm được tiến hành từ tháng 3/2011 đến tháng 8/2011

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam

3.3 Vật liệu

Đối tượng nghiên cứu: bùn thải sinh học của nhà máy sữa Thống Nhất do công

ty TNHH Khoa học công nghệ môi trường Quốc Việt – Tp HCM cung cấp và mụn dừa lấy từ Mỏ Cày – Bến Tre

Đối tượng vi sinh vật: Các chủng vi sinh vật được phân lập từ 51 nguồn: mẫu đất hoai mục, mụn dừa, đất nông nghiệp và các chế phẩm vi sinh vật

Vôi, cám và các hóa chất cần thiết để làm môi trường

 Hóa chất

Các hóa chất dùng để pha chế môi trường nuôi cấy và thử hoạt lực của vi sinh

vật và hóa chất dùng để phối trộn trong quá trình ủ phân như carbonmethylcellulose (CMC), agar, pepton, lugol,

Môi trường giữ giống nấm Trichoderma : môi trường PGA gồm: khoai tây,

glucosa, agar, nước cất

Môi trường bổ sung lên men bán rắn gồm: glucose, (NH4)2SO4, KH2PO4, urea, CaCl2, MgSO4.7H2O, peptone, FeSO4.7H2O, ZnSO4, CoCl2

Môi trường phân lập, kiểm tra hoạt lực của nấm Trichoderma phân giải

cellulose (môi trường I), phân giải tinh bột (môi trường II), môi trường CMC (môi trường III)

Môi trường TM + 1 % cơ chất (cơ chất là tinh bột , cellulose và CMC)

 Môi trường giá:

 Môi trường I: phân giải cellulose

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Nội dung 1: Phân lập tuyển chọn và đánh giá hoạt tính của Trichoderma

3.4.1.1 Phân l ập vi sinh vật nấm Trichoderma

Nguồn phân lập: từ các mạt dừa, đất,rác, các chế phẩm phân bón trên thị trường

Môi trường phân lập: MT giá

Phương pháp phân lập: (phân lập theo phương pháp Koch)

Cân 10g mẫu hòa vào 90 ml nước muối 0,9 % rồi pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau theo dãy thập phân

Ở mỗi nồng độ lấy 0,1 ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri chứa môi trường

đã được khử trùng ở 121o

C, 1 atm, dùng que cấy trải đều khắp mặt thạch

Ủ ở nhiệt độ thường (28 – 30 o

C) 5 – 7 ngày, 5 – 7 ngày quan sát khuẩn lạc của nấm mốc, chọn những khuẩn lạc riêng lẽ cấy chuyền qua môi trường phân giải cellulose (môi trường I), phân giải tinh bột (môi trường II), môi trường CMC (môi trường III)

Cấy chuyền nhiều lần cho đến khi quan sát khuẩn lạc có màu sắc tương đối đồng nhất

 Kiểm tra độ thuần khiết

Kiểm tra bằng mắt: quan sát các vết cấy mọc đồng đều, thuần nhất trên môi trường, quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc

Quan sát dưới kính hiển vi: chuẩn bị các tiêu bản tế bào sống hoặc các tiêu bản

cố định nhuộm màu tế bào, kiểm tra các tế bào đồng nhất về hình thái, chỉ khác nhau

về kích thước

 Mô tả hình thái

Dàn đều trên môi trường thạch: Chọn những khuẩn lạc đặc trưng, dùng que cấy vòng trích khuẩn lạc, huyền phù hóa trong nước muối sinh lý vô trùng, dùng que cấy vòng lấy 1 giọt dung dịch vi sinh vật cấy ria vào môi trường đặc trưng (môi trường I,

II, III), cấy chuyền nhiều lần cho đến khi quan sát thấy các khuẩn lạc có màu sắc đồng nhất chứng tỏ giống thuần khiết

 Test hoạt lực phân giải Celllulose, chọn ra 3 chủng Trichoderma có hoạt tính mạnh, thuần nhất đi làm tiếp các nội dung sau

3.4.2 Nội dung 2: Sơ chế công thức chất mang BBS + MXD + VSV

3.4.2.1 Thí nghi ệm 1: Sơ chế vật liệu thô bằng phương pháp hóa học

- Sơ chế bằng CaCO3 10 % và vi sinh vật (Trichoderma sp.) mật độ nấm Trichoderma

phối trộn là (2x107/ml)

Các nghiệm thức (NT) thí nghiệm:

NT 3 60 % bùn sữa + 40 % mạt dừa + vôi + VSV

NT 4 50 % bùn sữa + 50 % mạt dừa + vôi + VSV

NT 5 40 % bùn sữa + 60 % mạt dừa + vôi +VSV

Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 yếu tố, 5 nghiệm thức, 4 lần lặp lại

Các chỉ tiêu theo dõi:

Theo dõi hàng tuần:

 Sự thay đổi nhiệt độ

 Hàm lượng lân hữu hiệu (P2O5_hh)

 Hàm lượng kali tổng số ( K2O_ts)

 Hàm lượng kali hữu hiệu (K2O_hh)

 Mật độ nấm Trichoderma trong 1 gam cơ chất

Cách thực hiện:

Bùn sữa và mụn dừa sau khi nhận về đem gởi mẫu đi phân tích các thành phần dinh dưỡng (tỉ lệ C/N; tỉ lệ các chất N_ts; P2O5_ts; P2O5_hh; K2O_ts; K2O_hh) Riêng bùn sữa gởi đi phân tích bốn chỉ tiêu kim loại nặng Hg, As, Pb và Cd tại trường

ĐH Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh và Viện KHKTNN Miền Nam

Phối trộn bùn sữa và mạt dừa theo tỉ lệ thích hợp Mỗi nghiệm thức khối lượng 4 kg, chia đều cho 4 lần lặp lại Thêm vôi với khối lượng bằng 10 % khối lượng mạt dừa ở mỗi nghiệm thức

Trong tất cả các nghiệm thức thêm vào 42 g cám, 20ml Trichoderma (cạo nấm M4, M8, M50 trên đĩa petri trộn đều với nước đã khử trùng và rĩ đường) Thêm nước để đạt được ẩm độ 60 – 70 %

Quá trình ủ kéo dài 21 ngày, 1 tuần đảo trộn và thêm nước một lần để tạo điều kiện thoáng khí và độ ẩm cho vi sinh vật phát triển

 Xác định nhiệt độ

Kiểm tra: Tuần đầu 1 lần/ 1 ngày, Tuần thứ 2 và 3: 2 ngày/ lần