NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NƯỚC GIẢI KHÁT LÊN MEN TỪ TRÁI DÂU TẰM

TÓM TẮTĐề tài “Nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ trái dâu tằm” được tiếnhành tại phòng Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Đại Học Nông LâmTP.HCM trong khoảng thờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC









KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NƯỚC GIẢI KHÁT

LÊN MEN TỪ TRÁI DÂU TẰM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC









KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NƯỚC GIẢI KHÁT

LÊN MEN TỪ TRÁI DÂU TẰM

Tháng 07/2011

LỜI CẢM ƠN

Qua hơn ba tháng nghiên cứu, đề tài “Nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men

từ trái dâu tằm” đã hoàn thành

Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình giúp đỡ

em hoàn thành đề tài này

Em chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyềnđạt cho em những kiến thức quý báu trong thời gian qua

Em chân thành cảm ơn các cán bộ của Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường,Đại học Nông Lâm đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài này

Em cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị khoá trước đã đóng góp, độngviên giúp đỡ em hoàn thành đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Võ Đình Trung

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ trái dâu tằm” được tiếnhành tại phòng Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Đại Học Nông LâmTP.HCM trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2011 Đề tài được thực hiệnvới mục đích tìm ra các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men nước dâu tằm, từ đó xâydựng quy trình sản xuất thử nghiệm nước dâu tằm lên men

Dâu tằm (Morus nigra L.) có chứa nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe của con

người, trong thành phần của quả dâu tằm có chứa nhiều vitamin như vitamin A, B6, C,thiamin, riboflavin, việc tận dụng ưu điểm này của quả dâu tằm là hết sức cần thiết Chếbiến dâu tằm thành nước giải khát lên men sẽ làm phong phú hơn chủng loại nước giảikhát ở nước ta, tạo ra một loại nước giải khát giàu hàm lượng chất dinh dưỡng

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm men có trong dâutằm, khảo sát lần lượt ảnh hưởng của tỷ lệ giống nấm men, nồng độ chất khô ban đầu, pHban đầu, nhiệt độ lên men đến quá trình lên men nước dâu tằm

Và kết quả chúng tôi thu nhận được là chủng nấm men phân lập được từ trái dâu

tằm thuộc loài Saccharomyces cerevisiae, thích hợp cho lên men nước dâu tằm Các

thông số kỹ thuật của quá trình lên men nước dâu tằm: tỷ lệ giống tốt nhất là 9% so vớithể tích dịch lên men, mật độ nấm men là 107tế bào/ml, nồng độ chất khô tốt nhất củadịch trước lên men là 240Bx, độ pH tốt nhất là 3,5, và nhiệt độ lên men thích hợp nhất là

28 – 300C, lên men tiến hành trong hai ngày, và sau đó điều vị với 10% dịch syrup đường

và thanh trùng ở 60 – 630C trong vòng 20 phút

Thesis’s title: “The study on product of fermentation beverage from blackmulberry” Thesis were performed from February to June, 2011 at Microbiology lab,Institutes of Biotechnology and Environment, Nong Lam University

Black mulberry (Morus nigra L.) have many compounds which useful for human’s

healthy, include many vitamins such as vitamin A, B6, C, thiamin, riboflavin Product offermentation beverage from black mulberry will make a kind of beverage which containnutriments

The aim of this study consists of determination the influence of parameters,optimization in fermentation process The mulberry’s yeast were isolated The parameters

in fermentation such as yeast inocolum, temperature, pH, initial solube substances werestudied and optimized

As a result, the yeast of mulberry is S cerevisiae, the optimom conditions of

fermentation process were found to be yeast inocolum 9%, initial solube substances of

240Bx, pH 3,5, temperature of 28 ÷ 300C and residence time of 48 h

Key: mulberry, beverage, fermentation

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các bảng v

Danh sách các hình vi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 1

1.3 Nội dung đề tài 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về dâu tằm 3

2.1.1 Giới thiệu chung về cây dâu tằm 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 4

2.1.3 Thành phần hoá học và ứng dụng 5

2.2 Tổng quan về nấm men 6

2.2.1 Đặc điểm chung của nấm men 6

2.2.2 Vai trò của nấm men 7

2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của nấm men 7

2.2.4 Đặc điểm chung của S cerevisiae 8

2.2.5 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men 8

2.3 Công nghệ lên men 9

2.3.1 Tổng quan về quá trình lên men 9

2.3.1.1 Tác nhân lên men 9

2.3.1.2 Cơ chế của quá trình lên men 10

2.3.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11

2.3.2.1 Nhiệt độ 11

2.3.2.2 pH môi trường 11

2.3.2.3 Nồng độ đường 12

2.3.2.4 Nồng độ cồn ethylic 12

2.3.2.5 Ảnh hưởng của đạm, muối trong dịch lên men 12

2.3.2.6 Nồng độ oxy 13

2.3.2.7 Nồng độ CO2của môi trường 13

2.3.2.8 Thời gian 14

2.3.3 Những kỹ thuật chung áp dụng cho nước quả 14

2.3.3.1 Chống oxy hoá nước quả 14

2.3.3.2 Theo dõi quá trình lên men 14

2.3.4 Các sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men 14

2.3.5 Tình hình nghiên cứu giải khát và nước giải khát lên men 15

2.3.5.1 Tình hình sản xuất nước giải khát trên thế giới 15

2.3.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất nước giải khát tại Việt Nam 16

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Vật liệu thí nghiệm 17

3.2.1 Mẫu 17

3.2.2 Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm 17

3.2.2.1 Hoá chất 17

3.2.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Phân lập nấm men 18

3.3.1.1 Quy trình phân lập nấm men 18

3.3.1.2 Thuyết minh quy trình 19

3.3.2 Nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ trái dâu tằm 21

3.3.2.1 Quy trình dự kiến sản xuất nước lên men dâu tằm 21

3.3.2.2 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng pectinase bổ sung 23

3.3.2.3 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men 24

3.3.2.4 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô 25

3.3.2.5 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH 26

3.3.2.6 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 27

3.3.3 Phương pháp đếm nấm men bằng buồng đếm hồng cầu 28

3.3.4 Phương pháp đánh giá cảm quan 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Kết quả phân lập nấm men 32

4.2 Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 32

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng pectinase 32

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống 33

4.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô 35

4.2.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH 36

4.2.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 38

4.2.6 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm 39

4.3 Kết luận 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hoá học của quả dâu 5

Bảng 2.2 Thành phần vitamin trong quả dâu 5

Bảng 3.1 Bảng điểm đánh giá chất lượng sản phẩm nước lên men dâu tằm 30

Bảng 3.2 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng nước lên men dâu tằm 31

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng pectinase 32

Bảng 4.2 Số lượng nấm men khi nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống 34

Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ giống lên quá trình lên men 34

Bảng 4.4 Số lượng nấm men khi nghiên cứu ảnh hưởng của Brix 35

Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Brix ban đầu 35

Bảng 4.6 Số lượng nấm men khi nghiên cứu ảnh hưởng của pH 36

Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu 37

Bảng 4.8 Số lượng nấm men khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 38

Bảng 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 38

Bảng 4.10 Kết quả đánh giá cảm quan 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Quả dâu tằm đen 3

Hình 3.1 Quy trình phân lập nấm men từ trái dâu tằm 18

Hình 3.2 Quy trình dự kiến sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm 21

Hình 3.3 Bố trí thí nghiệm xác định lượng enzyme bổ sung thích hợp 23

Hình 3.4 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ giống bổ sung tối ưu 24

Hình 3.5 Bố trí thí nghiệm xác định lượng đường bổ sung tối ưu 26

Hình 3.6 Bố trí thí nghiệm xác định lượng pH ban đầu tối ưu 27

Hình 3.7 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu 28

Hình 4.1 Nấm men dâu tằm được phân lập trong môi trường Hansen 32

Hình 4.2 Hình ảnh nấm men dâu tằm chụp dưới kính hiển vi 32

Hình 4.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến nồng độ rượu ethylic tạo thành 34

Hình 4.4 Ảnh hưởng của Brix ban đầu đến độ cồn sau lên men 36

Hình 4.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến độ cồn sau lên men 37

Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới lượng rượu ethylic tạo thành 38

Hình 4.7 Quy trình sản xuất nước giải khát lên men dâu tằm 43

Hình 4.8 Hình ảnh sản phẩm nước lên men dâu tằm 44

Chương 1 MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Dâu tằm có tên khoa học là Morus nigra L , từ lâu y học cổ truyền đã dùng các bộ

phận của cây dâu tằm như lá dâu, vỏ rễ dâu, quả dâu và các loại tầm gửi trên cây dâu đểlàm thuốc để chữa hen suyển, viêm phế quản Thật vậy, trong các phần của cây dâu tằm

có chứa các hợp chất có lợi cho người sử dụng về mặt dinh dưỡng cũng như sức khoẻ Đó

là sự có mặt của các acid amin thiết yếu, các loại vitamin như vitamin A, thiamine,roboflavin và một số yếu tố vi lượng khác

Trong quả dâu tằm có chứa hàm lượng vitamin tương đối lớn, rất có lợi cho sứckhoẻ con người Nhưng hiện nay ở Việt Nam quả dâu tằm thường chỉ được sử dụng như quả ăntươi, một phần để sản xuất siro, thính, nước ép, chưa tận dụng được hết những ưu điểm của dâu

Ngành sản xuất nước giải khát đang phát triển với tốc độ rất nhanh cả về chủngloại và số lượng Nếu thế kỷ XX là thế kỷ của các mặt hàng nước giải khát truyền thốngvới các nhãn hàng nổi tiếng như Cocacola, Pepsico… thì thế kỷ XXI được đánh giá là thế

kỷ dành cho các mặt hàng nước giải khát có chứa nhiều chất dinh dưỡng như nước ép tráicây, nước giải khát lên men… nước giải khát lên men là loại nước uống tự nhiên có độcồn thấp, hàm lượng dinh dưỡng cao, phù hợp với nhiều lứa tuổi

Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu về nước giải khát đang ngày càng tăng lên, mộtphần là do thời tiết đang có phần nóng lên, một phần nữa là do đời sống con người đangdần được cải thiện Để có thể làm phong phú thêm chủng loại và góp phần tạo ra một loạinước giải khát có hàm lượng dinh dưỡng cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ trái dâu tằm”

1.2 Yêu cầu đề tài

Phân lập được chủng nấm men có trong trái dâu tằm

Đánh giá được sự ảnh hưởng của các yếu tố tỉ lệ giống, nồng độ chất khô ban đầu,

pH ban đầu, nhiệt độ đến quá trình lên men nước dâu tằm

Xây dựng được quy trình sản xuất thử nghiệm nước giải khát lên men dâu tằm

1.3 Nội dung đề tài

Phân lập chủng nấm men trong quả dâu tằm trên môi trường Hansen

Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến quá trình lên men nước dâu tằm.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu đến quá trình lên men nướcdâu tằm

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men nước dâu tằm

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men nước dâu tằm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về dâu tằm

2.1.1 Giới thiệu về cây dâu tằm

Cây dâu tằm có tên chung là mulberry, chúng có nhiều giống khác nhau như:

White Mulberry (Morus alba L.), Black Mulberry (M nigra L.), American Mulberry, Red Mulberry (M.rubra L.) Chúng có họ hàng gần với giống Korean Mulberry (Morus australis), Himalayan Mulberry (M.laevigata).

Nguồn gốc: Morus alba L có nguồn gốc từ miền đông và miền trung Trung Quốc.

Chúng được du nhập sang châu Âu từ những thế kỷ trước và nó được đưa sang châu Mỹvào thời thực dân xâm chiếm thuộc địa nhằm mục đích phát triển nghề nuôi dâu tằm tự

nhiên Morus alba L được đưa đến nơi đây và được nhân lên một cách tự nhiên, ngoài ra còn được lai với giống Morus rubal L có sẵn ở các nước thuộc địa Morus rubal L có nguồn gốc từ miền đông nước Mỹ, Morus nigra L có nguồn gốc từ châu Á và được trồng

để lấy quả ở châu Âu từ trước thời La Mã cổ đại (Lê Văn Nhất Hoài, 2004)

Hình 2.1 Quả dâu tằm đen (Morus nigra L.) (http://www.dacsancaonguyen.com)

2.1.2 Đặc điểm sinh học

 Khả năng thích nghi

Morus alba L trong chừng mực nhất định giống Morus rubra L chịu được điều kiện khô hạn, ô nhiễm và đất bạc màu, trong khi Morus nigra L cần phải có điều kiện

thuận lợi chúng mới phát triển tốt, chúng phát triển chậm trong điều kiện khí hậu lạnh và

nóng ẩm Morus alba L là giống cây chịu lạnh tốt nhất trong các giống cây dâu thông dụng còn Morus nigra L là một trong những giống chịu lạnh kém nhất.

 Quá trình sinh trưởng và phát triển cây

Cây dâu tằm thuộc vào cây rụng lá theo mùa Morus alba L có thể cao đến 80 feet,

thường phát triển theo dạng hình chóp hoặc dạng tán Trong điều kiện đất đai màu mỡ thì

Morus alba L có thể cao 70 feet Morus nigra L là giống thấp nhất trong ba giống dâu

tằm, chúng chỉ cao khoảng 30 feet, chúng có khuynh hướng phát triển theo dạng bụi nếu

không được chăm sóc từ nhỏ Các loại dâu tằm có tuổi thọ rất khác nhau Morus rubra L.

có thể sống trên hơn 75 năm, trong khi Morus alba L và Morus nigra L sống trên 100 năm.

 Hình thái

Morus alba L có tên là white mulberry không những do chồi nụ có màu trắng mà

còn do màu sắc của quả Độ dày mỏng, mức độ xanh sáng của lá trên cùng một cây là

khác nhau tuỳ theo vị trí của lá trên cây Morus rubra L có lá lớn và dày hơn so với Morus alba L , bề mặt của lá nhám bên trên và có lông tơ bên dưới Morus nigra L có lá tương tự như của Morus rubra L nhưng nhỏ hơn, cành non thì cứng cáp hơn, chồi cũng

lớn hơn Các loài dâu có thời gian rụng lá nhất định trong năm và thời gian rụng lá khác

nhau đối với mỗi loài, đối với Morus alba L nói chung thường rụng lá đầu mùa xuân, trong khi Morus nigra L thường rụng lá sau đó hai tháng.

 Hoa

Dâu tằm vừa là cây đơn tính, vừa lưỡng tính và chúng còn thụ phấn với những câylân cận Hoa nhỏ rụng xuống và rất khó nhận ra, chúng thường ra hoa từ nách lá củanhững nhánh non đang phát triển và trên phần chồi non của nhánh già Chúng thụ phấnnhờ gió và một số phương pháp tự nhiên để hình thành quả mà không cần thiết phải có sựgiao phấn Tại California dâu tằm ra quả mà không cần sự thụ phấn

 Quả

Dâu tằm có quả không phải hoàn toàn giống quả mọng mà chỉ là một tập hợp quả

bề ngoài tương tự quả mâm xôi Khi hoa đã được thụ phấn chúng bắt đầu phình to, cuốicùng chúng thay đổi hoàn toàn kết cấu, màu sắc và trở nên mọng, béo, nhiều nước Màu

sắc của quả không đồng nhất với giống dâu, chẳng hạn Morus alba L có thể cho quả màu trắng, xanh nhạt hơi phai màu đỏ hoặc đen Nhìn chung Morus alba L thường cho quả ngọt nhưng lại thiếu vị chua cần thiết Morus rubra L cho quả màu đỏ thẫm gần như

đen, dòng vô tính của loài dâu này có thể cho quả có hương vị ngang bằng với giống

Morus nigra L., Morus nigra L cho quả lớn, nhiều nước kết hợp hài hoà giữa vị ngọt và

chua làm cho chúng có hương vị thơm ngon nhất trong các loài dâu tằm (Lê Văn NhấtHoài, 2004)

2.1.3 Thành phần hoá học và ứng dụng

Thành phần hoá học của quả: thành phần hoá học của quả phụ thuộc vào nhiều yếu

tố như giống, điều kiện trồng trọt…, dưới đây là thành phần trung bình của quả dâu tằmtrong điều kiện trồng trọt bình thường:

Bảng 2.1 Thành phần hoá học của quả dâu (trong 100g)

(USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 23 (2010))

Trong quả dâu tằm còn chứa một lượng vitamin tương đối lớn, thành phần vitamincủa dâu như sau:

Bảng 2.2 Thành phần vitamin trong quả dâu (trong 100g)

(USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 23 (2010))

Ngoài ra trong quả dâu còn có chứa một số thành phần vi lượng khác

Ứng dụng: Theo Hartwell quả dâu tằm có thể dùng để chữa nhiều bệnh như bệnhung bướu, hen suyễn, viêm phế quản…(trích dẫn bởi Lê Văn Nhất Hoài, 2004)

2.2 Tổng quan về nấm men

2.2.1 Đặc điểm chung của nấm men

Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻhoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi

Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, nước, lương thực thựcphẩm…, đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt

Hình dạng và kích thước nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều kiện dinhdưỡng và một số yếu tố khác

Nấm men thường có dạng hình trứng, hình bầu dục (S cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus ), hình tròn (Candida utilis), hình ống dài (Pichia), hình quả dưa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn (Brettanomyces), hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình dạng đặc biệt khác.

Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi làkhuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium) Ở khuẩn ty giả, các tế bàokhông nối liền nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty Khuẩn ty và khuẩn ty giả thường

quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon…, nhiều loài nấm chỉ

sinh khuẩn ty giả khi không được cung cấp đủ oxy

Hình dạng nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện

ngoại cảnh Ví dụ, Saccharomyces thường có hình bầu dục trong môi trường nuôi cấy giàu dinh

dưỡng Trong điều kiện yếm khí thường có hình tròn, trong điều kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn

Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tùy theo giống, loài và từng giaiđoạn phát triển Nhìn chung, tế bào nấm men to hơn tế bào vi khuẩn một cách rõ rệt, kíchthước trung bình 3 – 5 * 10 – 12 µm, nấm men bia là 6–8µm,nấm men gia súc thường nhỏ hơn

Để quan sát hình thái và đo kích thước tế bào nấm men, người ta thường sử dụngmôi trường mạch nha dịch thể với nồng độ đường khoảng 10 – 150B (độ Baumé, đơn vịthường sử dụng để tính hàm lượng đường) hoặc trong môi trường thạch mạch nha, thờigian nuôi cấy là 3 ngày ở 25 – 300C

Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào có màng tế bào, nguyên sinh chất,nhân, ty thể, ribosome, không bào, một số thể vùi (glycogen, lipit, volutin…) (Vương ThịHồng Vy, 2007).

2.2.2 Vai trò của nấm men

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất giàu protein,lipid và vitamin (đặc biệt là vitamin B) Chúng có khả năng lên men các loại đường để tạothành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng có khả năngtăng nhanh lượng sinh khối tế bào

Trong quá trình trao đổi chất của hầu hết giống nấm men đều không sinh ra chấtđộc gây hại cho sức khỏe của người và vật nuôi nên chúng được sử dụng rộng rãi trongcông nghiệp chế biến thực phẩm như sản xuất rượu, bia, nước giải khát có cồn, làm men bánh

mì, chế biến các thực phẩm sữa lên men kefir, johur… cho người, sản xuất thức ăn gia súc

Người ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất vitamin,

enzyme…, và đặc biệt loài S cerevisiae đang được sử dụng như một công cụ đắc lực để

mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của ngànhcông nghệ sinh học hiện đại

Tuy nhiên, cũng có một số nấm men gây bệnh cho người và gia súc như Candida albican, Cryptococcus neoforman… và gây hư hỏng thực phẩm như Endomycopsis fiibuligera, Saccharomyces bisporus… (Vương Thị Hồng Vy, 2007).

2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men

Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chúng hô hấp như một cơ thể hiếu khíbậc cao, khi môi trường hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí, gọi là quátrình lên men Khi phản ứng lên men bắt đầu phát triển, tốc độ sinh sản của tế bào nấmmen bị kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu như không còn nữa Về cơ chế sinhhọc, đây là một quá trình sử dụng không hết năng lượng những chất dinh dưỡng của môitrường Vì quá trình phân hủy 1 phân tử gam đường bằng cách lên men chỉ tiết ra khoảng

28 kcal, trong khi đó nếu oxy hóa hoàn toàn 1 phân tử gam đường ta sẽ có 674 kcal Quátrình lên men tạm gọi là quá trình phosphoryl hóa Vì trong khi lên men, các hợp chátATP, ADP tham gia vào 1 cách tích cực

Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thụ chọn lọc trên bề mặt của tếbào và sau đó khuếch tán vào bên trong Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bàođóng vai trò màng bán thấm ngăn cách, điều hòa các chất dinh dưỡng vào tế bào và thải các sảnphẩm trao đổi chất ra ngoài Các chất dinh dưỡng sau khi được hấp thụ vào trong tế bào sẽ xảy

ra những phản ứng hóa học để chuyển hóa thành các hợp chất như protein, glucid, lipid…(Hoàng Văn Tiến, trích từ Nguyễn Thị Thu Hằng, 2008)

2.2.4 Đặc điểm chung của S cerevisiae

Đươc Meyen mô tả vào năm 1938, tế bào có dạng hình trứng, bầu dục…, kíchthước trung bình 3 – 6 * 8 –12 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi không theo quy luật,

có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một chuỗi

Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh, đường kính 1 –

2 mm vào ngày thứ ba

Phát triển tối ưu ở 33 – 350C trong môi trường chứa 10 – 30% glucose Nhiệt độtối thiểu là 40C trong 10% glucose và 130C trong 50% glucose, nhiệt độ tối đa là 38 –

390C (Jermini and Schmidt – Lorenz, 1987, trích từ Vương Thị Hồng Vy, 2007)

Có khả năng phát triển ở pH = 1,6 trong HCl; pH = 1,7 trong H3PO4và pH = 1,8 –

2 trong acid hữu cơ, có sức chịu đựng lớn nhất đối với các acid benzoic 100 mg/kg ở pH

= 2,5 – 4 và acid sorbic 200 mg/kg ở pH = 4 (Juven et al, 1978, trích từ Vương Thị Hồng Vy,

có khả năng chịu được acid dạ dày và muối mật tốt, đề kháng tự nhiên với kháng sinh

2.2.5 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men diễn biến qua 4 giai đoạn

 Giai đoạn thích nghi

Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trường đến lúc chúng bắt đầu sinh sản Ởgiai đoạn này, chúng còn phải thích nghi với điều kiện môi trường mới

Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua những biến đổi lớn về hình thái vàsinh lý, kích thước tăng lên đáng kể và chúng trở nên nhạy cảm với những tác động bênngoài Số lượng tế bào nấm men ở giai đoạn này là không tăng hoặc tăng không đáng kể.

 Giai đoạn logarit

Số lượng và sinh khối tế bào trong giai đoạn này tăng theo cấp số nhân Khả năngthích ứng với những điều kiện không thuận lợi của môi trường ngoài tăng lên rõ rệt, đồngthời xuất hiện chức năng lên men rượu

Giai đoạn này thuận tiện để xác định năng lượng sinh sản, thời gian nảy chồi,nhưng không nên đánh giá kích thước của tế bào cũng như những dấu hiệu khác củakhuẩn lạc Do trong thời kỳ đầu của giai đoạn này, tốc độ sinh sản của tế bào thườngnhanh hơn tốc độ tạo thành tế bào chất nên kích thước của tế bào có phần nhỏ đi

 Giai đoạn ổn định

Số lượng tế bào trong giai đoạn này không tăng nữa, có thể là do sự cân bằng giữa sốsinh ra và chết đi Song kích thước tế bào tăng lên rõ rệt Quá trình lên men rượu cũng bắt đầu

 Giai đoạn thoái hoá

Số lượng tế bào giảm xuống do có hiện tượng tiêu huỷ Lượng protein và acidnucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn tiêu biến

Như vậy có thể thấy số lượng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit,song sinh khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lượng tế bào ở giai đoạn này lớn(Vương Thị Hồng Vy, 2007)

2.3 Công nghệ lên men

2.3.1 Tổng quan về quá trình lên men

Lên men là quá trình trao đổi cơ chất dưới tác dụng của enzyme tương ứng Tuỳtheo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia thành nhiều kiểu lên menkhác nhau Trong đó hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí

Lên men sản xuất nước giải khát là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men

2.3.1.1 Tác nhân lên men

Tác nhân chính của quá trình lên men nước giải khát là các chủng nấm men

Saccharomyces Dựa vào đặc tính của quá trình lên men mà nấm men được chia thành

Enzyme piruvat decarboxylase

2.3.1.2 Cơ chế của quá trình lên men

Để lên men người ta cho vào môi trường một lượng nấm men nhất định Tuỳ theophương pháp mà cho lượng nấm men khác nhau Vì diện tích bề mặt tế bào của nấm menlớn (do số lượng tế bào lớn) nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng của nấm men làrất lớn Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác có trong môi trường lên men đầutiên được hấp thụ trên bề mặt nấm men, sau đó được khuếch tán vào trong tế bào nấmmen Rượu và CO2được tạo thành theo phương trình tổng quát sau:

CH3CH=O + NAD-H++ H+ CH3CH2OH + NAD

Như vậy sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy quá trình oxy hoá khử

có enzyme nội bào tham gia Rượu etylic tạo thành khuếch tán ra môi trường ngoài quamàng tế bào nấm men Rượu hoà tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất mạnh trongmôi trường CO2cũng hoà tan vào trong môi trường nhưng không lớn Vì thế CO2 sinh ratrong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng tháibão hoà Khi bão hoà CO2 sẽ bám vào tế bào nấm men hình thành những bọt khí Bọt khísinh ra càng nhiều và lớn lên tạo thành những túi khí, đến thời điểm nào đó do có sựchênh lệch về khối lượng riêng, tế bào nấm men sẽ nổi lên bề mặt môi trường Khi đến bềmặt, do có sự thay đổi đột ngột về sức căng bề mặt nên các túi khí sẽ vỡ ra làm CO2 thoát

ra ngoài Lúc này tế bào nấm men sẽ lại chìm xuống như cũ, quá trình cứ diễn ra liên tụcnên tế bào nấm men luôn chuyển từ trạng thái tĩnh sang trạng thái động, tạo điều kiện chonấm men tiếp xúc nhiều với môi trường giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanhhơn, rút ngắn thời gian lên men Khí CO2 ức chế quá trình lên men nhưng trong quá trình

(Glyceraldehyd-3-phosphat) Glycerin-3-phosphat

thoát khí CO2khả năng lên men của nấm men sẽ tăng lên

Lên men ethanol được chia làm hai thời kỳ:

– Thời kỳ cảm ứng: Ở thời kỳ này, lượng acetaldehyde tạo thành còn ít nên hydro

từ NADH2 được chuyển đến glyceraldehyde-3-phosphat để tạo thành phosphat Sau đó glycerin-3-phosphate bị mất gốc phosphate và tạo thành glycerin

Mỗi loài sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối với nấm

men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 – 32oC Ở nhiệt độ cao, hoạttính của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoangdại.Ở nhiệt độ 30oC, men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces từ 2-3 lần, còn

ở nhiệt độ 35 – 38oC chúng phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần Mặt khác khi lên men ở nhiệt

độ cao sẽ tạo nhiều este, aldehyd và tổn thất rượu theo CO2 tăng

Nhiệt độ lên men cao nhất là 39oC và thấp nhất là 4 – 6oC

2.3.2.2 pH môi trường

Nồng độ H+trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Mỗi

vi sinh vật chỉ có thể phát triển tốt trong những trạng thái ion nhất định, mà trạng thái nàylại phụ thuộc vào pH của canh trường pH tối thích cho sự lên men của nấm men không

cố định mà phụ thuộc nhiều yếu tố:

– Loài, chủng nấm men.

– Thành phần của môi trường lên men

– Điều kiện lên men

Thường thì pH tối ưu cho quá trình lên men là từ 3,5 – 6

pH môi trường còn ảnh hưởng đến các enzyme hình thành trong nấm men Theonghiên cứu của Haldane thì 96 enzyme có pH tối thích từ 4 – 8, ở pH < 4, hoạt tính củacác enzyme giảm dần

Trong quá trình lên men rượu, một số acid sẽ được hình thành thêm, dẫn đến sự hạthấp pH xuống

2.3.2.3 Nồng độ đường

Các loại dịch quả, dịch đường hoá đều tạo nên một áp suất thẩm thấu Áp suất nàycàng tăng khi gia tăng nồng độ đường của môi trường Các nấm men đều phải có khảnăng cân bằng áp suất thẩm thấu của môi trường với áp suất nội thể Trường hợp ngượclại nấm men sẽ bị co nguyên sinh

Từng loại nấm men riêng biệt có khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu khác nhau.Những nòi lên men nổi có đặc tính là khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu cao hơn các

nòi khác Ví dụ như những nấm men của giống Zygosaccharomyces có thể phát triển

trong môi trường có hàm lượng đường từ 50 – 80 %

2.3.2.4 Nồng độ cồn ethylic

Cồn ethylic chính là sản phẩm chính được tạo ra trong quá trình lên men rượu từđường Nhưng nó có thể ức chế hoạt động của nấm men Nồng độ rượu 1,5% thể tích đãphần nào ức chế sự sinh sản và phát triển của nấm men, khi tăng lên 5% thì sự sinh sảnbắt đầu ngừng trệ Nếu nồng độ rượu lên đến 7 – 8 % thì lên men bắt đầu giảm mạnh vàbắt đầu giai đoạn lên men yếu

Đa số các loại nấm men ở điều kiện tối ưu chịu được nồng độ cồn khoảng 14-16% thể tích

2.3.2.5 Ảnh hưởng của đạm muối trong dịch lên men

Đạm

Để nấm men phát triển nhanh và cường độ lên men mạnh thì đòi hỏi phải đủ đạmtrong dịch lên men

Thường trong dịch nước quả có đủ đạm để cung cấp cho nhu cầu của nấmmen,nhưng cũng có năm do điều kiện không thuận lợi: sâu bệnh, hạn hán, tỉ lệ đạm thấp

thì cần phải bổ sung thêm Đối với các loại nấm men Saccharomyces, muối amon thích

hợp nhất vì chúng đồng hoá được các muối này Từ muối amon, nấm men có thể tổng hợptất cả các acid amin và protein cần thiết cho mình nhưng nếu cho thêm acid amin, nhất làdưới dạng hỗn hợp thì tác dụng kích thích rất rõ

Muối khoáng

Muối khoáng cần thiết cho nấm men để cấu thành các tổ chức của mình, cũng cần

để tạo ra các enzyme, là tác nhân sinh ra các phản ứng sinh hoá trong rượu

Khi lên men tiến hành bổ sung P2O5, K2O và MgO bao giờ cũng kích thích sự lênmen Nguồn K và P có thể dùng để bổ sung là K2HPO4, KH2PO4hoặc (NH4)2HPO4, NH4H2PO4

và K2SO4, nguồn Mg và lưu huỳnh có thể dùng là MgSO4, nguồn sắt – FeCl3, FeSO4

2.3.2.6 Nồng độ oxy

Oxy rất cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình lên men, lúc này nấm men sẽ tiếnhành hô hấp hiếu khí để tăng sinh khối

Tuy nhiên, khi bắt đầu chuyển qua giai đoạn lên men, oxy lại gây bất lợi Lúc này

sự lên men bắt buộc phải yếm khí hoàn toàn, ở điều kiện này sự phát triển vi sinh vật cầnoxy bị cản trở hoàn toàn (vi khuẩn lactic, nấm men hoang dại)

2.3.2.7 Nồng độ CO 2 của môi trường

CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường: một phần sẽ tồn tạitrong môi trường, một phần tách lên trên bề mặt môi trường, phần còn lại tích tụ thànhmột lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường

CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả nâng sinh sản của nấm men,nhưng không làm giảm khả năng lên men của chúng

Theo Muler Turgar, với nồng độ 0,25% trọng lượng CO2 trong môi trường sẽ ứcchế sự sinh sản của nấm men rượu vang (trích dẫn bởi Vương Thị Hồng Vi, 2007)

2.3.2.8 Thời gian

Thời gian là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm nước lên men Thờigian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ lên men, nồng độ lên men, chủng nấm men(Lê Văn Nhất Hoài, 2004)

2.3.3 Những kỹ thuật áp dụng chung cho quá trình lên men

2.3.3.1 Chống oxy hoá nước quả

Nếu dịch quả tiếp xúc với oxy của không khí sẽ gây ra hiện tượng oxy hoá dịch lênmen ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Vì thế cần có những biện pháp phòng chống.Sau đây là một số biện pháp phòng chống:

– Không làm dập nát quả trong suốt quá trình thu hái vận chuyển

– Cần có công đoạn phân loại, lựa chọn nguyên liệu khi đưa vào sản xuất

– Vừa tách dịch xong cần lên men ngay

– Dùng những biện pháp lý hoá để hạn chế oxy hoá

– Chứa dịch trong thiết bị có CO2thay cho O2

– Xử lý nhiệt cũng là một biện pháp chống oxy hoá có hiệu quả

2.3.3.2 Theo dõi quá trình lên men

Kỹ thuật theo dõi quá trình lên men là công việc hết sức quan trọng, nếu khôngđược theo dõi chu đáo có thể dẫn đến hỏng cả mẻ lên men hoặc sản phẩm sẽ kém chấtlượng Nên phải tạo điều kiện cho quá trình lên men diễn ra nhanh Để tránh cho vi sinhvật phát triển làm hỏng sản phẩm Theo dõi quá trình lên men bằng cách theo dõi lượngbọt khí bay lên, nếu thấy tốc độ lên men chậm thì cần bổ sung thêm nấm men ngay

2.3.4 Các sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men

Khi lên men bên cạnh các sản phẩm chính là rượu etylic và khí CO2 còn có nhiềusản phẩm phụ khác như: acid acetic, glycerin, acetaldehyd,…

– Sự tạo thành glycerin

Trong điều kiện bình thường, khi pH của môi trường từ 4-5 thì sự lên men đượcgiải thích bằng phương trình tổng quát sau:

C6H12O6 CH3CHO + CO2 +C3H8O3(glycerin)

Còn khi pH > 7 thì sản phẩm tạo ra như sau:

C6H12O6 CH3CHO + O2 +C3H8O3 + C2H5OH

– Sự tạo thành acid hữu cơ

Trong quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acetic, lactic,citric, pyrovic và succinic nhưng nhiều nhất là acetic và lactic, axit acetic bị mất hydro vàngưng tụ tạo thành axit succinic

– Sự tạo thành este

Cùng với sự tạo thành axit, alcol, dưới tác dụng của enzym esterase của nấm men,các axit và alcol sẽ tác dụng với nhau để tạo thành những este tương ứng Được viết dướidạng tổng quát như sau:

R1CH2OH + R2COOH R2COOCH2R1 + H2O

Ngoài ra trong quá trình lên men còn tạo ra các sản phẩm phụ khác như: aceton,diacetyl và 2,3-butanol (Lê Cảnh Tuấn, 2009)

2.3.5 Tình hình nghiên cứu nước giải khát và nước giải khát lên men

nước giải khát là loại đồ uống đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con người,ngoài việc cung cấp cho con người một lượng nước đáng kể, nó còn bổ sung cho cơ thểmột lượng lớn các chất dinh dưỡng, các loại muối khoáng, cung cấp nguồn năng lượnglớn cho cơ thể Vì vậy nước giải khát trở thành nhu cầu tất yếu của con người

2.3.5.1 Tình hình sản xuất nước giải khát trên thế giới

Ngày nay khi đời sống con người ngày càng được nâng cao thì nhu cầu sử dụngnước giải khát ngày càng tăng và đang chuyển dần từ loại nước giải khát pha chế truyềnthống sang sử dụng các loại nước giải khát có chứa nhiều chất dinh dưỡng được sản xuất

từ các loại trái cây Đây được coi là mặt hàng chiến lược chủ yếu của thế kỷ XXI, nhiềuquốc gia như Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Hà Lan, Đức… đã và đang tập trung nghiên cứu vàsản xuất được nhiều loại nước giải khát từ trái cây có chất lượng cao phù hợp với nhu cầungày càng cao của khách hàng

Cho đến nay đã có một số sản phẩm nước giải khát từ trái cây không cồn như:Bluebird, Treetop…được sản xuất tại bang Florida (Mỹ), làm từ 100% dịch trái nho, táo

Một số sản phẩm nước giải khát có cồn cũng được sản xuất như Arbor Mist, độ cồn 6%,hàm lượng đường khoảng 12 – 15%, chứa nhiều loại vitamin và muối khoáng thiết yếu.

2.3.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất nước giải khát tại Việt Nam

Việt Nam có khí hậu nóng nên nhu cầu sử dụng nước giải khát là rất lớn, mặc dùcho đến nay đã có một số công ty nước ngoài được cấp giấy phép đầu tư và sản xuất nướcgiải khát từ trái cây của Việt Nam, nhưng mức tiêu thụ nước giải khát bình quân của nước

ta vẫn còn khá thấp so với các nước khác, trong khi nguồn nguyên liệu để sản xuất lại vôcùng phong phú, đa dạng

Nước giải khát lên men từ dịch trái cây không qua chưng cất, có độ cồn thấp làloại nước uống tự nhiên có lợi cho sức khoẻ vì có chứa nhiều chất dinh dưỡng của tráicây, phù hợp với nhiều lứa tuổi người tiêu dùng

Hiện nay trong nước đã có một số nghiên cứu về sản xuất các loại nước giải khátlên men từ trái cây như nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ chanh dây (LêCảnh Tuấn, 2009), nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ ổi (Phạm Ngọc Tuấn,2009), nghiên cứu sản xuất nước táo lên men có bổ sung caramen (Phạm Thị Khuyên, 2010)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Viện Công Nghệ Sinh học và Môi Trường – Đại họcNông Lâm TPHCM trong khoảng thời gian gần 4 tháng từ 28/02/2011 đến 24/06/2011

 Hoá chất xác định hàm lượng acid tổng

Dung dịch chuẩn NaOH 0,1N

Chỉ thị phenolphtalein, chỉ thị metylen xanh, chỉ thị hồ tinh bột

– Bồn ủ nhiệt Memmert

– Cần điện tử 2 số OHAVS (Golo Series)

– Cân điện tử 4 số Precisa XT220A

– Máy khuấy từ BIBBY

– Máy đo pH ORION 3 STAR

Sử dụng các dụng cụ thường có ở phòng thí nghiệm như bình tam giác, pipet,buret, nhiệt kế, cồn kế…

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập nấm men

Phân lập nấm men là quá trình tách nấm men từ quần thể ban đầu và đưa về dạngthuần khiết

3.3.1.1 Quy trình phân lập nấm men

Hình 3.1 Quy trình phân lập nấm men từ trái dâu tằm

Giữ giống trong ống thạch nghiêng

Chọn và rửa sạch dâu

Lên men (2 – 3 ngày)

Lắc tăng sinh trong 1 giờ (370C)

Pha loãng trong nước muối sinh lý

Phân lập

Làm thuần

3.3.1.2 Thuyết minh quy trình

 Chọn và rửa sạch dâu: Chọn một vài quả dâu đã đạt đủ độ chín kỹ thuật, không

bị dập nát, không có mùi lạ, đem rửa sạch vài lần với nước thường rồi ngâm với một ítnước muối để hạn chế sự phát triển của nấm mốc Sau đó vớt ra để ráo nước

 Lên men yếm khí: Dâu đã được rửa sạch cho vào một hũ nhựa nhỏ, bổ sung thêm

đường rồi đậy kín Cho lên men ở nhiệt độ thường trong 36-48 giờ

 Lắc tăng sinh: Trước khi phân lập, mẫu nấm men phải được chuyển về dạng lỏng.

Nhưng thay vì phải đồng nhất mẫu bằng cách nghiền nát, dịch lên men sẽ được chiết ra,lấy 1 ml pha loãng trong 99 ml môi trường peptone đệm (độ pha loãng 10-2), rồitiến hành lắc tăng sinh ở 370C trong 1 giờ để nấm men thích ứng với môi trường mới

 Pha loãng: Dịch tăng sinh được pha loãng dần vào các ống nghiệm chứa nước

muối sinh lý để được các nồng độ pha loãng khác nhau

Thao tác: Ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý được hấp khử trùng ở 1210Ctrong 20 phút, sau đó để nguội Dùng pipetman hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào ốngnghiệm thứ nhất để có độ pha loãng 10-3, trộn đều hỗn hợp trong ống nghiệm, sau đó tiếptục hút 1 ml trong ống thứ nhất chuyển qua ống thứ hai để có được độ pha loãng 10-4, tiếnhành tương tự với các độ pha loãng tiếp theo

 Phân lập:

- Cấy trang: thực hiện cấy vào đĩa petri có chứa môi trường Hansen

Cấy trang là thao tác đầu tiên trong quá trình phân lập, nhằm tạo ra khuẩn lạc đơntrên bề mặt thạch, các khuẩn lạc đơn này tiếp tục được làm thuần trong các bước tiếp theocủa quá trình phân lập Số lượng khuẩn lạc đơn sau khi cấy trang càng nhiều thì côngđoạn làm thuần sẽ càng dễ thực hiện

Thao tác: Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịchpha loãng lên bề mặt môi trường trong đĩa petri Nhúng đầu que trang (que trải) thuỷ tinhvào cồn 700, hơ qua ngọn lửa rồi để nguội trong khoảng không gian vô trùng của ngọnlửa Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trang lên bề mặt thạch, dùng đầu gạt xoay, trải dịchgiống lên bề mặt thạch Sau khi trang đều, rút que trang ra khỏi đĩa, đậy đĩa và gói lạibằng giấy báo hoặc bao nilon Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng 36 – 48 giờ

Cấy ria được tiến hành 3 – 4 lần để đảm bảo chủng nấm men thu được là thuầnkhiết Quan sát khuẩn lạc trên bề mặt đĩa, nếu xuất hiện đa số khuẩn lạc đơn có hình dạnggiống nhau, màu sắc đồng đều thì chứng tỏ chủng nấm men đã thuần khiết.

- Cấy chấm: Bước cuối cùng trước khi chuyển nấm men vào ống giữ giống Cấychấm nhằm mục đích tạo thành các khuẩn lạc đơn có số lượng lớn nấm men, thuận tiệncho việc quan sát, định danh và giữ giống

Thao tác: Tăm tre bình thường được làm tù một đầu, đem hấp khử trùng ở 1210Ctrong 20 phút Thao tác vô trùng thu giống bằng đầu được làm tù của que tăm, chuyển quamột đĩa môi trường khác, chấm nhẹ lên bề mặt thạch (chấm 3 chấm hoặc 9 chấm), gói đĩapetri rồi đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 36 – 48 giờ

 Giữ giống: Có thể tiến hành giữ giống nấm men trong ống thạch nghiêng hoặc

trong đĩa petri được dán kín bằng paraffin Giữ giống giúp bảo quản chủng nấm men lâudài, không bị nhiễm các chủng nấm men lạ, nấm mốc và các vi sinh vật khác Tuy nhiên,sau một thời gian giữ giống phải cấy chuyền để đảm bảo chủng nấm men không bị thoái hoá

Thao tác: Đổ các ống thạch nghiêng chứa môi trường Hansen, sử dụng que cấyvòng thu giống trong đĩa petri, sau đó cấy ziczac lên môi trường bên trong ốngnghiệm, hơ đầu ống nghiệm, đậy nút bông, bọc kín đầu ống nghiệm bằng parafin.Giữ giống trong điều kiện lạnh 8-100C

3.3.2 Nghiên cứu sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

3.3.2.1 Quy trình dự kiến sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

Dâu tằm(tươi, ít dập nát)

Rửa, phân loại

Ủ

Ép lấy dịch

Phối chếNấm men

Thanh trùng(620C, 20 phút)

Lên men

Xử lý sau lên men(làm trong, điều vị)

Thanh trùng(60-630C, 20 phút)

Chiết chai(thuỷ tinh 330 ml)

Bảo quản trong tủ lạnh

Hình 3.2 Quy trình dự kiến sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

Tăng sinh

T0= 40 – 420C

T = 2 giờ

EnzymePectinase

Đường

Na2CO3Acid citric

 Thuyết minh quy trình

Nguyên liệu là một trong các yếu tố quan trọng quyết định đến chất lượng sảnphẩm vì vậy việc lựa chọn nguyên liệu để tiến hành lên men là một khâu hết sức quantrọng Dâu tằm được mua tại Đà Lạt, Lâm Đồng, phải đảm bảo dâu mới được hái, chấtlượng dâu tốt, ít quả dập nát, trong quá trình vận chuyển dâu được để trong các thùng xốpthoáng khí để hạn chế dập quả Dâu sau khi vận chuyển phải được phân loại và rửa ngay,loại bỏ những quả dập nát và những quả chưa đủ độ chín kỹ thuật, rửa bằng nước 2 – 3lần, có thể ngâm với một ít nước muối loãng để hạn chế nấm mốc, sau đó để ráo nước.Quá trình phân loại và rửa cần phải được tiến hành nhanh để tránh hiện tượng oxy hoá.Sau khi rửa dâu được mang đi bổ sung enzyme pectinase và ủ ngay trong khoảng thờigian 2 giờ ở 40 – 420C Ủ với enzyme pectinase nhằm tăng hiệu suất ép dịch, làm giảm độnhớt của dịch lên men, tăng chất lượng của dịch ép cả về mặt hoá lý lẫn cảm quan Về hoá

lý là hàm lượng đường nhiều hơn do quá trình thuỷ phân pectin tạo đường đơn Về cảmquan là dịch trong, màu đẹp, tươi hơn so với dịch ban đầu

Sau khi ủ, tiến hành ép để lấy dịch quả, dịch quả sau khi ép được lọc qua 3 – 4 lớpbông gòn và vải lọc xen kẽ để loại bỏ bớt cặn Phối chế là công đoạn điều chỉnh nồng độchất khô bằng cách bổ sung đường sacaroze, điều chỉnh pH bằng cách bổ sung Na2CO3

hoặc acid citric Thanh trùng nhằm diệt một số vi sinh vật có hại cho nấm men, đặc biệt lànấm mốc Tiến hành thanh trùng ở 620C trong 20 phút

Để nguội dịch, sau đó tiến hành bổ sung nấm men để lên men ngay, tránh sự pháttriển của các vi sinh vật gây hại, thao tác bổ sung nấm men phải được thực hiện bên ngọnlửa đèn cồn để hạn chế tạp nhiễm

Tiến hành lên men 2 – 3 ngày, dịch dâu tằm sau khi lên men cần phải được làmtrong và điều vị để có thể đảm bảo về mặt cảm quan Làm trong bằng cách để lắng sau đótiến hành lọc bằng vải lọc Điều vị sản phẩm bằng syrup đường Syrup đường được làmnhư sau: Nước và đường được phối trộn với tỉ lệ 1/7 sau đó đem đun sôi trong 10 phút

Để nguội về 700C rồi tiếp tục bổ sung acid citric theo tỉ lệ nước/acid citric: 200/1 (g/g)nhằm để điều hoà vị Tiếp tục đun sôi dịch tiếp trong vòng 10 phút nữa để hoà tan các