KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL VÀ MENTHONE Ở GIỐNG BẠC HÀ CHÂU Á (Mentha arvensis L.) ĐÃ ĐƯỢC CHIẾU XẠ VÀ CHIẾT XUẤT MENTHOL TRONG TINH DẦU BẠC HÀ

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm khảo sát những ảnh hưởng của chiếu xạ đến hàm lượng tinh dầu và menthol trong tinh dầu bạc hà Á Đề tài bao gồm những nội dung sau: tiến hành tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL VÀ

MENTHONE Ở GIỐNG BẠC HÀ CHÂU Á (Mentha arvensis L.)

ĐÃ ĐƯỢC CHIẾU XẠ VÀ CHIẾT XUẤT MENTHOL

TRONG TINH DẦU BẠC HÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL VÀ

MENTHONE Ở GIỐNG BẠC HÀ CHÂU Á (Mentha arvensis L.)

ĐÃ ĐƯỢC CHIẾU XẠ VÀ CHIẾT XUẤT MENTHOL

TRONG TINH DẦU BẠC HÀ

H ướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện:

TS TRẦN THỊ LỆ MINH TRƯƠNG THỊ TUYẾT TRINH ThS TRỊNH THỊ PHI LY

Tháng 7/2011

 TS Trần Thị Lệ Minh, ThS Trịnh Thị Phi Ly đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

 Các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường trường Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

 Bạn Lucile Manon đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận

 Toàn thể các bạn lớp DH07SH đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm đề tài tốt nghiệp

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình đã luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Chân thành cảm ơn

Tháng 7 năm 2011

Trương Thị Tuyết Trinh

TÓM TẮT

Hiện nay, tinh dầu là nguồn nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp và cũng là nguồn nguyên liệu xuất khẩu có giá trị cao ở nhiều nước trên thế giới, trong đó tinh dầu được

chiết xuất từ cây bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L) đang rất được ưa chuộng do

chúng có nhiều công dụng Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về tinh dầu và những hợp chất thứ cấp trong tinh dầu bạc hà Á và gần đây đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của chiếu xạ lên cây bạc hà Á Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm khảo sát những ảnh hưởng của chiếu xạ đến hàm lượng tinh dầu và menthol trong tinh dầu bạc hà Á

Đề tài bao gồm những nội dung sau: tiến hành trồng và khảo sát các chỉ tiêu sinh trưởng

về số lá, số cành, chiều cao của cây bạc hà chiếu xạ và cây bạc hà không chiếu xạ (cây đối chứng), so sánh hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol và menthone trong cây chiếu xạ và cây không chiếu xạ, tinh sạch menthol trong tinh dầu bạc hà bằng phương pháp làm lạnh và phương pháp sử dụng dung môi

Cây bạc hà chiếu xạ tăng trưởng về số lá, số cành, chiều cao nhanh hơn so với bạc hà cây đối chứng Hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong tinh dầu của cây chiếu

xạ cũng cao hơn cây đối chứng Và phương pháp làm lạnh là tốt nhất để tinh sạch menthol trong tinh dầu bạc hà

SUMMARY

Currently, essential oil is the raw material of many industries and it is also the high value materials for export in the world, in which the essential oil from the mints

(Mentha arvensis L ) are very popular and useful The world studied more about

essential oil and secondary compounds in mint oil and recently it has been several

studies on the effects of radiate to the mints (Mentha arvensis L ) So we made this

experiment to study the effects of radiate to mints oil and menthol in the mints oil

The goal of experiment: Surveying on the growth of the leaves, branches and body height of the radiation mints, study essential oil in the radiation mints and the control mints by the steam distillation, quantiative the yeild of menthol, menthone

in the radiation mints and the control mints by Gas chromatography, isolation menthol in the essential oil by cooling method and using solvent method

The radiation mint growth for leaf number, branch number, body height more than the control mints Essential oil, menthol and menthone is also higher than the control mint The cooling method is best for isolation menthol in the essential oil

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung của đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây bạc hà châu Á (Mentha arvensis Linn) 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật học 3

2.1.3 Đặc điểm sinh vật học 4

2.1.4 Kỹ thuật trồng và thu hoạch 6

2.2 Tinh dầu 7

2.2.1 Giới thiệu về tinh dầu bạc hà 7

2.2.2 Thành phần hóa học trong tinh dầu bạc hà châu Á (Mentha arvensis Linn) 8

2.2.3 Phương pháp chưng cất hơi nước 10

2.2.4 Công dụng của tinh dầu bạc hà 12

2.3 Giới thiệu về sắc ký khí (GC) và sắc ký lớp mỏng (TLC) 12

2.3.1 Sắc kí khí (GC) 12

2.3.2 Sắc kí lớp mỏng (TLC) 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 14

3.2 Đối tượng thí nghiệm 14

3.3 Hóa chất thiết bị 14

3.4 Nội dung nghiên cứu 15

3.4.1 Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển ở cây bạc hà đối chứng và cây bạc hà đã được chiếu xạ 15

3.4.2 Xác đinh hàm lượng tinh dầu ở cây bạc hà đối chứng và cây bạc hà chiếu xạ bằng phương pháp chưng cất hơi nước 16

3.4.3 Xác định hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bạc hà bằng sắc ký khí 19

3.4.4 Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà 19

3.5 Phương pháp xử lí số liệu 21

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1.Khảo sát chỉ tiêu sinh trưởng của giống bạc hà Châu Á đã được chiếu xạ 22

4.2 Xác định hàm lượng tinh dầu ở giống bạc hà Châu Á đã được chiếu xạ bằng phương pháp chưng cất hơi nước 24

4.3 Xác định hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bằng sắc ký khí 25

4.4 Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà Á 27

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 Kết quả trắc nghiệm thống kê so sánh về chỉ tiêu chiều cao thân, số lá, số

cành của cây bạc hà Châu Á đã được chiếu xạ sau 70 ngày trồng……… 22

Bảng 4.2 Kết quả hàm lượng tinh dầu trong cây bạc hà Á đã được chiếu xạ………….24

Bảng 4.3 Kết quả đường chuẩn menthol trong tinh dầu bạc hà Á bằng sắc kí khí…….25

Bảng 4.4 Kết quả đường chuẩn menthone trong tinh dầu bạc hà Á bằng sắc kí khí… 25

Bảng 4.5 Kết quả hàm lượng (%) menthol, menthone trong tinh dầu cây bạc hà Á đã được chiếu xạ bằng sắc kí khí……….26

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Mentha arvensis Linn 3

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của menthol 9

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của menthone 10

Hình 3.1 Khay đất ươm bạc hà Á 16

Hình 3.2 Cây bạc hà Á ngoài đồng ruộng 16

Hình 3.3 Tinh dầu bạc hà 17

Biểu đồ 4.1 Sự tăng trưởng số lá của cây bạc hà Á đã được chiếu xạ 22

Biểu đồ 4.2 Sự tăng trưởng số cành của cây bạc hà Á đã được chiếu xạ 22

Biểu đồ 4.3 Sự tăng trưởng chiều cao của cây bạc hà Á đã được chiếu xạ 23

Biểu đồ 4.4 Đường chuẩn menthol trong mẫu tinh dầu 25

Biểu đồ 4.5 Đường chuẩn menthone trong mẫu tinh dầu 26

Biểu đồ 4.6 So sánh hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bạc hà Châu Á cây chiếu xạ và cây đối chứng 27

Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích tinh dầu 18

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Tinh dầu là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất dễ bay hơi, thường ở thể lỏng ở nhiệt độ phòng, có mùi đặc trưng tuỳ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu Phần lớn tinh dầu có nguồn gốc từ thực vật, chỉ có một số ít có nguồn gốc từ động vật (cầy hương, chồn hôi, cá voi…)

Ở thực vật, tinh dầu được tạo ra và tích trữ trong các mô có vai trò dẫn dụ côn trùng đến giúp cho hoa thụ phấn, góp phần bảo vệ cây chống lại sự xâm nhiễm của nấm mốc, vi sinh vật và hỗ trợ cho sự phát triển của cây

Trước đây, tinh dầu đơn thuần chỉ được xem như một nguồn dược liệu Nhưng hiện nay, tinh dầu đã được con người khai thác một cách triệt để hơn, do đó chúng có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như: thực phẩm, hoá mỹ phẩm… Một

số tinh dầu đang được sử dụng nhiều hiện nay là: tinh dầu hoa hồng, tinh dầu tràm, tinh dầu quế, tinh dầu cam chanh,… Trong đó, tinh dầu bạc hà từ cây bạc hà châu Á

(Mentha arvensis L.) đang rất được quan tâm

Do tinh dầu bạc hà và menthol trong tinh dầu có rất nhiều ứng dụng trong cuộc sống nên vấn đề đặt ra ở đây là làm sao phải gia tăng được hàm lượng tinh dầu và hàm lượng menthol trong cây bạc hà Và gần đây đã có nhiều báo cáo thành công cho thấy chiếu xạ có ảnh hưởng đến khả năng sản xuất hợp chất thứ cấp trong cây bạc hà

Dựa trên những cơ sở đó và được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm TPHCM và với sự hướng dẫn của cô Trần Thị Lệ Minh, chúng tôi tiến hành đề tài “ Khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone ở giống

bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.) đã được chiếu xạ và tinh sạch menthol trong tinh

dầu bạc hà”

1.3 Nội dung của đề tài

Khảo sát và so sánh sự sinh trưởng và phát triển ở cây bạc hà chiếu xạ và cây bạc hà đối chứng

So sánh hàm lượng tinh dầu trong cây chiếu xạ và cây đối chứng bằng phương pháp chưng cất hơi nước

Sử dụng sắc kí khí để định lượng hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu ở cây chiếu xạ và cây đối chứng

Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà bằng phương pháp làm lạnh và phương pháp sử dụng dung môi

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây bạc hà châu Á (Mentha arvensis Linn)

Loài: Mentha arvensis

Tên khoa học: Mentha arvensis L Hình 2.1: Mentha arvensis L

Tên khác: Bạc hà nam – Nhân đơn thảo (Trung Quốc), Mentha (Pháp), Peppermint (Anh)

2.1.2 Đặc điểm thực vật học

Rễ Bạc hà: thuộc loại rễ chùm, mọc từ các đốt thân ngầm dưới mặt đất và phân

bố ở tầng đất có độ sâu 20 - 30 cm Rễ bạc hà thích hợp với độ ẩm khá cao khoảng 70-80% nhưng chúng không chịu được ngập úng Thân ngầm không chứa tinh dầu

Thân, cành Bạc hà: thân bạc hà là thân thảo, thân và cành có nhiều đốt, các đốt ở thân, cành có khả năng phát sinh thành rễ và phát sinh các mầm cành thứ cấp tại các mắt đốt Chiều cao của cây biến động trung bình từ 0,6 -1,2 m và là cây trồng một năm Màu sắc của thân cành bạc hà tùy thuộc vào giống (xanh đậm, xanh nhạt hoặc tím) Thân chứa hàm lượng tinh dầu tương đối thấp khoảng 0,3% tỉ lệ tinh dầu

Lá Bạc hà: là lá đơn, mọc đối trên thân, có màu xanh hoặc đỏ tím, lá có hình trứng, bầu dục cân đối hay thon dài, đầu lá nhọn Mép lá có răng cưa và cả mặt trên và

lá đều có lông, mức độ nhiều hay ít là tùy vào giống Chiều dài lá 4 - 8 cm, rộng 2 - 4

cm, phía trên và phía dưới bề mặt lá đều có chứa tinh dầu Lá là nguyên liệu chính để chưng cất tinh dầu chiếm khoảng 2,4 - 2,7 % tỉ lệ tinh dầu

Hoa Bạc hà: là loại hoa chùm, hoa lưỡng tính nên có các bộ phận như đài, cánh hoa, nhị và nhụy Đài có 5 cánh đối xứng hai bên, mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ Chiếm khoảng 4 - 6 % tỉ lệ tinh dầu

ra

Trong thời kì này phải chú ý về dinh dưỡng, phải giảm đạm, tăng lượng phân lân, các yêu cầu về ánh sáng, nhiệt độ trong giai đoạn này đòi hỏi cao nhất

 Thời kì nở hoa

Thời kì ra hoa cây bạc hà đạt khối lượng chất xanh và hàm lượng tinh dầu cao nhất (trong một ngày có thể tạo ra 280 kg chất xanh/ha) Vào thời kì hoa nở 50% trên đồng ruộng là lúc hàm lượng tinh dầu trong cây đạt cao nhất, đây là thời điểm thu hoạch tốt nhất Nếu hoa nở 100% thì năng xuất tinh dầu giảm do lá rụng bớt đi

Trong thời kì này chú ý đến các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ cao, gió mạnh, khô hạn, úng sẽ làm cho hàm lượng tinh dầu giảm

2.1.3.2 Yêu cầu sinh thái của cây bạc hà

 Nhiệt độ

Cây bạc hà sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ từ 18 – 270

C, tròn thời kì ra hoa nhiệt độ thích hợp nhất là từ 25 – 270C Tuy nhiên trong điều kiện nhiệt

độ > 100C cây vẫn có thể sinh trưởng được Trong thời kì tiềm sinh, bạc hà có thể chịu đựng được nhiệt độ rất thấp dưới -10C Như vậy tùy theo nhiệt độ trong vùng trồng mà người ta bố trí thời vụ cho thích hợp Thời gian sinh trưởng của cây bạc hà từ 80 – 90 ngày khi nhiệt độ trung bình từ 18 – 190

C và 90 – 100 ngày khi nhiệt độ trung bình từ

15 – 160C Vì vậy để có sinh khối về tỉ lệ tinh dầu cao cần bố trí thời vụ thích hợp

 Ẩm độ

Cây bạc hà không yêu cầu độ ẩm một cách nghiêm ngặt, tuy nhiên trồng để đạt năng suất cao về chất xanh và tỉ lệ tinh dầu nên chú ý và coi trọng vấn đề tưới tiêu nước, do rễ bạc hà phát triển ở trên tầng đất mặt nên sức hút nước và dinh dưỡng, kém hơn so với các loại cây trồng khác Tưới tiêu, giữ ẩm là cơ sở cho việc tạo năng suất cao của cây bạc hà, trong một chu kì sinh trưởng bạc hà cần lượng nước 5700 m3

giờ, cây sẽ sinh trưởng yếu và không nở hoa Cây bạc hà là cây ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng trực xạ Trong quá trình trồng bạc hà phải chú ý đến thời vụ trồng mật độ trồng, không trồng xen kẽ để dảm bảo ánh sáng hợp lí cho chúng sinh trưởng và phát triển tốt

 Đất đai và dinh dưỡng

 Đất đai

Cây bạc hà ưa đất tơi xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng, giữ nước

và thoát nước tốt Các loại đất phù sa ven sông suối,các loại đất đen có tầng canh tác tương đối dày, mực nước ngầm thấp thích hợp cho cây bạc hà

Độ pH thích hợp cho cây bạc hà là 6 – 7,5, trên các loại đất trồng liên tục từ 2 –

3 năm nên phá đi để trồng lại, nên tiến hành luân canh với các loại cây trồng khác để giảm tỉ lệ sâu bệnh hại, không ảnh hưởng đến năng suất

 Dinh dưỡng

Trong từng giai đoạn sinh trưởng bạc hà cần lượng dinh dưỡng khác nhau Chú ý bón phân vào các thời kì: khi cây cao 10 cm, khi phân cành và khi nụ hoa bắt đầu phát sinh Nguyên tố kali cần bón kết thúc sớm (vào lúc cây phân cành) để không ảnh hưởng đến quá trình tích lũy tinh dầu

2.1.4 Kỹ thuật trồng và thu hoạch

2.1.4.1 Kỹ thuật trồng

Phương pháp nhân giống chính áp dụng trong trồng bạc hà là nhân giống vô tính, thường sử dụng thân ngầm để trồng, ngoài ra có thể dùng thân giải bò, thân non đem trồng

Thân ngầm dùng để nhân giống phải có màu trắng hoặc xanh nhạt, các đốt ngắn, đường kính đốt lớn (khoảng 5mm), chiều dài hom 60 -70 cm, rửa sạch cắt thành từng đoạn ngắn 15 – 20 cm đem đi trồng

Trước khi trồng nên xử lí bằng cách ngâm vào dung dịch CuSO4 nồng độ 5 % trong thời gian 15 phút để diệt các loại nấm bệnh

Tốt nhất nên trồng bạc hà vào mùa xuân và trồng theo luống để chủ động trong việc tưới và thoát nước Chiều rộng của luống 1,5 – 2 m, rãnh sâu 20 cm, chiều dài luống tối đa 30 m, trồng hàng cách hàng 30 - 35 cm, cây cách cây 10 - 12 cm

Khối lượng chất xanh của cây bạc hà rất lớn, cho nên cây bạc hà yêu cầu lượng phân lớn và đa dạng về chủng loại phân bón như phân hữu cơ, các loại vô cơ, phân đa lượng, trung lượng và vi lượng

Cần tưới nước và giữ ẩm sau khi trồng cũng như suốt thời gian sinh trưởng Cây rất kị úng vì vậy cần phải thoát nước tốt vào mùa mưa và chú ý phải làm sạch cỏ thường xuyên

2.1.4.2 Thời điểm và phương pháp thu hoạch

Bạc hà trồng 2 – 3 tháng có thể thu hoạch Dùng liềm cắt sát gốc, thu hoạch toàn

bộ thân lá để cất lấy tinh dầu Cây thu hoạch xong cần chuyển ngay đến nơi cất tinh dầu Nếu chưa kịp cất tinh dầu ngay thì cần trãi mỏng ở những nơi râm mát, tuyệt đối không đánh đống hoặc bó chặt cây sẽ làm tăng độ ẩm nóng, cây dễ bị thối hỏng, tinh dầu giảm sút nghiêm trọng Phơi nắng hàm lượng tinh dầu cũng bị giảm sút

Để có năng suất cao và phẩm chất tinh dầu tốt thì phải thu hoạch đúng thời vụ, chứng cất kịp thời Để thu hoạch bạc hà đúng lúc người ta dựa vào căn cứ sau:

Tùy thuộc từng giống mà có thời điểm thu hoạch thích hợp, có giống khi hoa nở

50 % thì hàm lượng tinh dầu cao nhất, cũng có những giống hoa nở 70% thì hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất

Tùy thuộc vào thời tiết, tuổi cây, nên thu hoạch vào lúc nắng ấm và khô sương

2.2 Tinh dầu

2.2.1 Giới thiệu về tinh dầu bạc hà

Tinh dầu là chất lỏng không màu hay vàng nhạt, có mùi thơm đặc biệt, vị cay, rất

dễ tan trong dung môi ethanol 900, tan trong 2 - 3 thể tích ethanol 700

 Tính chất vật lý

- Lỏng ở nhiệt độ thường, có mùi thơm không màu hoặc màu nhạt

- Chỉ số khúc xạ cao, có năng suất quay cực

- Ít tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ, este, cồn, có tính sát trùng

mạnh

- Tinh dầu là một hỗn hợp nên không có một độ sôi nhất định và chỉ số

khúc xạ, chỉ số quay cực thay đổi trong phạm vi nhất định

- Dễ bay hơi, khuếch tán mạnh ở nhiệt độ bình thường

- Tỷ trọng đa số là nhẹ hơn nước (Bạc hà, Sả, Cam, Chanh, Quýt, Bưởi)

Một số tinh dầu nặng hơn nước (Quế, Hương lài, Đinh hương)

- Tinh dầu dễ bị biến mùi khi có tác động của ánh sáng, nhiệt độ

 Tính chất hóa học

Một số tinh dầu chỉ có một hợp chất như: Tinh dầu Mơ, hạt Đào, hạt Cải

Nhưng phần lớn tinh dầu là hỗn hợp của nhiều hợp chất với những tỉ lệ thay đổi,

thành phần quan trọng nhất (về phương diện thơm) có khi chỉ ở một tỉ lệ rất thấp

Một số hợp chất gặp trong thành phần tinh dầu:

- Hydrocarbon: Cacbur tecpenic (chiếm nhiều nhất), camphen, pinen, limonen,

caryophyllen, cacbur no: heptan, parafin

- Rượu: Menthol, rượu methylic, ethylic, xinamic, xitronellol, geraniol, tecpineol, linalol, santatlol, xeneol

- Phenol và este phenolic: Anetol, eugenol, safrol, apiol, timol

- Andehyde: Xiamic, salyxilic, xitral

- Xeton: Comfo, thuyon, menthone

- Acid (dưới dạng este): Acetic, butyric, benzoic xinamic, saliailic (Nguyễn

Kim Phi Phụng, 2009)

2.2.2 Thành phần hóa học trong tinh dầu bạc hà châu Á (Mentha arvensis Linn)

Thành phần các chất các chất có trong tinh dầu bạc hà Mentha arvensis Linn: α –

pinene 0,13%, β – terpinene 0,09%, β – pinene 0,19%, β – myrcene 0,17%, 3 – octanol 0,66%, limonene 0,51%, eucalyptol 0,09%, terpineol Z – β 0,05%, isopulegol 0,43%, menthone 8,09%, isomenthone 1,64%, neomenthol 1,91%, menthol 80,92%,

isomenthol 0,13%, α – terpineol 0,16%, pulegone 0,48%, piperitone 0,6%, thymol 0,4%, β – bourbonene 0,11%, caryophyllene 0,84%, α – caryophyllene 0,11%, germacrene D 0,99%, β – bisabolene 0,7% (Nguyễn Trung Tín, Nguyễn Phương Vỹ, 2008)

Thành phần chủ yếu trong tinh dầu bạc hà là menthol và menthone

 Menthol

Menthol C10H19O là một terpenoid, ở trạng thái rắn trong điều kiện nhiệt độ phòng, không màu, trong suốt, không tan hoặc ít tan trong nước, nhưng tan trong dung môi hữu cơ Menthol trong tinh dầu chủ yếu ở trạng thái tự do nhưng một phần ở dạng kết hợp với acid acetic – dạng este Cả dạng este và dạng tự do cộng lại gọi là menthol toàn phần Trong công thức cấu tạo, menthol có chứa nhóm chức _OH vì vậy menthol cũng có những tính chất hóa học giống như rượu thường (Nguyễn Trần Lâm Thanh, 2010)

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của menthol

 Menthone

Menthone là một hợp chất hữu cơ có công thức phân tử C10H8O, là một monoterpen có công thức cấu tạo tương tự với menthol, chỉ khác nhau ở nhóm chức _OH được thay thế bằng oxi

Menthone được tổng hợp bằng cách nung nóng menthone với acid chromic

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của menthone

2.2.3 Phương pháp chưng cất hơi nước

Phương pháp chưng cất hơi nước dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao

Dựa trên thực hành người ta chia các phương pháp cưng cất hơi nước ra ba loại chính: chưng cất bằng nước, chưng cất bằng nước và hơi nước, chưng cất bằng hơi nước

2.2.3.1 Phương pháp chưng cất bằng nước

Nước được phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối lớn phía trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống hoàn lưu

Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này Những cấu phần

có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này

2.2.3.2 Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước

Trong phương pháp này, nguyên liệu được xếp lên trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được đổ nước sao cho nước không chạm đến vỉ Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt

trực tiếp hoặc dùng hơi nước từ nồi hơi dẫn vào lớp bao chung quanh phần đáy nồi Ta

có thể coi phương pháp này là một trường hợp điển hình của phương pháp chưng cất bằng hơi nước với hơi nước ở áp suất thường Như vậy chất nhưng tụ sẽ chứa ít sản phẩm phân hủy hơn trường hợp chưng cất bằng hơi nước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao hay hơi nước quá nhiệt

Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường hợp này quan trọng hơn nhiều so với phương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp chỉ bằng cách xuyên qua nó nên phải sắp xếp thế nào cho chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt Muốn vậy thì chất nạp nên có kích thước đồng đều không sai biệt nhau quá

Nếu chất nạp được nghiền quá mịn, nó dễ tụ lại vón cục và chỉ cho hơi nước đi qua một vài khe nhỏ do hơi nước tự phá xuyên lên Như vậy phần lớn chất nạp sẽ không được tiếp xúc với hơi nước Ngoài ra, luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có thể bị ngưng tụ và tinh dầu rơi ngược lại vào lớp nước nóng bên dưới gây hư hỏng thất thoát Do đó việc chuẩn bị chất nạp cần được quan tâm nghiêm túc và đòi hỏi kinh nghiệm tạo kích thước chất nạp cho từng loại nguyên liệu

Tốc độ chưng cất trong trường hợp này không quan trọng như trong trường hợp chưng cất bằng hơi nước Tuy nhiên tốc dộ nhanh sẽ có lợi vì ngăn được tình trạng quá ướt của chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất

Về sản lượng tinh dầu mỗi giờ được tạo ra bằng phương pháp này cao hơn so với phương pháp chưng bằng nước nhưng vẫn thấp hơn phương pháp chưng cất bằng hơi nước

2.2.3.3 Phương pháp chưng cất bằng hơi nước

Hơi nước được tạo ra từ nồi hơi (thường áp suất cao hơn không khí) được đưa thẳng vào bình chưng cất Ngày nay, phương pháp này được thường dùng để chưng cất tinh dầu từ nguyên liệu thực vật

Hơi nước dùng trong phương pháp này không được quá nóng và quá ẩm Nếu quá nóng các cấu phần có nhiệt độ sôi thấp sẽ bị phân hủy hoặc nguyên liệu bị khô quăn

khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra Nếu quá ẩm sẽ sinh hiện tượng ngưng tụ, nguyên liệu ở phía dưới sẽ bị ướt

Thực tế khi chưng cất, ta nên bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc

2.2.4 Công dụng của tinh dầu bạc hà

Cây bạc hà, tinh dầu và hoạt chất menthol trong cây bạc hà được người ta sử dụng với nhiều cách khác nhau:

Lá bạc hà giúp cho tiêu hóa, trừ co thắt, trị nôn (do có tinh dầu) Các flavanoid

có tác dụng lợi mật Trong y học cổ truyền người ta dùng bạc hà làm thuốc chữa cảm nóng, nhức đầu, ho, viêm khí quản, mụn nhọt, lở ngứa

Tinh dầu bạc hà dùng để chữa cảm lạnh nhứt đầu, chóng mặt, say tàu xe Nó còn là chất thơm trong công nghiệp thuốc lá, thuốc đánh răng, kẹo , mỹ phẩm

Menthol có tính sát khuẩn, tiếp xúc với da gây cảm giác mát và tê tại chỗ (do hiện tượng bay hơi)

2.3 Giới thiệu về sắc ký khí (GC) và sắc ký lớp mỏng (TLC)

2.3.1 Sắc kí khí (GC)

Máy sắc kí khí là một thiết bị không thể thiếu trong việc nghiên cứu về tinh dầu

Có hai loại cột được sử dụng trong các máy sắc kí khí là cột nhồi (paked column, colonne remplir) và cột mao quản (capillary column, colonne capillary) Cột mao quản

có độ phân giải tốt hơn

Nguyên tắc của sắc kí khí là mỗi cấu phần trong tinh dầu sẽ bị hấp thụ trên pha tĩnh của cột phân tích khác nhau Trên cơ sở khác nhau về thời gian lưu này mà người

ta có thể định tính và định lượng cấu tử cần nghiên cứu

Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc kí là hệ thống cột tách và detector Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào các cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc kí xảy ra ở đây, sau khi các cấu tử rời bỏ cột tách tại các thời điểm khác nhau các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín

hiệu điện, tín hiệu này được khuếch đại và xử lý trên hệ thống máy tính thành các peak khác nhau về cả chiều cao và diện tích

Trên sắc kí đồ ta thu được các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là peak Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng cho chất cần tách (định tính) còn diện tích peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu

độ di chuyển của các chất phân tách là hệ số di chuyển Rf được định tính bằng tỉ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất thử và khoảng cách di chuyển của dung môi

Rf = (khoảng cách di chuyển của chất thử)/ (khoảng cách đường di chuyển của dung môi)

Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1

Rf của chất cần phân tách bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố nên có nhiều thay đổi giữa các lần thực hiện Vì vậy nên triển khai song song với các chất chuẩn hoặc chất đối chiếu Khi đó,ta có hệ số dịch chuyển Rr Hệ số dịch chuyển tương đối Rr được xác định bằng tỉ số giữa khoảng cách di chuyển của vết chất phân tách và khoảng cách di chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với chất phân tách

Rr = (khoảng cách di chuyển của chất thử)/ (khoảng đường di chuyển của chất chuẩn)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành

3.2 Đối tượng thí nghiệm

Giống cây: Thí nghiệm được tiến hành trên giống bạc hà Á (Mentha arvensis L.) Mẫu thí nghiệm:

• Mẫu trồng ở vườn ươm: Cây bạc hà invitro 4 tuần tuổi đã được chiếu xạ trong quá trình nuôi cấy mô

• Mẫu chiết xuất tinh dầu: bao gồm lá và thân của cây bạc hà 3 tháng tuổi

Thiết bị:

• Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức)

• Bộ chưng cất hơi nước Clevenger (Ấn Độ)

• Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R – 200 – Buchi (Thụy Sĩ)

• Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Aligent technologies (Mỹ)

• Bộ dụng cụ sắc ký lớp mỏng (Đức)

3.4 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của giống bạc hà Châu Á khi được chiếu

xạ

Xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp chưng cất hơi nước

Xác định hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bằng sắc ký khí (GC) Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà bằng phương pháp sử dụng dung môi

Phương pháp trồng cây: đất trồng được phối trộn theo tỉ lệ 1:1:1 (đất: phân chuồng: tro trấu) Cây bạc hà sau khi được nuôi cấy mô, đưa ra ngoài vườn ươm và được trồng trong các khay xốp (Hình 3.1), mỗi cây cách nhau 5 – 8 cm Tưới nước phun sương ngày 2 lần sáng và chiều

Sau khoảng 3 – 4 tuần, cây con có độ cao trung bình từ 5 – 10 cm được trồng ra ngoài đồng ruộng với mật độ 10 cm/ 1cây (Hình 3.2)

Cây được tưới nước 1 lần/ 1 ngày Bón phân urê sau 14 và 28 ngày trồng, sau đó bón phân N – P – K sau 42 ngày và 56 ngày trồng

Hình 3.1 Khay đất ươm bạc hà Á Hình 3.2 Cây bạc hà Á ngoài đồng ruộng

3.4.2 Xác đinh hàm lượng tinh dầu ở cây bạc hà đối chứng và cây bạc hà chiếu xạ bằng phương pháp chưng cất hơi nước

Mục đích thí nghiệm : so sánh hàm lượng tinh dầu ở cây bạc hà đối chứng

để nguội 15 phút, lấy tinh dầu ra, khử nước bằng Na2SO4 (Sơ đồ 3.1)

Tinh dầu sau khi ly trích được bảo quản ở 40C trong các lọ thủy tinh tránh ánh sáng

Hàm lượng tinh dầu được xác định bằng công thức:

Khối lượng tinh dầu

Hàm lượng tinh dầu (%) = x 100 Khối lượng mẫu khô

Hình 3.3 Tinh dầu bạc hà

Toàn bộ mẫu bạc hà tươi (250g ) Cắt và xay nhuyễn để phá vỡ tế bào Bình cầu 2 lít + nước cất đạt 2/3 bình

Chưng cất từ 3 – 4 giờ

Để nguội trong vòng 15 phút Thu hỗn hợp nước và tinh dầu cho vào bình chiết Tráng bộ phận sinh hàn, ống hứng tinh dầu bằng dietyl ether rồi cho vào bình chiết

Lắc đều để tinh dầu tan vào dung môi dietyl ether

Để yên tách lớp trong 10 phút Hỗn hợp tách 2 lớp: lớp trên: dietyl ether + tinh dầu, lớp dưới: nước

Loại nước Loại nước dư trong hỗn hợp dietyl ether + tinh dầu bằng Na2SO4

Cô quay, loại dung môi ở áp suất thấp, nhiệt độ 40 – 500

C

Tinh dầu

Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích tinh dầu

3.4.3 Xác định hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bạc hà bằng sắc ký khí

Mục đích thí nghiệm: định lượng menhthol và menthone trong tinh dầu

Pha mẫu: tất cả các mẫu tinh dầu sau khi ly trích được pha loãng với acetone, pha loãng 1000 lần

Điều kiện phân tích: menthol và menthone trong tinh dầu bạc hà được phân tích trên hệ thống Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Aligent technologies (Mỹ)

• Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 2200

C

• Chế độ bơm mẫu chia dòng 1: 20

• Cột: ZB – 5MS: 30m x 0,25m x 0,25µm

• Khí mang He: 1,2 ml/ phút

• Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ ban đầu 90 0C, giữ trong 2 phút, sau đó

tăng 10 0C/ phút đến 180 0C, giữ trong 2 phút Thời gian tổng cộng là 15 phút

Hàm lượng menthol, menthone được tính dựa vào diện tích peak mẫu và chuẩn

Khối lượng menthol/ menthone

Khối lượng tinh dầu

3.4.4 Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà

Mục đích thí nghiệm: kết tinh menthol từ trong tinh dầu và kiểm tra độ sạch của menthol bằng sắc ký lớp mỏng

Thí nghiệm 1:

Tinh dầu được lắc với heptane và methanol trong bình chiết (1ml tinh dầu, 25ml methanol, 50 ml heptane) → dung dịch trong bình chiết chia thành 2 lớp→ loại bỏ lớp methanol (lớp bên dưới), lấy lớp heptane (lớp bên trên) → cô quay→ giữ lạnh ở - 40

C→menthol kết tinh →lọc lấy menthol→hong khô menthol ở nhiệt độ phòng