PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH

ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH

TRÊN GÀ TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG

Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ QUYÊN

Khóa học : 2007 – 2011

Tháng 07/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH

ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH

TRÊN GÀ TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG

TS NGUYỄN TẤT TOÀN PHAN THỊ QUYÊN

Tháng 07 năm 2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, bộ môn Công

Nghệ Sinh Học, Bệnh Viện Thú Y - Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM đã cho phép và tạo điều kiện, giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Nguyễn Tất Toàn và TS Nguyễn Thị Phước Ninh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập Xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô đã tận tình chỉ bảo và truyền lại những kiến thức, kinh nghiệm quí báu giúp tôi có được sự hiểu biết như ngày hôm nay

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, cổ vũ động viên của bạn bè và các anh chị trong Bệnh Viện Thú Y, Đại Học Nông Lâm TP HCM Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, những người luôn

âm thầm theo dõi và động viên, giúp tôi có thể hoàn thành tốt 4 năm đại học

Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn đối với mọi sự giúp đỡ quí báu đó Xin trân trọng cảm ơn!

TÓM TẮT

Phân lập vi khuẩn E coli từ 35 mẫu túi khí được thu thập từ những gà bệnh với

các bệnh tích khác nhau tại tỉnh Bình Dương cho kết quả dương tính với E coli là

22/34 (62,86%)

Tiến hành kiểm tra tính mẫn cảm của 22 gốc E coli phân lập được với 13 loại

kháng sinh cho thấy, đa số các gốc vi khuẩn đề kháng với ampicillin (81,82%), amoxicillin (77,27%), tetracycline (81,82%) và trimethoprim/sulphamethoxazone (72,73%) Các gốc E coli phân lập được chỉ còn nhạy cảm với norfloxacine,

tobramycin, neomycin và gentamicin với tỉ lệ 59,09 – 95,45%

Thử nghiệm độc lực của 22 gốc vi khuẩn E coli phân lập được từ gà bệnh trên

phôi trứng gà 12 ngày tuổi, cho tỉ lệ chết phôi trứng dao động trong khoảng 0 – 72% Trong đó, có 9/22 gốc cho tỉ lệ chết phôi ở mức độc lực cao (> 29%), 12/22 mẫu độc lực trung bình (10 – 29%), và 1/22 mẫu không gây chết phôi

Tiến hành chọn ra 12 gốc E coli phân lập được có độc lực từ kết quả tiêm trên

phôi trứng để tiến hành kiểm tra độc lực trên gà con 1 ngày tuổi Kết quả có 7/12 gốc

E coli thử nghiệm gây chết gà con với tỉ lệ dao động 30 - 100% Trong đó 3 gốc gây

chết 100% gà con và 5/12 gốc E coli không gây chết gà con trong 7 ngày thí nghiệm Triệu chứng bệnh E coli chỉ xuất hiện ở những lô có gà chết Tuy nhiên, bệnh tích vẫn

xuất hiện trên những lô không gây chết gà con, nhưng điểm tổn thương thấp hơn so với các lô có tỉ lệ chết gà là rất lớn

Kết quả kiểm tra 2 gene liên quan đến độc lực của E coli gây bệnh gia cầm là

fimC và iucD trên 21 gốc có độc lực bằng PCR cho thấy đa số các gốc vi khuẩn đều

mang 2 gene này Fim C được phát hiện với tỉ lệ là 100% và iucD là 90,91%

SUMMARY

Thesis title: “Isolation, Antimicrobial susceptibility pattern and determined

virulence of avian Escherichia coli pathogenic in Binh Duong provine”

Isolated E coli from 35 air sac samples were collected from the diseased chickens with different diseases in Binh Duong, produces positive for E coli is 22/34

(62.86%)

Proceed to test the sensitivity of 22 E coli isolates with 13 antibiotics showed that the majority of E coli resistant to ampicillin (81.82%), amoxicillin (77.27%), tetracycline (81.82%) and trimethoprim/sulphamethoxazone (72.73%) The E coli

isolates is only sensitive to norfloxacine, tobramycin, neomycin and gentamicin 95.45%

59.09-Experimental virulence of 22 E coli isolates from disease chickens on

12-day-old chicken eggs, mortality rate of them were isolated from 0 to 72% There were 9/22 model for embryonic mortality in the highly virulent (>29%), 12/22 in moderate virulent (10 - 29%), and 1/22 sample did not kill embryos

Twelve E coli isolates strains were picked out from the result of pathogenic in

12 day–old embryos to inject into 1 day – old chicks The result of the pathogenicity

in one-old-day chicks indicated that only 5/12 samples were recorded in 90 to 100% mortality, while 2/12 samples were in 30 - 40% motality and 5/12 samples were not

pathogenic for one-old-day chicks during the experiment Symptoms of E coli disease

only appear in the plots have dead-chickens However, the lesions still appeared on the non-lethal plots, but the lession scores is lower than in the strains had dead-chickens are great

In this study, the presence of the 2 virulence – associated genes in avian

pathogenic Escherichia coli was determined using PCR on 21 virulent samples Most

of the E coli isolates harbored two these genes FimC gene was detected in 100% and

iucD in 90,91%

M ỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu – nội dung thực hiện 2

1.2.1 Yêu cầu 2

1.2.2 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 E coli gây bệnh trên gia cầm 3

2.1.1 Lịch sử 3

2.1.2 Dịch tễ học 3

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái của E coli 3

2.1.2.2 Động vật cảm thụ 3

2.1.2.2 Chất chứa căn bệnh 4

2.1.2.3 Phương thức truyền lây 4

2.1.2.4 Triệu chứng bệnh 4

2.1.2.5 Các đặc điểm của E coli gây bệnh trên gia cầm 6

2.1.2.3 Chẩn đoán bệnh 8

2.1.2.4 Phòng ngừa và điều trị 8

2.2 Thử độc lực trên trứng gà có phôi 9

2.3 Động vật thí nghiệm 9

2.4 Kĩ thuật PCR 10

2.4.1 Nguyên tắc 10

2.4.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR 10

2.4.3 Thành phần phản ứng 10

2.4.4 Kiểm tra kết quả PCR 11

2.5 Nghiên cứu có liên quan 11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

3.1.1 Thời gian 13

3.1.2 Địa điểm 13

3.2 Đối tượng và số lượng mẫu 13

3.3 Nội dung nghiên cứu 13

3.4 Phương pháp nghiên cứu 13

3.4.1 Phân lập vi khuẩn E coli từ gà bị bệnh 14

3.4.1.1 Mục đích 14

3.4.1.3 Phương pháp tiến hành 15

3.4.2 Kiểm tra kháng sinh đồ các gốc E coli phân lập được 16

3.4.2.1 Mục đích 16

3.4.2.2 Dụng cụ và hóa chất 16

3.4.2.3 Phương pháp thực hiện 17

3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi 17

3.4.3 Thử nghiệm độc lực gốc E coli trên phôi trứng gà và gà thí nghiệm 18

3.4.3.1 Mục đích 18

3.4.3.2 Thử nghiệm độc lực gốc E coli phân lập được trên phôi trứng gà 18

3.4.3.3 Thử nghiệm độc lực gốc E coli phân lập được trên gà thí nghiệm 20

3.4.3.4 Xử lý số liệu 24

3.4.4 Phát hiện một số gene độc lực của các gốc E coli bằng kĩ thuật PCR 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli trên gà bệnh 26

4.2 Kết quả kháng sinh đồ các gốc E coli phân lập được 27

4.3 Kết quả thử nghiệm độc lực các gốc E coli trên phôi gà và gà thí nghiệm 29

4.3.1 Kết quả thử nghiệm độc lực các gốc E coli trên phôi trứng gà 29

4.3.2 Kết quả thử nghiệm độc lực gốc E coli phân lập được trên gà thí nghiệm 30

4.3.2.1 Tỉ lệ gà con chết sau khi tiêm huyễn dịch vi khuẩn 30

4.3.2.2 Triệu chứng lâm sàng của gà thí nghiệm 31

4.3.2.3 Bệnh tích đại thể 32

4.4 Kết quả kiểm tra một số gene độc lực của vi khuẩn E coli 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APEC : Avian pathogenic Escherichia coli

BA : Blood agar

BHI : Brain heart infusion

CFU : Colony – forming units

ctv : Cộng tác viên

CRD : Chronic Respiratory Disease

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate

EMB : Eosin methyl blue

EAST - 1 : E coli heat-stable enterotoxin-1

IMViC : Indol, Methyl red, Voges – Proskauer, Citrate KIA : Kligle iron agar

NA : Nutrient agar

LH : Heat – Labile toxins

ST : Heat – Stable toxins

SHS : Swollen Head Syndrome

Stx2f : Shiga Toxin 2 Variant

TAE : Tris – acetate EDTA

TBE : Tris – borate EDTA

TSH : Temperature – sensitive hemagglutinin

PCR : Polymerase chain reaction

DANH SÁ CH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực của E coli gây bệnh gia cầm 7

B ảng 3.1 Thu thập mẫu từ gà bệnh tại tỉnh Bình Dương 15

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm tiêm E coli vào trứng gà có phôi 18

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm trên gà con 1 ngày tuổi 21

Bảng 3.4 Điểm thương tổn các cơ quan trên gà nhiễm E coli 22

Bảng 3.5 Điểm triệu chứng của gà bị nhiễm E coli 23

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 24

B ảng 3.7 Trình tự các primer được sử dụng trong phản ứng PCR 25

Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25

Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli 26

Bảng 4.2 Kết quả kháng sinh đồ của các gốc vi khuẩn E coli phân lập được 27

Bảng 4.3 Kết quả tỉ lệ phôi trứng chết sau 2 ngày theo dõi 29

B ảng 4.4 Tỉ lệ chết của gà con thí nghiệm sau 7 ngày theo dõi 30

Bảng 4.5 Điểm triệu chứng trung bình các lô gà thí nghiệm 31

Bảng 4.6 Điểm bệnh tích trung bình ở một số cơ gan sau 7 ngày 33

B ảng 4.7 Tỉ lệ phát hiện gene độc lực 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Sơ đồ các bước thử nghiệm độc lực vi khuẩn E coli 14

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập vi khuẩn E coli 16

Hình 3.3 Sơ đồ thử độc lực E coli trên phôi trứng 19

Hình 3.1 Bệnh tích trên phổi sau khi nhiễm chủng APEC 22

Hình 3.2 Những thay đổi hình thái của tim khi nhiễm chủng APEC 23

Hình 3.3 Những thay đổi hình thái của túi khí khi nhiễm chủng APEC 23

Hình 4.1 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của E coli 28

Hình 4.2 Bệnh tích đại thể trên phôi gà 30

Hình 4.3 Gà có triệu chứng nhiễm E coli 32

Hình 4.4 Bệnh tích đại thể trên gà thí nghiệm 32

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli là một tác nhân gây bệnh chủ yếu trong chăn nuôi gia cầm thương mại thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, ảnh hưởng đáng kể đến tổn thất

nền kinh tế nông nghiệp E coli gây bệnh ở gà được gọi chung là E coli gây bệnh

cúm gia cầm (Avian pathogenic Escherichia coli: APEC) và có liên quan chủ yếu với nhiễm trùng ngoài đường ruột như nhiễm trùng túi khí, viêm màng ngoài tim, viêm phúc mạc, viêm vòi trứng, viêm màng hoạt dịch, viêm xương tủy, viêm mô tế bào, và nhiễm trùng túi lòng đỏ Bệnh do vi khuẩn E coli gây ra thường không có dấu hiệu rõ ràng và đặc trưng nên dễ nhầm lẫn với các bệnh khác, và chúng có khả năng lây lan nhanh, cùng với mật độ nuôi dày làm cho người chăn nuôi không phát hiện kịp thời gây hậu quả nghiêm trọng Vì vậy, cần chẩn đoán chính xác bệnh để phòng trị bệnh

kịp thời

Khả năng gây bệnh của E coli tương quan rất nhiều với các yếu bên ngoài và bên trong liên quan đến gia cầm Bản thân vi khuẩn E coli gây bệnh trên gia cầm tổng

hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu tố không phải là độc tố Nhưng chưa có

yếu tố độc lực cụ thể nào được xác định là chịu trách nhiệm gây bệnh E coli ở gia cầm

(dẫn liệu theo Antão và ctv, 2008) Đồng thời, do có nhiều chủng kháng nguyên E coli gây bệnh và việc điều trị bằng kháng sinh hiện nay không đạt được hiệu quả cao Vì vậy, việc kiểm soát và phòng trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn

Do đó, việc sử dụng các mô hình gây nhiễm thực nghiệm trên phôi gà và gà thí nghiệm để kiểm tra mức độ gây độc của E coli Đồng thời, sử dụng kĩ thuật sinh học

phân tử như PCR để phát hiện một số gene độc lực của các chủng E coli gây bệnh trên gia cầm là điều cần thiết Từ đó có những hiểu biết sâu hơn về đặc điểm gây bệnh của

E coli trên gia c ầm Đồng thời, kiểm tra tính mẫn cảm của E coli với một số loại

kháng sinh giúp hiểu hơn về tình trạng sử dụng thuốc hay kháng sinh hiện nay, từ đó tìm ra được các biện pháp phòng trị bệnh hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi Do đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, thử kháng sinh đồ

và xác định độc lực vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh trên gà tại tỉnh Bình Dương”

1.2 Yêu cầu – nội dung thực hiện

1.2.1 Yêu cầu

Phân lập và thử kháng sinh đồ của các mẫu vi khuẩn E coli phân lập từ gà bệnh

tại tỉnh Bình Dương

Xác định một số gene liên quan độc lực của E coli gây bệnh gia cầm trên các

mẫu phân lập được

1.2.2 Nội dung thực hiện

Phân lập vi khuẩn E coli từ gà bệnh

Kiểm tra tính mẫn cảm của E coli với một số loại kháng sinh thường được sử

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 E coli gây bệnh trên gia cầm

2.1.1 Lịch sử

E coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế nhất trong hệ vi sinh vật đường

ruột của người và động vật Phần lớn các vi khuẩn E coli không có ảnh hưởng gì đáng

kể đến sức khỏe chỉ có một số E coli có thể gây bệnh khi cơ thể bị stress hay bị bệnh

E coli được phát hiện đầu tiên vào những năm 1885 từ phân của trẻ sơ sinh với tên gọi Bacterium coli commune Sau đó được đổi tên thành Escherich nhằm tri ân

người có công khám phá (Theodor Escherich) Năm 1991, thống nhất với tên gọi là

Escherichia coli (vi ết tắt là E coli)

Các báo cáo đầu tiên về nhiễm trùng ở gia cầm gây ra bởi sinh vật trực khuẩn ruột là của David (1938, dẫn liệu theo Huq, 2002) và Twisselman (1939, dẫn liệu theo Huq, 2002) Sau đó Wasserman và ctv (1954, dẫn liệu theo Huq, 2002) và Fahey (1955, dẫn liệu theo Huq, 2002) đã báo cáo việc phân lập E coli từ “bệnh túi khí”

Nhóm huyết thanh gây bệnh của vi khuẩn E coli phổ biến trong môi trường nuôi gia

cầm và có thể nguyên nhân gây bệnh túi khí, viêm màng ngoài tim, viêm phúc mạc, viêm vòi trứng, viêm màng hoạt dịch, viêm tủy xương, viêm mô tế bào hoặc nhiễm trùng túi lòng đỏ Tập hợp các bệnh này tạo nên một tổn thất lớn về kinh tế đối với ngành chăn nuôi gia cầm

2.1.2 Dịch tễ học

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái của E coli

E coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn, có lông, di động, không tạo bào tử, không hình thành nha bào, bắt màu Gram âm (−) thường thẫm ở hai đầu, ở giữa nhạt, loại có độc lực thì có capsule, loại không có độc lực không có capsule Trong cơ thể, vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng

rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn

2.1.2.2 Động vật cảm thụ

Gia cầm, các loài chim, động vật hữu nhũ ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh do

E coli gây ra, nhưng con non, những con đang bị bệnh, suy yếu thì dễ mắc bệnh hơn

Trên gà, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn 1 – 10 ngày tuổi, những con gà ở giai đoạn chuẩn bị đẻ

2.1.2.2 Chất chứa căn bệnh

Nơi chất chứa quan trọng nhất của E coli là đường ruột của động vật, bao gồm

gia cầm Ở gà, có khoảng 109

CFU của vi khuẩn trên mỗi gram phân Trong số này,

106 CFU là E coli, 10 – 15% trong số đó là nhóm huyết thanh gây bệnh và có thể lây nhiễm sang hầu hết các động vật có vú và gia cầm do đó chúng có mặt toàn thế giới E

coli cũng thường được phân lập từ đường hô hấp Ngoài ra, chúng còn có mặt trên da

và lông của gia cầm Sự lây nhiễm E coli vào trứng là phổ biến và có thể là nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong cao ở gà Hầu hết, các chủng E coli phân lập từ gia cầm là chỉ

gây bệnh trên các loài gia cầm, nhưng một số ít có thể gây bệnh cho động vật khác (dẫn liệu theo Kabir, 2010)

2.1.2.3 Phương thức truyền lây

Các con đường lây bệnh chủ yếu của vi khuẩn E coli trên gia cầm là truyền lây

qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh, qua vỏ trứng do bị nhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường chuồng trại bị nhiễm khuẩn, qua đường hô hấp do gà bị bệnh CRD làm cho niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua vết thương Truyền lây qua thức ăn và nước uống nhiễm trùng

2.1.2.4 Triệu chứng bệnh

Thể viêm túi khí

Kế phát các bệnh CRD, tụ huyết trùng, viêm phế quản và khí quản truyền nhiễm

Vi khuẩn E coli có thể bị nhiễm vào những mô đã bị tổn thương của đường hô hấp Vi

khuẩn phát triển rất nhanh và định hướng vào các túi khí Túi khí bị dày lên có màu

trắng như bã đậu làm cho con vật khó thở Vi khuẩn có thể lây lan ra các cơ quan phủ

tạng như tim, gan và các túi khí vùng bụng làm tăng sinh các màng túi khí Chất dịch viêm firin tiết ra gây viêm dính màng bao tim, màng bao gan và màng phúc mạc Kết

quả làm cho tuần hoàn máu bị đình trệ, nhu động ruột giảm, tỷ lệ chết 8 - 10%

Viêm túi noãn hoàng

Tỉ lệ nhiễm trùng túi lòng đỏ là cao nhất khi vỏ trứng bị ô nhiễm, chúng xảy ra vào giai đoạn ấp trứng cuối cùng và nhiều phôi bị ảnh hưởng sẽ dẫn đến hiện tượng chết phôi Chỉ cần một vài vi khuẩn có độc tính ( ví dụ như O1: K1) cũng có thể dẫn

đến cái chết của tất cả các phôi, sau khi tiêm chúng vào túi lòng đỏ (Siccardi, 1966,

dẫn liệu theo Huq, 2002)

Nhiễm trùng đường hô hấp

Bệnh hô hấp liên hợp, liên quan đến nhiễm trùng thứ cấp do E coli, thường xảy

ra từ 2 – 12 tuần tuổi, với thiệt hại xảy ra chủ yếu giữa tuần thứ 4 và 9 Đây là một trong những bệnh gia cầm phổ biến nhất với thiệt hại đôi khi vượt quá 20% Kết quả là

tăng trưởng kinh tế giảm và giảm hiệu quả thức ăn, tăng tỷ lệ tử vong (Huq, 2002)

Ở một số loại gà, nhiễm trùng đường hô hấp không được kiểm soát và các nhiễm

trùng E coli trở thành nhiễm trùng máu Hầu hết những con gà bị nhiễm trùng máu,

nhiễm trùng sẽ lan rộng đến các cơ tim và sau đó đến màng ngoài tim

Nhiễm trùng máu cấp tính ở gà

E coli gây nhiễm trùng máu cấp tính thường nhiễm trùng ở gà trưởng thành, biểu

hiện đặc trưng là gan sậm màu và cơ ngực tắc nghẽn Đôi khi trên gan xuất hiện các đốm hoại tử nhỏ Trong một số trường hợp, viêm màng ngoài tim và viêm phúc mạc

cũng xuất hiện

Viêm vòi tr ứng

Những loài gia cầm bị ảnh hưởng thường chết trong 6 tháng đầu tiên, những con

sống sót hiếm khi đẻ trứng

H ội chứng sưng đầu

Hội chứng sưng đầu (SHS) đặc trưng là sưng phù nề, viêm mô tế bào, che mắt gà

thịt, gà thịt giống và gà đẻ thương mại

Viêm mô t ế bào

Viêm mô tế bào (đôi khi được gọi là viêm hoại tử da) ở thành bụng dưới bên dưới lỗ thông hơi và đùi của gà thịt, tuy không dẫn đến tử vong nhưng sự hiện diện của

mảng bám fibrin gây thiệt hại đáng kể cả về chất lượng và mỹ quan của thịt

Viêm ruột

Một vài báo cáo cho rằng, E coli có thể là nguyên nhân gây viêm ruột ở gia cầm

Sự hiện diện phổ biến nhất của nhóm huyết thanh gây bệnh E coli trong đường ruột

của gia cầm thì không liên quan đến bệnh

Bệnh thường nhiễm truyền kế phát sau các bệnh cầu trùng, viêm ruột hoại tử, kí sinh trùng hoặc trong những trường hợp bị suy dinh dưỡng và thiếu vitamin A làm cho niêm mạc ruột bị tổn thương Khi nhiễm bệnh gà thường tiêu chảy nặng, phân thường

có dịch nhày màu nâu, xanh, trắng bị chảy nước kết hợp với trọng lượng giảm nhanh chóng Bệnh tích ở đường tiêu hóa có chứa máu và dịch nhày Thành ruột sưng to, dày

và phù nề

2.1.2.5 Các đặc điểm của E coli gây bệnh trên gia cầm

Nhóm huy ết thanh

Sự tồn tại của một số kiểu huyết thanh phụ thuộc vào điều kiện cụ thể như khu

vực địa lý, quốc gia, và thời gian cách ly

Các kiểu huyết thanh khác nhau của E coli được phân loại theo hệ thống Ewing

(Ewing và ctv, 1956, dẫn liệu theo Huq, 2002) Nhiều nghiên cứu trên toàn thế giới đã

xác định nhóm huyết thanh của E coli có liên quan đến dịch bệnh ở gia cầm Siccardi

(1966, dẫn liệu theo Huq, 2002) thấy rằng 48% nhóm huyết thanh được biết đến đã gây bệnh cho gà, trứng có phôi hoặc cả hai Trong số các nhóm huyết thanh O đã được báo cáo là gây bệnh cho gia cầm là: 1, 2, 3, 6, 8, 15, 18, 35, 71, 74, 78, 87, 88, 95, 103

và 109 Trong đó nhóm huyết thanh O 1, 2 và 78 là phổ biến nhất trên thế giới, và một

số nhóm huyết thanh O vẫn chưa xác định được

Pili

Pili thường được liên tưởng với sự bám dính của E coli và đã có nhiều nghiên

cứu để xác định pili, điều này quan trọng với khả năng gây độc của E coli gây bệnh gia cầm Naveh và ctv (1984, dẫn liệu theo Huq, 2002) đã chứng minh rằng ba chủng

vi khuẩn E coli (O2, O78 và O88) từ E coli nhiễm trùng máu gia cầm tạo ra pili khi

được nuôi cấy ở 37oC nhưng không tạo pili ở 18o

C Tiêm vào gà các chủng tạo pili dẫn đến sự xuất hiện bệnh cao hơn đáng kể so với những con gà bị lây nhiễm với chủng không tạo pili (nonpiliated )

hợp với các O nhóm 1 hoặc 2 Bree và ctv (1989, dẫn liệu theo Huq, 2002) cho rằng

nhận biết K1 cũng được xem như xác định tính độc hại trong các chủng E coli gây

bệnh gia cầm của các nhóm huyết thanh O2

Các yếu tố gây độc của E coli gây bệnh trên gia cầm

Một số yếu tố độc lực tiềm năng của APEC đã được xác định cho đến nay được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực của E coli gây bệnh gia cầm

Yếu tố gây độc Tính gây độc

Tiêm mao (fimbria)

− Tiêm mao F1 (loại 1)

− Tiêm mao P

− Curli

− Bám dính với các tế bào biểu

mô của đường hô hấp

− Bám dính vào cơ quan nội tạng

− Bảo vệ chống lại sự thực bào

− Không bào của tế bào

(D ẫn liệu theo Janßen và ctv, 2003)

Ngoài ra, một số gene liên quan đến độc lực vi khuẩn E coli gây bệnh trên gia

cầm đã được kiểm tra: gene adhesion (csgA, fimC, mat, tsh); một số gene mã hóa cho

sự hấp thu sắt(chuA, afa/ draB, bmaE, fyuA, ireA, iron, irp2, iucD, iutA, sit ep., sit

chr.); gene mã hóa cho kh ả năng phòng vệ và kháng huyết thanh (iss, neuC, kpsMTII,

ompA, traT; asta ); gene độc tố vat, hlyA, gene liên quan đến khả năng xâm lấn (ibeA,

gimB, maIX) và gene mã hóa cho operon CoIV (cvi/cva) Ngoài ra, một số gene khác

cũng đã được xác định như focG, gafD, hrlA, papAH, papC, papEF, papG, sfaS (dẫn

liệu theo Antão và ctv, 2008)

2.1.2.3 Chẩn đoán bệnh

Những hình ảnh lâm sàng và/hoặc tổn thương sau khi chết thường cho thấy gà bị nhiễm trùng E coli, và sự phân lập E coli từ các cơ quan tổn thương đặc trưng là

phương pháp chẩn đoán đã được áp dụng Việc nuôi cấy cần được thực hiện từ những

mô bị ảnh hưởng như gan, lách, màng ngoài tim, và tủy để tránh lây nhiễm các vi sinh

vật đường ruột Mẫu bệnh phẩm được cấy trên môi trường thạch Mac Conkey hoặc môi trường thạch Eosin methylene blue (EMB)

Một chẩn đoán được cho là dương tính nếu các khuẩn lạc có màu sắc đặc trưng

của E coli như màu hồng trên môi trường thạch Mac Conkey hoặc tím ánh kim trên

môi trường thạch EMB

2.1.2.4 Phòng ngừa và điều trị

Do có nhiều chủng kháng nguyên E coli nên việc phòng bệnh bằng vaccine ít có

hiệu quả Quản lý tốt sẽ làm giảm lượng E coli nhiễm nên ngừa được bệnh E coli bộc

phát Vệ sinh trứng ấp bằng thuốc sát trùng trứng, vệ sinh máy ấp, khu chăn nuôi Tăng cường vệ sinh chuồng trại, nuôi dưỡng chăm sóc nâng cao sức đề kháng, giảm

tối đa stress (như nhiệt độ cao, gió lùa, khí amoniac, mật độ nuôi quá dày, không đủ thông thoáng, ) Đồng thời hạn chế người ra vào nơi chăn nuôi và người ra vào cần phải mặc quần áo bảo hộ để tránh làm phương tiện truyền vi khuẩn

Sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh, nhưng cần kiểm tra kháng sinh đồ trước khi chọn loại kháng sinh để điều trị Nó giúp chọn đúng loại kháng sinh và làm giảm nguy cơ vi khuẩn kháng kháng sinh

2.2 Thử độc lực trên trứng gà có phôi

Thử nghiệm trên phôi gà là thử nghiệm bằng sinh vật được dùng nhiều sau thử nghiệm trên gà nhằm xác định độc lực của loài gây bệnh quan tâm Trứng gà có phôi thường được sử dụng trong sản xuất vaccine hoặc xác định độc lực vi-rút

Đây là phương pháp tiện lợi, tiết kiệm kinh phí và có kết quả nhanh chóng Lấy

trứng gà đã thụ tinh cho ấp ở 38oC, độ ẩm 60% tùy thuộc vào tác nhân muốn thử nghiệm, đồng thời chọn tuổi phôi thích hợp thường 6 – 13 ngày tuổi và lựa chọn đường tiêm thích hợp

2.3 Động vật thí nghiệm

Đây là phương pháp cổ điển, đã được sử dụng từ lâu (Pasteur đã tiêm vi-rút dại vào não thỏ) và ngày nay nó còn được ứng dụng để phân lập vi-rút, để nghiên cứu bệnh lý, tác dụng gây bệnh trên cơ thể và các tổ chức riêng biệt, những đặc tính sinh

học của vi-rút, sản xuất vaccine Việc sử dụng động vật thí nghiệm hiện nay không chỉ được áp dụng cho vi-rút mà còn được sử dụng cho các nghiên cứu độc lực, dịch tễ của

vi khuẩn Tuy nhiên phương pháp này còn tương đối cồng kềnh, mất nhiều thời gian, không kinh tế và đặc biệt là dễ gây ô nhiễm và lây lan mầm bệnh

Phương pháp này, dùng huyễn dịch bệnh phẩm nghi có tác nhân gây bệnh tiêm cho động vật cảm thụ, sau một thời gian động vật cảm thụ sẽ có các biểu hiện lâm sàng

hoặc chết do tác nhân được tiêm Căn cứ vào biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đặc trưng khi mổ khám, có thể kết luận sự có mặt của tác nhân gây bệnh Nếu sau khi tiêm, động vật không biểu hiện triệu chứng, người ta cũng giết động vật sau 5 – 10 ngày, xem sự biến đổi trong phủ tạng qua đó phán đoán sự tồn tại của tác nhân tiêm vào Động vật thí nghiệm có thể thay đổi tùy theo tác nhân tiêm vào, có thể là chuột lang, chuột bạch, thỏ,… Tùy theo tính chất gây bệnh và tùy theo mục đích công việc nghiên

cứu mà lựa chọn đường tiêm thích hợp nhất

Để nghiên cứu E coli gây bệnh trên gà, phương pháp này là hoàn toàn cần thiết

để có một mô hình lây nhiễm thích hợp Động vật được dùng thử nghiệm cho tác nhân gây bệnh này là gà Tuy nhiên, quan trọng hơn là những yếu tố khác nhau cần được xem xét khi thực hiện trong các thí nghiệm in vivo này bao gồm các loại gà được sử

dụng, tuổi và tính nhạy cảm của gà và liều sử dụng trong mô hình lây nhiễm

2.4 Kĩ thuật PCR

Năm 1985, K Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản để khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Kĩ thuật này được gọi là polymerase chain reaction (PCR), là phản ứng dây chuyền, được thực hiện trong ống nghiệm plastis (Phạm Thành Hổ, 2008)

2.4.1 Nguyên tắc

PCR là kĩ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác

của enzyme DNA polymerase Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể từ 30 – 40 lần) gồm đun nóng (95oC), làm nguội (60 – 65oC), và ủ dài ở

72oC Trong dung dịch có các primer (thường có 2 primer) bắt cặp bổ sung ở hai đầu

mạch đơn tương ứng

2.4.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ tăng lên 94 – 96 °C để tách hai sợi DNA ra Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra, tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới Thời gian: 1 – 2 phút

Giai đoạn bắt cặp: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để

mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45 – 60 °C)

Thời gian: 1 – 2 phút

Giai đoạn kéo dài chuỗi: nâng nhiệt phản ứng lên 72o

C để DNA – polymerase tổng hợp sợi mới Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại

2.4.3 Thành phần phản ứng

Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm: Khuôn mẫu (đoạn DNA cần khuếch đại, không cần độ tinh sạch cao), cặp primer (nhân tố khuếch đại, thường chứa

18 – 25 nucleotide), polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) (giúp chịu được nhiệt độ

biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng), dNTPs (các loại nucleotide triphosphate), dung dịch đệm (thường là MgCl2)

2.4.4 Kiểm tra kết quả PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di Điện

di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường

Axit nucleic là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch chuyển qua

bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác dụng của điện trường Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử khác nhau về trọng lượng nên chạy được

những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta dùng phương pháp làm hiện hình Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide Chất này sẽ gắn xen vào các base

của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại Như vậy dễ dàng cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel Đối với gel polyacrylamide, các phân tử được đánh

dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng

xạ tự ghi Tùy thuộc kích thước DNA mà người ta chọn loại gel, nồng độ gel, loại đệm (TBE hay TAE) (Lò Thanh Sơn, 2009)

2.5 Nghiên cứu có liên quan

Wooley và ctv (2002) đã xác định độc lực của E coli phân lập được từ gia cầm thông qua tỉ lệ chết phôi gà Kết quả cho thấy rằng, nếu tỉ lệ phôi gà 12 ngày tuổi

>29% thì chủng rất độc, 10-29% độc lực trung bình, <10% không có độc lực trong 2 ngày sau khi tiêm 100 vi khuẩn/trứng Kết quả nghiên cứu này được áp dụng để kiểm

tra độc lực vi khuẩn E coli phân lập được, làm cơ sở cho các bước kiểm tra độc lực

trên gà và kiểm tra gene liên quan độc lực bằng PCR trong nghiên cứu của chúng tôi

Sharada và ctv (2010), phân lập, đặc điểm và tỉ lệ mẫu nhạy cảm với kháng sinh

của E coli phân lập từ gia cầm Kết quả cho thấy tỉ lệ phân lập thành công E coli từ

các mẫu bệnh tích khác nhau từ gà bệnh và tỉ lệ đề kháng với kháng sinh của các mẫu phân lập được

Janßen và ctv (2003) đã sử dụng kĩ thuật multiplex – PCR cho phép phát hiện đặc

hiệu và nhạy với E coli gây bệnh gia cầm Nghiên cứu cho thấy, multiplex – PCR có

thể phát hiện đồng thời nhiều gene liên quan đến yếu tố độc lực hay gene độc lực, từ

đó dễ dàng phát hiện chủng E coli gây bệnh trên gia cầm

Antão và ctv (2008) đã sử dụng gà 5 tuần tuổi như một mô hình lây nhiễm tự nhiên bệnh ngoài đường ruột gây ra bởi APEC Nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt

giữa chủng E coli độc lực và không độc thông qua tỉ lệ chết gà thí nghiệm, triệu

chứng và bệnh tích quan sát

Các công trình nghiên cứu trên đã xác định được tỉ lệ nhiễm E coli trên gà, độc

lực vi khuẩn qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà thí nghiệm, phát hiện một số gene

liên quan độc lực của E coli gây bệnh trên gia cầm bằng multiplex – PCR, và tỉ lệ

nhạy cảm với kháng sinh của các mẫu phân lập được Từ các công trình nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định độc lực vi khuẩn E coli phân lập được

từ túi khí gà bệnh qua gây nhiễm thử nghiệm trên phôi trứng 12 ngày tuổi và gà con 1 ngày tuổi, đồng thời xác định 2 gene liên quan độc lực E coli gây bệnh bằng PCR và

kiểm tra kháng sinh đồ các gốc phân lập được

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian

Thời gian nghiên cứu từ ngày 17/1/2011 đến tháng 7/2011

3.1.2 Địa điểm

Địa điểm lấy mẫu: Bệnh Viện Thú Y trường ĐH Nông Lâm TP HCM

Địa điểm xét nghiệm: Phòng Vi Sinh - Bệnh Viện Thú Y trường ĐH Nông Lâm

3.2 Đối tượng và số lượng mẫu

Đối tượng: Gà bệnh từ tỉnh Bình Dương

Số lượng mẫu khảo sát : 35 mẫu túi khí của gà bệnh

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Phân lập vi khuẩn E coli trên gà bệnh

3.3.2 Thử kháng sinh đồ các gốc E coli phân lập được

3.3.3 Thử nghiệm độc lực các gốc E coli phân lập được trên phôi trứng gà và gà

thí nghiệm

3.3.4 Sử dụng kĩ thuật PCR để phát hiện một số gene độc lực của E coli phân lập

được

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Gà bệnh được mổ khám, lấy túi khí từ những con gà có bệnh đem phân lập

Khi đã có được các gốc E coli, tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ, xác định mức độc

lực của các gốc vi khuẩn qua gây nhiễm thực nghiệm trên trứng gà có phôi và gà thí nghiệm, phát hiện một số gene độc lực bằng kỹ thuật PCR Các bước tiến hành thí nghiệm (hình 3.1)

Hình 3.1 Sơ đồ các bước thử nghiệm độc lực vi khuẩn E coli

3.4.1 Phân lập vi khuẩn E coli từ gà bị bệnh

Tiêm vào xoang niệu mô

Trứng gà có phôi 12 ngày tuổi

Tái phân lập E coli Quan sát bệnh tích

3.4.1.2 Môi trường và hóa chất

Môi trường: Quá trình phân lập E coli được tiến hành trên nhiều môi trường khác

nhau như: tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHI, Titan Biotech), phân lập vi khuẩn E coli trên môi trường Eosin Methylene Blue Agar

(EMB, Himedia), môi trường Colombia-Agar (Merck), giữ gốc trên môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient agar (NA, Himedia), Nutrient Broth (NB, Himedia), Simon Citrate Agar (Himedia)

Hóa chất dùng cho phản ứng sinh hóa: thuốc thử Kowacs, methyl red, α-napthol 10%

KOH 40%

3.4.1.3 Phương pháp tiến hành

Thu thập mẫu

Túi khí được lấy từ những gà bệnh của tỉnh Bình Dương được mang đến Bệnh

Viện Thú Y trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Những gà bệnh này có thể có bệnh

tích điển hình hoặc không điển hình do E coli gây ra Những bệnh tích điển hình

thường gặp như túi khí dày đục, có thể có casein, viêm màng quanh gan, viêm màng bao tim, viêm phổi

Bảng 3.1 Thu thập mẫu từ gà bệnh tại tỉnh Bình Dương

Bệnh tích do E coli Số mẫu

phân lập Điển hình Không điển hình

Số mẫu mổ khám

Phân l ập vi khuẩn

Sau khi lấy mẫu, tiến hành phân lập vi khuẩn E coli theo quy trình phân lập của

Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nông Lâm TP HCM (hình 3.2)

Những mẫu túi khí được cấy trực tiếp trên môi trường chọn lọc EMB hoặc mẫu được cho vào môi trường tăng sinh BHI trước khi cấy lên môi trường EMB (nếu mẫu không có bệnh tích điển hình do E coli) Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37o

C, chọn những khuẩn lạc đơn có màu tím ánh kim đặc trưng cho vi khuẩn E coli trên môi trường

thạch EMB

Những khuẩn lạc đơn này được cấy lên môi trường thạch bán nghiêng KIA để

thử phản ứng sinh hơi và khả năng lên men đường glucose và lactose và thực hiện

phản ứng sinh hóa IMViC để khẳng định đúng là vi khuẩn E coli

Chỉ tiêu theo dõi: Mẫu dương tính với E coli/tổng số mẫu phân lập

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập vi khuẩn E coli (Bệnh Viện Thú Y trường ĐH Nông Lâm

TP HCM, 2010)

3.4.2 Thử kháng sinh đồ các gốc E coli phân lập được

3.4.2.1 Mục đích

Khảo sát tình trạng đề kháng kháng sinh của các gốc vi khuẩn E coli phân lập

được trên gà bệnh tại tỉnh Bình Bương

Chọn khuẩn lạc đơn màu tím ánh kim

đặc trưng của vi khuẩn E coli

Giữ giống trên ống

thạch nghiêng NA

E coli

37oC/24 giờ

Đĩa kháng sinh (13 loại): ampicilin, amoxicillin, cephalexine, gentamycin, kanamycin, norfloxacin, cefuroxime acetil, tobramycin, colistin, doxycyclin, tetracyclin, neomycin, trimethoprim/sulphamethoxazone (công ty Nam Khoa)

Micropittet 100-1000µl, máy vortex

3.4.2.3 Phương pháp thực hiện

Tính mẫn cảm của vi khuẩn E coli với kháng sinh sẽ được kiểm tra bằng phương

pháp khuếch tán đĩa kháng sinh trên môi trường thạch của Kirby – Bauer

Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn (có nồng độ tương đương 108

vi khuẩn/ml): cho vào ống nghiệm vô trùng khoảng 2 ml nước muối 0,9% vô trùng Dùng que cấy vòng

lấy một ít vi khuẩn kiểm định vào, lắc đều để thu được huyễn dịch vi khuẩn đồng nhất Sau đó, so độ đục của huyễn dịch vi khuẩn với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5 %

Cấy vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa NA (hay Muller – Hinton) Bằng thao tác

vô trùng, đổ huyễn dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị sẵn lên đĩa môi trường Xoay nhẹ đĩa để huyễn dịch vi khuẩn láng đều khắp bề mặt của môi trường, để yên ít phút Sau

đó, nghiêng nhẹ đĩa để huyễn dịch vi khuẩn còn dư tụ lại một góc và dùng micropipette hút hết phần huyễn dịch dư Để yên đĩa môi trường đã cấy ở nhiệt độ phòng từ 3 – 5 phút cho bề mặt môi trường khô bớt trước khi đặt những đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt môi trường

Gắn đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt môi trường: dùng kẹp gắp lấy một đĩa giấy tẩm kháng sinh đặt lên môi trường, hơi ấn nhẹ để đĩa giấy tẩm kháng sinh tiếp xúc đều bề mặt môi trường Thực hiện thao tác trên tất cả các loại kháng sinh cần thử Sau đó, để đĩa môi trường đã có đặt các đĩa kháng sinh ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán dễ dàng, rồi đặt đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 37o

C trong

24 giờ (Nguyễn Ngọc Hải và Nguyễn Thị Kim Loan, 2009)

Đánh giá kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn xuất hiện trên đĩa và đem đo với đường vòng vô khuẩn chuẩn được quy định cho mỗi loại kháng sinh để đánh giá khả năng nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh: nhạy, trung gian, kháng

3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi

Tỉ lệ các mẫu E coli phân lập được nhạy cảm và đề kháng với 13 loại kháng

sinh của các gốc E coli phân lập được tại tỉnh Bình Dương