ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RTPCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VIRÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV)

Như vậy quy trình real time RT-PCR sử dụng EvaGreen cho kết quả nhanh, nhạy, chính xác trong việc định chủng và định lượng PRRSV trong mẫu bệnh phẩm.. Sự thay đổi kháng nguyên giữa các

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VI-RÚT

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VI-RÚT

L ỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên mà tôi muốn nói đó là: “Con xin cảm ơn cha mẹ và các anh chị thật nhiều!” Gia đình mình đã luôn bên cạnh con, động viên và giúp đỡ con trong những

lần “té ngã” để đứng lên trong cả quá trình dài học tập trong như trong cuộc đời này

Em xin cảm ơn các Thầy Cô của trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh – Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những

kiến thức khoa học, kiến thức chuyên ngành, cũng như những kinh nghiệm quý báu trong những năm học tại trường tạo cho em nguồn động lực nghiên cứu khoa học

Lòng biết ơn chân thành sâu sắc xin được gửi đến PGS.TS Trần Thị Dân và

KS Võ Khánh Hưng, người đã dành hết nhiệt tâm và trách nhiệm để hướng dẫn, chỉ dạy em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường và Công ty Nam Khoa đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp DH07SH, Đại học chính quy khóa 2007

-2011 đã quan tâm và động viên mình trong thời gian học tập và thực hiện đề tài Đặc

biệt gửi lời cảm ơn đến KS Nguyễn Phan Thành, chị Trang (công ty Nam Khoa) nhóm nghiên cứu và bạn Lê Thị Thơm đã giúp đỡ về mặt tinh thần, một nguồn động

lực lớn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Phản ứng real time RT-PCR sử dụng chất phát huỳnh quang EvaGreen dựa trên đường chuẩn plasmid DNA gắn khung đọc mở ORF7 đã được xây dựng Kết quả thu được

gồm:

Đường chuẩn real time RT-PCR với DNA tạo bằng phương pháp plasmid DNA Toàn bộ vùng ORF7 của bộ gen PRRSV được gắn vào plasmid pGEM T Easy

và chuyển vào tế bào chủ E coli DH5α

Cặp mồi F7 và R7 sử dụng trong quy trình real time RT-PCR cho phép định

chủng và định lượng PRRSV trên hai chủng Bắc Mỹ (NA), Châu Âu (EU) Độ nhạy trong quy trình real time RT-PCR là 101 bản sao Tính đặc hiệu của phản ứng được khẳng định với PCV (porcine circovirus)

Phân biệt chủng PRRSV châu Âu và PRRSV Bắc Mỹ dựa vào sự chệnh lệch về nhiệt độ Tm khi phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ Tm sản phẩm khuếch đại PRRSV châu Âu là 83,4o

C và PRRSV Bắc Mỹ là 84,4o

C

Lượng PRRSV trong máu nhiều hơn so với mẫu ngoáy hầu họng trong từ 4 – 8 tuần tuổi

Như vậy quy trình real time RT-PCR sử dụng EvaGreen cho kết quả nhanh,

nhạy, chính xác trong việc định chủng và định lượng PRRSV trong mẫu bệnh phẩm Điều này giúp cho việc sử dụng vacxin hiệu quả hơn và giảm thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi

Recently, the Vietnam pig livestock industry has been influenced by infection diseases Especially, porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) which caused by PRRSV is detrimental to economy The thesis: “To establish EvaGreen-based real time RT-PCR assay for quantifying and genotyping porcine reproduction and respiratory virus” plays an important role to control and prevent the widespread of the virus Blood and swab samples taken from swines suspected of PRRSV infection were extracted to get virus RNA The real time RT-PCR protocol was used to quantify and genotype PRRSV RNA in the collected samples A standard curve used in the EvaGreen-based real time RT-PCR assay was created by a plasmid DNA template All the length of ORF7 of PRRSV genome was inserted into pGEM T Easy plasmid Results obtained from the study:

A pair of primers F7 and R7 used in the EvaGreen-based real time RT-PCR assay could quantify and distinguish the genotypes of PRRSV The sensibility of the assay was 101 copies The speciality of the assay was confirmed by using PCV (porcine circovirus)

Genotyping of EU PRRSV and US PRRSV was based on the differences of Tm when considering melt curve analysis The Tm temperature of EU PRRSV amplification product was 83,4oC and the Tm temperature of US PRRSV amplification product was 84,4oC

The number of virus in the blood sample was larger than that of the swab one in the period of 4 – 8 weeks old

In conclusion, by using the EvaGreen-based real time RT-PCR assay, we could offer quick, sensitive and accurate results of testing for quantify and genotype PRRSV

It helps for using vaccine more effectively and decreases the economic devastation

M ỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo 3

2.2 Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV) 4

2.2.1 Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng 5

2.2.2 Cấu trúc phân tử của PRRSV 7

2.2.2.1 Cấu trúc virion 7

2.2.2.2 Tổ chức bộ gen của PRRSV 8

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh 10

2.3 Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 11

2.3.1 Chẩn đoán PRRSV trên môi trường nuôi cấy tế bào 11

2.3.2 Phương pháp kháng thể huỳnh quang và hoá mô miễn dịch 12

2.3.3 Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp 12

2.3.4 Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSV 12

2.4 Kỹ thuật real time RT-PCR 13

2.4.1 Kỹ thuật real time PCR 13

2.4.1.1 Nguyên tắc kỹ thuật real time PCR 13

2.4.1.2 Hóa chất định lượng 14

2.4.1.3 Công cụ phát hiện 19

2.4.1.4 Phân tích dữ liệu real time PCR 19

2.4.1.5 Ưu và nhược điểm 23

2.4.1.6 Ứng dụng 23

2.4.2 Phương pháp tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên 24

2.5 Sơ lược các nghiên cứu có liên quan 24

2.5.1 Trên thế giới 24

2.5.2 Trong nước 25

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.3 Vật liệu và hóa chất 26

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 26

3.3.2 Hóa chất 26

3.4 Phương pháp tiến hành 28

3.4.1 Thu nhận mẫu 28

3.4.2 Ly trích RNA từ huyết thanh 29

3.4.3 Đánh giá đoạn mồi dùng trong phản ứng real time RT-PCR 30

3.4.3.1 Đánh giá khả năng khuếch đại của đoạn mồi 32

3.4.3.2 Đánh giá khả năng khuếch đại của đoạn mồi 32

3.4.4 Xây dựng đường chuẩn (standard curve) 32

3.4.5 Thực hiện phản ứng real time RT-PCR 34

3.4.5.1 Phản ứng phiên mã ngược (reverse transcription) 34

3.4.5.2 Phản ứng real time PCR 34

3.4.5.3 Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp real time RT-PCR 35

3.4.5.4 Đánh giá khả năng định chủng của phương pháp real time RT-PCR 36

3.4.6 Ứng dụng phương pháp real time RT-PCR để kiểm tra mầm bệnh PRRS 36

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Đánh giá đoạn mồi dùng trong phản ứng real time RT-PCR 38

4.2 Xây dựng đường chuẩn 39

4.2.1 Phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen chứa ORF7 40

4.2.2 Kiểm tra plasmid chèn đoạn gen ORF7 40

4.2.2.1 Ly trích plasmid từ khuẩn lạc 41

4.2.2.2 Kiểm tra plasmid DNA bằng PCR 41

4.3 Kết quả thực hiện real time RT-PCR 42

4.3.1 Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp real time RT-PCR 42

4.3.2 Tính đặc hiệu của phản ứng real time RT-PCR 45

4.3.3 Kết quả phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy định chủng PRRSV 46

4.4 Ứng dụng phương pháp real time RT-PCR để định chủng và định lượng PRRS 47 4.4.1 Định lượng 47

4.4.2 Định chủng 48

Chương V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Đề nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

I Tiếng Việt 53

II Tiếng Anh 53

PHỤ LỤC

IFA Indirect flourescent antibody

IPMA Immunoperoxidase monolayer assay

PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng PRRSV 6

Bảng 3.1 Nguồn mẫu nghiên cứu 28

Bảng 3.2 Cặp đoạn mồi trong phản ứng real time RT-PCR 31

B ảng 3.3 Thành phần các chất trong phản ứng phiên mã ngược 34

Bảng 3.4 Quy trình nhiệt của phản ứng phiên mã ngược 34

Bảng 3.5 Thành phần một phản ứng real time PCR 34

B ảng 3.6 Chu kỳ nhiệt phản ứng real time PCR 35

Bảng 4.1 Phân tích sản phẩm khuếch đại 2 mẫu vacxin và các trình tự tham khảo 39

Bảng 4.2 Hệ số biến động giá trị Ct 43

B ảng 4.3 Kết quả định lượng một số mẫu thực địa, vacxin, và dịch tế bào nuôi cấy 48

Bảng 4.4 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại của các mẫu xét nghiệm 50

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ phân bố bệnh PRRS tại các nước trên thế giới 4

Hình 2.2 Hình dạng bên ngoài PRRSV 5

Hình 2.3 Cây phân bố giống, loài của một số chủng PRRSV 6

Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen PRRSV 9

Hình 2.5 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV 11

Hình 2.6 Thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green I liên kết với DNA 15

Hình 2.7 Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman 18

Hình 2.8 Hệ thống CFX96 REAL TIME PCR System 19

Hình 2.9 Biểu đồ khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh quang 20

Hình 2.10 Đường chuẩn cho phản ứng định lượng 21

Hình 2.11 Biểu đồ phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy 22

Hình 3.1 Ví trí trình tự đoạn mồi F7 và R7 31

Hình 3.2 Sự chệnh lệch về kích thước sản phẩm khuếch đại giữa 2 chủng PRRSV 32

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình tạo DNA tái tổ hợp dùng trong xây dựng đường chuẩn 33

Hình 3.4 Sơ đồ thực hiện phản ứng real time RT-PCR 37

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR cặp đoạn mồi F7 và R7 38

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR vùng ORF7 với primer F3 và R3 Error! Bookmark not defined Hình 4.3 Kết quả điện di plasmid sau khi ly trích 41

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra plasmid DNA bằng PCR 42

Hình 4.5 Biểu đồ khuếch đại các mức pha loãng từ 100 đến 108 bản sao 42

Hình 4.6 Độ lập lại khuếch đại các mức pha loãng từ 100 đến 108 bản sao 43

Hình 4.7 Đường tuyến tính đường chuẩn 44

Hình 4.8 Biểu đồ khuếch đại đối chứng dương 44

Hình 4.9 Biểu đồ khuếch đại mẫu PCV dương tính 45

Hình 4.10 Biểu đồ phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy 46

Hình 4.11 Đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy của mẫu PRRSV thực địa 49

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành chăn nuôi chiếm một ví trí quan trọng trong nền kinh tế nước ta Chăn nuôi chiếm hơn 21% giá trị sản xuất nông nghiệp, trong đó chăn nuôi heo chiếm 60% giá trị sản xuất toàn ngành Tổng đàn heo Đông Nam Bộ là 2,63 triệu con, trong đó ngành chăn nuôi TP.HCM chiếm 12,05% (hơn 317 ngìn con) (Cục Chăn nuôi, 2008)

Với sự phát triển mạnh mẽ như vậy thì các nhà chăn nuôi cũng phải đối mặt với rất nhiều nguy cơ đặc biệt là mầm bệnh gây tổn thất rất nghiêm trọng Một trong những vấn đề nổi lên trong thời gian vừa qua, gây ảnh hưởng không nhỏ đến ngành chăn nuôi

là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome)

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) hay còn gọi là bệnh heo tai xanh

đã trở thành đại dịch ở heo, gây rất nhiều thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi Đặc biệt là trận dịch lớn xảy ra ở Trung Quốc năm 2006 với đột biến chủng mất 30 acid amin vùng NSP2 tạo thành chủng độc lực cao gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế nước này Chủng vi-rút này sau đó cũng được báo cáo xuất hiện tại Việt Nam Theo báo cáo của cục thú y tại Việt Nam dịch PRRS chính thức bùng nổ năm 2007, hiện vẫn đang diễn biến phức tạp trên các tỉnh trong toàn quốc Tính đến 25/9/2010 dịch PRRS bùng phát trở lại với 32 tỉnh thành công bố dịch với đặc điểm của bệnh là lây lan nhanh, khó khống chế, gây thiệt hại về chăn nuôi, nhất là đàn heo giống

Để phát hiện PRRSV, các phương pháp huyết thanh học , nuôi cấy tế bào được

sử dụng phổ biến Sự phát triển của sinh học phân tử cùng với các biện pháp kỹ thuật xét nghiệm nhanh, hiện đại và độ chính xác cao như PCR, RT-RCR, nested-PCR, LAMP, real time PCR Gần đây kỹ thuật real time RT-PCR đang trở thành kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong việc định lượng vi-rút có vật chất di truyền RNA Nhằm phát hiện sớm, định chủng và định lượng vi-rút thực địa, góp phần nâng cao hiệu quả

sử dụng vacxin, cách thức bố trí nhập đàn, giảm thiệt hại kinh tế Được sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Thị Dân và KS Võ Khánh Hưng và góp phần xây dựng một quy trình chuẩn định lượng và định chủng PRRSV phục vụ tiến trình nghiên cứu, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật real time RT-PCR sử dụng EvaGreen

nhằm định lượng và định chủng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo

(PRRSV)”

1.2 Yêu cầu

Xây dựng quy trình định lượng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRSV) bằng kỹ thuật real time RT-PCR sử dụng EvaGreen định lượng và định

chủng PRRSV trên heo nhằm phục vụ công tác phòng chống dịch bệnh xảy ra

1.3 Nội dung thực hiện

− Gắn đoạn gen ORF7 vào plasmid pGEM T Easy và chuyển vào tế bào chủ E

Ch ương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) là bệnh xảy ra trên heo với đặc điểm gây sẩy thai ở heo nái và rối loạn đư ờng hô hấp trên heo sơ sinh và heo choai (Christianson và ctv , 1992) Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ và nhanh chóng bệnh lan sang Canada năm1988 Sau đó, các nước vùng châu Âu cũng xuất hiện bệnh như ở Đức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm 1991 và

1992 ở Pháp Năm 1998, bệnh được phát hiện ở châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản

Do chưa xác định căn nguyên bệnh nên được gọi là “bệnh thần bí trên heo” (mystery swine disease - MSD) Sau đó, bệnh lây lan rộng trên toàn thế giới và được gọi bằng nhiều tên: hội chứng hô hấp và vô sinh của heo (swine infertility and respiratory disease - SIRS), bệnh bí hiểm ở heo (MSD), hội chứng hô hấp và sẩy thai ở heo (porcine epidemic abortion and respiratory syndrome-PEARS), hội chứng hô hấp

và sinh sản ở heo (PRRS), bệnh tai xanh (blue-eared pig disease) Năm 1992, Hội nghị

quốc tế về bệnh này đã nhất trí dùng tên PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome) và được Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) công nhận Năm 2006, đại dịch PRRS đã xảy ra ở Trung Quốc làm hàng triệu heo bị mắc bệnh Trong trận dịch này đã phát hiện sự biến chủng của vi-rút thành chủng độc lực cao, có khả năng lây lan và gây

chết rất nhanh trên heo Cho đến nay, hội chứng PRRS đã xảy ra hầu hết các nước có nền chăn nuôi heo công nghiệp phát triển trên thế giới Gần đây các ổ dịch xảy ra tại

Thụy Điển, Nam Phi, Nga, Trung Quốc, và Việt Nam với chủng động lực cao, diễn

biến ngày càng phức tạp (FAO, 2007)

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1997 bằng kiểm tra huyết thanh học trên đàn heo nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính) Năm 1999 một khảo sát của Cơ quan Thú Y Vùng 6 ở một số trại giống tại các tỉnh phía Nam cho

thấy tỉ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%

Ngày 12/3/2007, đợt dịch đầu tiên bùng nổ tại Hải Dương, chỉ trong vòng 1 tháng, bệnh đã lây lan sang 6 tỉnh lân cận như Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Bình, Hải Phòng và Quảng Ninh (Trần Thị Bích Liên, 2008) Từ đó đến nay dịch vẫn

tiếp tục xảy ra ở một số địa phương trong cả nước Tháng 7 năm 2007 tại Long An cũng xác định có dịch với 91 heo mắc bệnh và 8 con chết, điều đó có nghĩa là

bệnh đã xuất hiện ở Đồng bằng sông Cửu Long Theo đánh giá không chính thức,

hiện nay hội chứng PRRS có thể đã chuyển sang dạng mãn tính tại hầu hết các trại có

bệnh (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2008) Kết quả giải trình tự và gây bệnh thực nghiệm trên heo cho thấy chủng PRRSV tại Việt Nam hiện nay có mức độ tương đồng cao về

di truyền so với PRRSV chủng độc lực cao của Trung Quốc (Tô Long Thành và ctv, 2008)

Như vậy, tại Việt Nam, dịch PRRS có thể sẽ có những diễn biến phức tạp và có nguy cơ bùng phát ở tất cả các địa phương trong cả nước

Hình 2.1 Sơ đồ phân bố bệnh PRRS tại các nước trên thế giới (Tổ chức dịch tể thế giới OIE, 2007).

2.2 Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV)

Vi-rút gây bệnh được phân lập vào năm 1991 tại Lelystad, Hà Lan Tuy nhiên việc phân lập được vi-rút trong các mẫu máu heo trữ cho thấy vi-rút đã hiện diện trong đàn heo từ năm 1979 (hình 2.2)

PRRSV thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirades Ba đặc tính quan trọng đáng lưu ý của giống Arterivirus nói chung và PRRSV nói riêng là gây

nhiễm trùng dai dẳng mà không thể hiện triệu chứng, nhân lên trong các đại thực bào

và có khả năng biến đổi gen rất lớn

2.2.1 Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng

Hiện nay, PRRSV đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn

gốc từ châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA) (Meulenberg và ctv, 1993) Ngoài ra, trong mỗi kiểu gen còn có nhiều chủng khác nhau đã được phân lập

Việc so sánh trình tự gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa hai nhóm này Ở Bắc Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gen NA, mặc dù cũng có một số báo cáo đã cô l ập được kiểu gen EU (Ropp, 2004) Ở Châu Âu thì kiểu gen EU trội hơn và cho đến năm

1998 vẫn chưa có chủng nào thuộc kiểu gen NA được xác lập ở phía Tây Âu (Madsen

và ctv, 1998) Ở Châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gen trên đã được xác lập Thông thường, các chủng vi-rút này gây chết với tỷ lệ thấp, nhưng từ ổ dịch PRRS xảy ra năm

2006 trên heo tại Trung Quốc, người ta xác định rằng là do chủng vi-rút cường độc cao

có thể gây chết đến 20% heo bệnh, kể cả heo trưởng thành

Sự khác nhau giữa các chủng được cho thấy trong bảng 2.1 và hình 2.3 bên dưới Hình 2.3 mô tả cây phân bố giống, loài của PRRSV theo số liệu trong bảng 2.1 trên Trong đó có hai kiểu gen dòng Bắc Mỹ (với chủng VR2332 phân lập tại Mỹ,

chủng 807/94 Canada và Đài Loan) và kiểu gen châu Âu (với chủng I10 ở Hà lan và

chủng Olot Tây ban nha) Sự khác nhau giữa các chủng phụ thuộc vào sự khác nhau trong chuỗi trình tự nuceotide hay chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong từng chủng vi-rút

Hình 2.2 Hình d ạng bên ngoài PRRSV

(http//www.agraroldal.hu)

Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng PRRSV

Hội chứng PRRS đã xuất hiện ở Trung Quốc từ 1995 và đã nhanh chóng lan

rộng khắp các tỉnh thành gây thiệt hại to lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước này (Chen và ctv, 2006) Gần đây, chủng PRRSV Trung Quốc động lực cao đã được nhắc đến nhiều do khả năng gây bệnh và chết với tỷ lệ cao Nhiều công trình đã cung cấp

những thông tin quan trọng về quan hệ di truyền của PRRSV này với các chủng vi-rút trên thế giới, đồng thời lập những giả thuyết cho sự tiến hóa của PRRSV tạo ra các chủng vi-rút động lực cao như hiện nay (Gao và ctv, 2004; Chen và ctv, 2006; An và ctv, 2007; Tian và ctv, 2007; Feng và ctv, 2009) Năm 2006, một đợt dịch PRRS lớn bùng nổ ở Trung Quốc gây tỷ lệ chết lớn và chủ yếu ảnh hưởng đến heo nái và heo trưởng thành Theo Tian và ctv (2007) vi-rút gây bệnh vẫn là PRRSV nhưng với độc

lực cao hơn nhiều với đột biến thứ nhất là đột biến mất leucine ở acid amin (aa) 482 và

đột biến thứ hai là mất liên tục 29 aa, từ aa thứ 534 đến aa thứ 562 Từ các kết quả này, Tian và ctv (2007) đã xây dựng nên những giả thuyết ban đầu về sự tiến hóa của các

chủng PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc kiểu gen Bắc Mỹ với vùng tiến hóa của các chủng vi-rút Bắc Mỹ lưu hành tại Trung Quốc chịu ảnh hưởng

về mặt địa lý hay môi trường như nhiệt độ và ẩm độ cao vào mùa hè hay sự nhiễm các

vi khuẩn thứ phát cũng góp phần lên sự hình thành chủng vi-rút độc lực

Tại Việt Nam, toàn bộ chuỗi gen M của chủng vi-rút gây bệnh ”tai xanh” phân

lập từ heo bệnh tại Quảng Nam (Việt Nam) năm 2007, ký hiệu TXMT1 (Việt Nam),

có độ dài 525 bp đã được thu nhận và giải trình tự Thành phần nucleotide, acid amin

biểu hiện từ gen M của chủng TXMT1 được sử dụng để phân tích và so sánh đồng

nhất về nucleotide và tương đồng về acid amin giữa chủng này với một số chủng của Trung Quốc phân lập trong các năm 2006 - 2008 và thế giới Chủng TXMT1 (Việt Nam) được xác định thuộc vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV), type II (chủng Bắc Mỹ), có tỷ lệ đồng nhất (identity) về thành phần nucleotide và tỷ lệ tương đồng (homology) về acid amin rất cao (99 - 100%) với các

chủng của Trung Quốc; thấp hơn (94% nucleotide; 96% acid amin) so với chủng VR2332 và rất thấp (69% nucleotide; 79% acid amin) so với chủng Lelystad Chủng TXMT1 chỉ có 2 - 3 vị trí nucleotide khác biệt so với các chủng Trung Quốc, trong khi

đó có đến 28 vị trí khác so với chủng VR2332 (type II, chủng Bắc Mỹ) và rất nhiều so với các chủng châu Âu (type I) Khác biệt V (valine)/I (isoleucine) ở vị trí 24 của chuỗi polypeptide M là nét đặc trưng giữa chủng TXMT1 với tất cả các chủng thuộc

chủng Bắc Mỹ và châu Âu Đặc tính gen M cho thấy, chủng TXMT1 của Việt Nam có biến đổi di truyền cao, có thể có cùng nguồn gốc phát sinh cùng với các chủng PRRSV

của Trung Quốc, dẫn đến suy đoán, tác nhân gây PRRS cường độc cao này có tại Việt Nam rất có thể là do từ Trung Quốc vào (Feng, 2009)

2.2.2 Cấu trúc phân tử của PRRSV

2.2.2.1 Cấu trúc virion

PRRSV là vi-rút dạng sợi đơn, thẳng, vỏ bao Hạt PRRSV có dạng hình cầu với đường kính khoảng 45 đến 65 nm đối với chủng PRRSV châu Âu (Wensvoort và ctv., 1991) và từ 48 đến 83 nm đối với chủng Bắc Mỹ (Benfield và ctv., 1992; Dea và ctv, 1992) Virion của PRRSV gồm 3 phần Thứ nhất , bộ gen là RNA sợi đơn (+) nằm trong nhân Thứ hai là vỏ capsid bao bọc bộ gen của vi-rút Cấu trúc thứ ba là vỏ bao

ngoài, đây là màng lipid chứa glycoprotein vi-rút và phức hợp protein (Conzelmann, 1993) gồm: protein xuyên màng M (integral membrane protein ) tạo phức hợp với glycoprotein chính của vi-rút - GP5 (major viral glycoprotein- GP5) xung quanh nhân Hai glycoprotein khác của vi-rút khác (GP2 và GP4) cũng đựơc gắn với màng và hiện diện ít hơn so với GP5 (Nelson và ctv, 1995) Một glycoprotein thứ tư (GP3) được mô

tả như một phần của cấu trúc virion trên PRRSV dòng châu Âu Lelytad, trong khi ở

chủng PRRSV dòng Bắc Mỹ tại Quebec ngư ời ta cho rằng GP 3 được biểu hiện như protein không cấu trúc hoà tan (Mardassi và ctv, 1998)

2.2.2.2 Tổ chức bộ gen của PRRSV

Chuỗi hệ gen đầy đủ của PRRSV được xác lập vào năm 1993, nó có kích thước khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa 9 khung đọc mở nằm hai đầu hai vùng không dịch

mã (untranslate region - UTR) 5’UTR và 3’UTR, và có cấu trúc mũ methyl tại đầu 5’

và đuôi poly (A) tại đuôi 3’ (hình 2.4) Gần đây, một protein cấu trúc không glycosyl hóa đã được xác định và biểu hiện từ ORF2b (Snijder và ctv , 1999) Một khung đọc

mở nhỏ ORF2b nằm bao trọn trong ORF2a (Wu và ctv, 2001) ORF1a và ORF1b định

vị xuôi dòng từ đầu 5’-UTR, chúng chiếm giữ khoảng 75% của bộ gen và ghi mã protein không cấu trúc , liên quan đến sự nhân bản của vi-rút (Meulenberg và ctv ,

1997) ORF1a được dịch mã trực tiếp trong khi ORF1b được dịch bởi một khung dịch chuyển ribosom Vùng trùng lắp ORF1a/ORF1b chứa những tín hiệu thúc đẩy khung dịch chuyển này (Snijder và ctv, 1998) ORF 2 - 7 định vị ngược dòng từ 3'-UTR, mã hóa một loạt các protein cấu trúc của vi-rút như: protein vỏ ngoài (E) (envelop protein)

và protein vỏ nhân capsid (N) (nucleocapside protein) (Nelson và ctv, 1995) Chiều dài của ‘5UTR là 190nucleotide cho PRRSV chủng Bắc Mỹ (Nelsen và ctv, 1999) và 221 nucleotide cho PRRSV chủng châu Âu (Meulenberg và ctv, 1995) Vùng 3’UTR

chủng Bắc Mỹ và chủng PRRSV châu Âu lần lượt là 150 và 120 base (Meng và ctv, 1994)

Hạt PRRSV đuợc cấu thành từ 7 protein gồm 4 protein vỏ (envelope glycoprotein) là GP 2a (ghi mã bởi ORF 2a); GP3 (ORF3); GP4 (ORF4) và GP 5 (ORF5); protein màng, M (ORF6); protein vỏ nucleocapsid, N (ORF7); và protein vỏ ngoài, E (ORF2b) Thành phần protein cấu trúc chính trong hạt vi-rút là protein N (14

- 15 kDa), M (18 - 19 kDa) và GP5 (24 - 26 kDa) (Dea và ctv, 2000; Rowland, 2003)

Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen PRRSV (Yanjin Zhang, 2008) Vùng gen tái bản, nằm

ở vùng 5’ của bộ gen, bao gồm 2 vùng gối lên nhau ORF1a và ORF1b, mã hóa thành polyprotein (sau đó polyprotein này sẽ hình thành 12 loại protein không cấu trúc NSP1 - 12) ORF2 đến ORF5 mã hóa cho polyprotein GP2 đến GP5, ORF6 mã hóa protein màng M, và ORF7 mã hóa cho protein nucleocapsid N ORF2b nằm trọn trong vùng ORF2a Những protein này từ ORF2 - ORF7, tất cả biểu hiện thành mRNA

Protein vỏ nucleocapsid, N (14 – 15 kDa) của PRRSV , được qui định bởi ORF7, là protein không glycosyl hóa, không chứa peptide tín hiệu (signal peptide), có

123 hay 128 aa tương ứng với 2 chủng của PRRSV: VR2332 hay Lelystad (Mardassi

và ctv, 1996) Protein N của PRRSV Bắc Mỹ và châu Âu chỉ giống nhau khoảng 63%

về mặ t aa, nhưng chúng có vùng kháng nguyên chung giữa aa vị trí 52 và 69 (Meulenberg và ctv, 1998; Wootton và ctv, 1998) Protein N mang tính kháng nguyên cao và là protein đa dạng nhất trong hạt vi-rút, và đựơc dùng trong chẩn đoán (Casal

và ctv , 1998; Yang và ctv , 2000) Protein N mang vùng chức năng gắn RNA đuợc xem là giữ vai trò quan trọng trong sự sao chép (Rowland, 2003)

Protein GP5 (~ 26 kDa), do ORF5 qui định, là protein biến đổi nhiều nhất giữa các chủng PRRSV Protein GP5 và M (18 – 19 kDa) kết hợp chặt chẽ với nhau và tạo

ra nhị trùng dị hợp (heterodimeric) được liên kết bằng cầu nối disulfide trong hạt virion (Mardassi, 1996) Người ta cho rằng sự hình thành nhị trùng này cần thiết ch o

sự lắp ráp của PRRS V, vì khi không có sự tạo thành phức hợp này do sự vắng mặt hoặc là protein GP5 hoặc là protein M thì không có những hạt vi-rút được giải phóng Tuy nhiên, sự phá vỡ cấu trúc nhị trùng giữa protein GP5 và M không giảm tính gây

nhiễm của vi-rút (Lee C và ctv, 2005) Protein M được xem là có vai trò thiết yếu cho miễn dịch tế bào đ ối với PRRSV vì nó gây ra đáp ứng mạnh nhất trong tất cả protein cấu trúc của PRRS V trong đáp ứng khá ng nguyên đặc hiệu (antigen-specific proliferation responses) (Bautista, 1999)

Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng PRRSV người ta đã xác định rằng ở PRRS V Bắc Mỹ, các khung đọc mở ORF7 và ORF6 có tính ổn định rất cao , chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của các dòng vi-rút này Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng PRRS V châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ , cụ thể, sự tương đồng về trình tự aa của ORF7 giữa 2 dòng vi-rút này chỉ vào khoảng 57 đến 59% và của ORF6 là 70 đến 81% Trong khi đó khung đọc mở ORF 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng một dòng Bắc Mỹ (giống nhau chỉ từ 88 đến 97%) và chỉ tương đồng với dòng châu Âu khoảng từ 51 đến 59% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Thành phần protein cấu trúc khác trong hạt virion PRRSV là protein GP 2 (29 –

30 kDa), GP3 (41 – 50 kDa), và GP4 (31 – 35 kDa) và protein vỏ E (10 kDa) Protein GP2, GP3 và GP4 được nhận định là tương tác với những protein cấu trúc khác và được lắp ráp vào hạt virion như phức hợp đa trùng hợp (multimeric) (Lee và ctv , 2005) Cấu trúc phức hợp này mang chức năng xâm nhập của vi-rút vì những hạt vi-rút thiếu protein vỏ này không thể gây nhiễm (Wissink, 2005) Lee và ctv (2006) cho rằng protein E (ORF2b qui định) cùng với những protein vỏ thứ yếu khác hình thành một kênh làm cho việc cỡi áo của vi-rút trở nên dễ dàng, giúp phóng thích bộ gen của vi-rút vào tế bào chất vật chủ Protein GP3 của dòng châu Âu kết hợp chặt chẽ vào virion, trong khi protein GP 3 của dòng Châu Mỹ là một protein ẩn và có thể hoà tan

(Mardassi, 1998) Sự tương đồng về trình tự aa qui đị nh bởi các khung đọc mở ORF 2,

3 và 4 giữa các dòng châu Mỹ và châu Âu tươn g ứng chỉ ở mức độ từ 63,58 và 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh

Vi-rút rất thích hợp với đại thực bào đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi Chúng xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian thụ thể Người ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế

nang đối với vi-rút và hai thụ thể PRRSV được xác định trên môi trường tế bào FAM (Duan và ctv., 1998b; Delputte và ctv., 2002) Một thụ thể PRRSV được xác định bằng

cách dùng hai kháng thể đơn dòng (Duan và ctv, 1998a) và trên MARC - 145 là vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào

chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Delputte, 2004) Bình thường đại thực bào sẽ tiêu diệt được cả vi khuẩn, vi-rút xâm nhập vào cơ thể, riêng PRRSV có thể nhân lên trong đại thực bào sau đó phá hủy và giết chết đại thực bào tới 40% Do vậy, khi đã

xuất hiện PRRSV trong đàn, chúng thường có xu hướng duy trì sự tồn tại và hoạt động

âm thầm Đại thực bào bị giết chết sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể

từ đó làm tăng nguy cơ nhiễm các bệnh kế phát Điều này có thể thấy rõ ở những đàn heo vỗ béo hoặc chuẩn bị giết thịt có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do

những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp (Nguyễn Văn Thanh, 2007)

2.3 Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

2.3.1 Chẩn đoán PRRSV trên môi trường nuôi cấy tế bào

Việc phân lập vi-rút gặp nhiều khó khăn vì PRRSV chỉ có thể nhân lên trên hai

loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (porcine alveolar macrophage - PAM) và các dòng tế bào thận khỉ mặt xanh Châu Phi (MARC - 145, CL2621) Tuy nhiên theo Yoon và Stevenson (1999) không phải tất cả PRRSV đều phát triển ở cả hai loại tế bào này Han-Kook Chung và ctv (2002) cho rằng PRRSV kiểu gen Bắc Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC - 145, ngược lại PRRSV kiểu gen Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM

Hình 2.5 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV

(http://www.animal-health-online.de) a) Đại thực bào bình thường,

b)Đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV.

2.3.2 Phương pháp kháng thể huỳnh quang (Fluorescent Antibody Staining - FA) và hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry staining - IHC)

Đây là phản ứng đầu tiên được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng PRRSV được gọi là kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp (IPMA) Kỹ thuật này thực hiện

bằng cách gây nhiễm PRRSV trên các dòng tế bào PAM, CL2621, MARC - 145 Sau

đó tế bào được gây nhiễm sẽ được cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ và được cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase) Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng vi-rút thì 30 - 50% tế bào

sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch tạo màu trong 30 phút Trong

chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, người ta thường sử dụng IPMA do độ nhạy của IPMA cao hơn ELISA Xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7 - 15 ngày

và có thể phát hiện kháng thể đặc hiệu từ 2 - 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV Sự thay đổi kháng nguyên giữa các chủng có liên quan đến kết quả của phản ứng (Nguyễn

hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng

hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate) Sự hiện diện của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ

mẫu có kháng thể kháng vi-rút Phản ứng cho phép phát hiện kháng thể kháng vi-rút đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Ưu điểm của phương pháp này

là hiệu giá kháng thể có thể được xác định trong giới hạn rộng và hữu dụng trong các trường hợp mới nhiễm hay cấp tính Nhược điểm của IFA và IPMA là không thể làm

tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn

2.3.4 Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSV

Trong những năm gần đây, phương pháp RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reation) được sử dụng nhiều để phát hiện PRRSV trong huyết thanh

và các mẫu xét nghiệm khác (Christopher-Hennings và ctv, 1995; Legeay và ctv, 1997; Spagnuolo-Weaver và ctv, 2000; Christopher-Hennings và ctv, 2001) và phân biệt hai chủng châu Âu và Bắc Mỹ (Mardassi và ctv, 1994; Egli và ctv, 2001) Kỹ

thuật RT-PCR có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm ngắn vì thế đựơc dùng rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện PRRSV Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV có thể dùng kỹ thuật nested RT -PCR (RT-nPCR) RT-PCR được thực hiện với các cặp mồi khác nhau cho phép phát hiện gen của các ORF7, ORF6 hay ORF1b của PRRSV PRRSV có 2 chủng: Châu Âu và Châu Mỹ Hai chủng này có độ tương đồng về gen khoảng 52 đến 81% Dựa trên cở sở đó nhiều cặp mồi đã được thiết kế đề phát hiện PRRSV nói chung và để phân biệt dòng PRRSV Bắc Mỹ với châu Âu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.4 Kỹ thuật real time RT-PCR

Kỹ thuật real time RT-PCR là sự kết hợp của phương pháp tổng hợp cDNA từ mồi ngẫu nhiên và kỹ thuật real time PCR Kỹ thuật này có ý nghĩa quan trọng trong

việc định lượng nhanh, hiệu quả các vật liệu di truyền có bản chất RNA Đầu tiên, RNA sẽ được chuyển thành cDNA nhờ reverse transcriptase và sản phẩm cDNA sẽ tạo nguồn nguyên liệu cho phản ứng real time PCR

2.4.1 Kỹ thuật real time PCR

Trong những phương pháp PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phân tích tại điểm kết thúc phản ứng bằng cách điện di trên gel agarose Trong khi đó, kỹ thuật real time PCR có thể phân tích kết quả ngay khi phản ứng đang xảy ra

2.4.1.1 Nguyên tắc kỹ thuật real time PCR

Định lượng vi-rút thường cung cấp thông tin giá trị cả những nghiên cứu về chẩn đoán và mầm bệnh Trong những năm gần đây, phương pháp real time PCR được phát triển trong định lượng, và chẩn đoán mầm bệnh vi-rút Cách tiếp cận cho phép định lượng nhanh mục tiêu RNA, DNA đích trong một eppendorf đã cải thiện nhiều tính đặc hiệu và cho phép phát hiện nhiều gen đích trong mẫu Real time PCR định lượng (qPCR) được xem là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác

nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu xét nghiệm Khác với việc định lượng khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng số lượng DNA ngay khi phản ứng đang xảy ra (đây là ý nghĩa của từ ”real time”) Trong

kỹ thuật này, ở mỗi chu kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu

huỳnh quang nhất định Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỷ lệ thuận

với mỗi chu kỳ khuếch đại thành công của phản ứng real time PCR Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu

sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng tín hiệu quỳnh quang Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang gọi là mẫu dò Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ phát hiện huỳnh quang được sử dụng để kiểm soát tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy

ra Tín hiệu huỳnh quang được đo lường phản ánh số sản phẩm khuếch đại sau mỗi chu kỳ Kết quả của real time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt

một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA)

Như vậy, bằng cách ghi nhận lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu

kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng Sự gia tăng đầu tiên của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu Hiệu quả của kỹ thuật real time PCR dựa trên cả hóa chất dùng để định lượng và kiểm soát phản ứng khuếch đại và công cụ để phát hiện các tín hiệu

huỳnh quang

2.4.1.2 Hóa chất định lượng

Có nhiều loại hóa chất được sử dụng trong phản ứng real time PCR cho việc định lượng DNA Chúng có thể chia thành 2 loại chính:

- Thuốc nhuộm xen giữa DNA: ethidium bromide, SYBR Green I, EvaGreen

- Mẫu dò lai: Taqman, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Molecular Beacons, Scorpions và Taqman Minor Groove Binder

a) SYBR Green I

SYBR Green I là một loại thuốc nhuộm khá hiệu quả so với các loại thuốc nhuộm khác, và tính dễ dàng sử dụng, cho phép tối ưu hóa cho bất cứ hóa chất qPCR Khi thuốc nhuộm SYBR Green I gắn với DNA mạch đôi, mà không gắn với DNA

mạch đơn Kết quả là tín hiệu huỳnh quang (bước sóng kích thích khoảng 488 nm và

254 nm; bước sóng phát quang 560 nm) được gia tăng rất nhiều (khoảng 800 đến 1000 lần) Khi phản ứng PCR bắt đầu, sự gia tăng số lượng trình tự DNA mới được tổng

hợp sẽ làm tăng lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra

Ưu điểm của việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA là thiết kế phản ứng đơn

giản (chỉ cần 2 đoạn mồi, không cần thiết kế mẫu dò), kiểm tra được nhiều gen nhanh chóng mà không cần thiết kế mẫu dò khác nhau, chi phí ban đầu thấp Một điểm hạn chế của việc định lượng bằng SYBR Green I là hóa chất này liên kết không đặc hiệu

với DNA mạch đôi Vì vậy, mọi trình tự DNA mạch đôi trong phản ứng đều được định

lượng, cho dù đó là sản phẩm PCR không đặc hiệu hay nhị trùng của đoạn mồi Để

giải quyết vấn đề này, việc phân tích một đường cong nhiệt độ nóng chảy (melt curve)

cần được thực hiện là rất cần thiết Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy được dùng để nhận diện các sản phẩm khác nhau như sự tạp nhiễm, đoạn mồi bắt nhằm vị trí, hay nhị trùng của đoạn mồi Khi chu kỳ cuối kết thúc, một phản ứng nhiệt độ nóng

chảy được tiến hành bằng cách gia tăng nhiệt độ từng bước và kiểm soát tính hiệu

huỳnh quang tại mỗi bước Khi DNA mạch đôi trong phản ứng bị biến tính, tín hiệu

huỳnh quang bị sụt giảm Sự sụt giảm tín hiệu huỳnh quang này được thể hiện trên đồ thị Tại nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại (Tm nhiệt độ mà tại đó 50% cặp base của một DNA mạch đôi bị tách ra) xuất hiện một đỉnh đặc trưng phân biệt nó với các sản phẩm khác (nhị trùng của đoạn mồi) nóng chảy ở nhiệt độ khác Do mỗi chuỗi DNA mạch đôi đều có một nhiệt độ nóng chảy khác nhau, ta có thể xác định các thành

phần có nhiệt độ nóng chảy khác nhau trong phản ứng và do đó, có thể loại bỏ các kết

quả không đặc hiệu khi định lượng

Hình 2.6 Thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green I liên kết với

DNA trong phản ứng real time PCR (Bio-Rad, 2006)

(b) Thuốc nhuộm huỳnh quang EvaGreen

SsoFast EvaGreen supermix sử dụng công nghệ protein hợp nhất Sso7d (Sso7d fusion protein) giúp tối ưu hóa hiệu quả khuếch đại, độ nhạy và tín hiệu huỳnh quang

mạnh thích hợp cho những quy trình truyền thống và nhanh trong qPCR Khả năng khuếch đại đặc hiệu cao là rất quan trong cho một phản ứng qPCR thành công, bởi vì thuốc nhuộm EvaGreen liên kết và phát hiện tất cả các DNA mạch đôi được nhân lên trong quá trình khuếch đại Đặc tính khởi đầu bởi nhiệt qua trung gian kháng thể được thực hiện bởi Sso7d-fusion polimerase cô lập hoạt tính enzyme trước bước biến tính đầu tiên Sau khi hoạt hóa bởi nhiệt, kháng thể biến tính không thuận nghịch, giải phóng hoàn toàn hoạt tính DNA polimerase Điều này cho phép làm tăng tính hiệu quả

và tính đặc hiệu

Sso7d-fusion polymerase cho phép thực hiện chu kỳ nhanh mà không gây ảnh hưởng đến độ nhạy, tính hiệu quả, và độ lập lại Protein liên kết DNA mạch đôi (dsDNA-binding protein), Sso7d, ổn định hoạt tính polymerase: tăng tiến trình và cung cấp tốc độ tối ưu và giảm thời gian phản ứng so với quy trình khuếch đại bình thường EvaGreen là loại thuốc nhuộm huỳnh quang acid nhân với đặc tính tương tự như SYBR Green I và các chất nhuộm khác Tuy nhiên, không giống như SYBR Green I, EvaGreen thể hiện rất thấp tính ức chế phản ứng PCR, điều này tạo nên một sự lựa chọn lý tưởng cho những quy trình qPCR nhanh Như vậy, nó có thể được dùng với nồng độ cao để nhân lên tín hiệu huỳnh quang lớn hơn và tăng độ nhạy

Một phản ứng real time PCR đòi hỏi sản phẩm phải đặc hiệu và hiệu quả Cả đoạn mồi và trình tự đích ảnh hưởng đến hiệu quả này Vì vậy, cần cẩn thận lựa chọn

một trình tự đích và thiết kế đoạn mồi phù hợp với nó Phản ứng real time PCR dựa trên EvaGreen phụ thuộc hoàn toàn đoạn mồi thiết kế Nếu cặp đoạn mồi không tạo ra liên kết không đặc hiệu, cấu trúc bậc 2 hoặc nhị trùng, thì tối ưu hóa hiệu quả và độ đặc hiệu khuếch đại là những bước quan trọng

Để thiết kế trình tự khuếch đại, cần tuân thủ các nguyên tắc sau:

- Thiết kế trình tự khuếch đại từ 75 – 200 bp Trình tự càng ngắn thì hiệu quả khuếch đại càng cao Tuy nhiên chúng cần dài hơn 75 bp để có thể phân biệt

với các trình tự nhị trùng của đoạn mồi có khả năng tạo ra Và cũng không quá

200 bp vì như vậy sẽ khó đạt hiệu quả PCR lý tưởng và như vậy thì biểu đồ chuẩn sẽ không đạt để có thể cho được kết quả định lượng chính xác Tuy nhiên, trong một số trường hợp đặc biệt như cần phân biệt chủng, khuếch đại vùng bảo tồn trong khi loài có sự khác biệt về di truyền thì những sản phẩm khuếch đại có kích thước lớn vẫn được chấp nhận Thêm vào đó, SsoFast

EvaGreen supermix cho phép khuếch đại những sản phẩm có kích lớn đến 1 kb

mà vẫn đạt được hiệu quả khuếch đại cao (Bio-Rad, 2009)

- Tránh việc một base đơn được lập lại bốn lần liên tục trong khuôn DNA

- Duy trì hàm lượng CG của sản phẩm khuếch đại ở 50 - 60%

Để thiết kế đoạn mồi cho real time PCR dùng màu huỳnh quang chèn cũng tuân theo các quy luật thiết kế mồi chung cho PCR cần chú ý các nguyên tắc sau:

- Thiết kế đoạn mồi với hàm lượng CG từ 50 - 60%

- Kiểm soát nhiệt độ nóng chảy (Tm) ở giữa 50 và 65o

C

- Tránh lập lại base C và G hơn 3 lần

- Thiết kế base C và G ở đầu cuối của đoạn mồi

- Kiểm tra trình tự đoạn mồi xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp bổ sung ở đầu 3’

- Nên thiết kế để nhiệt độ bắt cặp tối hảo từ 55 - 65oC để không bị khuếch đại không đặc hiệu vì nhiệt độ bắt cặp quá thấp

(c) Mẫu dò phân hủy (Taqman probe)

Vấn đề về tính đặc hiệu của phản ứng định lượng đã được giải quyết bằng cách

sử dụng các mẫu dò có trình tự đặc hiệu gắn với chất phát quang được thiết kế bên trong cặp mồi của phản ứng PCR Quá trình liên kết và phân hủy của các mẫu dò này thường không gây ảnh hưởng cho việc khuếch đại DNA Có nhiều cách khác nhau, tuy nhiên một phương pháp khá đơn giản được tìm hiểu, đó là mẫu dò Taqman

Phương pháp Taqman dựa trên khả năng 5’ - 3’ exonuclease của Taq DNA

polymerase để cắt đứt một mẫu dò trong phản ứng PCR Taqman thông thường là một chuỗi oligonucleotide dài khoảng 20 - 30 base (thường nó có nhiệt độ nóng chảy cao hơn 10o

C so với nhiệt độ nóng chảy của mồi) có gắn thuốc nhuộm phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một thuốc nhuộm hấp thu ở đầu 3’ Do đầu 3’ bị khóa, mẫu dò không thể được kéo dài như một mồi Trong phản ứng PCR, với sự hiện diện của gen đích, mẫu

dò liên kết đặc hiệu ở giữa hai mồi xuôi và ngược Khi mẫu dò còn nguyên vẹn, thuốc nhuộm hấp thu ở gần thuốc nhuộm phát huỳnh quang làm cho tín hiệu huỳnh quang bị triệt tiêu chủ yếu do hiệu ứng chuyển năng lượng kiểu Forster Khi phản ứng PCR xảy

ra, hoạt động 5’ - 3’ exonuclease của Taq DNA Polymerase sẽ phá hủy trình tự mẫu dò

khi và chỉ khi mẫu dò này liên kết với gen đích Lúc này, thuốc nhuộm phát huỳnh quang sẽ cách xa thuốc nhuộm hấp thu và chúng sẽ phát quang Vì vậy, lượng DNA

được tích lũy sẽ được phát hiện qua sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang Quá trình này xảy ra trong mỗi chu kỳ và không gây cản trở việc khuếch đại DNA Trong phương pháp này, mẫu dò Taqman phóng thích chất phát quang cộng thêm vào chất phát quang đã được phóng thích trong các chu kỳ trước đó Vì vậy lượng tín hiệu

huỳnh quang gia tăng rất nhiều sau mỗi chu kỳ Phương pháp này sử dụng các chương trình nhiệt của một phản ứng PCR bình thường Một yêu cầu đặc biệt đối với mẫu dò

là nó không được có base G ở đầu 5’ Vì base G có thể triệt tiêu thuốc nhuộm phát

huỳnh quang ngay cả khi mẫu dò đã bị phá hủy

Hình 2.7 Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman (Bio-Rad, 2006)

Gần đây, kỹ thuật real time RT-PCR dùng mẫu dò Taqman đã được sử dụng thành công để phát hiện chủng và định lượng RNA của PRRSV (Chung và ctv., 2005; Egli và ctv., 2001; van Rijn và ctv., 2004; van Vugtet và ctv, 2001; Wasilk và ctv., 2004) Những thí nghiệm này với độ nhạy ổn định và đạt tính đặc hiệu cao qua sự kết

hợp giữa đoạn mồi và mẫu dò đặc hiệu Điều trở ngại nhất của dùng Taqman là việc thiết kế và tính đặc hiệu mẫu dò để lập một thí nghiệm hiệu quả và kết quả âm tính giả trên trình tự DNA do mức độ biến động trong mặt kiên kết với mẫu dò (Anderson và ctv, 2003; Hughes và ctv, 2004; Papin và ctv, 2004)

PRRSV có độ biến động di truyền cao và do đó việc thiết kế hệ thống phát hiện PRRSV là rất khó khăn Ponchel và ctv (2003) đề xuất một phương pháp thay thế cho việc phân tích real ime RT-PCR là dùng SYBR Green Tuy dùng SYBR Green có thể

cho kết quả sai nhưng phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy cho thấy là một hướng đơn giản và trung thực để kiểm tra những phản ứng dựa trên SYBR Green cho dương tính giả hay đảm bảo tính đặc hiệu phản ứng Phương pháp real time RT-PCR dựa trên phân tích nhiệt độ nóng chảy đã thành công để định lượng và xác định kiểu gen đa

dạng cho người, vi-rút gia súc, vi khuẩn, ký sinh trùng

2.4.1.3 Công cụ phát hiện

Việc phát hiện sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang để định lượng DNA đòi hỏi các công cụ khá phức tạp Có nhiều công ty trên thế giới đã phát triển các loại phương pháp phục vụ cho việc này Trong khóa luận này chúng tôi sử dụng hệ thống máy CFX96 REAL TIME PCR System

Hình 2.8 Hệ thống CFX96 REAL TIME PCR System (Bio-Rad, 2009).

2.4.1.4 Phân tích dữ liệu real time PCR

Khả năng của phản ứng real time PCR là nó cho phép định lượng ngay trong giai đoạn DNA khuếch đại gia tăng theo hàm mũ, mà không ở giai đoạn cuối cùng khi lượng DNA bão hòa Điều này nâng cao độ chính xác của việc định lượng do có sự tương quan trực tiếp giữa lượng DNA ban đầu và giai đoạn mà tại đó toàn bộ DNA được nhân đôi sau mỗi chu kỳ

Trong phản ứng real time PCR, chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, Ct) được định nghĩa là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang có giá trị cao hơn đáng kể so với tín

hiệu nền nhưng vẫn nằm trong giai đoạn log tuyến tính Lượng DNA ban đầu càng nhiều thì lượng DNA khuếch đại được phát hiện càng sớm và giá trị Ct càng thấp Do

vậy, Ct được sử dụng làm công cụ để tính toán lượng DNA ban đầu trong mỗi phản ứng Chu kỳ ngưỡng này cần được thiết lập phía trên đường tín hiệu nền và nằm trong pha tăng trưởng hàm mũ, tại nơi mà đồ thị khuếch đại giống nhau nhất

(a) Đồ thị biểu diễn đường chuẩn

Đường chuẩn được thiết lập nên từ 5 nồng độ chuẩn được pha loãng ở hình 2.10 với trục tung: chu kỳ ngưỡng - Ct (threshold cycle), và trục hoành: giá trị logarit của

số lượng bản sao ban đầu (Log Starting Quantity) có đơn vị là số bản sao (copy number) Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu (X) và chu

kỳ ngưỡng (Y) Thông qua chu kỳ ngưỡng được thể hiện qua hình 2.9, giá trị log số

bản sao ban đầu được xác định theo phương trình Y = a.X + b Đồ thị này còn thể hiện các mẫu dương tính qua các mẫu cần kiểm tra (unknown), các hiển thị tương ứng với chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu trên đường chuẩn

Thêm vào đó, một đối chứng âm (NTC - no template control) cần được thêm vào trong mỗi thí nghiệm

Phương trình hồi quy tuyến tính gồm các thông số cần phân tích thể hiện trên đường chuẩn bao gồm: hệ số tương quan (R2

) (correlation coefficient), hiệu quả phản ứng (PCR efficiency) và độ nghiêng (slope)

Hình 2.9 Biểu đồ khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh

quang (Phạm Hùng Vân, 2009).

Hình 2.10 Đường chuẩn cho phản ứng định lượng

− Hệ số tương quan (correlation coefficient)

Hệ số tương quan được đánh giá mức độ tối ưu của phản ứng real time PCR Hệ

số tương quan càng cao tương ứng với các thông số thí nghiệm càng chính xác và phù

hợp với giá trị mong đợi Hệ số tương quan có giá trị giữa 0 và 1 Sự khác biệt lớn của các giá trị chi kỳ ngưỡng qua các lần lập lại sẽ làm giảm giá trị r hay R2.Trong phản ứng PCR định lượng, giá trị tuyệt đối của r cần phải trên 0.990 hay giá trị R2

phải lớn hơn 0.980 (Bio-Rad, 2004)

− Hiệu quả phản ứng và độ nghiêng

Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan chặt chẽ với hiệu quả phản ứng Hiệu

quả phản ứng sẽ cho biết các thông tin có giá trị về hóa chất phản ứng Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan với hiệu quả phản ứng qua phương trình sau: Hiệu quả (efficiency) = [10(-1/slope)] – 1 (slope: độ nghiêng) Theo lý thuyết, trong giai đoạn khuếch đại hàm mũ, có số lượng mạch khuôn mẫu (template) tăng gấp đôi sau mỗi chu

kỳ thì độ nghiêng là – 3,322 cho hiệu quả 100% Hiệu quả khuếch đại có giá trị gần 100% là một chỉ thị tốt nhất cho một phản ứng chính xác và lập lại Trong thí nghiệm,

hiệu quả khuếch đại cần đạt được từ 90 - 105% Độ nghiêng thấp hơn – 3,322 cho thấy hiệu quả phản ứng thấp hơn 100% Hầu hết các phản ứng đều không đạt tới 100% do các giới hạn thí nghiệm như do đoạn mồi được thiết kế kém hay điều kiện tối ưu hóa

thấp Độ nghiêng cao hơn – 3,322 cho hiệu quả phản ứng real time PCR cao hơn 100% Nguyên nhân có thể do thao tác bơm hút mẫu sai trong dãy pha loãng hay sự

đồng khuếch đại của của các sản phẩm không đặc hiệu như nhị trùng của đoạn mồi Điều này cũng có thể do các giá trị được đo ở giai đoạn không có sự tuyến tính giữa

nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ hay do sự hiện diện của các chất ức chế trong phản ứng (QIagen, 2004)

(b) Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy

Đôi khi tín hiệu không đặc hiệu không tránh khỏi được, thì việc phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy là rất quan trọng Chức năng phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy của thiết bị real time PCR có thể được sử dụng để phân biệt sản phẩm đặc hiệu và không đặc hiệu Sự thay đổi lượng tín hiệu huỳnh quang dưới tác động của nhiệt độ được thể hiện trên đồ thị Đỉnh thể hiện giá trị Tm của sản phẩm PCR Sau khi phản ứng khuếch đại hoàn tất, phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy được tiến hành bằng cách gia tăng nhiệt độ từng bước và kiểm soát tín hiệu huỳnh quang tại mỗi bước Khi DNA mạch đôi trong phản ứng bị biến tính, tín hiệu huỳnh quang bị sụt giảm Sự giảm tín hiệu huỳnh quang này được biểu hiện trên đồ thị

Hình 2.11 Biểu đồ phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy

(Bio-Rad, 2006)

Tại nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại (Tm, nhiệt độ mà tại đó 50%

cặp base của một DNA mạch đôi bị tách ra) xuất hiện một đỉnh đặc trưng Tm phụ thuộc một phần vào thành phần base trong sản phẩm khuếch đại được hình thành Tất

cả sản phẩm khi dùng cùng một cặp đoạn mồi đặc hiệu thì nó sẽ có cùng Tm, trừ

những sản phẩm giả do tạp nhiễm, đoạn mồi bắt nhầm hay do nhị trùng của đoạn mồi

Nếu có sự tương đồng về chiều dài sản phẩm, một đường cong đơn (single thermal transition) được phát hiện Ngược lại, nếu có hơn hai sản phẩm không tương đồng về chiều dài thì nó tạo nhiều đỉnh

Khi phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy, cần tập trung vào hai khía cạnh,

sự hiện diện sản phẩm nóng chảy đơn (single melting product) và đánh giá mẫu NTC cho việc hình thành nhị trùng của đoạn mồi Nếu hai thông số trên đáng tin cậy thì giá

trị Ct thu được có thể tin là chính xác

2.4.1.5 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm của kỹ thuật này là khả năng định lượng chính xác số DNA tham gia

phản ứng, quan sát trực tiếp tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi

phản ứng real time PCR xảy ra (Bio-Rad, 2004) Ngoài ra, real time PCR còn thể hiện một số ưu điểm nổi bật (Nguyễn Thái Thủy, 2003): không cần điện di sau khi thực

hiện phản ứng real time PCR; quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn

thời gian cho kết quả; độ nhạy cao; tính đặc hiệu cao; ống phản ứng PCR luôn luôn đóng, tránh nguy cơ ngoại nhiễm Tuy nhiên, trong việc ứng dụng các phương pháp

chẩn đoán phân tử, bất lợi đầu tiên của real time RT-PCR cho việc phát hiện vi-rút

nằm ở nhu cầu liên quan đến thiết bị đắt tiền và hiện đại

2.4.1.6 Ứng dụng

Real time PCR cũng được ứng dụng vào trong các lĩnh vực tương tự như PCR truyền thống Nhờ khả năng thu nhận tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số DNA đích ở pha cấp số, real time PCR được mở rộng thêm nhiều ứng dụng mới và hiệu quả hơn PCR truyền thống (Applied Biosystems, 2004):

− Định lượng hàm lượng vi-rút

− Định lượng mức độ biểu hiện gen

− Phát hiện tác nhân gây bệnh

− Xác định kiểu gen (genotyping)

− Ứng dụng hiệu quả trong trị liệu thuốc

Đối với tác nhân gây bệnh là vi-rút, real time PCR đóng vai trò rất quan trọng trong phát hiện và định lượng tác nhân gây bệnh này Vi-rút gây bệnh rối loạn hô hấp

và sinh sản trên heo đang là mối quan tâm chung của ngành chăn nuôi Một trong

những ứng dụng đáng được quan tâm hiện nay đó là sử dụng kỹ thuật real time PCR trong phát hiện và định lượng vi-rút gây bệnh này

RT-2.4.2 Phương pháp tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên

Phương pháp tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên hay còn gọi là phản ứng RT (reverse transcription) là phản ứng sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotide (random hexaner primer) mà không cần mồi đặc hiệu để tổng hợp toàn bộ RNA từ mẫu thử thành cDNA từ RNA nhờ reverse transcriptase Bao nhiêu RNA tồn tại trong mẫu thì lượng cDNA sẽ được tạo thành tương ứng bấy nhiêu Ngoài ra trong hệ thống phản ứng còn có men RNAse H để cắt bỏ RNA bị bắt cặp vào cDNA sau khi phiên mã ngược thành cDNA mạch đơn

2.5 Sơ lược các nghiên cứu có liên quan

2.5.1 Trên thế giới

Phương pháp real time RT-PCR sử dụng SYBR Green I hoặc Taqman khá phổ

biến để phát hiện hai chủng PRRSV châu Âu và Bắc Mỹ (Egli và ctv, 2001; Wasilk và ctv, 2004; Chung và ctv, 2005; Chen và ctv, 2008, Balka và ctv, 2009; Chen và ctv; 2009) Tuy nhiên sử dụng mồi Taqman đòi hỏi sự bắt cặp chính xác giữa mẫu dò và vùng mục tiêu, nếu không độ nhạy có thể sẽ giảm đi

Wasilk và ctv (2004) đã phát triển phương pháp real time RT-PCR để phát hiện vi-rút và đo lường nồng độ vi-rút trong huyết thanh hoặc tinh dịch bằng cách so sánh với nested RT-PCR về độ nhạy và tính đặc hiệu Ngoài ra, việc định lượng của real time RT-PCR giúp ích cho việc nghiên cứu sinh bệnh học, điều trị và nghiên cứu hiệu

quả vacxin

Martinez và ctv (2008) áp dụng real time RT-PCR với SYBR Green phát hiện đồng thời hai chủng NA và EU Kết quả cho thấy độ nhạy của phương pháp này đạt 100% cao hơn RT-PCR (97,5%) khi xét nghiệm trên cùng mẫu

Xiao và ctv (2008) phát hiện PRRSV gây độc lực cao gây ra trận dịch lớn tại Trung Quốc năm 2006 bằng kỹ thuật real time PCR với mẫu dò Taqman Kết quả cho

biết PRRSV được phát hiện với độ nhạy 105 bản sao

Lurchachaiwong và ctv (2008) sử dụng real time RT-PCR để phát hiện nhanh

và xác định chủng (NA và EU) của PRRSV với SYBR Green I, Taqman và giải trình

tự Kết quả phát hiện vi-rút với độ nhạy là 104 bản sao với SYBR Green I, và với mẫu

dò Taqman là 103 bản sao Kết quả nghiên cứu cũng cho biết khi xét nghiệm 112 mẫu

ở phương pháp RT-PCR cho 18 trường hợp dương tính trong khi real time RT-PCR dùng Taqman và giải trình tự cho 20 mẫu dương tính

2.5.2 Trong nước

Trần Thị Bích Liên và Tr ần Thị Dân (2007), xác định tỷ lệ nhiễm PRRSV tại

một số cơ sở chăn nuôi heo miền Đông Nam Bộ Khảo sát được tiến hành trên 1082

mẫu huyết thanh thu thập từ 21 trại chăn nuôi công nghiệp và hộ chăn nuôi của hai

tỉnh/thành (gọi là khu vực) thuộc miền Đông Nam bộ trong các năm 2003 – 2005 Xác định tỷ lệ nhiễm và chủng PRRS dựa vào sự phát hiện kháng thể kháng PRRSV bằng

kỹ thuật ELISA

Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2007) chẩn đoán vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) bằng kỹ thuật RT-PCR, thực hiện với cặp mồi Rovira 1

và Rovira 2 (Rovira, 2000), và cặp mồi P1, P2 (Donadeau, 1999) nhằm phát hiện PRRSV trong huyết thanh, tinh dịch, mô phổi, mô hạch

Kim Văn Phúc và ctv (2007) sử dụng nested RT-PCR trên 23 mẫu khảo sát cho

kết quả là các mẫu nhiễm chủng PRRSV Bắc Mỹ, không tìm thấy chủng PRRSV châu

Âu

Lê Thanh Hòa và ctv (2008) phân tích trình tự ORF6 trên mẫu heo bệnh tại Quãng Nam (TXMT1), kết quả cho thấy TXMT1 này thuộc chủng NA, có tỷ lệ đồng

nhất về thành phần nucleotide và tỷ lệ tương đồng về aa rất cao (99 - 100%) với các

chủng của Trung Quốc; thấp hơn so với chủng VR2332 (94% về nucleotide, 96% về aa); và rất thấp với chủng Lelystad (69% nucleotide; 79% aa) Điều này cho thấy chủng TXMT1 của Việt Nam có biến đổi di truyền cao, có thể có cùng nguồn gốc phát sinh với các chủng PRRSV độc lực cao của Trung Quốc

Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2010), phân tích ORF5 của PRRSV tại Đồng Nai và

Tp Hồ Chí Minh cho thấy vi-rút thuộc nhóm Bắc Mỹ cùng nhóm với chủng PRRSV độc lực cao của Trung Quốc So sánh trình tự aa của protein GP5 giữa các chủng PRRSV Tp HCM và Đồng Nai với chủng vacxin BSL-PS100 cho thấy không có sự

mất hay thêm vào, có sự khác biệt lớn tại vùng peptide tín hiệu (aa 1 - 31), vùng chức năng trung hòa sơ cấp, vùng chức năng không trung hòa và mang tính trội miễn dịch

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 23/12/2010 đến 15/6/2011 tại Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường và Công ty TNHH Nam Khoa

3.2 N ội dung nghiên cứu

− Gắn đoạn gen ORF7 vào plasmid pGEM T Easy và chuyển vào tế bào chủ E

− Xây dựng quy trình định lượng và định chủng PRRSV bằng real time RT-PCR

3.3 Vật liệu và hóa chất

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu máu từ những cá thể heo nghi ngờ bị nhiễm PRRSV

Vacxin nhược độc PRRSV IngelVac (thuộc chủng PRRSV Bắc Mỹ) của hãng Boehringer Ingelheim VET, Đức, và vacxin nhược độc AmperVac (thuộc chủng PRRSV châu Âu) của hãng Hipra, Tây Ban Nha sản xuất

Dịch PRRSV chủng Bắc Mỹ nuôi cấy tế bào MARC - 145 do công ty Navetco cung cấp

− Carrier RNA (poly A)

Hóa chất và dụng cụ trong điện di gel TBE

− Dung dịch đệm TBE 10X (Promega)

− Agarose (Promega)

− Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 6X (Promega)

− Dung dịch ethidium bromide (invitrogen)

− Thang DNA chuẩn

Hóa chất dùng trong phản ứng tạo plasmid DNA

− Bộ kit pGEM T Easy Vectors system (Promega)

o pGEM T Easy Vector

o T4 DNA Ligase

o 2X Rapid Ligation Buffer

− Dung dịch CaCl2 100 mM, Glycerol 98%

− Môi trường LB

− Ampiciline 50 mg/ml

− IPTG 40 mg/ml

− X-Gal 20 mg/ml

Bộ kit ly trích plasmid AurumTM

Plasmid Mini Kit (Bio-Rad)

− Resuspension solution (dung dịch hòa tan)

− Lysis solution (dung dịch phân giải)

− Neutralization solution (dung dịch trung hòa)

− Wash solution (dung dịch rửa)

− Elution solution (dung dịch tách rửa)

Hóa chất dùng trong phản ứng RT-PCR (Bộ kit QIAGEN OneStep RT-PCR)

− QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix

− QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer, 5X

− dNTP Mix

− Nước không RNase

Hóa chất dùng trong phản ứng real time RT-PCR

− Bộ kit Using the High Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems)

− SsoFastTM

EvaGreen® Supermix (Bio-Rad) Thiết bị và dụng cụ

− Tủ cấy vô trùng

− Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C)

− Máy spin down

− Bộ nguồn và bồn điện di (Bio-Rad)

− Micropipet, đầu tip và eppendorf

− Hệ thống real time PCR CFX96 (Bio-Rad)

3.4 Phương pháp tiến hành

3.4.1 Thu nhận mẫu

Mẫu máu và mẫu ngoáy hầu họng được thu nhận từ những heo 4 – 8 tuần tuổi

có biểu hiện lâm sàng nghi nhiễm PRRSV Mẫu được trữ đông ở -70oC cho đến khi ly trích

Bảng 3.1 Nguồn mẫu nghiên cứu

Thời gian phân lập

(4)

Đặc điểm mẫu (5)

Bảng 3.1 (tt) Nguồn mẫu nghiên cứu

23 Pos NA Dịch tế bào 2010 Dịch nuôi cấy tế bào

3.4.2 Ly trích RNA từ huyết thanh

 Quy trình ly trích RNA theo b ộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit

Kiểm tra dung dịch đệm AW1 và AW2 đã pha và để ổn định ở nhiệt độ phòng Hoà tan lại khối kết tủa dung dich đệm AVL/Carrier RNA bằng nhiệt nếu cần thiết và giữ ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

Bước 1: Cho 560 µl dung dịch đệm AVL có chứa Carrier RNA vào một eppendorf 1,5 ml

Bước 2: Cho 140 µl mẫu vào eppendorf có chứa dung dịch đệm ở trên Rung

lắc nhẹ để trộn đều trong 15 giây Nếu mẫu cần phải rã đông thì chỉ nên rã đông một lần