ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DO VI RÚT DENGUE GÂY RA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT

DO VI RÚT DENGUE GÂY RA

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LIỆU Niên khóa: 2007 - 2011

Tháng 7/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT

DO VI RÚT DENGUE GÂY RA

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

Tháng 7/2011

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các quý thầy cô, các anh chị ở bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã luôn chỉ dạy, truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt 4 năm học tại trường

Thanh Huệ đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho em những kiến thức bổ ích, giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các cô, các chú, cùng các chị làm việc trong khoa Vi sinh vật - Bệnh viện 175 đã hỗ trợ em trong suốt quá trình em làm khóa luận tại đây Con xin bày tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, người đã luôn tận tình nuôi dưỡng luôn quan tâm và ủng hộ con để con đạt được những gì tốt đẹp nhất ngày hôm nay

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể DH07SH, những người bạn đồng hành, luôn giúp đỡ, động viên tôi suốt 4 năm qua

TÓM TẮT

Bệnh sốt Dengue và bệnh sốt xuất huyết Dengue có thể xuất hiện ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt phổ biến ở các nước nhiệt đới trong đó có Việt Nam Trong vùng dịch lưu hành, mọi lứa tuổi đều có thể bị nhiễm vi rút Dengue

Hiện nay, nhiều phương pháp được ứng dụng để chẩn đoán phát hiện nhiễm vi rút Dengue trên bệnh nhân như huyết thanh học, nuôi cấy vi rút, sinh học phân tử…Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch trong chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue được coi là một trong những phương pháp đơn giản, hiệu quả, có độ đặc hiệu cao và cho kết quả nhanh

Tôi đã tiến hành khảo sát trên 869 mẫu huyết thanh được thu thập trên bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện 175 Trong số đó có 370/869 mẫu dương tính, chiếm 42,58%, bao gồm: 54/370 trường hợp IgM dương tính (14,59%); 212/370 trường hợp dương tính cả 2 kháng thể IgM và IgG (57,3%) và 104/370 trường hợp chỉ dương tính với IgG (28,11%) Tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ em là 48% và ở người lớn là 42,42%, (p > 0,05) Tỷ lệ bệnh cao vào một số tháng là : tháng 6 (46%); tháng 10 (42,52%); tháng 11 (50,84%); tháng 12(53,5%) Tỷ lệ mắc bệnh giữa nữ (42,64%) và nam (42,11%) không có sự khác biệt, với p > 0,05 Test SD BIOLINE Dengue IgM/IgG dựa trên cơ sở sắc ký miễn dịch có thể áp dụng rộng rãi để phát hiện sớm các trường hợp nhiễm vi rút Dengue và có thể phân biệt được sơ nhiễm hay tái nhiễm

be infected with Dengue virus

Curently, there are several methods be used to diagnosis of Dengue hemorrhagic fever such as: serology, viral culture, molecular biology,…However, using the immunochromatography techniques in diagnosis of Dengue hemorrhagic fever is considered one of the methods of simple, efficient and high specificity, and giving rapid results

Acute-phase blood samples were collected from 869 patients attending outpatient and inpatient departments with clinical suspicion of dengue infection in Hospital 175

A total of 370 (42,58%) patients were found to be antibody positive, of which 54 (14,59%) had IgM antibody alone, whereas 212 (57,3%) cases had both IgM and IgG antibodies, indicating secondary infection The remaining 104 (28,11%) cases had IgG antibody The rate of infection was 48% in children and 42,42% in aduls, p > 0.05 Prevalence of Dengue fever in some months of the year: June (46%); October (42,52%); November (50,84%); December (53,5%) The rate of infection in female was 42,64% and male 42,11%, p > 0.05 Test SD BIOLINE Dengue IgM/IgG could be widely applied to detect of Dengue virus infection and could differentiate between primary or secondary infection

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Khái quát chung về sốt xuất huyết 2

2.1.1 Dịch tễ học SXH 2

2.1.2 Nguồn bệnh và đường lây truyền 3

2.1.3 Tác nhân gây bệnh 5

2.2 Sinh bệnh học SXH 6

2.2.1 Thúc đẩy nhiễm trùng phụ thuộc kháng thể 6

2.2.2 Độc lực của vi rút Dengue 7

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh học miễn dịch 7

2.3 Triệu chứng và chẩn đoán 8

2.3.1 Triệu chứng 8

2.3.1.1 Sốt Dengue 8

2.3.1.2 Sốt xuất huyết Dengue 8

2.3.2 Chẩn đoán 9

2.3.2.1 Phân lập vi rút 9

2.3.2.2 Huyết thanh học 10

2.4 Điều trị và phòng bệnh 12

2.4.1 Điều trị 12

2.4.2 Phòng bệnh 12

2.5 Một số công trình nghiên cứu về SXH trong và ngoài nước 14

2.5.1 Công trình nghiên cứu trong nước 14

2.5.2 Công trình nghiên cứu ngoài nước 15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 16

3.2 Đối tượng khảo sát và số lượng mẫu 16

3.3 Nội dung nghiên cứu 16

3.4 Vật liệu và dụng cụ 16

3.5 Phương pháp nghiên cứu 16

3.6 Kỹ thuật nghiên cứu (theo kỹ thuật thường quy của Bộ y tế) 17

3.6.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm 17

3.6.2 Các bước thực hiện 17

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả chung 22

4.2 Kết quả dương tính theo các lớp kháng thể 24

4.3 Kết quả chẩn đoán SXH theo ngày sốt 24

4.3.1 Kết quả dương tính SXH chung theo ngày sốt 24

4.3.2 Kết quả dương tính các lớp kháng thể theo ngày sốt 25

4.4 Kết quả khảo sát SXH theo lứa tuổi 26

4.5 Kết quả chẩn đoán Dengue theo giới tính 27

4.6 Kết quả khảo sát Dengue theo tháng 27

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30

5.1 KẾT LUẬN 30

5.2 ĐỀ NGHỊ 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Nhận định kết quả xét nghiệm 21

Bảng 4.1 Tỷ lệ dương tính chung của xét nghiệm 22

Bảng 4.2 Tỷ lệ dương tính theo lớp kháng thể 24

Bảng 4.3 Tỷ lệ SXH dương tính theo ngày sốt 25

Bảng 4.4 Tỷ lệ dương tính phân bố theo lứa tuổi 26

Bảng 4.5 Kết quả dương tính được phân loại theo giới tính 27

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.2 Muỗi Aedes aegypti và Aedes albopitus 4

Hình 2.3 Chu trình tái nhiễm tạo ra miễn dịch hoặc gây sốc 4

Hình 2.4 Chu trình phát triển của Aedes aegypti 5

Hình 3.1 Các bước thực hiện 17

Hình 3.2 Quy trình thực hiện của xét nghiệm 20

Hình 4.1 Kết quả thu được trên test SD Bioline Dengue IgM/IgG 23

Hình 4.2 Phân bố dương tính các lớp kháng thể theo ngày sốt 25

Hình 4.3 Tỷ lệ dương tính với vi rút Dengue theo các tháng 28

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFRIMS ELISA Armed Forces Research Institute of Medical Sciences

WHO Tổ chức y tế thế giới

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) gọi chung là sốt xuất huyết

là bệnh truyền nhiễm do muỗi truyền thường gặp ở tất cả các lứa tuổi trong đó tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao nhất ở trẻ em

Bệnh diễn biến phức tạp và thường có những biến chứng nặng nề, khả năng gây

tử vong cao nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời Việc chẩn đoán vi rút Dengue hiện nay có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp: phân lập vi rút, RT-PCR, ELISA, phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn men (MAC-ELISA, GAC-ELISA) Tuy nhiên, một số xét nghiệm đòi hỏi nhiều thiết

bị đắt tiền, một số không phát hiện sớm được bệnh do cơ thể đáp ứng miễn dịch chậm (Aaskov M J G, 2003) Do tính chất nguy hiểm của bệnh nên cần phải có phương pháp chẩn đoán nhanh, phát hiện sớm và chính xác và đó là một nhu cầu cần thiết cho

cả thầy thuốc lẫn bệnh nhân trong việc điều trị nhằm giảm những biến chứng nặng nề

do SXH gây ra

Phương pháp huyết thanh học trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch cho phép phát hiện sớm kháng thể lớp IgM và IgG trong huyết thanh của bệnh nhân góp phần hỗ trợ cho việc quản lý và điều trị bệnh nhân

Do vậy, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Tìm hiểu phương pháp huyết thanh học

trong chẩn đoán sốt xuất huyết do vi rút Dengue gây ra”

- Thu thập và xử lý số liệu

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát chung về sốt xuất huyết

Sốt xuất huyết (SXH) thuộc nhóm bệnh do muỗi truyền (MBD-mosquitoes borne diseases) thường gặp nhất ở người, bệnh do vi rút Dengue thuộc họ Flaviviridae của vi rút Arbo gây ra Vi rút này có 4 kiểu huyết thanh khác nhau là DEN-1, DEN-2, DEN-3

và DEN-4 Bệnh thường xảy ra ở các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới và trở thành vấn đề

y tế nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng Bệnh có biểu hiện khác nhau tùy thuộc vào thể trạng của mỗi người SXH được đặc trưng bởi hiện tượng thất thoát huyết tương dẫn đến sốc giảm thể tích và rối loạn đông máu gây ra xuất huyết Đây là nguyên nhân chính dẫn đến tử vong nếu không được phát hiện kịp thời Trên toàn thế giới có khoảng 2,5 tỷ người đang sống trong vùng có bệnh lưu hành (Halstead, 1980)

Sự lan tràn về mặt địa lý của cả véc tơ truyền bệnh (muỗi) và vi rút đã đưa đến sự tăng cao tỷ lệ bệnh trong vòng 25 năm qua cũng như khả năng xuất hiện dịch do nhiều chủng huyết thanh khác nhau ở các vùng nhiệt đới Do đó, việc kiểm soát dịch bệnh gặp nhiều khó khăn

2.1.1 Dịch tễ học SXH

Trận dịch SXH đầu tiên xảy ra vào những năm từ 1778 - 1780 ở châu Á, Châu Phi và Bắc Mỹ Sự xuất hiện dịch bệnh gần như đồng thời ở 3 lục địa khác nhau chứng

tỏ vi rút gây bệnh cũng như véc tơ truyền bệnh đã phân bố rộng rãi trên toàn thế giới

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ước tính mỗi năm có khoảng 50 đến 100 triệu người mắc bệnh trong đó đáng báo động là khả năng nhiễm nhiều loại vi rút Dengue khác nhau gây khó khăn cho việc chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân (Bùi Đại, 1999)

Bệnh SXH/SXHD trở thành một bệnh dịch lưu hành ở nước ta, bệnh không chỉ xuất hiện ở đô thị mà cả vùng nông thôn, nơi có muỗi-véc tơ truyền bệnh Dịch lớn SXH/SXHD bùng nổ theo chu kỳ khoảng 3 - 5 năm

SXH du nhập vào Việt Nam từ những năm 1960 Trong khoảng thời gian 1960

-1988, Việt Nam đứng đầu 8 quốc gia Đông Nam Á và cả thế giới về tổng số trường hợp mắc bệnh và chết do SD/SXHD Tỷ suất bệnh mới gia tăng theo sự phát triển kinh

tế xã hội (Nguyễn Đỗ Nguyên, 1997) Theo thống kê của Cục Y tế Dự phòng (Bộ Y Tế), trong năm 2010, cả nước đã ghi nhận 128.381 trường hợp mắc sốt xuất

huyết, trong đó 109 trường hợp tử vong So với cùng kỳ năm 2009, số trường hợp mắc SXH tăng 22%, tử vong tăng 25,3% và bệnh bùng phát chủ yếu ở miền Trung và Tây Nguyên Đa số các trường hợp tử vong xảy ra do SXH Dengue độ III, IV và tỷ lệ trẻ

em mắc SD/SXHD là 46,4%

Hình 2.1 Tỷ lệ mắc sốt xuất huyết/100.000 dân theo khu vực 2010

(http://www.impe-qn.org.vn/impe qn/vn/portal)Bệnh SXH ở Việt Nam phát triển theo mùa và cũng có sự phát triển khác biệt giữa các miền: ở miền Bắc bệnh thường xảy ra nhiều từ tháng 7 đến tháng 9, miền Nam và miền Trung bệnh bùng phát quanh năm và xuất hiện nhiều vào tháng 6 đến tháng 10

2.1.2 Nguồn bệnh và đường lây truyền

Người bệnh là ổ chứa vi rút chính Gần đây người ta phát hiện ở Malaysia có loại

khỉ hoang dại ở những khu rừng nhiệt đới có mang vi rút Dengue Muỗi Aedes aegypti

là véc tơ truyền bệnh chủ yếu ở hầu hết các khu vực bệnh lưu hành Nước ta có 2 loại

muỗi Aedes gây bệnh là Aedes aegypti và Aedes albopitus Muỗi Aedes aegypti hoạt

động vào ban ngày và chỉ có muỗi cái mới đốt người và truyền bệnh Muỗi trưởng thành chủ yếu sống trong nhà, tầm bay ngắn (300 m), đẻ trứng vào dụng cụ chứa nước, thời gian phát triển của ấu trùng phụ thuộc vào nhiệt độ và thức ăn (thường là 7 ngày)

Muỗi Aedes albopictus, thường gây bệnh ở vùng nông thôn, sống ngoài nhà, ấu

trùng phát triển ở các vật chứa nước tự nhiên (hốc cây, vỏ dừa, thân tre cụt…)

Hình 2.2 Muỗi Aedes aegypti và Aedes albopitus (http://www.health.qld.gov)

Sự lan truyền dịch xảy ra ở những vùng có nhiều muỗi Aedes, vệ sinh môi trường kém, dân cư đông đúc Khi muỗi cái Aedes hút máu bệnh nhân nhiễm vi rút Dengue, vi

rút này sẽ ủ bệnh trong cơ thể muỗi khoảng 8 đến 11 ngày Trong khoảng thời gian sống còn lại muỗi có nguy cơ truyền bệnh cho người Khi vi rút vào cơ thể người chúng tuần hoàn trong máu từ 2 đến 7 ngày Trong khoảng thời gian này nếu muỗi

Aedes hút máu thì vi rút sẽ được truyền cho muỗi (Gubler D J, 1989)

Hình 2.3 Chu trình tái nhiễm tạo ra miễn dịch hoặc gây sốc

(http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Dengue_transmission)

Hình 2.4 Chu trình phát triển của Aedes aegypti (http://3.bp.blogspot.com)

2.1.3 Tác nhân gây bệnh

Vi rút Dengue thuộc họ Flaviviridae, chúng mang đặc điểm của vi rút Arbo (Arthropod born virus), có nhân ARN và có 2 kháng nguyên quan trọng là kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu và kháng nguyên kết hợp bổ thể Vi rút Dengue có 4 týp huyết thanh khác nhau DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, giữa các týp này có phản ứng chéo nhau, đây chính là đặc điểm quan trọng dẫn đến tính phức tạp của bệnh cảnh lâm sàng do vi rút Dengue gây ra

Vi rút Dengue có hình cầu, đường kính 45 - 60 nm, cấu trúc vi rút gồm 3 thành phần: nhân ARN, sợi đơn, cực dương, vỏ capsid là hình khối khoảng 20 mặt và màng bọc lipoprotein Vi rút này có 3 protein cấu trúc: protein lõi, protein màng, protein vỏ

và 7 protein không cấu trúc ( Mackenzie JM và cs,1996)

Hình 2.5 Cấu trúc vi rút Dengue (Marianncau, 1997) 2.2 Sinh bệnh học SXH

2.2.1 Thúc đẩy nhiễm trùng phụ thuộc kháng thể

• Đáp ứng sơ nhiễm

Lần đầu tiên một người bị nhiễm vi rút Dengue thì đáp ứng kháng thể xảy ra kiểu

sơ nhiễm Trong đáp ứng sơ nhiễm kháng thể IgM xuất hiện rất sớm, thường vào ngày thứ 3 của bệnh, tăng cao nhất trong 2 tuần lễ rồi sau đó giảm dần Còn kháng thể IgG xuất hiện muộn hơn và ở mức tương đối thấp

• Đáp ứng tái nhiễm

Một người đã có đáp ứng sơ nhiễm nếu sống trong vùng dịch sốt xuất huyết Dengue có thể bị nhiễm tiếp theo bởi các týp huyết thanh khác của vi rút Dengue thì đáp ứng sẽ xảy ra theo kiểu tái nhiễm Trong đáp ứng tái nhiễm kháng thể IgG xuất hiện sớm và tăng cao trong 2 tuần lễ còn kháng thể IgM ở mức tương đối thấp

• Sự thúc đẩy nhiễm trùng phụ thuộc kháng thể

Theo Halstead, biểu hiện nặng của nhiễm Dengue (SXHD/sốc SXHD) xảy ra ở những trường hợp tái nhiễm vi rút Dengue do vai trò của kháng thể tăng cường Trẻ nhũ nhi mặc dù bị sơ nhiễm vi rút Dengue vẫn có nguy cơ cao bị SXHD/sốc SXHD như trẻ lớn bị tái nhiễm

Khi sơ nhiễm, kháng thể được tạo ra không đủ khả năng trung hòa chéo do đó vẫn có khả năng tái nhiễm với một týp huyết thanh vi rút Dengue khác Kháng thể tăng cường của lần sơ nhiễm sẽ kết hợp với vi rút Dengue tái nhiễm tạo thành phức hợp

miễn dịch Các phức hợp miễn dịch này làm tăng khả năng thực bào của bạch cầu đơn nhân Khi vi rút Dengue được đưa vào bên trong bạch cầu đơn nhân, nó sẽ nhân lên rất mạnh dẫn đến hậu quả nhiều tế bào bị nhiễm nhanh hơn Hiện tượng này sẽ hoạt hóa các tế bào lympho gây độc tế bào Các tế bào lympho gây độc sau khi được hoạt hóa sẽ làm ly giải các bạch cầu đơn nhân bị nhiễm Các bạch cầu đơn nhân bị nhiễm sau khi

bị chết sẽ giải phóng các hóa chất trung gian Các tế bào lympho T sẽ kích thích giải phóng các cytokine gây ra thất thoát huyết tương và biểu hiện xuất huyết trong SXHD/sốc SXHD

2.2.2 Độc lực của vi rút Dengue

Những biểu hiện lâm sàng của sốt Dengue, SXHD/sốc SXHD có thể là do độc tính của các chủng vi rút Dengue khác nhau Có sự khác nhau về mặt cấu trúc được tìm thấy giữa các chủng vi rút Dengue được phân lập từ bệnh nhân bị sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue Nồng độ vi rút trong máu có liên quan đến độ nặng của bệnh

và nồng độ vi rút trong máu cao phản ánh độc lực của vi rút, tốc độ tăng trưởng nhanh của vi rút góp phần thúc đẩy biểu hiện SXHD/sốc SXHD

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh học miễn dịch

• Sự sản xuất quá mức cytokine

Cytokine là tên gọi của một nhóm các phân tử có chức năng truyền đạt thông tin giữa các tế bào trong và ngoài hệ miễn dịch đồng thời chúng hoạt động trong một mạng lưới Đáp ứng của một tế bào riêng lẻ phụ thuộc vào loại cytokine và thụ thể của cytokine mà nó biểu hiện Trong nhiễm vi rút Dengue, nồng độ cytokine tăng lên như IL2, IL6, IL8, IL10, γ-IFN, α-TNF Sự tăng lên của các cytokine này được xem là các dấu hiệu chỉ điểm ở những bệnh nhân bị SXHD/sốc SXHD

• Giảm tiểu cầu và kháng thể kháng tiểu cầu

Sinh bệnh học của giảm tiểu cầu trong SXHD/sốc SXHD vẫn chưa được biết rõ

Có nhiều giả thiết được đưa ra để giải thích cho sự giảm tiểu cầu:

- Vi rút Dengue ức chế tủy xương do đó sự sản xuất tiểu cầu bị giảm

- DEN-2 có thể kết hợp tiểu cầu với sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu làm tiêu hủy tiểu cầu dẫn đến số lượng tiểu cầu giảm

- Sự tiêu thụ tiểu cầu trong đông máu nội mạch lan tỏa và tiểu cầu bị kết dính ở các chỗ tế bào nội mạc bị tổn thương

• Rối loạn miễn dịch

Bệnh nhân bị nhiễm vi rút Dengue thường giảm số lượng bạch cầu hạt và bạch cầu đơn nhân cùng với sự gia tăng các tế bào lympho không điển hình đồng thời ức chế sự tăng sinh tế bào T

- Giải phóng các cytokine và chemokine như IL-6, IL-8 và RANTES (Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted)

- RANTES: là một chemokine có tác dụng thu hút tế bào lympho và tế bào diệt

tự nhiên đến các vị trí viêm

• Rối loạn đông máu

Bắt nguồn từ 3 yếu tố: tăng tính thấm thành mạch, tiểu cầu giảm và các yếu tố đông máu giảm do giảm tổng hợp và tiêu thụ nhiều vào quá trình tăng đông máu nội mạch Rối loạn đông máu thường nặng ở những trường hợp có sốc

Ở trẻ em, đau bụng và đau họng thường là những triệu chứng nổi trội Hạ sốt xuất hiện vào ngày thứ 3 đến ngày thứ 8 thường kèm theo biểu hiện xuất huyết nhẹ (chấm xuất huyết dưới da, nốt xuất huyết và chảy máu mũi) Sau khi hạ sốt thường xuất hiện ban dạng dát sẩn đa hình thái, đôi khi gây ngứa, đầu tiên ở thân mình và lan rộng theo hướng ly tâm đến các chi, mặt, lòng bàn tay và lòng bàn chân Một số trường hợp, thể bệnh có thể tiến triển đến xuất huyết tiêu hóa và sốc

2.3.1.2 Sốt xuất huyết Dengue

Giai đoạn sớm của bệnh không thể phân biệt được với sốt Dengue Tuy nhiên, thường sau từ 2 đến 5 ngày (giai đoạn hạ sốt), một số trường hợp nhiễm trùng đầu tiên

và đa số các nhiễm trùng thứ phát sau khi đã nhiễm một týp huyết thanh khác có biểu hiện hạ tiểu cầu (< 100.000 mm3) và cô đặc máu Biểu hiện xuất huyết có thể xảy ra hoặc không Các biểu hiện xuất huyết thường gặp gồm xuất huyết dưới da, chảy máu răng, chảy máu mũi và xuất huyết tiêu hóa Lá lách thường không lớn, nếu gan lớn và

đau thì đây là những dấu hiệu bệnh nặng Các biểu hiện khác có thể gồm tràn dịch màng phổi, giảm protein máu, bệnh lý não với dịch não tủy bình thường Tính thấm mao mạch gia tăng, với hậu quả thoát huyết tương ra ngoài khoang dịch kẽ với lượng lớn, là nguyên nhân của tình trạng cô đặc máu

Phân loại lâm sàng của SXHD (theo WHO), theo mức độ bệnh chia làm 4 độ:

+ Độ II: giảm tiểu cầu và cô đặc máu kèm theo chảy máu tự phát

+ Độ III: giảm tiểu cầu và cô đặc máu, huyết động không ổn định: mạch lăn tăn, huyết áp kẹp (hiệu số huyết áp tâm thu-huyết áp tâm trương < 20 mm Hg), tay chân lạnh, tinh thần lú lẫn

mạch ngoại biên, huyết áp = 0 mm Hg

Nếu được điều trị thoát sốc thì bệnh nhân lành bệnh nhanh chóng và rất hiếm có

di chứng

• Hội chứng sốc dengue-DSS (Dengue Shock Syndrome)

Là biểu hiện lâm sàng trầm trọng nhất của nhiễm vi rút dengue, độ IV theo bảng sắp xếp lâm sàng của Tổ Chức Y Tế Thế Giới Thường gặp ở trẻ em dưới 12 tuổi, thể trạng suy yếu, tiền sử đã từng bị nhiễm vi rút Dengue

Các mạch máu nhỏ bị tổn thương nên tăng tính thấm gây ra xuất huyết dưới da, nội tạng, đồng thời là hiện tượng đông máu nội mạch lan tỏa, làm rối loạn cơ chế đông máu do giảm trầm trọng số lượng tiểu cầu

tế bào muỗi C6/36 vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán, nhưng cần thời gian khoảng 7 ngày mới cho ra kết quả Hơn nữa, việc phân lập vi rút Dengue trên tế

bào nuôi cấy từ máu thường không thành công do vi rút Dengue rất khó khăn trong nuôi cấy và nồng độ vi rút máu thấp (Guzman MG và cs, 2004)

2.3.2.2 Huyết thanh học

• Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu

Được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước vì phản ứng này nhạy, dễ thực hiện, kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu tồn tại trên 50 năm nên phản ứng này lý tưởng cho các nghiên cứu dịch tễ học huyết thanh

Nguyên tắc: vi rút Dengue có khả năng gây ngưng kết hồng cầu và tác dụng này

bị ức chế bởi kháng thể đặc hiệu Kháng nguyên được chiết xuất từ não chuột hoặc tế bào muỗi đã được gây nhiễm vi rút Dengue Mẫu huyết thanh xét nghiệm tìm kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu cần xử lý trước khi tiến hành phản ứng để loại bỏ các chất ức chế và chất gây ngưng kết không đặc hiệu Hạn chế của phương pháp này là không đủ độ tin cậy để định danh týp vi rút (Nguyễn Thanh Bảo và ctv, 2004)

• Phản ứng kết hợp bổ thể

Phản ứng này kém nhạy cảm hơn phản ứng ức chế hồng cầu và phản ứng trung hòa Nguyên tắc: bổ thể bị kết hợp trong các phản ứng kháng nguyên-kháng thể Kháng thể kết hợp bổ thể xuất hiện muộn hơn và tồn tại ngắn hơn kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu Phản ứng kết hợp bổ thể có độ đặc hiệu cao trong sơ nhiễm nhưng không đặc hiệu trong tái nhiễm Phản ứng này cũng như phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu có phản ứng chéo giữa 4 týp Dengue và với các Flavivirus khác, do vậy, kết quả thường không rõ ràng, khó đọc và đôi khi rất khó kết luận

• Phản ứng trung hòa

Là phản ứng huyết thanh đặc hiệu và nhạy cảm nhất đối với vi rút Dengue, nhưng ít được dùng trong chẩn đoán huyết thanh vì rất đắt tiền, đòi hỏi kỹ thuật cao và tốn nhiều thời gian, phản ứng này có thể dùng để định danh vi rút trong giai đoạn sơ nhiễm nhưng lại hạn chế trong tái nhiễm Kháng thể trung hòa tăng cùng lúc hoặc muộn hơn kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu nhưng sớm hơn kháng thể kết hợp bổ thể và tồn tại hơn 50 năm

Nguyên tắc: vi rút được trung hòa với kháng huyết thanh từ chuột bạch pha loãng bậc 2 được sản xuất từ 4 týp Dengue hoặc dùng kháng thể đơn dòng Đem cấy hỗn hợp

vi rút-kháng huyết thanh này vào nuôi tế bào một lớp sau đó phủ thạch, 6 ngày sau phủ thêm một lớp thạch thứ 2 và đọc kết quả vào ngày thứ 7

Phản ứng này rất đặc hiệu để định týp vi rút Dengue nhưng lại có nhược điểm là môi trường nuôi cấy có cảm nhiễm thấp với vi rút Dengue, với những chủng chưa thích ứng thường ít phát triển, không có hiệu giá đủ cao sau lần cấy truyền đầu tiên để làm phản ứng trung hòa (Đỗ Quang Hà, 2003)

• Phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn men thu bắt IgG (MAC-ELISA)

MAC- ELISA kém nhạy hơn phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu nhưng được sử dụng rộng rãi do phản ứng đơn giản, rẻ tiền

• Phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược (RT-PCR)

RT-PCR là một loại thử nghiệm sinh học phân tử, cho độ nhạy và độ chính xác rất cao, cho kết quả sớm Có thể định danh được týp vi rút nhưng đòi hỏi kỹ thuật và chi phí cao (Hồ Huỳnh Thùy Dương và cs, 1997)

Các phương pháp trên đều ít có ý nghĩa trong quản lý bệnh nhân, khống chế dịch, bảo vệ sức khỏe cộng đồng Bởi vậy, cần có một phương pháp phát hiện nhanh vi rút Dengue nhằm giảm thời gian điều trị của bệnh nhân, cung cấp dữ liệu cho điều tra dịch

và khống chế lan tràn dịch

• Kỹ thuật sắc ký miễn dịch chẩn đoán nhanh SXH

Sắc ký là một trong những phương pháp phân tích thông dụng và hiệu quả thuộc nhóm các phương pháp phân tích hiện đại Ngày nay, phương pháp sắc ký đã trở thành một công cụ được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: hóa sinh, y học, dược học, nghiên cứu xúc tác…

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, qua đó có thể phát hiện định tính và phân biệt nhanh các lớp kháng thể IgM và IgG Phương pháp này được sử dụng trợ giúp trong việc chẩn đoán

và phân biệt giữa sơ nhiễm và tái nhiễm vi rút Dengue

Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi do phản ứng đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp và chỉ cần 15 - 20 phút là có kết quả

Bảng 2.1 Ưu và nhược điểm của các phương pháp xét nghiệm

- Phát hiện sớm giúp điều trị sớm

- Dương tính giả do ngoại nhiễm

- KTV chuyên nghiệp, phòng xét nghiệm hiện đại

- Thời gian > 1 tuần

- Không thể phân biệt sốt Dengue tiên nhiễm hay thứ nhiễm

- Chậm trễ chẩn đoán xác định

(Tổ chức y tế thế giới, 2009)

2.4 Điều trị và phòng bệnh

2.4.1 Điều trị

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, chỉ mang tính chất điều trị triệu chứng

và xử lý cấp cứu kịp thời khi sốc sốt xuất huyết xảy ra

2.4.2 Phòng bệnh

• Phòng bệnh đặc hiệu