KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum ( Leyss. ex Fr. ) Karst. THEO THỜI GIAN SINH TRƯỞNG

HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum Leyss... HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN

CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum

(Leyss ex Fr.) Karst THEO THỜI GIAN SINH TRƯỞNG

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ CẨM TÚ Niên khóa: 2007 – 2011

Tháng 7/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN

CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum

(Leyss ex Fr.) Karst THEO THỜI GIAN SINH TRƯỞNG

Tháng 7/2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trương Thị Đẹp, người đã tận tình hướng

dẫn cho tôi ngay từ bước đầu làm quen với nấm Linh chi Ganoderma lucidum cho đến

khi sẵn sàng sửa chữa từng lỗi nhỏ để khóa luận được hoàn chỉnh nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phan Văn Minh, người thầy đã định hướng đề tài,luôn dõi theo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn TS Trần Công Luận đã sẵn lòng tạo điều kiện để đề tàiđược thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM, GS.TS Nguyễn Minh Đức,

DS Nguyễn Minh Cang đã tận tình giúp đỡ để thực hiện phần Sắc ký lỏng hiệu năngcao trong khoá luận

Xin cảm ơn KS Nguyễn Minh Quang đã hướng dẫn rất tận tình về những kỹ thuậttrồng và chăm sóc nấm

Xin cảm ơn Thầy cô tại Bộ môn Công nghệ sinh học trường ĐH Nông LâmTPHCM đã luôn quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tậpcũng như thực hiện khoá luận, đã lắng nghe, góp ý và giúp tôi sữa chữa khoá luận này.Xin cảm ơn Thầy cô, các anh chị và các bạn tại trại thực nghiệm Viện nghiên cứuCNSH và Môi trường Trường Đại học Nông Lâm TPHCM, tại Trung tâm Sâm vàDược liệu TPHCM, Bộ môn Thực vật và Ban nghiên cứu khoa học của khoa Dược -

ĐH Y Dược TPHCM, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên TPHCM đã chỉ dẫn, chia sẻkinh nghiệm và giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài.Chân thành cảm ơn những người bạn đã cùng tôi chia ngọt sẻ bùi, hỗ trợ về vậtchất và cả tinh thần để tôi có thể luôn tiến lên phía trước

Xin cảm ơn tập thể lớp DH07SH, những người bạn thân thiết đã gắn bó với cảquãng đường sinh viên đầy kỉ niệm

Tháng 7/2011

TÓM TẮT

Từ xưa, nấm Linh chi đã được xem là một loại thảo dược quý ở Việt Nam vànhiều nước châu Á Nấm Linh chi chứa nhiều dược chất có khả năng phòng và trị bệnhcho con người Trong đó, triterpenoid toàn phần là một trong những thành phần dùng

để đánh giá chất lượng nấm Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid có thể sẽ thay đổi theothời gian sinh trưởng của nấm Hiện nay, những nghiên cứu về hàm lượng triterpenoid

toàn phần trong quả thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum theo thời gian sinh trưởng

ở Việt Nam rất ít Do đó, đề tài “Khảo sát hàm lượng triterpenoid toàn phần của quả

thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst theo thời gian sinh

trưởng” được tiến hành nhằm xác định thời điểm thích hợp để thu hoạch nấm có hàmlượng triterpenoid toàn phần cao

Cơ chất trồng nấm là mạt cưa cao su Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóahọc cho thấy trong nấm Linh chi có chất béo, carotenoid, alkaloid, triterpenoid,coumarin, glycosid tim, tannin, saponin, polyphenol, acid hữu cơ và chất khử Pháthiện được sự hiện diện của triterpenoid bằng phản ứng hóa học Liebermann - Burchard

và SKLM với hệ dung môi Toluen – Ethylacetat – Acid formic Sau khi chiết Soxhlet

và định lượng bằng phương pháp cân, xác định được hàm lượng triterpenoid toàn phầntăng theo thời gian sinh trưởng, cao nhất vào tuần thứ 8 và 10, đạt 4,51% và 4,54%tính theo Khối lượng khô của quả thể nấm Kết quả này cho thấy giai đoạn 8 - 10 tuầntuổi là thời điểm thích hợp nhất cho việc thu hoạch nấm Linh chi có hàm lượngtriterpenoid toàn phần trong quả thể cao

Ngoài ra, khi so sánh với mẫu Linh chi Nhật, kết quả của quá trình phân tíchbằng sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy thành phần triterpenoid toàn phần trong Linhchi Nhật đa dạng hơn Linh chi Việt Nam

“Lingzhi”, Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst., is a valuable medicinal

herb in Vietnam and many other Asian countries It contains many beneficialingredients which are effective in preventing and treating human diseases One ofthese ingredients is total triterpenoid content which is used for estimating its quality.However, the total triterpenoid content can vary during the growth of this fungus.Presently, understandings on the variation of the total triterpenoid content in fruitingbody through the growth stages of this species is still very few in Vietnam Therefore,the objective of this thesis is “Investigating the variation of the total triterpenoid

content in fruiting body of Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst through its

growth stages” This understanding can help in determining the best time for theharvest of fruiting bodies with expected high total triterpenoid contents

In the present study, Lingzhi was planted on rubber sawdust And, the results ofanalysis showed that chemical components of Lingzhi is composed of lipid,carotenoid, triterpenoid, coumarin, cardiac glycosides, tannins, saponins, polyphenols,organic acids and reductants

Detection the presence of total triterpenoid was examined by Liebermann Burchard reaction and thin layer chromatography with Toluene – Ethylacetat – Formicacid solvent After Soxhlet extraction, the weighing method was applied and showedthat the total triterpenoid content on a basis of dry weight was increasing withingrowth stage and highest at week 8 to 10 of the experiment; 4,51 and 4,54%,

-respectively This result introduced the best time for the haverst of Ganoderma

lucidum fruiting body with highest triterpenoid content should be from 8thto 10thweek

of the cultivation

In addition, in comparison to Japanese “Lingzhi”, the results of the high liquidperformance chromatography analyse showed the composition of the triterpenoidingredient of Japanese “Lingzhi” was more diverse than Vietnam “Lingzhi”,

Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst

Key words: Ganoderma lucidum, Lingzhi, total triterpenoid content, growth

stage, fruiting bodies

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nấm Linh chi 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái – cấu trúc nấm Linh chi 4

2.1.4 Đặc điểm nuôi trồng nấm Linh chi 4

2.1.4.1 Các thông số thích hợp trong nuôi trồng 4

2.1.4.2 Tình hình phát triển trồng nấm Linh chi 5

2.1.5 Tác dụng dược lý của nấm Linh chi 7

2.2 Thành phần hóa học nấm Linh chi 8

2.3 Giới thiệu về nhóm triterpenoid 10

2.4 Phương pháp đánh giá hàm lượng triterpenoid trong nấm Linh chi 12

2.4.1 Sắc ký lớp mỏng 12

2.4.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm 14

3.2 Đối tượng nghiên cứu 14

3.2.1 Nguyên liệu: 14

3.2.2 Dung môi, hoá chất sử dụng 15

3.2.3 Thiết bị sử dụng 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Quy trình trồng nấm 16

3.3.2 Thiết kế thí nghiệm 17

3.3.3 Mô tả nấm Linh chi thí nghiệm 18

3.3.4 Xác định đường cong tăng trưởng 18

3.3.5 Thử độ tinh khiết của dược liệu 18

3.3.5.1 Xác định độ ẩm 18

3.3.5.2 Xác định độ tro 18

3.3.6 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của nấm Linh chi 19

3.3.7 Định tính triterpenoid toàn phần 22

3.3.7.1 Định tính bằng phản ứng hoá học Liebermann- Burchard 22

3.3.7.2 Định tính triterpenoid toàn phần bằng SKLM 22

3.3.7.3 Định tính triterpenoid toàn phần bằng HPLC pha đảo 23

3.3.8 Định lượng triterpenoid toàn phần bằng chiết - cân 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Mô tả nấm Linh chi thí nghiệm 25

4.1.1 Đặc điểm hình thái – cấu trúc 25

4.1.2 Soi bột 25

4.13 Xác định tên khoa học 26

4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật bằng phản ứng hoá học 31

4.3 Thử độ tinh khiết của dược liệu 31

4.3.1 Độ ẩm 31

4.3.2 Độ tro 32

4.4 Sự tăng trưởng của các mẫu nấm Linh chi thí nghiệm 33

4.5 Định tính triterpenoid 35

4.5.2 Định tính triterpenoid bằng phương pháp HPLC 37

4.6 Định lượng triterpenoid bằng phương pháp cân 41

4.6.1 Chiết Soxhlet và tinh chế 41

4.6.2 Hàm lượng triterpenoid toàn phần 41

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 47

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 48

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Phân loại Linh chi theo màu sắc – công dụng 3

Bảng 2.2 Thành phần các chất có hoạt tính ở Linh chi 9

Bảng 3.1 Quả thể nấm Linh chi dùng trong nghiên cứu 15

Bảng 3.2 Phản ứng xác định các nhóm hợp chất 21

Bảng 4.1 Kết quả sơ bộ thành phần hoá thực vật 31

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát độ ẩm của 7 mẫu quả thể nấm Linh chi 31

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát độ tro toàn phần của 7 mẫu quả thể nấm Linh chi 32

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát độ tro không tan trong acid 32

Bảng 4.5 Khối lượng quả thể Linh chi thí nghiệm ở các giai đoạn tăng trưởng 33

Bảng 4.6 Vị trí các vết chất trên SKLM 37

Bảng 4.7 Kết quả chiết Soxhlet với dung môi methanol 41

Bảng 4.8 Kết quả tinh chế cao methanol qua cột Diaion HP - 20 41

Bảng 4.9 Hàm lượng triterpenoid toàn phần 42

Bảng 4.10 Khối lượng triterpenoid toàn phần theo khối lượng trung bình quả thể 42

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Bốn nhóm triterpenoid pentacyclic 10

Hình 2.2 Ba nhóm triterpenoid tetracyclic 11

Hình 2.3 Các loại acid ganoderic được phân lập 12

Hình 3.1 Bột quả thể các mẫu Linh chi 14

Hình 3.2 Quả thể các mẫu Linh chi 15

Hình 3.3 Quy trình trồng nấm Linh chi trên giá thể mạt cưa cao su 16

Hình 3.4 Quy trình thí nghiệm 17

Bảng 3.2 Phản ứng xác định các nhóm hợp chất 21

Hình 3.5 Quy trình chiết xuất định tính triterpenoid toàn phần bằng HPLC 24

Hình 4.1 Quả thể nấm Linh chi thí nghiệm ở các giai đoạn sinh trưởng 27

Hình 4.2 Cấu tạo quả thể nấm Linh chi 28

Hình 4.3 Bào tử đảm Linh chi 29

Hình 4.4 Sợi nấm Linh chi dưới kinh hiển vi quang học vật kính 100 30

Hình 4.5 Biểu đồ tăng trọng của quả thể nấm Linh chi 34

Hình 4.6 Hàm lượng nước trong quả thể nấm Linh chi 34

Hình 4.7 Phản ứng Liebermann - Burchard định tính triterpenoid .35

Hình 4.8 SKLM định tính triterpenoid của 7 mẫu nấm Linh chi 36

Hình 4.9 Sắc ký đồ HPLC mẫu quả thể Linh chi thí nghiệm 10 tuần tuổi 38

Hình 4.10 Sắc ký đồ HPLC mẫu quả thể Linh chi VINA .39

Hình 4.11 Sắc ký đồ HPLC mẫu quả thể nấm Linh chi Nhật .40

Hình 4.12 Hàm lượng triterpenoid toàn phần 43

Hình 4.13 Sự gia tăng hàm lượng triterpenoid toàn phần 44

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong cuộc sống hiện đại với quá nhiều các sản phẩm tổng hợp nhân tạo nhưngày nay, người ta lại có xu hướng tìm về với những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên,bao gồm các loại cây thuốc dân gian gọi là thảo dược Trong số đó, nấm Linh chi từlâu đã được xếp vào nhóm “Thượng dược”, được ưa chuộng sử dụng trong y học cổtruyền của nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam Nấm Linh chi có giá trị dượcliệu cao, chứa nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý như polysaccharid, triterpenoid,germanium, adenosin… giúp nâng cao thể chất, tăng khả năng phòng chống bệnh, điềuchỉnh cân bằng sinh lý, làm chậm quá trình lão hóa

Trong số những hoạt chất trên, triterpenoid là một trong những chất được quantâm nhiều nhất với khả năng chống oxy hóa, ức chế sự ngưng kết tiểu cầu, hạcholesterol huyết, chống HIV Ngoài ra, triterpenoid còn tạo nên vị đắng rất được ưachuộng cho nấm Linh chi Do vậy, triterpenoid được xem là một trong những thànhphần dùng để đánh giá chất lượng của nấm Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid có thể

sẽ thay đổi theo thời gian sinh trưởng của nấm Hiện nay, những nghiên cứu về hàm

lượng triterpenoid toàn phần trong quả thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum theo thời

gian sinh trưởng còn rất ít, và ở Việt Nam chưa có tài liệu nghiên cứu về vấn đề này

Do đó, đề tài “Khảo sát hàm lượng triterpenoid toàn phần của quả thể nấm Linh chi

Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst theo thời gian sinh trưởng” được tiến hành

nhằm xác định thời điểm thích hợp nhất cho việc thu hoạch nấm có hàm lượngtriterpenoid toàn phần trong quả thể cao

1.2 Yêu cầu của đề tài

 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của mẫu quả thể nấm Linh chi thínghiệm

 Khảo sát hàm lượng triterpenoid toàn phần trong quả thể nấm Linh chi thínghiệm trồng trên cơ chất mạt cưa cao su theo thời gian sinh trưởng của quảthể: 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần và 10 tuần tuổi Từ đó, xác định thời gian quảthể nấm Linh chi có hàm lượng triterpenoid toàn phần cao nhất

1.3 Nội dung nghiên cứu

 Xác định đường cong tăng trưởng của quả thể nấm Linh chi theo thời gian

 Phân tích hoạt chất:

 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của nấm Linh chi thí nghiệm

 So sánh hàm lượng triterpenoid toàn phần từ quả thể nấm Linh chi thínghiệm trồng trên cơ chất trên ở giai đoạn 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần và

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nấm Linh chi

Họ: Linh chi (Ganodermataceae)

Chi: Linh chi (Ganoderma)

Loài : Linh chi (Ganoderma lucidum)

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst.

Thông thường, Linh chi được gọi là Linhzhi theo tiếng Trung Quốc, Reishi hayMannentake trong tiếng Nhật Ở Việt Nam, Linh chi còn có tên là nấm Lim, Bất lãothảo, Vạn niên…

Linh chi có rất nhiều loài khác nhau Sách Bản thảo cương mục (1595) của LýThời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành 6 loại,mỗi loại có công dụng chữa bệnh khác nhau (trích dẫn bởi Lê Xuân Thám, 1998)

Bảng 2.1 Phân loại Linh chi theo màu sắc – công dụng (Nguyễn Duy Đại, 2009)

Thanh chi (Long chi) Xanh Vị chua, tính bình, không độc, chủ trị sáng mắt, bổ

gan khí an thần, tăng trí nhớHồng chi

(Xích chi, Đơn chi) Đỏ

Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡngtim, bổ trung, trị tức ngực

Hoàng chi (Kim chi) Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần, ích tì khíBạch chi (Ngọc chi) Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi,

an thần, chữa ho, nghịch hơiHắc chi (Huyền chi) Đen Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu, ích

thận khí

Tử chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức khớp

xương, gân cốt

2.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Chi Ganoderma rất phong phú và phân bố khá rộng, nhất là ở vùng nhiệt đới

ẩm, gặp hầu hết ở các nước Châu Á (Cổ Đức Trọng, 2006)

Nấm Linh chi có thể mọc trên cây gỗ sống hay đã chết, mọc tốt dưới bóng rợp,ánh sáng khuếch tán nhẹ Nhờ có lớp vỏ láng, Linh chi có thể chịu được nắng, mưa

Các chủng Linh chi chịu nhiệt độ cao thường chiếm ưu thế ở những vùng thấpdưới 500 m Các chủng ôn hoà thích hợp ở những vùng vĩ độ cao, các chủng nàythường được coi là các chủng nấm quý nhờ vào thành phần và hàm lượng các hoạtchất trong nấm Ở một số tỉnh của Trung Quốc, Linh chi thường mọc hoang dại ở cácvùng núi cao lạnh Ở Việt Nam, Linh chi được gặp rải rác từ Bắc đến Nam

2.1.3 Đặc điểm hình thái – cấu trúc nấm Linh chi

Quả thể nấm Linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm

Cuống nấm dài hoặc ngắn, thường đính một bên bên, đôi khi đính tâm do quátrình liền tán tạo thành Cuống nấm thường hình trụ, thanh mảnh (đường kính 0,3 – 0,8cm) hoặc mập khỏe (2 – 3,5 cm), ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo Lớp

vỏ cuống láng đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm

Mũ nấm dạng thận, đôi khi xòe hình quạt hoặc dị dạng Trên mặt mũ có vân gạchđồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tímnhẵn bóng như láng vecni Mũ nấm có đường kính 2 – 36 cm, dày 0,8 – 3,3 cm, phầnđính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm

Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm Bào

tử đảm có lớp vỏ kép, màu vàng mật ong, ở giữa có khối nội chất dạng giọt hình cầu.Bào tử dạng trứng có đầu chóp tròn – nhọn, do có chụp phủ lỗ nảy mầm lõm thụt hoặcphồng căng (Lê Xuân Thám, 1998)

2.1.4 Đặc điểm nuôi trồng nấm Linh chi

2.1.4.1 Các thông số thích hợp trong nuôi trồng (Nguyễn Duy Đại, 2009)

 Nhiệt độ:

- Giai đoạn nuôi sợi: 20oC - 30oC

- Giai đoạn quả thể: 22oC - 28oC

 Độ ẩm:

- Độ ẩm cơ chất: 60% - 62%

- Độ ẩm không khí: 80 - 95%

Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể, nấm Linhchi đều cần có độ thông thoáng tốt.

 Ánh sáng:

- Giai đoạn nuôi sợi: không cần ánh sáng

- Giai đoạn phát triển quả thể: cần ánh sáng tán xạ (ánh sáng đọc được) Cường độánh sáng cân đối từ mọi phía

 pH: Linh chi thích nghi trong môi trường trung tính đến acid yếu (pH 5,5 - 7)

 Dinh dưỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn cellulose

 Chất lượng của nấm Linh chi trồng thí nghiệm phụ thuộc vào 2 điều kiện chính:

- Giống thuần chủng, không bị lai tạp

- Thành phần dinh dưỡng và điều kiện môi trường cho nấm sinh sản phát triển (đây

là bí mật công nghệ của từng nhà sản xuất)

Có 2 loại giá thể chính để trồng nấm Linh chi là mạt cưa và khúc gỗ chôn xuốngđất Ở Việt Nam người ta trồng Linh chi bằng mạt cưa cao su đựng trong túi Ở HànQuốc, Trung Quốc, Nhật Bản người ta trồng Linh chi bằng khúc gỗ chôn dưới đất, sau

6 - 7 tháng sẽ thu hoạch, nấm có đường kính lớn, mỗi cây nấm sau khi sấy khô đạt 200– 400 g

2.1.4.2 Tình hình phát triển trồng nấm Linh chi

 Trên thế giới

Theo Wang, X.J (dẫn theo S T Chang, 1993), nấm Linh chi đã được nuôi trồng

ở Trung Quốc từ đầu thế kỷ 17, bởi giá trị dược liệu cao của chúng Trung Quốc hiệnvẫn được thừa nhận là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng, sản xuất Linh chi(Zhao et Zhang, 1994) Ngoài ra ở Châu Á còn có các nước có truyền thống nghiêncứu Linh chi: Nhật Bản, Hoa Kỳ, Hàn Quốc, Việt Nam, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,Indonesia Các nước Châu Á tập trung vào công nghệ nuôi trồng, khảo sát thành phầnhoá học, tác dụng dược lý, lâm sàng, các chế phẩm (Cổ Đức Trọng, 2006):

- Hàn Quốc là nước sản xuất Linh chi thứ hai trên thế giới sau Trung Quốc, sảnlượng năm 1998 đạt trên 1300 tấn

- Ở Nhật, sản lượng nuôi trồng Linh chi từ 1979 - 1995 tăng đến 40 lần

- Theo Teow và ctv (1994), Malaysia chú trọng cải tiến các quy trình trồng Linhchi ngắn ngày trên phế thải giàu chất xơ (trích dẫn bởi Lê Xuân Thám, 1998)

- Thái Lan có một số trang trại cỡ vừa nuôi trồng G.lucidum và G.capense (Linh

Trên thế giới nấm Linh chi cùng các chế phẩm Linh chi đã được sản xuất để làmthuốc và thực phẩm dưỡng sinh

 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, Viện Dược liệu - Hà Nội đã trồng nấm Linh chi (giống Trung Quốc)thành công vào năm 1978 Chín năm sau, năm 1987, các nhà khoa học thuộc Ðại họckhoa học tự nhiên đã chọn được giống Linh chi mọc hoang ở rừng núi Lâm Ðồng đểnhân giống và đưa vào sản xuất tại trại trồng nấm Linh chi của Xí nghiệp Dược phẩm

TW 24, đạt kết quả tốt vào năm 1988 Nuôi trồng Linh chi phát triển mạnh ở TP HồChí Minh trong 20 năm trở lại đây (Lê Duy Thắng, 2001), sản lượng hàng năm đạtkhoảng 10 tấn (Cổ Đức Trọng, 2006)

Ngành nuôi trồng nấm Linh chi hiện nay rất dễ phát triển vì:

- Điều kiện thiên nhiên ưu đãi, nhất là các tỉnh phía Nam

- Nguồn nguyên liệu dồi dào: mạt cưa, cùng các phế liệu khác cũng chiếm sốlượng rất lớn như rơm, bã mía, bông thải…

- Lực lượng lao động nhàn rỗi khá đông, nhất là trong lĩnh vực nông nghiệp

- Nhiều nơi có truyền thống trồng nấm lâu đời như Bình Chánh (Tp HCM), LongAn… hoặc đang phát triển nghề nấm như Cần Thơ, Sóc Trăng, Long Khánh, Hóc Môn(Tp HCM)…có đội ngũ kỹ thuật được rèn luyện trong thực tế ngày càng nhiều, sẽ làhạt nhân thúc đẩy phong trào trồng nấm lan rộng

- Ngành chế biến và xuất khẩu nấm đang ở bước đầu với lợi nhuận tương đối, khuyếnkhích được người trồng nấm

- Sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, sự bùng nổ của công nghệ thông tin và sựhình thành các hiệp hội nấm

- Tuy nhiên chủ yếu vẫn do hiệu quả của nấm Linh chi nuôi trồng: chỉ sử dụngnguyên liệu chính là phế liệu của ngành nông, công nghiệp như bã mía, bông thải, mạt

cưa… ít bị cạnh tranh bởi những ngành khác, nhưng sản phẩm lại là nguồn thực –dược phẩm rất quý, có giá trị cao.

Do vậy, cần chú trọng phát triển trồng nấm Linh chi ở nước ta hiện nay (NguyễnDuy Đại, 2009; Lê Duy Thắng, 2001)

2.1.5 Tác dụng dược lý của nấm Linh chi

Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc Các sáchdược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh chi được sử dụng làmthuốc từ lâu đời

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng cụ thể củanấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng lớn như sau:

- Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)

- Bảo can (bảo vệ gan)

- Cường tâm (thêm sức cho tim)

- Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá)

- Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp)

- Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc)

- Giải cảm (giải toả trạng thái dị cảm)

- Trường sinh (sống lâu tăng tuổi thọ)

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi,người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh (Lê Xuân Thám, 1998):

* Đối với bệnh về hệ tim mạch

Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp Khi dùng cho người huyết

áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng nhiều thì huyết áp ổnđịnh Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tácdụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng Đốivới bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh chi có tác dụng giảm cholesterol toànphần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số sinh bệnh.Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm

co tắc mạch, giải toả cơn đau thắt tim

* Đối với các bệnh về hô hấp

Nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những ca điều trị viêm phế quản dịứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn

* Đối với hệ tuần hoàn

Ổn định huyết áp, lọc sạch máu tăng cường tuần hoàn máu, giảm mệt mỏi, hỗ trợthần kinh, chống đau đầu và tứ chi, điều hoà kinh nguyệt, làm da dẻ hồng hào chốngcác bệnh ngoài da như dị ứng, trứng cá

Ngoài ra nấm Linh chi còn có tác dụng tốt tới các bệnh gan mãn tính mới phát,nâng cao chức năng gan, ổn định đường huyết ở những người bị bệnh đái tháo đường.Các tác giả ở Đài Loan dùng Linh chi trồng thí nghiệm trên gỗ long não điều trị ungthư cho kết quả rất tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn Trên cơ sở nguyên lý hiệu dụng là

do nấm Linh chi làm tăng và khôi phục hệ miễn dịch (J.T.Xie và ctv, 2006) Hàng nămdoanh thu của các chế phẩm chống ung thư điều chế từ các loài nấm Linh chi ở ĐàiLoan đạt trên 350 triệu USD

2.2 Thành phần hóa học nấm Linh chi

Ganoderma lucidum có khoảng 400 hoạt chất sinh học khác nhau, chủ yếu là

triterpenoid, polysaccharid, nucleotid, sterol, steroid, acid béo, alkaloid, protein, aminoacid, peptid và các nguyên tố vi lượng Trong đó, hai nhóm được quan tâm nhiều nhất

GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0) M= 23.000 Da

GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0) M= 25.000 Da

Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhậnsáng chế ở Nhật Năm 1982, Cty Teikoko Chemical Industry sản xuất sản phẩm từLinh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm Tại Mỹ đã có bằng sáng chếtrong việc sản xuất chất mucopolysaccharid từ Linh chi dùng chống ung thư (Nyoman

P Aryantha và ctv,2001)

 Triterpenoid

Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giảiphóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan Hiện nay, đã tìmthấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic Trong đó ganodosteron được xem là chất kíchthích hoạt động của gan và bảo vệ gan

Bảng 2.2 Thành phần các chất có hoạt tính ở Linh chi (Nguyễn Duy Đại, 2009)

D- 6 Tăng tổng hợp protein, tăng chuyểnhoá acid nucleic

Steroid GanodosteronLanosporeric acid A, Giải độc gan

Lonosterol Ức chế sinh tổng hợp Cholesterol

Triterpenoid

Ganodermic acid Mf,T-O Ưc chế sinh tổng hợp CholesterolGanodermic acid R, S Ưc chế giải phóng Histamin*

Ganoderic acid B,D,F,H,K,S,Y

Ganodermadiol Hạ huyết áp, ức chế ACE**

Ganosporelacton A, B

Nucleosid Adenosin dẫn suất Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giản cơ,giãm đauProtein Lingzhi – 8 Chống dị ứng phổ rộng, điều hoàmiễn dịchAcid béo Oleic acid Ưc chế giải phóng Histamin

Theo B K Kim và ctv (1994), thì dịch chiết nước và methanol của quả thể Linhchi ức chế sự nhân lên của virus Hiệu quả cũng nhận thấy trên tế bào lympho T củangười nhiễm HIV - 1 Phân đoạn hỗn hợp methanol (A) kháng virus rất mạnh Cácphân đoạn khác, như hexan (B), etyl acetat (C), trung tính (E), kiềm (G) đều có tácdụng kháng virus tốt

Phân tích thành phần nguyên tố của nấm Linh chi, còn phát hiện thấy khoảng 40nguyên tố, trong đó phải kể đến germanium Germanium có liên quan chặt chẽ vớihiệu quả lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô, đặc biệt là giảm bớtđau đớn cho người bệnh bị ung thư ở giai đoạn cuối (R Russellm và M Paterson,2006; Nyoman P.Aryantha và ctv, 2001; Jiang Jing Gaovà ctv,2006)

2.3 Giới thiệu về nhóm triterpenoid

Triterpenoid được tạo thành bởi 6 đơn vị isopren kết hợp và được phân bố rộngrãi trong giới thực vật và động vật, bao gồm: sterol có trong động vật, thực vật;triterpen; saponin (saponin triterpenoid; saponin steroid); glycosid có tác dụng trên tim(Trịnh Thị Huyền Trang, 2010; Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985)

Triterpenoid chia làm 2 phân nhóm chính: triterpenoid pentacyclic và triterpenoidtetracyclic Các triterpenoid có cấu trúc hóa học cơ bản là nhân lanosterol, chất trunggian quan trọng trong con đường sinh tổng hợp steroid và triterpenoid ở vi sinh vật vàđộng vật (Nguyễn Văn Đàn và Ngyễn Viết Tựu, 1985; S B Mahato và ctv,1992)

 Triterpenoid pentacyclic: Chia thành 4 nhóm: Olean, ursan, lupan và hopan

Hình 2.1 Bốn nhóm triterpenoid pentacyclic.(a): Cấu trúc khung Olean;

(b):Cấu trúc khung Ursan; (c): Cấu trúc khung Lupan; (d): Cấu trúc khung Hopan.

(b) (a)

 Triterpenoid tetracyclic: Chia thành 3 nhóm: dammaran, lanostan và cucurtan.

Hình 2.2 Ba nhóm triterpenoid tetracyclic.(a): Cấu trúc khung Dammaran;

(b): Cấu trúc Lanostan; (c): Cấu trúc Cucurbitan.

Theo Nishitoba và cộng sự, trong số các triterpenoid được phân lập, nổi bật hơn

cả là ganoderic (C30) và lucidenic (C27) Tùy thuộc chủng loại, môi trường sống, giaiđoạn sinh trưởng của nấm Linh chi mà hàm lượng acid ganodenic và mức độ đắngcũng không giống nhau Những loại Linh chi đắng thường có hàm lượng acid

ganodenic cao Ganoderma lucidum là một nguồn giàu triterpen đắng và vị đắng được

xem như đặc trưng cho đặc tính trị liệu của chúng (trích dẫn bởi Nguyễn Thị ThuHằng, 2009)

Các triterpenoid có thể biến đổi nhiều tùy theo chủng nấm Linh chi và theo từnggiai đoạn sinh trưởng phát triển Acid ganoderic A, B, H chỉ phát hiện thấy trong quảthể, trong khi acid ganoderic R, S, T chiếm chủ đạo trong hệ sợi nấm (M Hirotani và

T Furuya, 1990) Theo Miyahara và cộng sự (1987), hàm lượng triterpenoid tăng lênkhi quả thể xuất hiện và tích tụ nhiều hơn ở phía ngoài hoặc phần già (trích dẫn bởiNguyễn Thị Thu Hằng, 2009)

(c)

(a) (b) Hình 2.3 Các loại acid ganoderic được phân lập.

(a) Trong quả thể nấm ; (b): Trong hệ sợi nấm

2.4 Phương pháp khảo sát triterpenoid toàn phần trong nấm Linh chi

2.4.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký là kỹ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa phađộng và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnhdựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, là kỹ thuật khá đơn giản và tiện lợi

Nó giúp nhận biết nhanh số lượng thành phần có trong hỗn hợp đem sắc ký, xác địnhthành phần trong hỗn hợp nhờ so sánh hệ số lưu của hỗn hợp Rf và hệ số lưu Rfcủamột số chất đã biết

Nguyên tắc của kỹ thuật này là tách các chất trong mẫu phân tích dựa vào hiệntượng hấp thu Trong đó mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp nhiều chất với độphân cực khác nhau Pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyểnkéo theo mẫu chất ngang qua pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như silica gel hoặc oxidalumin Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi các thànhphần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau

theo thời gian Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua một hệ thống trong mộtkhoảng thời gian riêng biệt, gọi là “thời gian lưu”.

Ưu điểm của kỹ thuật SKLM: sử dụng lượng nhỏ mẫu phân tích cũng như chấthấp thu, quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong thời gian ngắn có thể biết ngay kếtquả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng,2007)

2.4.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiêncứu như phân tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên hoặc tổnghợp…

HPLC có thể phân tích nhiều mẫu phân tích có tính chất khác nhau như các hợpchất có khối lượng phân tử lớn, hợp chất không phân cực, hợp chất rất phân cực, hợpchất có tính bay hơi, hợp chất kém bền nhiệt…

Khả năng tách chất của HPLC dựa vào sự tương tác của các cấu tử của hỗn hợpvới các thành phần của pha động lỏng

Ưu điểm: Áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc ký nhanh, có thể thu hồimẫu để thực hiện các phân tích tiếp theo do các đầu dò HPLC không làm hư hại mẫu(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Y Chen và ctv, 2008)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 01/2011 đến tháng 7/2011

Địa điểm thực hiện đề tài:

 Trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và Môi trường Trường Đại học NôngLâm TPHCM

 BM Thực vật – Khoa Dược Đại học Y Dược TPHCM

 Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM

 Ban nghiên cứu khoa học - Khoa Dược Đại học Y Dược TPHCM

3.2 Đối tượng nghiên cứu

3.2.1 Nguyên liệu:

- Giống nấm trồng thí nghiệm: giống nấm Linh chi Ganoderma lucidum nguồn gốc

từ Trung tâm CNSH ứng dụng, 2 bis Nguyễn Hữu Cảnh, Q1, TPHCM

- Vật liệu nghiên cứu gồm:

 Quả thể nấm Linh chi trồng tại trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và Môitrường Trường Đại học Nông Lâm TPHCM được khảo sát ở 2, 4, 6, 8 và 10 tuầntuổi

 Quả thể nấm Linh chi mua tại công ty TNHH Linh chi VINA làm mẫu so sánh:Linh chi VINA (Quả thể Linh chi chủng Việt Nam) và Linh chi Nhật (Quả thể Linhchi chủng Nhật trồng tại Việt Nam)

 Nguồn gốc và ngày thu mẫu thể hiện ở Bảng 3.1

Hình 3.1 Bột quả thể các mẫu Linh chi.(a) Bột quả thể

Linh chi thí nghiệm;(b) Bột quả thể Linh chi VINA;

(c) Bột quả thể Linh chi Nhật.

(b) (a)

(c)

Hình 3.2 Quả thể các mẫu Linh chi (a) Quả thể Linh chi thí nghiệm; (b) Quả thể Linh

chi VINA; (c) Quả thể Linh chi Nhật.

Bảng 3.1 Quả thể nấm Linh chi dùng trong nghiên cứu

2 tuần Việt Nam Trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và

Môi trường Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

13/4/2011

4 tuần Việt Nam Trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và

Môi trường Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

27/4/2011

6 tuần Việt Nam Trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và

Môi trường Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

11/5/2011

8 tuần Việt Nam Trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và

Môi trường Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

25/5/2011

10 tuần Việt Nam Trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH và

Môi trường Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

3.2.2 Dung môi, hoá chất sử dụng

- Methanol PA (Trung Quốc)

- Cloroform PA (Trung Quốc)

- Hệ dung môi: Toluen – Ethylacetat – Acid formic

- Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254, Merck (Đức)

(a)

- Chất nhồi cột: Nhựa Diaion HP-20 (styren divinyl copolymer resin cuảMitsubishi Chemical Corporation, Nhật).

- Hoá chất sơ bộ: Anhydric acetic, H2SO4đđ, HCl, KOH, FeCl3, Na2CO3,…Cácthuốc thử Dragendorff, Mayer, Fehling, Bouchardat

3.2.3 Thiết bị sử dụng

- Phần trồng nấm: nồi hấp, đèn cồn, bịch giá thể, giàn, nhà lưới…

- Phần khảo sát hàm lượng triterpenoid (định tính và định lượng):

 Bộ chiết Soxhlet 1000 ml

 Máy cô quay dưới áp suất giảm

 Cột tinh chế bằng thuỷ tinh 30 x 4 cm

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao LC – OAD, Shimazu (Nhật Bản), detectorPhotodiod Array SPD M10 AVP Shimadzu (Nhật Bản)

 Các thiết bị khác: bình cầu, bếp cách thủy, máy siêu âm, tủ sấy, tủ soi UV…

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Mẫu phân tích hoạt chất

CânRửa, sấy, nghiền thành bộtSàn, ủ vôi 2%

Mạt cưa cao su

3.3.2 Thiết kế thí nghiệm

Thiết kế thí nghiệm: Bố trí thí nghiệm một nhân tố kiểu khối ngẫu nhiên

 Quá trình chuẩn bị mẫu:

- Trồng nấm trên cơ chất mạt cưa cao su

- Thu mẫu quả thế Linh chi thí nghiệm theo lịch trình 2, 4, 6, 8, 10 tuần sau khi mởnắp bịch phôi

- Xử lý mẫu Linh chi sau khi thu hái: Mẫu Linh chi thí nghiệm sau khi thu hái ở cáctuần tuổi trên được rửa sạch với nước, để ráo, làm khô tự nhiên trong mát, nơithoáng gió Sau đó, cắt nấm thành các lát mỏng, trải đều phơi khô ở nhiệt độ phònghoặc sấy trong lò sấy 60oC đến khi đạt khối lượng không đổi Đem mẫu đã sấy khônghiền thành bột mịn Quá trình nghiền này giúp phá vỡ màng tế bào thực vật, giúpdung môi dễ thấm vào bột cây giúp chiết tách hết các hợp chất ra khỏi cây (NguyễnKim Phi Phụng, 2007)

- Tiến hành bước mô tả các đặc điểm của mẫu quả thể Linh chi thí nghiệm và đánhgiá độ tinh khiết của mẫu thể quả song song với quá trình xử lý mẫu

3.3.3 Mô tả nấm Linh chi thí nghiệm

Quả thể nấm Linh chi 8 tuần tuổi sau khi thu hái được tiến hành mô tả về hình thái,

mô tả hệ sợi nấm và cấu tạo của bào tử nấm bằng cách quan sát dưới kính hiển viquang học, nhằm khẳng định chính xác giống nấm đã trồng, tránh nhầm lẫn giữa cácgiống Việt Nam, Trung Quốc, Nhật

3.3.4 Xác định đường cong tăng trưởng

Cân khối lượng tươi của mẫu nấm ở 2, 4, 6, 8, 10 tuần tuổi ngay sau thu hái Phơikhô hoặc sấy nấm ở 60oC đến khi đạt khối lượng không đổi Cân khối lượng khô

3.3.5 Thử độ tinh khiết của dược liệu

3.3.5.1 Xác định độ ẩm

Độ ẩm của dược liệu: Tỉ lệ phần trăm nước trong dược liệu khi bảo quản ở điềukiện thường Định lượng độ ẩm trong dược liệu nhằm kiểm tra xem dược liệu có đạttiêu chuẩn về độ ẩm hay không Ngoài ra, xác định độ ẩm cũng cần thiết cho việc tínhkết quả định lượng và hiệu suất chiết hoạt chất trong dược liệu

Bột nấm được xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy theo DĐVN III, PL - 98:Chuẩn bị 3 bì được đánh số, sấy khô đến khối lượng không đổi ở 105oC, ghi nhận khốilượng bì Cân chính xác khoảng 1 g bột nấm trên bì đã chuẩn bị, đem sấy 105oC trong

2 giờ Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng 10 phút Cân và ghi nhận kết quả.Tiếp tục sấy và cân lại cho đến khi đạt khối lượng không đổi Tiến hành 3 lần lấy trị sốtrung bình

% 100

*

a

b a

Trong đó: A: độ ẩm (%)

a: khối lượng bột nấm trước khi sấy (g)

b: khối lượng bột nấm sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)

3.3.5.2 Xác định độ tro

Tro là phần cắn vô cơ còn lại sau khi đốt cháy hoàn toàn bột nấm Các chất vô cơnày có thể là các chất có trong mô của bản thân nấm (nguồn gốc nội sinh) hoặc do lẫntạp cát, bụi trong quá trình thu hái, phơi sấy hoặc bảo quản nấm (nguồn gốc ngoạisinh) (Trần Hùng và Bộ môn Dược liệu ĐH Y Dược TPHCM, 2003)

 Độ tro toàn phần: Nung một chén sứ đến khối lượng không đổi, để nguội trongbình hút ẩm, cân khối lượng chén đã nung Cân chính xác khoảng 1 g bột nấm vào

chén nung, đốt trên bếp điện cho đến khi bột nấm cháy hoàn toàn và không còn bốckhói đen Đưa chén vào lò nung trong 4 giờ ở 500oC đến khi vô cơ hoá hoàn toàn¸tro mất màu đen Để nguội chén trong bình hút ẩm khoảng 30 phút rồi cân ghi nhậnkhối lượng Tiếp tục thực hiện đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp chênh lệch khôngquá 0,5 mg Tính kết quả.

Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt

)

*(

100

*)

(

A c c

b a

Trong đó:

X: tỷ lệ tro toàn phần

a: khối lượng chén có tro (g)

b: khối lượng bột chén không tro (g)

c: khối lượng dược liệu dùng (g)

A: độ ẩm (%)

 Tro không tan trong acid

Thêm vào chén sứ chứa tro toàn phần 25 ml HCl 2M, đun sôi 5 phút, lọc chấtkhông tan vào giấy lọc không tro, rửa lại bằng nước nóng rồi đem nung ở 500oC đếnkhối lượng không đổi Để nguội chén trong bình hút ẩm khoảng 30 phút rồi cân ghinhận khối lượng Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đãlàm khô trong không khí

3.3.6 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của nấm Linh chi

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật: Sử dụng các quy trình chiết đơn giảntrong những điều kiện nhất định (dung môi, pH ) để phân tách các chất trong nguyênliệu thực vật thành những phân đoạn đơn giản hơn, giúp định tính nhanh các nhóm hợpchất trong các phân đoạn bằng một số thuốc thử chung Phản ứng xác định các nhómhợp chất được trình bày ở bảng 3.2

 Chuẩn bị dịch chiết: Theo tài liệu của Bộ môn Dược liệu (2007) và Nguyễn Khắc

Quỳnh Cứ (1999)

 Chiết dịch chiết ether

Chiết khoảng 20 g bột dược liệu (có thể ít hoặc nhiều hơn tùy điều kiện thực hiện)bằng 20 ml diethyl ether trong bồn siêu âm trong 10 - 20 phút Chiết đến chi dịch chiết

ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, thực hiện 2 –

3 lần Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch ether

 Chiết dịch chiết nước

Bã dược liệu sau khi chiết cồn được chiết nóng với 20 ml nước trong bình siêu âm.Gộp các dịch chiết, để nguội, lọc, cô lại thu được 50 ml dịch chiết nước Phần lớn dịchchiết nước dùng để định tính các aglycon sau khi thủy phân

Lấy 15 ml dịch chiết nước cho vào cốc thủy tinh, thêm 10 ml acid hydrocloric 10%đánh trong bồn siêu âm 30 phút Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiếtbằng ether Dịch ether được dùng để định tính các aglycon

Glycosid tim Tannin

ngả sang xanh dươngTriterpenoid tự do Liebermann - Burchard Đỏ nâu - tím, lớp trên cómàu xanh lụcAlkaloid Thuốc thử chung alkaloid Kết tủa

Courmarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn

Glycosid tim Thuốc thử vòng lacton Tím

Hợp chất polyuronic Pha loãng với cồn 90% Tủa bông trắng – vàngnâu