NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC LOÀI TRE VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

Trong đó việc sử dụng các hệ thống chỉ thị phân tử sẽ giúp phân biệt và định danh các cá thể một cách chính xác hơn dựa trên sự đa hình kiểu gene của chúng.. SSR cung cấp công cụ đủ mạnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC LOÀI TRE VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC LOÀI TRE VIỆT NAM

BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

TS DIỆP THỊ MỸ HẠNH NGUYỄN ANH TÍN

ThS TRƯƠNG QUỐC ÁNH

Tháng 7/2011

LỜI CẢM ƠN

Con muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến bố mẹ và những người thân trong

gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc cho con và tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt

Cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Bộ môn

Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại

trường

Xin chân thành cảm ơn nhóm thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng di

truyền của quần thể tre Việt Nam và giá trị ứng dụng của chúng” bao gồm chủ nhiệm

đề tài TS Diệp Thị Mỹ Hạnh, ThS Trương Quốc Ánh, chị Cao Minh Thùy Nguyên,

Nguyễn Bích Loan, Nguyễn Hà Phương và các anh chị thuộc phòng nghiên cứu Công

nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tận tình giúp

đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cảm ơn toàn thể lớp Công nghệ Sinh học niên khóa 2007 – 2011 đã giúp đỡ và

động viên tôi trong suốt bốn năm qua

Nguyễn Anh Tín

TÓM TẮT

Tre được phân bố khắp nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam, với một loạt các chi khác nhau phù hợp với những vùng sinh thái khác nhau Chúng có nhiều ứng dụng trong cuộc sống với tầm quan trọng cao về mặt kinh tế cũng như giữ nhiều vai trò trong hệ sinh thái nên cần thiết phải có những nỗ lực nghiêm túc để bảo tồn sự đa dạng

của tre Tuy nhiên, việc bảo tồn tre bằng những phương pháp ex-situ vẫn chưa là một

lựa chọn khả thi Những thành tựu của sinh học phân tử hiện đại ngày nay đang mang lại nhiều công cụ mạnh, nhanh chóng và chính xác để phân loại thực vật và vì thế đóng một vai trò quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn và

sử dụng nguồn gene có hiệu quả Trong đó, các hệ thống chỉ thị phân tử đã cho thấy tính đặc hiệu trong việc phân biệt và định danh các cá thể dựa trên sự đa hình kiểu gene của chúng Một trong những chỉ thị phân tử thường được sử dụng hiện nay đối với cây trồng đó là chỉ thị Simple Sequence Repeat (SSR) nhờ những ưu điểm nổi trội như dễ sử dụng và tần số biến dị cao Chính vì thế, đề tài này được thực hiện để hiểu

rõ hơn mối quan hệ di truyền giữa các loài tre ở Việt Nam, sự phân bố và mức độ đa dạng di truyền, từ đó làm cơ sở cho công tác bảo tồn và sử dụng có hiệu quả

Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa hai mươi hai mẫu tre dựa trên chín chỉ thị SSR được chọn lọc cho thấy rằng hai mươi hai mẫu tre được chia làm bốn nhóm di truyền với khoảng cách di truyền giữa bốn nhóm là 0,35 Hệ số tương đồng dao động từ 0,44 đến 0,96 với giá trị trung bình tương đối cao là 0,65 Chín chỉ thị

SSR hữu ích trong việc phân biệt tính đa hình giữa bảy loài tre thuộc chi Bambusa Chi Dendrocalamus có sự biến dị rất lớn trong khi chi Gigantochloa cho thấy tính đa dạng thấp Kết quả cũng chứng tỏ mối quan hệ gần gũi giữa hai chi Bambusa và

Gigantochloa Chi Neohouzeaua và chi Pseudostachyum có mối quan hệ gần gũi với

nhau hơn là với chi Schizostachyum Tuy nhiên những chỉ thị này lại cho thấy hạn chế

trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền giữa tre mọc rải và tre mọc cụm

However, ex-situ conservation has yet to be a viable option Advances in modern

molecular biology providing powerful, prompt and accurate tools for a more objective classification will assist effective conservation measures and efficient use of genetic resources Especially, many molecular marker systems have revealed high specificities

in plant taxonomy based on their genetic polymorphisms Microsatellites or Simple Sequence Repeats (SSRs) with obvious advantages for crop species, such as ease of use and high levels of simply inherited variation, are one of the most favorable molecular markers For these reasons, this study was conducted to better understand relationships between bamboo species from different regions of Vietnam as well as the distribution and extent of their genetic diversity so that the genetic diversity of Vietnamese bamboo can be safely conserved and efficiently used

The result of analysis of genetic relationships among twenty two bamboo accessions based on nine SSR markers were constructed into a UPGMA dendrogram that split the twenty two accessions into four main groups with a genetic distance of 0,35 Similarity coefficients between accessions ranged from 0,44 to 0,96 with a relatively high average of 0,65 These SSR markers were useful in determining genetic

diversity among the seven Bambusa species The five Dendrocalamus species showed

a wide variation while the genus Gigantochloa was genetically less diverse The results also found a close relationship between the genera Bambusa and Gigantochloa Two genera Neohouzeaua and Pseudostachyum showed a higher affinity to each other than did genus Schizostachyum However, these SSR markers showed limitations in

assessing genetic diversity between running and clumping bamboos

Keywords: bamboo, conservation, genetic diversity, SSRs (microsatellites)

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 3

Chương 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Cơ sở khoa học cây tre 4

2.1.1 Phân loại khoa học 4

2.1.2 Hình thái học và sinh lý học 4

2.2 Vai trò của tre 12

2.3 Đa dạng di truyền và đa dạng sinh học 14

2.3.1 Khái niệm cơ bản 14

2.3.2 Ý nghĩa của đa dạng di truyền và nghiên cứu đa dạng di truyền 14

2.4 Chỉ thị phân tử 15

2.4.1 Khái niệm cơ bản 15

2.4.2 Chỉ thị phân tử SSR 17

2.5 Giới thiệu kỹ thuật PCR 21

2.5.1 Khái niệm PCR 21

2.5.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR 21

2.5.3 Các thành phần cần thiết của một phản ứng PCR 22

2.5.4 Các bước của một phản ứng PCR 23

2.6 Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền các loài tre 25

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 27

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

3.2 Vật liệu 27

3.2.1 Các mẫu tre dùng trong nghiên cứu 27

3.2.2 Hóa chất dùng trong thí nghiệm 28

3.2.3 Thiết bị thí nghiệm 30

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Ly trích DNA 30

3.3.2 Kiểm tra DNA sau khi tinh sạch 31

3.3.3 Phản ứng PCR 32

3.3.4 Điện di sản phẩm PCR 33

3.3.5 Thu thập và xử lý số liệu 33

Chương 4 Kết quả và thảo luận 35

4.1 Sản phẩm DNA tổng số sau ly trích 35

4.2 Phát hiện sự đa hình bằng chỉ thị phân tử SSR 36

4.3 Đánh giá sự tương đồng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR 40

4.4 Phân nhóm di truyền bằng giản đồ hình cây 40

Chương 5 Kết luận và đề nghị 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 48

Tài liệu tham khảo 49

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms

ALP: Amplicon Length Polymorphisms

bp (unit): base pair

CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequences

cpSSRs: Chloroplastic Simple Sequence Repeats

DNA: Deoxyribonucleic acid

DNase: Deoxyribonuclease

dNTPs: Deoxynucleoside triphosphate

EST-SSR: Express Sequence Tags – Simple Sequence Repeat

ISA: Inter-Simple sequence repeat Amplification

MAB: Marker-assisted backrossing

MAS: Marker-assisted selection

mtSSRs: Mitochondrial Simple Sequence Repeats

nuSSRs: Nuclear Simple Sequence Repeats

OD: Optical Density (absorbance)

PCR: Polymerase Chain Reaction

PIC: Polymorphic Information Content

QTLs: Quantitative trait loci

RAPDs: Random Amplified Polymorphic DNAs

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

RNase: Ribonuclease

SCARs: Sequence Characterized Amplified Regions

SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms

SSRs: Simple Sequence Repeats (microsatellite)

STS: Sequence-Tagged Sites

Ta: Annealing Temperature

Tm: Melting Temperature

UV: Ultraviolet

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Một số loại chỉ thị phân tử 16

Bảng 2.2 So sánh ứng dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền 17

Bảng 2.3 Phân loại chỉ thị SSR 19

Bảng 3.1 Tên của 22 mẫu tre dùng trong nghiên cứu 27

Bảng 3.2 Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của 9 cặp mồi SSR dùng trong đề tài 29

Bảng 3.3 Thành phần một phản ứng PCR 32

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32

Bảng 3.5 Thông số điều kiện điện di 33

Bảng 4.1 Giá trị OD của 22 mẫu DNA sau ly trích được dùng để chạy PCR 36

Bảng 4.2 Tổng số phân đoạn được hình thành của 22 mẫu DNA với 9 mồi SSR 37

Bảng 4.3 Bảng mô tả đặc điểm của từng locus SSR 39

Bảng 4.4 Hệ số tương đồng của 22 mẫu tre trong nghiên cứu 45

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Thân ngầm mọc rải 6

Hình 2.2 Thân ngầm mọc cụm 6

Hình 2.3 Tre mọc rải 7

Hình 2.4 Tre mọc cụm, chi Bambusa 7

Hình 2.5 Rễ tre đặc trưng của chi Phyllostachys 8

Hình 2.6 Thân tre với những màu sắc khác nhau 9

Hình 2.7 Hoa tre 11

Hình 2.8 Phản ứng PCR 24

Hình 4.1 Kết quả điện di 22 mẫu tre sau ly trích 35

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-5 38

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-7 38

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-11 38

Hình 4.5 Giản đồ hình cây mô tả quan hệ di truyền giữa 22 mẫu tre 46

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Tre có nhiều ứng dụng trong cuộc sống cũng như giữ nhiều vai trò trong hệ sinh thái Chúng xuất hiện rộng rãi trong các khu rừng tự nhiên cũng như được trồng bởi con người Ứng dụng của tre phụ thuộc vào đặc tính của từng loài như độ bền, tính dẻo dai và kích cỡ thân tre Vai trò của tre đối với hệ sinh thái của một khu vực xuất phát

từ khả năng tái chế chất dinh dưỡng hiệu quả, khả năng bảo vệ chống xói mòn đất, và giá trị dinh dưỡng cao của lá và măng tre (Rao và Ramakrishnan, 1989; Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2007) Vì tầm quan trọng về mặt kinh tế cũng như sinh thái như vậy, cần thiết phải có những nỗ lực nghiêm túc để bảo tồn sự đa dạng của tre

Tuy nhiên, đặc tính sinh sản tự nhiên của tre là một trở ngại rất lớn đối với công tác bảo tồn (Stapleton, 1996) Khác với phần lớn các loài thực vật trên thế giới, hầu hết các loài tre hiếm khi ra hoa Khoảng cách ra hoa của tre có thể dài hàng thập kỷ, cá

biệt như Phyllostachys bambusoides, một loài tre lấy gỗ phổ biến ở Nhật Bản, có

khoảng cách ra hoa đạt kỉ lục là 130 năm Mặc dù thế cũng có những loài tre ra hoa hàng năm nhưng rất hiếm Ở tre, hiện tượng ra hoa đồng thời trong các khu vực lớn của một loài cũng đã được ghi nhận Nó có thể làm mất một số lượng lớn dân số của quần thể nếu môi trường sống bị suy thoái và các cây con không thể tồn tại Quần thể

sẽ không thể phục hồi nếu như vòng đời sinh trưởng không lặp lại và giai đoạn sản xuất hạt giống không xảy ra Trong khi đó việc can thiệp thông qua hình thức lưu trữ vật liệu di truyền hoặc nhân giống là điều không dễ dàng Hạt giống của tre có thời hạn sống ngắn Nhân giống sinh dưỡng lại phức tạp, và có thể làm thu hẹp cơ sở di truyền

ngoài mong đợi Vì vậy, việc bảo tồn ex-situ vẫn chưa là một lựa chọn khả thi

(Stapleton và Rao, 1995) và do đó đối với mục đích thực tiễn, sự thành công của công tác bảo tồn đa dạng các loài tre có lẽ phụ thuộc vào việc bảo vệ môi trường sống tự nhiên cùng với việc quản lý chặt chẽ hoặc trồng rừng Điều này đòi hỏi sự hiểu biết tốt

về hệ sinh thái nơi cư ngụ của các loài tre và những tác động mà các biện pháp quản lý đất đai khác nhau có thể ảnh hưởng lên từng loài (Stapleton, 1996)

Tre được phân bố khắp nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam, với một loạt các chi khác nhau phù hợp với những vùng sinh thái khác nhau, tuy nhiên số lượng loài,

phân loài, giống vẫn chưa được biết rõ Phân loại học truyền thống ở thực vật chủ yếu dựa vào những đặc điểm hình thái của cây trồng, trong đó các bộ phận của hoa thường

là những phần kiểu hình khác biệt rõ ràng nhất và hữu ích nhất cho việc phân loại Nhưng vì khoảng cách ra hoa của tre có thể kéo dài hàng thập kỉ nên việc phân loại và định danh chính xác các loài tre là một nhiệm vụ rất khó khăn và vì thế việc phân loại khoa học của tre đã dần bị bỏ quên Ngoài ra, việc phân loại thực vật dựa vào kiểu hình cũng không hòan toàn chính xác (Stapleton và Rao, 1995) Những tác giả khác nhau có thể sử dụng hệ thống phân loại khác nhau hoặc những bộ phận của cây được cho là quan trọng nhất để phân loại và do đó kết quả định danh thực vật cũng sẽ có thể khác nhau

Việc ra đời của sinh học phân tử có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn và chọn giống bởi nó cung cấp những công cụ mạnh, nhanh chóng và chính xác để phân loại thực vật Trong đó việc sử dụng các hệ thống chỉ thị phân tử sẽ giúp phân biệt và định danh các cá thể một cách chính xác hơn dựa trên sự đa hình kiểu gene của chúng Một trong những chỉ thị phân tử được ưa chuộng là microsatellite hay còn gọi là simple sequence repeat (SSR) SSR cung cấp công cụ đủ mạnh nhờ có nhiều thuộc tính di truyền mong muốn như tần số đột biến cao, phát hiện nhiều locus, cho đa hình các locus cao và ổn định, có thể phát hiện các locus đặc trưng và đa allele, là những chỉ thị đồng trội, đồng phân ly, số lượng phong phú, phân bố đều khắp bộ gene tại những vị trí chuyên biệt trên nhiễm sắc thể, dễ sử dụng và có khả năng áp dụng cho việc phân tích kiểu gene với độ chính xác cao (high throughput genotyping) (Kalia và ctv, 2010)

Chính vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền các loài tre Việt Nam bằng chỉ thị phân tử SSR” được thực hiện để hiểu rõ hơn mối quan hệ di truyền giữa các loài tre ở Việt Nam, từ đó làm cơ sở ban đầu cho công tác bảo tồn và

sử dụng có hiệu quả

1.2 Yêu cầu của đề tài

Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của hai mươi hai loài tre đã thu thập dựa trên chín chỉ thị SSR

Đánh giá khả năng của chín chỉ thị SSR được sử dụng trong việc phân biệt tính

đa hình giữa hai mươi hai loài tre

1.3 Nội dung thực hiện

Ly trích DNA của hai mươi hai mẫu tre thu thập

Thực hiện phản ứng PCR với chín cặp mồi SSR, điện di sản phẩm PCR và đọc kết quả

Chuyển đổi số liệu từ kết quả điện di sang thuật toán nhị phân, xử lý số liệu bằng phần mềm NTSYSpc21, đánh giá đa dạng di truyền giữa hai mươi hai mẫu tre

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học cây tre

2.1.1 Phân loại khoa học

Tre là một nhóm thực vật thường xanh đa niên thân gỗ thuộc họ Hòa Thảo (Poaceae), phân họ Tre (Bambusoideae), tông Tre (Bambuseae) Hơn 1000 loài, 91 chi, 9 phân tông tre tồn tại khắp Thế giới và chúng có khả năng sinh trưởng trong nhiều vùng địa lý và khí hậu khác nhau Tre có khả năng sinh trưởng trong các sa mạc thuộc vùng tiểu lục địa Sahara của Châu Phi cho đến địa hịnh miền núi lạnh lẽo của dãy Himalaya Phần lớn các loài tre có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Á, tuy nhiên

có một loài là đặc chủng của Mỹ, Arundinaria gigantea Kích thước của các loài tre rất

khác nhau Giống nhỏ nhất cao khoảng 28 cm, trong khi tre gỗ khổng lồ có thể đạt đến chiều cao 30 m Dưới đây là phân loại khoa học của tre:

là mọc rải – running hoặc là mọc cụm – clumping (Complete Bamboo – Bamboo Information Resources)

nhanh chóng và dày đặc Chính vì thế, tre có thể sử dụng được cả hai nguồn năng lượng: năng lượng quang hợp và năng lượng tích lũy trong thân ngầm Theo thời gian, thân ngầm sẽ tạo ra một mạng lưới ngầm (interconnected system) kết nối các thân tre trên mặt đất và các thân tre sẽ sinh trưởng nhờ chất dinh dưỡng trong hệ thống thân ngầm này Thân ngầm được phân thành từng đốt và được bọc bởi một lớp vỏ bảo vệ Các thân ngầm không có lá vì không thể quang hợp dưới mặt đất Lớp vỏ này bảo vệ trong quá trình nhô khỏi mặt đất hình thành một thân tre mới Một thân ngầm khỏe mạnh thường hơi vàng hoặc ngà, mặc dù thế màu sắc có thể là đỏ, nâu, xanh lá, hoặc tía Hình dạng và đặc tính của thân ngầm thay đổi giữa các loài và được chia thành hai loại chính bao gồm hệ thống pachymorph và hệ thống leptomorph

Hệ thống thân ngầm leptomorph được tìm thấy ở tre mọc rải Chúng di chuyển theo chiều ngang, có xu hướng mọc ra xa thân chính Hướng và khoảng cách tăng trưởng của thân ngầm là không thể đoán trước, ở một số loài có thể kéo dài đến 6 m trong một mùa sinh trưởng duy nhất Thân ngầm leptomorph thường dài và ốm, tại các mắt có thể hình thành các chồi phát triển thành thân nổi trên mặt đất hay thân ngầm mới Trong tự nhiên, tre mọc rải hầu hết thường được tìm thấy ở khu vực ôn đới, với

các chi đáng chú ý nhất là Phyllostachys và Pleioblastus Hầu hết các giống có thể

chịu đựng được dưới nhiệt độ đóng băng Tre mọc rải với hệ thống thân ngầm leptomorph có khả năng xâm lấn trong tự nhiên và sẽ lan tỏa nhanh chóng trong một diện tích rộng nếu không được kiểm soát

Hệ thống thân ngầm pachymorph, được tìm thấy ở tre mọc cụm, kéo dài mỗi năm một khoảng ngắn Thân ngầm loại này thường ngắn, mập và dày đặc Chúng cong lên phía trên và rất gần với thân chính Tại các mắt có thể hình thành các rễ hay các thân ngầm mới Các thân tre mới chỉ hình thành tại đỉnh của mỗi thân ngầm Điều này giải thích tại sao thân ngầm pachymorph lại mọc cong lên trên và hình thành nên các

bụi tre tập trung Chi phổ biến nhất là Bambusa và chủ yếu được tìm thấy ở các vùng

nhiệt đới Tre mọc cụm khả năng chịu lạnh kém hơn tre mọc rải (Complete Bamboo – Bamboo Information Resources)

Hình 2.1 Thân ngầm mọc rải (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2007).

Hình 2.2 Thân ngầm mọc cụm (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2007).

Hình 2.3 Tre mọc rải (Complete Bamboo, Bamboo Information Resources, 2011).

Hình 2.4 Tre mọc cụm, chi Bambusa (Complete Bamboo, Bamboo Information Resources, 2011).

2.1.2.2 Rễ

Rễ tre có chức năng quan trọng là cố định thân cây xuống mặt đất Không có rễ tre, thân cây rất dễ bị tổn thương do thời tiết khắc nghiệt Nó cũng cho phép giữ trọng lượng của thân cây, tạo khả năng phát triển nhiều lá hơn với khoảng cách rộng hơn Rễ tre cũng đóng vai trò lưu trữ chất dinh dưỡng, tuy nhiên đây không phải là chức năng chính của rễ Về hình dạng, gốc rễ thường đối xứng về kích thước và hình dạng Chúng hình thành tại gốc của thân cây từ vị trí các mắt của thân ngầm và nói chung không đi sâu hơn 30 cm dưới mặt đất (Complete Bamboo – Bamboo Information Resources)

Hình 2.5 Rễ tre đặc trưng của chi Phyllostachys

(Complete Bamboo, Bamboo Information Resources, 2011).

2.1.2.3 Thân tre

Thân tre là phần dễ dàng phân biệt nhất của cây tre Thân có thể khác nhau về kích thước, hình dạng, màu sắc, và thậm chí cả mùi Hình dạng có thể thay đổi từ mập hay ốm, cao hay thấp, mọc thẳng hay cong, và cũng có thể không theo một quy luật

như Tre Mai Rùa P heterocycla f heterocycla ‘Kiko’ Hầu hết có hình tròn, nhưng

một số có thân hình vuông Màu cũng có nhiều loại khác nhau Mặc dù phần lớn là xanh lá, nhưng cũng có thể là màu nâu, đen, vàng, hoặc có sọc Một trong những loài

tre hoang dại phổ biến nhất, Tre Đen Phyllostachys nigra, là loài duy nhất sở hữu màu

đen tuyền Thân tre cũng có thể có nhiều mùi hương khác nhau Tre Hương Trầm

Phyllostrachys atrovaginata trên thân có một lớp sáp với một mùi thơm dễ chịu tương

tự hương trầm

Thân mới hình thành từ những chồi gọi là măng tre Chúng thường nhô lên vào mùa xuân, tuy nhiên thời gian khác nhau giữa các loài Măng mới mọc được bao phủ bởi những lớp màng bảo vệ màu nâu với một lớp lông tơ Những lớp màng này bảo vệ phần mô mềm của thân con và cung cấp hormone cần thiết cho sự phát triển nhanh chóng của thân cây Măng tre hay thân con mọc lên rất dễ bị chết bởi tác động của môi trường như dinh dưỡng, khí hậu trong một vài tuần đầu tiên Thực tế, phải mất gần ba mùa sinh trưởng để hầu hết các thân con có thể trở nên hòan toàn cứng cáp (Complete Bamboo – Bamboo Information Resources) Điều này cũng là một trở ngại cho sự sinh tồn của quần thể tre sau khi tre ra hoa, bởi nhiều loài sẽ chết sau hiện tượng ra hoa toàn

bộ và quần thể tre khó có thể phục hồi nếu điều kiện dinh dưỡng kém hoặc các cây con không có khả năng tồn tại bởi các tác động xấu của môi trường (Stapleton, 1996)

Hình 2.6 Thân tre với những màu sắc khác nhau

(Complete Bamboo, Bamboo Information Resources, 2011)

2.1.2.4 Cành

Phần lớn các loài tre sẽ phát triển nhiều cành từ một chồi duy nhất, nằm tại mắt

Một số chi, như Chusquea, có khả năng phát triển nhiều chồi từ mỗi mắt

2.1.2.5 Lá

Lá có mặt tại tất cả các phần chính của cây tre, bao gồm các thân ngầm, thân trên mặt đất, và các cành Các thành phần của lá bao gồm một phiến lá, vỏ, và bẹ lá Ở thân ngầm, lá gần như chỉ bao gồm lớp vỏ bọc Ở giai đoạn này, lá đóng vai trò là lớp

vỏ bảo vệ khi thân ngầm di chuyển trong lòng đất Sau khi các thân ngầm nhô lên mặt đất và trở thành một thân tre, phiến lá sẽ hình thành và trở thành bộ phận chiếm ưu thế

Phiến lá có chức năng thực hiện quang hợp tạo năng lượng Hình dạng phiến lá khác nhau giữa các loài Ở một số loài có lá rất lớn và ít, trong khi các loài khác có một số lượng lớn các lá rất nhỏ Hình dạng của lá cũng đóng một vai trò lớn trong việc định danh các loài tre (Complete Bamboo – Bamboo Information Resources)

2.1.2.6 Hiện tượng ra hoa

Khác với phần lớn các loài thực vật trên thế giới, hầu hết các loài tre hiếm khi

ra hoa Khoảng cách ra hoa của tre có thể dài hàng thập kỉ Phyllostachys

bambusoides, một loài tre lấy gỗ phổ biến ở Nhật Bản, có khoảng cách ra hoa đạt kỉ

lục là 130 năm Mặc dù thế cũng có những loài tre ra hoa hàng năm nhưng rất hiếm

Tre có hiện tượng ra hoa đồng thời (simultaneous) Hiện tượng ra hoa này được chia làm hai loại: ra hoa toàn bộ (gregarious/mass flowering) hay ra hoa rải rác (sporadic flowering) Một số loài sẽ ra hoa toàn bộ, một số loài sẽ ra hoa rải rác, nhưng cũng có những loài có thể có cả hai hiện tượng trên Trong hiện tượng ra hoa rải rác, không phải tất cả các thân trong một cụm sẽ ra hoa mà chỉ một phần của từng cụm trong quần thể mới ra hoa Trong hiện tượng ra toàn bộ, toàn bộ quần thể tre trong một khu rừng sẽ hoa cùng một lúc bất kể điều kiện bên ngoài bao gồm khí hậu hay vị trí địa lý Tất cả các cụm và tất cả các cây của một cụm sẽ ra hoa trong một khoảng thời gian có thể kéo dài từ vài tháng đến vài năm (National Mission on Bamboo Application) Điều này có thể có liên quan đến khả năng nhân giống sinh dưỡng của tre, nhờ đó mà tre lan tỏa trong một khoảng diện tích rộng Hình thức này xảy ra do sự

di chuyển của thân ngầm đến một vị trí mới, nhờ đó cũng hình thành nên các dòng (clone) xuất phát từ một cây chính ban đầu Thời gian ra hoa cũng có thể đã được lập trình trong cấu trúc di truyền của loài Vì thế, tất cả các cây đều ra hoa trong cùng một khung thời gian chính xác

Cũng như hầu hết các loài thực vật thuộc họ Hòa Thảo, hoa tre không có cánh

và không có khả năng thu hút côn trùng do thiếu tuyến mật Tuy nhiên, chúng lại được cấu tạo đặc biệt thích hợp cho việc thụ phấn nhờ gió Hiện tượng ra hoa không nhất thiết dẫn đến việc tạo quả/hạt (Complete Bamboo – Bamboo Information Resources)

Chu kì ra hoa cũng thay đổi giữa các loài Có loài ra hoa hàng năm, hay khoảng cách ra hoa ngắn, nhưng rất hiếm, còn hầu hết các loài tre có ý nghĩa cao về mặt kinh

tế thì có hiện tượng ra hoa toàn bộ với khoảng cách ra hoa dài và cố định Cũng có vài loài ra hoa rải rác với khoảng cách ra hoa dài nhưng không cố định

Hình 2.7 Hoa tre (Complete Bamboo, Bamboo Information Resources, 2011).

Ảnh hưởng của việc ra hoa cũng khác nhau Một số loài sẽ chết sau một lần ra hoa/tạo quả đầu tiên và cũng là duy nhất Một số loài sau khi tạo quả sẽ chết một phần

và thay thế các phần đã chết Cũng có những loài không chết nhưng ra hoa và tạo quả đều đặn hoặc không đều đặn

Trong hiện tượng ra hoa toàn bộ, toàn bộ các cụm ra hoa và vì thế là toàn bộ các thân sẽ chết Trong ra hoa rải rác, chỉ các thân ra hoa mới chết, còn bản thân cụm

có thể chết hoặc không, và thậm chí trong thực tế các thân còn sống có thể được trẻ lại

và hồi sinh để tiếp tục phát triển thành những thân khỏe mạnh Trong ra hoa rải rác, khi tất cả các thân trong một cụm ra hoa, trong hầu hết trường hợp, các cụm sẽ chết, nhưng có nhiều loài vẫn tiếp tục sản sinh ra những thân khỏe mạnh mới Nguyên nhân của hiện tượng tre chết sau khi ra hoa là do cây tập trung toàn bộ năng lượng cho việc

ra hoa Có thể thấy rõ nhất là ở giai đoạn này, việc tạo lá bị gián đoạn dẫn đến nguồn năng lượng tạo ra do quang hợp bị suy giảm Do vậy, những cây tre sẽ sống dựa vào chất dinh dưỡng được lưu trữ trong các thân ngầm và thân Tuy vậy, cũng có một số loài tiếp tục tạo lá vào mùa xuân, và ra hoa trong mùa hè Nhưng nhìn chung, việc ra hoa đồng thời xảy ra trong quẩn thể tre thường sẽ làm cây bị suy yếu trong một vài năm rồi mới có thể hồi phục (National Mission on Bamboo Application) Nếu trong giai đoạn này, môi trường đất bị suy giảm dinh dưỡng thì quần thể tre có thể bị sụt giảm một số lượng lớn cá thể

2.2 Vai trò của tre

Hầu hết các loài tre phân bố tự nhiên ở các vùng đồi núi, trong các khu rừng gỗ

tự nhiên và nó thường nằm ở tầng hai trong cấu trúc của rừng Tán lá cung cấp bóng mát, làm giảm động năng của hạt mưa Hệ thống rễ và thân ngầm dày đặc của tre phân

bố tập trung ở tầng đất mặt, nên có tác dụng làm tăng độ xốp, tăng khả năng thấm nước của đất, bám giữ đất tốt Do đó rừng tự nhiên có tre tăng được khả năng chống xói mòn của đất trong mùa mưa và tăng dòng chảy kiệt trong mùa khô, nên điều tiết tốt hơn dòng chảy của các lưu vực sông ngòi ở miền núi, đặc biệt là ở các vùng đầu nguồn của các lưu vực sông quan trọng ở nước ta Hiểu được công dụng giúp tăng độ bền vững của nền đất, nhân dân ta từ lâu đã có kinh nghiệm trồng các bụi tre ven theo các

bờ sông, suối, chân đê, tạo thành các hành lang cây xanh nhằm chống xói lở các bờ sông suối và các chân đê trong mùa nước lũ

Tre là các loài cây cho sợi dài, thân tròn, rỗng, nhẹ, nhưng rất dẻo và dễ uốn cong, chẻ thành nan, mảnh nhỏ dễ dàng, có độ bền cao, ít co trương, nên chúng là nguyên liệu để sản xuất ra rất nhiều các đồ dùng trong sản xuất và đời sống của nhân dân ta Đặc biệt tre là nguyên liệu của các nghề phụ đan lát ở nông thôn, để sử dụng có hiệu quả hàng triệu công lao động nông nhàn ở nông thôn, góp phần tích cực trong chương trình xoá đói giảm nghèo của Chính phủ Bên cạnh đó, tre có ưu điểm đặc biệt

là chúng có tốc độ sinh trưởng rất nhanh, tăng trưởng về chiều cao có thể đạt tới 20 –

30 cm/24 giờ Đặc biệt có ngày đạt tới tốc độ sinh trưởng về chiều cao là 60 – 70 cm/24 giờ (Luồng trồng ở Thanh Hoá) (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2007) Hơn nữa, nhờ việc tạo thân mới từ hệ thống thân ngầm nên việc thu hoạch thân tre sẽ không làm ảnh hưởng đến đất (Soderstrom và Calderon 1979)

Ở miền nhiệt đới và đặc biệt là ở châu Á, sau thóc gạo, người ta coi tre trúc là đối tượng chủ yếu mà đời sống con người phải nương tựa vào (IT Haig và MA Huberman, 1959) Rừng tre ngoài cung cấp cây tre, còn cung cấp măng làm thực phẩm

có giá trị dinh dưỡng cao, sử dụng trong nước và xuất khẩu Ở Châu Á, giá trị kinh tế thương mại của tre ít nhất là 7 tỉ USD một năm (Stevens 1995) Liese (1985) báo cáo rằng trong năm 1979, từ Đài Loan tre và sản phẩm có nguồn gốc từ tre đã được xuất khẩu tới hơn 80 quốc gia, đạt giá trị xuất khẩu là 116 triệu USD Giá trị xuất khẩu của Đài Loan chắc chắn đã tăng lên đáng kể kể từ đó Ở Việt Nam những năm gần đây cũng đã nhập nhiều giống tre, trồng tre để lấy măng, hoặc kết hợp cung cấp cây tre và

măng Tỉnh Quảng Trị trong mấy năm gần đây đã trồng nhiều Tre điềm trúc thu 60 triệu đồng/ha/năm (giá bán 1 kg măng tươi 3.000 đồng) (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2007)

Tre không những có vai trò trong tự nhiên, trong đời sống kinh tế con người mà hiện nay tre còn trở thành một sản phẩm trang trí cho không gian sống Khi đời sống con người ngày càng phát triển thì chất lượng của môi trường sống ngày càng được chú trọng hơn Con người ngày càng có xu hướng hướng về thiên nhiên Ngoài những loài hoa, cây cỏ thông dụng khác, tre đang dần trở thành một lựa chọn thích hợp bởi tính dân dã nhưng nghệ thuật khi xuất hiện với nhiều chủng loại với màu sắc, kích thước, hình dạng khác nhau Hơn nữa, tre lại rất linh hoạt, thích nghi với nhiều điều kiện môi trường cũng như chăm bón cũng khá dễ dàng nên rất thích hợp cho việc trồng trang trí cho không gian xanh trong nhà, vườn

Hiện nay, biến đổi khí hậu là mối quan tâm hàng đầu không chỉ ở Việt Nam mà của toàn bộ thế giới Vì thế, việc ứng phó với sự thay đổi khí hậu cũng trở thành một nhiệm vụ cấp bách Việc bảo tồn và xây dựng các mảng xanh được xem là chủ yếu để ứng phó và thích nghi với biến đổi khí hậu, vì rừng hoạt động như một bể chứa carbon, giúp loại bớt khí thải nhà kính (GHG), vấn đề này được Tổ chức liên chính phủ vì biến đổi khí hậu (IPCC) công nhận Việc làm sạch môi trường dựa trên cơ sở thực vật có khả năng hấp thụ CO2 thông qua quá trình quang hợp Vì vậy, nghiên cứu các thực vật

có khả năng hấp thụ CO2 cao và hiệu quả rất được chú trọng, để góp phần đáng kể làm giảm lượng khí CO2 trong bầu khí quyển, gây hiệu ứng nhà kính Ngoài ra, các nghiên cứu về khả năng giữ đất, chống bão lụt của hệ thống thực vật cũng góp phần đáng kể trong sự ứng phó với biến đổi khí hậu Các nghiên cứu của TS Diệp Thị Mỹ Hạnh và ctv (2008 – 2010) cho thấy vai trò của cây tre trong sự ứng phó với biến đổi khí hậu

Mặc dù tre rất phổ biến nhưng vẫn chưa có một biện pháp quản lý cụ thể nào được xem là cần thiết Trong khi đó nhu cầu về tre ngày càng tăng xuất phát từ sự tăng dân số nông thôn, tăng các khu đô thị và mở rộng hoạt động thương mại quốc tế đang dẫn đến sự thu hẹp của các quần thể tre hiện nay và vì thế việc bảo tồn tre đang là vấn

đề đáng được quan tâm Mặt khác, sự đa công dụng của tre cũng là một động lực cho các tổ chức thực hiện việc bảo tồn nhằm hỗ trợ sự phát triển bền vững

2.3 Đa dạng di truyền và đa dạng sinh học

2.3.1 Khái niệm cơ bản

Đa dạng sinh học đề cập đến những khác biệt trong thế giới sinh vật, về vật liệu

di truyền của chúng và hệ sinh thái trong đó sinh vật tồn tại Sự đa dạng sinh học có thể biểu hiện ở ba mức độ khác nhau:

 Đa dạng di truyền: đề cập đến sự đa dạng trong cấu trúc gene và kiểu gene,

 Đa dạng loài: đề cập đến mức độ phong phú về loài trong một khu vực nhất định,

 Đa dạng hệ sinh thái: đề cập đến các quần xã độc lập của các loài và môi trường bao quanh chúng

Đa dạng di truyền đề cập đến những biến dị trong cấu trúc gene và kiểu gene trong một loài hoặc giữa các loài khác nhau Nó là sự tổng hợp của tất cả các biến dị trong thông tin di truyền chứa trong các gene của từng cá thể thực vật, động vật và vi sinh vật (Stapleton và Rao, 1995) Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị

do tổ hợp trình tự của bốn loại base cơ bản tạo nên mã di truyền Sự biến dị hình thành

ở một cá thể sinh sản hữu tính do đột biến gene, đột biến nhiễm sắc thể có thể được nhân rộng trong quần thể nhờ sự phân ly vào các giao tử và tái tổ hợp trong hợp tử

2.3.2 Ý nghĩa của đa dạng di truyền và nghiên cứu đa dạng di truyền

Tính đa dạng trong loài cho phép một sinh vật có thể thích ứng với những thay đổi của môi trường, khí hậu hoặc các phương pháp trồng trọt, hay sự hiện diện của những yếu tố gây stress sinh học và phi sinh học Như vậy, đa dạng di truyền có ý nghĩa rất lớn về mặt tiến hóa (Stapleton và Rao, 1995) Nói cách khác, khía cạnh biến

dị di truyền trong quần thể giao phối cùng loài là cơ sở của hiện tượng chọn lọc cũng như cải biến thực vật Vì vậy, bảo tồn đa dạng di truyền của thực vật là việc làm rất cần thiết hiện tại cũng như trong tương lai

Đa dạng sinh học nói chung rất quan trọng đối với sự phát triển Cần hiểu được rằng chỉ có sự đa dạng mới đưa đến sự bền vững Chỉ có sự đa dạng mới hỗ trợ các hệ thống xã hội và kinh tế phát triển mạnh từ đó cho phép những người nghèo nhất đáp ứng được nguồn thực phẩm và dinh dưỡng cần thiết cho bản thân họ, và duy trì sự đa dạng trong hệ thống canh tác của các nước trên thế giới (Shiva, 1994)

Vài năm gần đây, con người ngày càng nhận thức được tầm quan trọng của việc

áp dụng một cái nhìn toàn diện về đa dạng di truyền, trong đó bao gồm đa dạng di

truyền trong nông nghiệp và tầm quan trọng của việc kết hợp giữa bảo tồn với sử dụng

và phát triển bền vững (Rao và Hodgkin, 2001) Những nguyên tắc này đã được ghi nhận trong Công ước Đa dạng Sinh học và Kế hoạch Hành động Toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Thế giới Mục đích chính là nhằm hiểu được sự phân bố và mức độ đa dạng di truyền của các loài thực vật, để phục vụ cho công tác bảo tồn và sử dụng đa dạng di truyền một cách hiệu quả Đa dạng di truyền thực vật thay đổi theo thời gian và không gian Mức độ và sự phân phối của đa dạng di truyền trong một loài thực vật phụ thuộc vào hệ thống sinh sản và sự tiến hóa của loài đó, các yếu tố địa lý và sinh thái, hiện tượng “cổ chai” xảy ra trong quá khứ làm số lượng loài

bị thu hẹp, và thường gây ra bởi tác động của con người Sự đa dạng của một loài phần lớn được nghiên cứu trong một quần thể, hoặc giữa một số quần thể khác nhau của cùng một loài

Hiểu rõ hơn về đa dạng di truyền và sự phân bố của nó sẽ giúp ích cho việc bảo tồn và sử dụng có hiệu quả Nó giúp ta xác định cái gì và nơi nào cần được bảo tồn, và cũng giúp hiểu rõ hơn về phân loại học, nguồn gốc và sự tiến hóa của các loài cây trồng ta quan tâm Điều này là rất cần thiết cho việc thu thập và sử dụng bất kỳ loài thực vật nào và họ hàng hoang dã của nó Để bảo tồn nguồn gene tốt hơn, cũng cần phải hiểu sự đa dạng di truyền có trong bộ sưu tập Điều này sẽ giúp hợp lý hóa bộ sưu tập, phát triển và ứng dụng những phương thức tốt hơn để tái sinh nguồn gene Thông tin về đa dạng di truyền của bộ sưu tập gene sẽ giúp khai thác các nguồn lực có sẵn theo nhiều cách có hiệu quả hơn (Rao và Hodgkin, 2001)

2.4 Chỉ thị phân tử

2.4.1 Khái niệm cơ bản

Chỉ thị di truyền thể hiện sự khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể hay các

loài riêng lẻ, và có thể sử dụng để phân biệt các cá thể trong một quần thể Nhìn chung, chỉ thị di truyền không đại diện cho bản thân các gene mục tiêu mà đóng vai trò

là một dấu hiệu để nhận biết sự hiện diện của gene mục tiêu Chúng định vị rất gần với những gene có thể là gene mục tiêu Chúng không ảnh hưởng đến kiểu hình của tính trạng quan tâm bởi chỉ định vị gần hoặc liên kết với những gene kiểm soát tính trạng Tất cả chỉ thị di truyền chiếm một vị trí chuyên biệt trong bộ gene trên nhiễm sắc thể

gọi là “locus” (Collard và ctv, 2005) và được chia thành 3 loại chính:

 Chỉ thị hình thái là những đặc tính hay tính trạng kiểu hình, nhìn thấy được

bằng mắt thường như màu sắc hoa, kích thước hạt, đặc tính sinh trưởng hay sắc tố

 Chỉ thị hóa sinh bao gồm những biến thể khác nhau của enzyme gọi là

isozyme, có thể được phát hiện thông qua phương pháp điện di và nhuộm đặc hiệu

 Chỉ thị phân tử là những trình tự DNA đặc trưng, có tính đa hình, định vị tại

những vị trí xác định trên nhiễm sắc thể

Chỉ thị phân tử có nguồn gốc từ các loại đột biến khác nhau của DNA như đột

biến điểm, đột biến chèn hay mất đoạn, hay lỗi trong quá trình sao chép của các trình

tự lặp lại (Paterson, 1996) Không giống với chỉ thị hình thái và sinh hóa, chỉ thị DNA

không bị giới hạn về số lượng và không chịu tác động bởi các yếu tố môi trường hoặc

các giai đoạn phát triển của thực vật Chỉ thị DNA được sử dụng để xây dựng bản đồ

liên kết gene, đánh giá mức độ đa dạng di truyền trong ngân hàng gene và xác định các

giống cây trồng nhằm ứng dụng trong chọn giống thực vật Dựa vào phương pháp phát

hiện, chỉ thị DNA được chia thành ba nhóm:

 Chỉ thị dựa trên cơ sở của phản ứng PCR như RAPDs, SCARs, SSRs, STS,

AFLPs, ISA, CAPS, ALPs

 Chỉ thị dựa trên cơ sở đánh dấu thăm dò, lai DNA như RFLPs và

oligonucleotide fingerprinting

 Chỉ thị dựa trên giải trình tự DNA như SNPs (Gupta và ctv, 1999)

Bảng 2.1 Một số loại chỉ thị phân tử

RAPDs Random amplified polymorphic DNAs

SCARs Sequence characterized amplified regions

SSRs Simple sequence repeats (microsatellite)

AFLPs Amplified fragment length polymorphisms

ISA Inter-simple sequence repeat amplification

CAPS Cleaved amplified polymorphic sequences

ALP Amplicon length polymorphisms

RFLP Restriction fragment length polymorphism

SNPs Single nucleotide polymorphisms

(Gupta và ctv, 1999).

Các chỉ thị phân tử đã trở thành một phần thiết yếu của hầu hết các nghiên cứu

về mức độ và phân bố của đa dạng di truyền và trong các phân tích về hệ thống gây giống, hiện tượng “cổ chai” và các yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến các các dạng

đa dạng di truyền Thường thì các nghiên cứu có thể sử dụng các chỉ thị phân tử RFLPs, RAPDs, AFLPs hoặc SSRs Tuy nhiên, điều quan trọng là phải hiểu được rằng các chỉ thị khác nhau có các thuộc tính khác nhau và sẽ phản ánh khía cạnh khác nhau của sự đa dạng di truyền (Karp và Edwards, 1995) Hơn nữa, việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố cụ thể như những ưu

và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế Tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể được

so sánh một cách tương đối theo những tiêu chí sau:

Bảng 2.2 So sánh ứng dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền

Các yếu tố chính RFLP AFLP RAPD SSR Allozyme

Số lượng thông tin Thấp Cao Cao Cao Thấp Khả năng đáng tin cậy Cao Cao Biến đổi Cao Cao

Độ phân giải Cao Cao Vừa phải Cao Vừa phải Cách tiến hành Khó Vừa phải Dễ Khó Dễ Thời gian tiến hành Dài Ngắn Ngắn Dài Ngắn

Bộ gene của thực vật có rất nhiều kiểu lặp AT, trong khi ở động vật AC lại là kiểu lặp lại phổ biến nhất (Kalia và ctv, 2010) Đây có thể là một trong những đặc điểm cơ bản phân biệt giữa bộ gene của động vật và thực vật

SSR có những đặc điểm đặc trưng như: số lần lặp lại khoảng 5 – 100 lần tại mỗi locus, phân tán ngẫu nhiên trong toàn bộ gene với số lượng khoảng 104 – 105 và có mức độ đa hình chiều dài khá cao (Kalia và ctv, 2010) Tính đa hình chiều dài của SSR phụ thuộc vào độ dài ngắn và số lần lặp lại của đơn vị lặp lại Thông thường, độ dài

locus SSR càng lớn thì khả năng cho nhiều allele càng cao Sự đột biến tại vùng SSR bắt nguồn từ nhiều nguyên nhân Trong quá trình sao chép DNA, sự trượt của enzyme DNA polymerase III trên mạch khuôn tại vị trí lặp lại có thể khiến mạch đơn mới hình thành bị tách khỏi sợi khuôn, kết quả là làm tăng hoặc giảm kích thước của locus SSR, hiện tượng này gọi là single-stranded DNA slippage Trong quá trình tái tổ hợp, sự trao đổi chéo không cân hoặc đảo đoạn cũng dẫn đến sự thêm, mất vài đơn vị lặp lại và những thay đổi trong cấu trúc của vùng lặp lại Thất bại trong quá trình sửa chữa sai sót hoặc hoạt động của những retrotransposon cũng có thể tạo ra những đột biến tại vùng SSR (Kalia và ctv, 2010) Việc chèn và tích lũy các retrotransposon vào giữa các gene có thể đóng một vai trò quan trọng trong mở rộng bộ gene ở thực vật (Bennetzen, 2000)

SSR được phân loại dựa trên kích thước của chúng, dạng lặp lại và vị trí của chúng trong bộ gene Tùy thuộc vào số lượng nucleotide cấu tạo nên đơn vị lặp lại, SSR được phân thành mono-, di-, tri-, tetra-, penta- hoặc hexanucleotides (Kalia và ctv, 2010) Tùy theo sự sắp xếp các nucleotide trong các đơn vị lặp lại, Weber (1990), Jarne và Lagoda (1996) phân SSR thành các dạng hòan hảo (perfect/pure), không hòan hảo (imperfect/interrupted) và phối hợp (compound) Trong khi đó, Wang và ctv (2009) phân SSR thành các dạng hòan hảo đơn (single perfect), không hòan hảo đơn (simple imperfect), phối hợp hòan hảo (compound perfect) và phối hợp không hòan hảo (compound imperfect) Dạng hòan hảo là sự lặp đi lặp lại nối tiếp nhau của một đơn vị lặp lại, trong khi ở dạng không hòan hảo, sự lặp lại này bị ngắt quãng bởi một hay nhiều nucleotide tại một số vị trí nào đó Dạng phối hợp thì được cấu tạo bởi hai đơn vị lặp lại khác nhau (bảng 2.3)

Hầu hết các chỉ thị SSR nằm trong nhân tế bào, tuy nhiên SSR cũng được có mặt trong gene ty thể và lục lạp Căn cứ vào vị trí của SSR trong hệ gene, Kalia và ctv (2010) đã phân chúng thành các dạng SSR nhân tế bào (nuSSR), SSR ty thể (mtSSR) hoặc SSR lục lạp (cpSSR) Trong những năm gần đây, cpSSRs đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu những biến đổi gene ở thực vật và sự phân bố và trao đổi các dòng gene trong quần thể tự nhiên (Kalia và ctv 2010) do đặc tính di truyền một phía của cpSSRs

Sự sắp xếp các nucleotide trong

các đơn vị lặp lại

Hòan hảo đơn (CA)n Không hòan hảo đơn (AAC)n.ACT.(AAC)n Phối hợp hòan hảo (CA)n.(GA)n

Phối hợp không hòan hảo (CCA)n.TT.(CGA)n

Vị trí trong hệ gene

SSR nhân tế bào (nuSSRs) SSR ti thể (mtSSRs) SSR lục lạp (cpSSRs)

(Weber, 1990; Jarne và Lagoda, 1996; Wang và ctv, 2009; Kalia và ctv, 2010).

Ngày nay, chỉ thị phân tử SSR đã trở thành một công cụ đắc lực của những nghiên cứu ở thực vật do tần số biến dị cao và mật độ bao phủ rộng trên toàn bộ hệ gene Nó được sử dụng để đánh giá biến dị di truyền ở cấp độ phân tử trong một bộ sưu tập giống, làm cơ sở cho việc lựa chọn giống lai thích hợp, lập bản đồ hoặc định vị các gene quan tâm hoặc các QTL (locus quy định tính trạng số lượng) cho các đặc tính nông học và kháng bệnh, lập bản đồ bộ gene, phương pháp chọn lọc dựa trên chỉ thị (MAS) cho những dòng triển vọng và phương pháp lai ngược dựa trên chỉ thị (MAB) trong chương trình chọn giống, xác định giới tính, nghiên cứu cấu trúc quần thể và các mối quan hệ di truyền và tiến hóa (Kalia và ctv, 2010)

SSR được sử dụng rộng rãi bởi nó có nhiều đặc tính nổi trội hơn so với những chỉ thị phân tử khác SSR là những chỉ thị đồng trội Khác với những chỉ thị trội như RAPD, AFLP có biểu hiện đồng nhất hòan toàn giữa một cặp allele, không phân biệt được kiểu gene dị hợp, chỉ thị đồng trội là chỉ thị có biểu hiện khác biệt giữa các cặp allele, giúp phân biệt được kiểu gene dị hợp tử

SSR có tính đa hình chiều dài cao do tần số biến dị cao làm thay đổi số lượng của các đơn vị lặp lại Sự đa hình chiều dài này của SSR có thể dễ dàng được phát hiện trên gel độ phân giải cao bằng cách chạy sản phẩm từ phản ứng PCR sử dụng một cặp mồi duy nhất tương ứng với các vùng sườn của trình tự lặp lại (Weber và May, 1989)

và kết quả này là ổn định và mang tính lặp lại giữa các lần phân tích (Kalia và ctv, 2010) Trong khi đó, RAPD không có độ ổn định, tính lặp lại thấp qua các lần xét nghiệm

SSR cho phép phát hiện các locus đặc trưng và đa allele (Kalia và ctv, 2010)

So với lượng thông tin mà chỉ thị này cung cấp thì kinh phí bỏ ra không đáng kể SSR

di truyền tuân theo định luật di truyền tính trội của Mendel, có số lượng phong phú và phân bố đều khắp bộ gene của nhiều loài, tại những vị trí chuyên biệt trên nhiễm sắc thể (Kalia và ctv, 2010) Chính vì thế, nó là một lựa chọn thích hợp và thường được dùng trong nhiều nghiên cứu về thực vật hiện nay (Marulanda và ctv, 2006)

Xác định SSR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng, nhưng tỉ lệ phần trăm số locus được khuếch đại có thể giảm nếu khoảng cách di truyền càng lớn (Jarne và Lagoda, 1996; Marulanda và ctv, 2006; Barkley và ctv, 2005)

Ngoài ra, do kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng nên SSR có khả năng áp dụng cho việc phân tích kiểu gene có độ chính xác cao với lượng mẫu lớn (high throughput genotyping) Ngược lại, chỉ thị RFLP lại khó áp dụng khi lượng mẫu quá lớn Phân tích AFLP thì phức tạp đối với những bộ gene có kích thước lớn vì các phân đoạn hình thành có thể chứa nhiều hơn một trình tự (Kalia và ctv, 2010)

Mặc dù thế, việc phát triển chỉ thị SSR cho mỗi loài cây trồng vẫn còn đắt tiền

và tốn thời gian và các chỉ thị ở mức độ chi (generic makers) vẫn chưa được xác định (Rao và Hodgkin, 2001)

Việc đòi hỏi phải sử dụng gel có độ phân giải cao để khai thác hàm lượng thông tin một cách chính xác và đầy đủ cũng như phức tạp trong việc tạo dòng và giải trình

tự vùng lân cận của SSR nhằm thiết kế các trình tự mồi thích hợp và chuyên biệt cũng

là những khó khăn chủ yếu trong việc phát triển và sử dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu (Gianfranceschi và ctv, 1998)