PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC

VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ

TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ MỸ LINH Niên khóa : 2007 - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ

TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS NGUYỄN TẤT TOÀN NGUYỄN THỊ MỸ LINH

Tháng 07/2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn

TS Nguyễn Tất Toàn và TS Nguyễn Thị Phước Ninh đã tận tình hướng dẫn cho tôi từ những ngày đầu cho đến khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Bệnh Viện Thú Y, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại đây để tôi có thể hoàn thành khóa luận Các anh chị trong phòng xét nghiệm vi sinh đã hỗ trợ, hướng dẫn, chỉ bảo rất tận tình trong suốt thời gian tôi thực tập làm khóa luận

Các Thầy Cô ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm đã hết lòng truyền đạt những kiến thức quí báu trong thời gian tôi theo học tại trường

Gia đình và những người bạn đã ủng hộ, chia sẻ và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua

TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2011 Nguyễn Thị Mỹ Linh

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Phân lập, thử kháng sinh đồ và xác định độc lực vi khuẩn

Escherichia coli gây bệnh trên gà tại một số địa phương” được tiến hành tại Bệnh Viện Thú Y, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh trong thời gian từ 15/01/2011 – 30/06/2011

Trong số 45 mẫu gà mổ khám chỉ có 24 mẫu có triệu chứng bệnh tích điển hình

tiến hành phân lập xác định có dương tính với E coli hay không Kết quả có 20 mẫu dương tính với E coli đạt tỷ lệ phân lập là 83,3%, trong đó có 10 mẫu từ Đồng Nai, 7

mẫu ở Quận 9, TP HCM, 2 mẫu ở Tiền Giang và một mẫu ở Bình Phước

Sau đó tiến hành thử kháng sinh đồ của 20 gốc E coli cho kết quả là đa số các

mẫu đề kháng cao với kháng sinh như ampicillin (tỷ lệ 57,14% - 100%), amoxicillin (tỷ lệ 50% - 100%), trimethoprim/sulfamethoxazone (tỷ lệ 40% -

100%) và tetracycline (tỷ lệ 80% - 100 %) Trong số 13 loại kháng sinh trên thì E

coli còn khá nhạy với một số kháng sinh như norfloxacine (50% - 100%), tobramycin (90% - 100%) Vi khuẩn kháng trung bình với colistin, cephalexin, cefuroxine, doxycyline, gentamicin, kanamycin, neomycine (tỷ lệ 10% – 42,86%)

Xác định độc lực của 20 gốc dương tính qua tiêm truyền trên phôi trứng 12 ngày tuổi và gà con 1 ngày tuổi Kết quả cho thấy ở Bình Phước và Tiền Giang có tỷ lệ chết phôi trung bình tương ứng 54,55% và 45,45% là mức rất độc Đồng Nai và Quận 9,

TP HCM có tỷ lệ chết phôi trung bình từ 23% - 33,64% ở mức độc trung bình

Tỷ lệ gà con chết sau khi tiêm vi khuẩn dao động trong khoảng 20% – 100%

Triệu chứng chung của gà con sau 2 ngày tiêm huyễn dịch vi khuẩn là thở yếu, ngực phập phồng nhẹ, xù lông, phản ứng nhanh với âm thanh Tỷ lệ số gà chết cao nhất thuộc các lô tiêm vi khuẩn phân lập được ở Đồng Nai Sau khi mổ khám gà con ta thấy

có bệnh tích điển hình của bệnh do E coli như gan viêm, viêm màng bao tim, phổi có

khối viêm, túi khí dày, lách xung huyết…

Xác định 2 gene độc lực iucD và fimC trong 15 gốc E coli có độc lực thì cho kết quả dương tính là 86,7% và 93,3% Hầu hết các gốc E coli đã phân lập đều chứa cả 2

gene độc lực

SUMMARY

The thesis title “Isolation, resistance status study, and determination virulence of

avian pathogenic Escherichia coli in some provinces of Vietnam” was conducted in

the Hospital Veterinary, Nong Lam University from January to June, 2011

There was 24 post mortem chickens express typical symptoms and lesions among 45

ones, they were isolated to detective Escherichia coli The result showed that 20 positive samples with percentage 83,3%, there was 10 E coli strains in Dong Nai province, 7 E coli strains in district 9, Ho Chi Minh city, 2 E coli strains in Tien Giang province and 1 E coli

strains in Binh Phuoc province

After that, we performed antibiotic sensitivity test for 20 E coli strains with 13

antibiotic agents Result showed that a high level of resistance of all the isolates to four antimicrobial agents such as ampicillin (57,14 – 100%), amoxicillin (50 – 100%), trimethoprim/sulfamethoxazone (40 – 100%) and tetracycline (80 – 100%), intermediate resistance of them to 7 such as colistin, cephalexin, cefuroxine, doxycyline, gentamicin, kanamycin, neomycine (10 – 42,86%) and sensitive of them to 2 antimicrobial agents norfloxacine (50 - 100%), tobramycin (90 - 100%)

Virulence determination of the 20 E coli strains will be done by injection in twelve

day old embryonated fowls’ eggs and one day old chick The result showed that rate of death inoculated embryos was high in Binh Phuoc (54,55%) and Tien Giang (45,45%), correlative isolates was virulent, medium in Dong Nai and district 9, Ho Chi Minh city (23

- 33,64%) correlative isolates was moderately

The death of chick fluctuated 20 – 100% The most common from of chicks symptom after 2 day observed is light breathing with slight movement of the chest, ruffled feathers and alert The high percentage of the chick died in after they were injected with isolates in Dong Nai The most important lesion was pericarditis, the air sac membranes become thicker and cloudy in appearance Liver may show a thin covering of fibrinous exudates Spleen was congestion Lung had lesions

Using PCR to detect the presence of 2 virulent gene iucD and fimC The result showed that rate of iucD and fimC were 93,3%, 86,7% repectively Most of the isolates

E coli harboring combination iucD and fimC gene

M ỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

M ỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 3

2.1.1 Định nghĩa 3

2.1.2 Tính chất nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 3

2.1.3 Cấu tạo kháng nguyên 4

2.1.4 Phân loại E coli 4

2.1.5 Shiga toxigenic E coli (STEC) 5

2.1.5.1 Thuật ngữ 5

2.1.5.2 Shiga toxin và những yếu tố độc lực liên quan 5

2.1.6 Enteropathogenic E coli (EPEC) 6

2.1.7 Enterotoxingenic E coli (ETEC) 6

2.1.7.1 Các yếu tố độc lực 6

2.1.8 Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) 8

2.2 Bệnh do E coli gây trên gà 10

2.2.1 Động vật cảm thụ 10

2.2.2 Những phương thức truyền lây 10

2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích 10

2.2.3.1 Thể viêm túi khí 10

2.2.3.2 Thể bại huyết 10

2.2.3.3 Thể viêm ruột 10

2.2.3.4 Thể viêm vòi trứng 11

2.2.3.5 Thể chết phôi 11

2.2.3.6 Các thể khác 11

2.2.4 Chẩn đoán 11

2.2.5 Phòng và trị bệnh 11

2.2.5.1 Phòng bệnh 11

2.2.5.2 Trị bệnh 11

2.3 Kỹ thuật PCR 12

2.3.1 Khái niệm và nguyên tắc 12

2.3.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR 12

2.3.3 Các thành phần của một phản ứng PCR 13

2.3.4 Phân tích kết quả PCR 14

2.4 Một số nghiên cứu liên quan 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm 16

3.1.1 Thời gian 16

3.1.2 Địa điểm 16

3.2 Đối tượng nghiên cứu 16

3.3 Nội dung nghiên cứu 16

3.4 Phương pháp nghiên cứu 16

3.4.1 Phân lập các gốc E coli trên gà bệnh 17

3.4.1.1 Mục đích 17

3.4.1.2 Vật liệu 17

3.4.1.3 Phương pháp tiến hành 18

3.4.2 Khảo sát kháng sinh đồ 19

3.4.2.1 Mục đích 19

3.4.2.2 Vật liệu 19

3.4.2.3 Thực hiện 20

3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi 20

3.4.3 Xác định độc lực qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà con 20

3.4.3.1 Mục đích 20

3.4.3.2 Vật liệu 20

3.4.3.3 Tiêm trên phôi trứng 12 ngày tuổi 21

3.4.3.4 Tiêm truyền trên gà 1 ngày tuổi 23

3.4.4 Khảo sát các gen độc lực từ các gốc E coli phân lập bằng phương pháp PCR 25

3.4.4.1 Mục đích 25

3.4.4.2 Vật liệu 25

3.4.4.3 Phương pháp tiến hành 25

3.4.4.4 Chỉ tiêu theo dõi 26

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Phân lập các gốc E coli trên gà bệnh 27

4.2 Khảo sát kháng sinh đồ 28

4.3 Xác định độc lực qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà con 31

4.3.1 Kết quả tiêm trên phôi trứng 31

4.3.1.1 Ghi nhận số phôi chết trong thời gian theo dõi ( 24 - 48 giờ) 31

4.3.1.2 Quan sát bệnh tích đại thể trên những phôi trứng đã chết 32

4.3.1.3 Phân lập lại vi khuẩn E coli từ những trứng đã chết phôi 34

4.3.2 Xác định độc lực qua tiêm truyền trên gà 34

4.3.2.1 Số gà con chết sau khi tiêm truyền huyễn dịch vi khuẩn 34

4.3.2.2 Triệu chứng lâm sàng của gà con trong thời gian theo dõi 35

4.3.2.3 Bệnh tích quan sát được 35

4.3.2.4 Tái phân lập E coli trên EMB 37

4.4 Khảo sát các gene độc lực từ các gốc E coli phân lập bằng PCR 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC C HỮ VIẾT TẮT

DNA : Deoxyribonucleic acid

EaggEC = EAEC : Enteroaggregative E coli

IMViC : Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon Citrate

VT : Verotoxin

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực của E coli gây bệnh trên gia cầm 9

Bảng 3.1 Số lượng mẫu gà đã mổ khám 18

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm tiêm vi khuẩn trên phôi trứng 12 ngày 21

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm tiêm vi khuẩn lên gà con 23

Bảng 3.4 Điểm triệu chứng lâm sàng 24

Bảng 3.5 Cho điểm bệnh tích đặc trưng do E coli của các cơ quan 24

Bảng 3.6 Trình tự primer 26

Bảng 4.1 Kết quả phân lập 27

Bảng 4.2 Kết quả kháng sinh đồ các gốc E coli phân lập được từ tỉnh Đồng Nai 28

Bảng 4.3 Kết quả kháng sinh đồ các gốc E coli phân lập được từ Quận 9, TP HCM 29

Bảng 4.4 Kết quả kháng sinh đồ gốc E coli phân lập được ở tỉnh Tiền Giang 29

Bảng 4.5 Kết quả kháng sinh đồ gốc E coli phân lập được ở tỉnh Bình Phước 30

Bảng 4.6 Kết quả sau khi tiêm vào phôi trứng 32

Bảng 4.7 Kết quả gây bệnh và tỷ lệ chết trên gà thực nghiệm sau 7 ngày theo dõi 34

Bảng 4.8 Điểm triệu chứng trung bình trên gà con sau khi tiêm truyền vi khuẩn 35

Bảng 4.9 Điểm trung bình bệnh tích trên một số cơ quan 37

Bảng 4.10 Tỷ lệ các gốc có mang gene iucD và fimC 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm 17

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình phân lập E coli 18

Hình 3.3 Quy trình thử nghiệm độc lực vi khuẩn trên phôi trứng 22

Hình 4.1 Kết quả kháng sinh đồ 28

Hình 4.2 Đặc điểm phôi trứng sau khi tiêm 33

Hình 4.3 Nội quan 33

Hình 4.4 Phổi xuất huyết 33

Hình 4.5 Màng bao tim dày đục, chứa dịch bên trong 36

Hình 4.6 Phổi có khối viêm 36

Hình 4.7 Gan nhạt màu có lớp tơ huyết phủ, tim tích dịch 36

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của fimC và iucD 38

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh E coli trên gia cầm là do một nhóm vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn E coli

gây bệnh ngoài đường ruột, chúng có khả năng gây bệnh trên tất cả các cơ quan như viêm túi khí, viêm màng bao quanh gan, tim, viêm phổi, viêm ống dẫn trứng, u não, gây nhiễm trùng máu… Các tổn thương nghiêm trọng trong các cơ quan thường dẫn đến cái chết cấp tính, bệnh lây lan nhanh trong đàn gây thiệt hại lớn về kinh tế (Barnes và Gross, 1999) Triệu chứng và bệnh tích bên ngoài cũng dễ bị nhầm lẫn với một số bệnh

trên gia cầm khác Vì thế cần phải xác định chính xác bệnh do nhiễm E coli gây ra để phòng và điều trị kịp thời Việc kiểm tra tính nhạy cảm của E coli với một số kháng

sinh là rất cần thiết từ đó nâng cao hiệu quả trong công tác phòng và điều trị bệnh do

E coli gây ra

Khả năng gây bệnh của E coli còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố bên trong và bên

ngoài tác động như: điều kiện môi trường (chuồng nuôi không đủ tiêu chuẩn, thức ăn

và nước uống bị ô nhiễm, tình trạng nuôi nhốt quá đông) và gia cầm bị trong giai đoạn nhạy cảm (suy giảm miễn dịch, stress, chấn thương … ) (Dho - Moulin và Fairbother, 1999) Trong chính vi khuẩn E coli cũng chứa các yếu tố độc lực và những yếu tố

không độc Một số yếu tố liên quan đến yếu tố độc lực của E coli nhưng không có

gene độc lực cụ thể nào chịu trách nhiệm hoàn toàn trong việc gây bệnh trên gia cầm (Antão và ctv, 2008) Việc sử dụng phôi gà và gà con làm mô hình thử nghiệm để gây

nhiễm với E coli phân lập từ thực địa kết hợp với kĩ thuật sinh học phân tử như PCR

để xác định gene độc lực giúp chúng ta hiểu rõ hơn cơ chế gây bệnh, các yếu tố độc

lực liên quan đến E coli trên gia cầm

Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Tất Toàn tôi đã thực hiện

đề tài: “Phân lập, thử kháng sinh đồ và xác định độc lực vi khuẩn Escherichia coli gây

bệnh trên gà tại một số địa phương”

1.2 Yêu cầu của đề tài

Phân lập E coli trên gà bệnh và thử kháng sinh đồ, xác định một số gene độc lực của mẫu E coli đã phân lập được tại một số địa phương

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập các gốc E coli trên gà bệnh

Khảo sát kháng sinh đồ

Xác định độc lực qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà con

Tiến hành PCR kiểm tra một số gene gây độc từ các gốc E coli đã phân lập

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli)

2.1.1 Định nghĩa

Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa người

Đức Theodor Escherich (1857 - 1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi

khuẩn này vào năm 1885.Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống

Escherichia (Theo hệ thống phân loại của Bergey)

E coli là trực khuẩn hình que thẳng, kích thước dài ngắn khác nhau, trung bình

từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm, đôi khi trong môi trường nuôi cấy trực khuẩn dài 6 – 8 µm Trực khuẩn có thể có vỏ, có lông di động (có thể một số chủng không đi động), không sinh nha bào, bắt màu Gram âm (Đoàn Thị Nguyện, 2001)

2.1.2 Tính chất nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

Vi khuẩn kỵ khí hiếu khí tùy nghi, phát triển được ở nhiệt độ 15 - 40oC, tốt nhất

là 37oC, pH 7 - 7,2 Trong môi trường lỏng sau 4 - 8 giờ E coli đã làm đục nhẹ môi

trường nuôi cấy, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trường Để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống

E coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí E coli thường được phân lập

bằng môi trường Mac Conkey (MCK) hoặc eosin methylene blue agar (EMB) Trên

môi trường thạch EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch MCK, E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng

E coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng

2 - 3 mm Lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như lactose, glucose, manitol, ramnose… Người ta căn cứ vào khả năng lên men đường lactose để phân biệt

E coli với một số vi khuẩn đường ruột khác Môi trường Kligler iron agar (KIA): lên men đường glucose và lactose (vàng/vàng), sinh gas, không sinh H2S Nghiệm pháp IMViC (+ + - -): indol (+), methyl đỏ (+), Voges Proskauer (-),simmon citrate (-)

E coli có sức đề kháng yếu, các chất sát khuẩn thông thường như nước Javel 1/200, phenol 1/200 giết chết vi khuẩn sau 2 - 4 phút Nhiệt độ 55oC giết vi khuẩn sau

1 giờ và 60o

C sau 30 phút (Đoàn Thị Nguyện, 2001)

2.1.3 Cấu tạo kháng nguyên

Kháng nguyên thân O (somatic): có bản chất là lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn, khi đun nóng ở 100oC trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên Có trên 160 loại phân bố trong vách tế bào Kháng nguyên H

(flagellar): bản chất là protein, chịu nhiệt thấp, phần lớn E coli có chung type kháng

nguyên này Kháng nguyên bề mặt K (capsular): bản chất là polysaccharide, chịu nhiệt kém Kháng nguyên K gồm 4 nhóm: A, B, L, M các kháng nguyên này có khả năng ngưng kết với huyết thanh của kháng nguyên O Kháng nguyên F (pili): là kháng nguyên tiêm mao, bản chất là protein kết dính vào tế bào thành ruột, có hình dạng sợi giúp kết dính vi khuẩn vào nhung mao ruột (Đoàn Thị Nguyện, 2001)

2.1.4 Phân loại E coli

Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh),

E coli được chia thành 5 nhóm sau:

• STEC (Shiga toxin – producing E coli) hoặc VTEC (Vero toxigenic E coli)

và EHEC (Enterohaemorrhagic E coli) : mang nhiều gen độc lực như gene eae chịu

trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội

chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu

(HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gene stx2e sản sinh độc tố vero gây

bệnh phù thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa

• EPEC (Enteropathogenic E coli) : mang gene eae sản sinh protein intimin, …

• EAEC (Enteroaggregative E coli)

• ETEC (Enterotoxigenic E coli) : mang gene lt sản sinh độc tố ruột kém chịu

nhiệt (heat labile toxin = LT) và gene st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable

toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi

• Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:

− EIEC (Enteroinvasive E coli)

− DAEC (Diffusely adherent E coli)

(Nataro và Kaper, 1998)

Ngoài ra còn có nhóm ExPEC (extra intestinal pathogenic E coli) gây bệnh

ngoài đường ruột trong đó có nhóm APEC (Avian pathogenic E coli) gây bệnh trên

gia cầm

2.1.5 Shiga toxigenic E coli (STEC)

2.1.5.1 Thuật ngữ

Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những thuật ngữ khác nhau

để gọi tên cho nhóm E.coli này Tên gọi Verotoxigenic E coli (VTEC) được

Konowalchuck và ctv (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây

độc cho dòng tế bào Vero Tên gọi Enterohaemorrhagie E coli (EHEC) là do dòng này

gây viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS) (Nataro và Kaper,

1989) Và thuật ngữ Shiga toxin – producing E coli (STEC) trước đây gọi là Shiga – like toxin – produccing E coli – SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1996)

2.1.5.2 Shiga toxin và những yếu tố độc lực liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC

STEC sản xuất độc tố Shiga – like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx) hoặc Verotoxin (VT) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2 Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood và ctv, 1996), Stx2g (Leung và ctv, 2003) Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2

Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B 7,7 kDa và một tiểu đơn vị A 32 kDa Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28 kDa và A2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfit Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (Globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4) Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một N – glycoside cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S

của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein Do không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động sẽ chết

Yếu tố bám dính của STEC / EHEC đã chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong sự định vị của vi khuẩn ở ruột Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Protein intimin được mã hóa bởi gene eae (E coli attaching và

effacing) Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and - effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993)

Yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (EHEC - Hly) và có thể là độc tố chịu nhiệt heat - stable enterotoxin (EAST1) Gene mã hóa EHEC - Hly nằm trên plasmid 60 - MDa mà plasmid này được tìm thấy ở tất cả các dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải O157 (Nataro và Kaper, 1998)

2.1.6 Enteropathogenic E coli (EPEC)

Thuật ngữ enteropathogenic E coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để chỉ những dòng E coli gây tiêu chảy ở trẻ em

Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998) Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự

hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu

mô Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và

V cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao) Gene cần

thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gene eae mã hóa intimin Protein này là yếu tố độc

lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993) Theo Nataro và Kaper (1998), gene

eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia

alvei, nh ưng không hiện diện ở những dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột

−Độc tố ruột enterotoxin

Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và độc

tố ruột kém chịu nhiệt (LT)

• Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT)

Độc tố LT của E coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức

năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra

LT - I: Được tiết bởi những dòng E coli gây bệnh trên người và thú LT - I là

một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu

đơn vị B 11,5 kDa Gene mã hóa cho LT là elt hay lt - I nằm trên plasmid mà plasmid

này có thể chứa cả gene mã hóa ST và hoặc gene mã hóa những kháng nguyên của yếu

tố định vị (colonization factor antigen – CFA) (Nataro và Kaper, 1998)

LT – II: LT - II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn

vị A, nhưng không giống với LT - I và CT ở tiểu đơn vị B LT - II cũng làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT - I, nhưng LT - II không liên quan đến bệnh trên người và thú

• Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)

Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này ST được chia thành hai nhóm là STa

và STb Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động Gene mã hóa cho cả hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gene mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài

việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1 Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC

− Yếu tố định vị (colonization factor – CF)

Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu

kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens)

Hầu hết CFA, chúng được mã hóa bởi gene nằm trên plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996)

2.1.8 Avian pathogenic Escherichia coli (APEC)

Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy phổi và túi khí là vị trí quan trọng từ đó E

coli xâm nhập vào máu trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng và khả năng chống lại thực bào của cơ thể là một cơ chế để phát triển bệnh

Các yếu tố độc lực được xác định như là F1 kháng nguyên lông roi bám vào tế bào biểu mô cơ quan hô hấp như hầu họng, khí quản (Dozois và ctv, 1994; Dho – Moulin và Fairbrother, 1999) Yếu tố haemagglutinin nhạy nhiệt (TSH) giữ vai trò chính trong tấn công túi khí (Dozois và ctv, 2000), và kháng nguyên P1 thì quan trọng trong giai đoạn nhiễm sau để xâm nhập vào bên trong các cơ quan (Dho – Moulin và Fairbrother, 1999), đưa tới khả năng chống lại sự thực bào (Pourbakhsh và ctv, 1997) (Dẫn liệu theo tài liệu của Giovanardi và ctv, 2005)

Một số gene độc lực liên quan tới các yếu tố độc lực của APEC được biết như

iucD ( tổng hợp aerobactin), tsh (haemagglutinin nhạy cảm với nhiệt độ), fimC (Loại 1-Fimbriae), hlyE ( gây dung huyết E) và stx2f và astA (gene sản xuất nội độc tố), fyuA

và irp2 (liên quan đến hấp thu sắt), iss (gene liên quan đến yếu tố chống lại sự tiêu

diệt của vật chủ) (Janßen và ctv, 2003)

Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực của E coli gây bệnh trên gia cầm

Tiêm mao (fimbria)

−Tiêm mao F1 (loại 1)

− Tiêm mao P

− Curli

−Bám dính với các tế bào biểu mô của đường hô hấp

−Bám dính vào cơ quan nội tạng

−Bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực

bào

Hệ thống hấp thu sắt

− Aerobactin

− Yersinabactin

− Loại bỏ chất sắt khỏi tế bào chủ

−Giúp vi khuẩn tăng trưởng và

nhân lên nhanh chóng

Haemolysins (gây dung huyết)

−Tiêu hủy hồng cầu

2.2 Bệnh do E coli gây trên gà

2.2.1 Động vật cảm thụ

Các loại gia cầm đều nhiễm bệnh này, riêng ở gà trong mọi lứa tuổi đều có thể

bị nhiễm

2.2.2 Những phương thức truyền lây

Truyền lây qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh, hoặc truyền lây qua đường hô hấp do gà bị bệnh hô hấp mãn tính làm cho niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập qua vết thương vào cơ thể, truyền lây qua vỏ trứng do bị nhiễm bệnh

từ phân hoặc môi trường ở chuồng trại bị nhiễm trùng và có thể lây qua thức ăn và nước uống bị nhiễm trùng

2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích

2.2.3.1 Thể viêm túi khí

Kế phát các bệnh viêm hô hấp mãn tính trên gà, tụ huyết trùng, viêm phế quản và

khí quản truyền nhiễm Vi khuẩn E coli có thể bị nhiễm vào những mô đã bị tổn

thương của đường hô hấp Vi khuẩn phát triển rất nhanh và định hướng vào các túi khí Túi khí bị dày lên có màu trắng như bã đậu làm cho con vật khó thở Vi khuẩn có thể lây lan ra các cơ quan phủ tạng như tim, gan và các túi khí vùng bụng làm tăng sinh các màng túi khí Chất dịch viêm fibrin tiết ra gây viêm dính màng bao tim, màng bao gan và màng phúc mạc Kết quả làm cho tuần hoàn máu bị đình trệ, nhu động ruột giảm, tỷ lệ chết 8 - 10%

2.2.3.2 Thể bại huyết

Do vi khuẩn xâm nhập vào máu quá nhiều trong điều kiện sức khỏe gà kém như khi vận chuyển, tiêm phòng, thức ăn thay đổi, giai đoạn đẻ cao và kế phát của các bệnh về hô hấp Triệu chứng mệt mỏi không thích đi lại Chết đột ngột không rõ bệnh tích Tỷ lệ chết nhanh này chiếm 1 - 2% Bệnh tích chỉ có ở những con bị bệnh kéo dài

từ 3 – 4 ngày trở đi: màng tim, gan và xoang phúc mạc bị viêm dính vào tim, gan và

ruột màu sắc trắng đục

2.2.3.3 Thể viêm ruột

Bệnh thường nhiễm truyền kế phát sau các bệnh cầu trùng, viêm ruột hoại tử, kí sinh trùng hoặc trong những trường hợp bị suy dinh dưỡng và thiếu vitamin A làm cho niêm mạc ruột bị tổn thương Khi nhiễm bệnh gà thường tiêu chảy nặng, phân thường

có dịch nhày màu nâu, xanh, trắng Bệnh tích ở đường tiêu hóa có chứa máu và dịch nhày Thành ruột sưng to, dày và phù nề

Gây chết phôi, nhiễm trùng E coli là hiện tượng gây chết phôi Vi khuẩn có thể

xâm nhập qua vỏ trứng vào phôi

giống E coli như hô hấp mãn tính

Phòng bệnh bằng phương pháp vệ sinh: Vệ sinh chuồng trại định kỳ để giảm lượng vi khuẩn trong môi trường Chuồng trại phải được thông khí để các khí độc như ammoniac sẽ không tích tụ gây độc cho cơ thể gà

2.2.5.2 Trị bệnh

Dùng một trong các loại thuốc kháng sinh diệt vi khuẩn Gram âm như cosumix,

colicopha, anticoli B, imequil, flumequil, ampicillin, neomycin, spectam, gentamycin

Ngoài ra cần cho uống bổ sung vitamin C, vitamin E và vitamin A để tăng sức đề

2.3 Kỹ thuật PCR

2.3.1 Khái niệm và nguyên tắc

PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Đây là kỹ thuật invitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn (không cần hiện diện của tế bào)

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Các mồi này gồm có mồi “xuôi” (forward primer mồi tác động lên sợi 3’ → 5’ và mồi “ngược” (reverse primer mồi tác động lên sợi 5’ → 3’)

2.3.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)

Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở

94 -95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút

 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 - 60oC tuỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút

 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72oC giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA

• Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m * 2n

Với: n: Số chu k m: Số bản sao của chuỗi mã hóa

− DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại

− Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình thự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR Các primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer Chiều dài các primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 - 24 nucleotide) Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb

− Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được

chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng Taq DNA polymerase

không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+

Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng 5’→ 3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 - 72o

primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả Nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 - 5 mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ = 300 nm) thành vạch màu đỏ da cam

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make - MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder) (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005)

2.4 Một số nghiên cứu liên quan

Abdul - Aziz và Sukhon (1996) đã tiến hành kiểm tra độc lực của chủng E coli

J5 bằng cách tiêm vào tĩnh mạch gà 3 tuần tuổi và xoang niệu mô phôi 12 ngày tuổi

Kết quả cho thấy chủng E coli J5 không gây chết gà và phôi, chứng tỏ chủng này có

giá trị thử nghiệm như một loại vaccine sống để tạo miễn dịch chống lại sự cảm nhiễm

từ các serotype khác

Janßen và ctv (2001) thực hiện đề tài xác định mối tương quan các gene gây

trong bệnh E coli trên gia cầm, phân lập từ cơ quan nội tạng gà chết trong tổng số 150

mẫu phân lập trên tổng số 17 gene độc lực liên quan Kết quả cho thấy các chủng phân

lập liên quan đến 17 gene độc lực như: gây tiêu chảy (stx1/2, eae, hly EHEC, estI, eltI,

astA, cdtb ), nhiễm trùng máu (hlyA, papC, cnf /2, fyuA, irp2) và bệnh E coli trên gia

cầm (iucD, tsh, fimC, hlyE và stx2f) Gene fimC (loại fimbriae I) được phát hiện tỷ lệ

cao nhất 92,7% trong tổng số các chủng phân lập Hầu hết các mẫu chứa gene iucD đều chứa gene tsh Một số lượng đáng kể các chủng (chiếm 57,3%) có sự kết hợp giữa

các gene độc lực iucD, tsh, fimC, fyuA và irp2

Wooley và ctv (2000) có nghiên cứu về xác định độc lực của chủng E coli bằng

cách tiêm vi khuẩn vào xoang niệu mô gà 12 ngày tuổi Tiêm 100 vi khuẩn/1 phôi

trứng và mỗi chủng E coli phân lập tiêm cho 11 trứng, theo dõi trong 4 ngày Kết

quả xác định được chủng độc và không độc theo tỷ lệ chết phôi Tỷ lệ chết phôi < 10%

là không độc, 10 - 29% là độc trung bình, > 29% rất độc

Janßen và ctv (2003) dùng phương pháp multiplex PCR để xác định gene gây

độc của E coli gây bệnh trên gà Phát hiện cùng lúc 6 gene gây bệnh astA, irp2, iss,

papC, iucD và tsh có trong 150 chủng phân lập Trong 150 chủng E coli phân lập thì

có 19 chủng chứa đồng thời cả 6 gene

Các nghiên cứu về vi khuẩn E coli kể trên xác định gene gây độc bằng phương

pháp PCR và multiplex PCR và xác định mức độ độc của vi khuẩn E coli trên động

vật thí nghiệm Trong nghiên cứu này chúng tôi xác định tỷ lệ nhiễm E coli từ thực

địa, tìm hiểu khả năng nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, xác định các mức độ

độc lực và gene độc lực để làm rõ đặc điểm gây bệnh của các vi khuẩn E coli gây

bệnh tại các trại gà ở Việt Nam

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

3.1.1 Thời gian

Từ ngày 15/01/2011 đến ngày 30/06/2011

3.1.2 Địa điểm

Thực hiện tại Phòng Vi sinh - Bệnh Viện Thú Y, trường Đại học Nông Lâm TP

Hồ Chí Minh và Bộ môn Nội Dược – Khoa Chăn Nuôi Thú Y – Đại học Nông Lâm,

TP Hồ Chí Minh

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu cơ quan của gà bệnh được lấy từ các trại chăn nuôi ở Đồng Nai, Bình Phước, Quận 9, TP Hồ Chí Minh và Tiền Giang

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các gốc E coli trên gà bệnh

- Khảo sát kháng sinh đồ

- Xác định độc lực qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà con

- Khảo sát các gene độc lực từ các gốc E coli phân lập bằng phương pháp PCR

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Gà bệnh được mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y, lấy cơ quan (như túi khí, gan, lách, gan, tim, phổi) có biểu hiện bệnh do E coli để phân lập Sau khi phân lập được

các gốc E coli, tiến hành thử kháng sinh đồ, xác định độc lực các gốc qua tiêm truyền

vi khuẩn vào phôi trứng và gà con, chạy PCR kiểm tra xem có gene độc lực trong các gốc đã phân lập (Hình 3.1)

Phân lập E coli

Phôi chết

Hình 3.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm

3.4.1 Phân lập các gốc E coli trên gà bệnh

Chọn ống có kết quả dương tính, vàng/ vàng, sinh hơi Xét nghiệm IMViC; Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-)

Định danh E coli

Giữ gốc trên NA

Thử kháng sinh đồ Mẫu bệnh phẩm (túi khí, gan, phổi, casein…)