Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens

Hiện nay, do tình hình khủng hoảng năng lượng chất đốt trên thế giới và các vấn đề ô nhiễm môi trường toàn cầu nên dầu diesel sinh học nói chung và dầu diesel sinh học từ hạt cây cọc rào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas

L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens

Sinh viên thực hiện : MÃ YẾN THANH Niên khóa : 2007 – 20011

Tháng 07/2011

LỜI CẢM ƠN

Để trưởng thành và đạt được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên con xin được gửi lòng biết ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ và em trai, những người luôn dõi theo con trên mỗi bước đường trong thời gian con học xa nhà, luôn là điểm tựa để con vực dậy sau mỗi lần vấp ngã, luôn là động lực để con sống, học tập và phấn đấu

Xin chân thành cảm ơn cô Võ Thị Thúy Huệ đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý báu và thầy Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khoá luận

Cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM đã tạo điều kiện cho tôi trong bốn năm học tập tại trường Các Thầy Cô đã từng dạy dỗ tôi và quí thầy

cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên ngành

bổ ích Bạn bè và những người thân xung quanh đã cảm thông và chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens” đã được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô, Bộ môn Công

nghệ Sinh học Thực vật - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm

Tp HCM Thời gian thực hiện từ tháng 1 - 7/2011 Các thí nghiệm được tiến hành để xác định thời gian khử trùng mẫu hạt thích hợp, theo dõi khả năng tái sinh chồi và khả

năng thu nạp gen ngoại lai của mẫu J curcas Qua quá trình thực hiện thí nghiệm

chúng tôi nhận thấy:

Chế phẩm NaOCl 5% cho hiệu quả khử trùng mẫu hạt tốt khi xử lý khử trùng 2 lần, lần lượt trong 10 phút ở nồng độ 10% và 20 phút ở nồng độ 20% Đạt tỉ lệ 96,66% mẫu sạch, không bị nhiễm nấm khuẩn

Chồi tái sinh từ callus của mẫu lá mầm, số chồi cao nhất được ghi nhận trên môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/l kết hợp với IBA 0,05 mg/l, tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 70%, trung bình khoảng 4,72 chồi trên một mẫu (ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy) GA3 nồng độ 0,1 mg/l khi bổ sung vào môi trường trên (môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/l kết hợp với IBA 0,05 mg/l) cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất (8,91 chồi/ mẫu) Đối với mẫu phôi, nồng độ BA 0,5 mg/l kết hợp với IBA 0,25 mg/l cho hiệu quả tái sinh chồi từ callus đạt 20%, trung bình khoảng 1,27 chồi trên một mẫu tái sinh (ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy)

Các chồi khỏe mạnh được đem tạo rễ trên môi trường 1/2 MS bổ sung IBA 0,5 mg/l, tỉ lệ hình thành rễ đạt 75% (sau 3 tuần)

Nồng độ kháng sinh kanamycin dùng chọn lọc mẫu phôi và lá mầm chưa chuyển gen là 30 mg/l Nồng độ glufosinate 1,5 mg/l dùng cho chọn lọc lá mầm và 1 mg/l

dùng chọn lọc phôi chưa chuyển gen Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101pIB-GUS do Jabcobsen cung cấp mang plasmid pGII0229 (gồm các gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA) đã được sử dụng

để chuyển vào cây J curcas Bước đầu ghi nhận kết quả biểu hiện của gen gusA được

chuyển vào genome của cây cho thấy:

Hiệu quả chuyển gen đạt 40% ở phôi và 66,67% ở lá mầm khi ủ trong dịch khuẩn thời gian là 30 phút, đồng nuôi cấy trong 4 ngày

SUMMARY

The thesis "Establishment of an efficient in vitro regeneration protocol and assessment for initial results of gene transfer into J curcas via Agrobacterium

tumefaciens" was carried out at Research Institute for Biotechnology and

Environment, Nong Lam university from 1/2011 to 7/2011

The goal of this study was to develop an efficient regeneration protocol to be

used for genetic transformation of Jatropha curcas Results shown that the

surface-sterilised protocol which seeds were surface-surface-sterilised with 70% (v/v) ethanol for 30 sec, followed by 10% and 20% (v/v) commercial bleach (with NaOCl as the active agent) containing 2 - 3 drop Tween 80 for 10 and 20 minutes is the highest percentages

of aseptic cultures (96.66%)

Shoot regeneration from cotyledon and embryo - derived callus is generally influenced by a combination of auxin and cytokinin Zygotic embryo - derived callus regenerated shoot on low concentration of BA (0.5 mg/l) MS Medium supplemented with 0.5 mg/l BA in combination with 0.25 mg/l IBA gave callus regeneration frequency of 20% and produced on avegare 1.27 shoots per plant (after 45 days)

In the case of cotyledon explants, the highest number of shoots was obtained on

MS medium supplemented with 1.5 mg/l BA in combination with 0.05 mg/l IBA The callus regeneration frequency of 70% and produced on avegare 4.72 shoots per explant (after 45 days) Efficient adventitious shoot multilication rate was achieved on MS medium supplemented with 1.5 mg/l BA + 0.05 mg/l IBA + 0.1 mg/l GA3, producing

on average 8.91 shoots per explant

Regenerated shoots were cut off and placed onto root induction media for rooting About 75% of the shoots (after 3 weeks) successfully produced roots on 1/2

MS medium supplemented with 0.5 mg/l

Optimal concentration of kanamycin for selecting transformed cotyledon and embryo were 30 mg/l 1 mg/L of glufosinate for selection of transformed embryo and

1.5 mg/L for selection of transformed cotyledon Agrobacterium tumefaciens strain

EHA101pIB-GUS, harboring a binary transformation vector pGII0229 (containing

Trgus cp148 luc carrying β-glucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV

35S terminator) was used to assess transformation efficiency in J curcas Initial result

of expression of gusA gene was observed:

Embryo explants produced high transformation frequency of 40% when

co-incubated in Agrobacterium suspension for 30 min (cocultured for 4 days) In the case

of cotyledon explant, frequency of transformation obtained 66.67% when co-incubated

in Agrobacterium suspension for 30 min (cocultured for 4 days)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

SUMMARY iv

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây dầu mè 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc 3

2.1.3 Phân bố 3

2.1.4 Đặc điểm hình thái 3

2.1.5 Điều kiện sinh thái 4

2.1.6 Giá trị của cây dầu mè 4

2.2 Sự tái sinh in vitro 5

2.2.1 Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật 5

2.2.2 Ý nghĩa của sự tái sinh trong quy trình chuyển nạp gen 6

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh 6

2.2.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 6

2.2.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 8

2.2.4 Các nghiên cứu về vấn đề tái sinh cây J.curcas trong in vitro 9

2.3 Giới thiệu chung về chuyển gen ở thực vật 10

2.3.1 Khái niệm 10

2.3.2 Các biện pháp chuyển gen vào trong thực vật 10

2.3.2.1 Biện pháp sinh học 10

2.3.2.2 Biện pháp cơ học 11

2.3.2.3 Biện pháp vật lí 13

2.3.3 Thành phần của gen chuyển nạp 13

2.3.3.1 Promoter 13

2.3.3.2 Gen thông báo 13

2.3.3.3 Chỉ thị chọn lọc 14

2.3.4 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến 15

2.3.4.1 Gen bxn 15

2.3.4.2 Gen bar 15

2.3.5 Hiện trạng và xu hướng phát triển cây trồng biến đổi gen trên thế giới 18

2.3.6 Tình hình trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ trên thế giới 19

2.3.7 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen tại Việt Nam 20

2.4 Các nghiên cứu chuyển nạp gen vào Jatropha curca bằng Agrobacterium 21

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.2 Vật liệu thí nghiệm 24

3.2.1 Giống 24

3.2.2 Vi khuẩn 24

3.2.3 Vật liệu 25

3.2.3.1 Vật liệu dùng trong hệ thống tái sinh 25

3.2.3.2 Vật liệu dùng trong quy trình chuyển gen 25

3.2.3.3 Vật liệu dùng trong phản ứng PCR 25

3.2.4 Thiết bị dùng trong thí nghiệm 25

3.2.5 Điều kiện nuôi cấy 26

3.2.6 Phương pháp bố trí và xử lý số liệu 26

3.3 Phương pháp thí nghiệm 26

3.3.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt 26

3.3.2 Nhóm thí nghiệm tái sinh cây Jatropha curcas in vitro 27

3.3.3 Nhóm thí nghiệm tiền chuyển gen 29

3.3.4 Nhóm thí nghiệm chuyển gen 31

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt 34

4.2 Nhóm thí nghiệm tái sinh 34

4.3 Nhóm thí nghiệm tiền chuyển gen 40

4.4 Nhóm thí nghiệm chuyển gen 44

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.1.1 Quy trình khử trùng hạt 46

5.1.2 Môi trường tái sinh cây 46

5.1.3 Nồng độ kanamycin và glusinate dùng chọn lọc 46

5.1.4 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu quả chuyển gen 46

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

NT Nghiệm thức

OD Mật độ quang (Optical density)

PEG Polyethylene glycol TDZ Thidiazuron

X-gluc 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một số auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro 7

Bảng 2.2 Một số cytokinin được phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro 8

Bảng 2.3 Các loại thuốc diệt cỏ và gen kháng phổ biến 19

Bảng 2.4 Các cây trồng chuyển gen phổ biến nhất trên thế giới trong năm 2005 20

Bảng 3.1 Các quy trình thử nghiệm khử trùng hạt 27

Bảng 3.2 Các nghiệm thức của môi trường tái sinh chồi từ phôi J curcas 27

Bảng 3.3 Các nghiệm thức của môi trường tái sinh chồi từ lá mầm của J curcas 28

Bảng 3.4 Các nghiệm thức của môi trường nhân chồi từ callus lá mầm 29

Bảng 3.5 Các môi trường chọn lọc với glufosinate 29

Bảng 3.6 Các môi trường chọn lọc với kanamycin 30

Bảng 3.7 Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR 31

Bảng 3.8 Chương trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR 31

Bảng 3.9 Các nghiệm thức về thời gian ngâm 33

Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu sống và sạch nấm khuẩn ở hai quy trình khử trùng 34

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự tái sinh chồi từ mẫu phôi 35

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự tái sinh chồi từ lá mầm 38

Bảng 4.4 Ảnh hưởng nồng độ GA3 trong đến tốc độ nhân chồi 38

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến khả năng tái sinh của lá mầm và phôi cây Jatropha curcas chưa chuyển gen 41

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ glufosinate đến tỷ lệ sống và khả năng tái sinh của lá mầm cây Jatropha curcas chưa chuyển gen 42

Bảng 4.7 Nồng độ plasmid của dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 44

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu quả chuyển gen 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây dầu mè (Jatropha curcas L.) 3

Hình 2.2 Các bộ phận của cây J curcas 4

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của Bialaphos 16

Hình 2.4 Diện tích cây chuyển gen trên toàn cầu 18

Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 24

Hình 3.2 Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 24

Hình 3.3 Quy trình kiểm tra plasmid và gen bar 30

Hình 3.4 Các bước của quy trình nhuộm GUS 33

Hình 4.1 Callus và chồi tái sinh từ phôi 35

Hình 4.2 Các giai đoạn tái sinh của mẫu lá mầm cây J curcas 37

Hình 4.3 Các môi trường tái sinh chồi 39

Hình 4.4 Rễ hình thành sau 3 tuần chuyển lên môi trường tạo rễ 39

Hình 4.5 Ảnh hưởng của kanamycin lên sự phát triển của lá mầm chưa chuyển gen 41 Hình 4.6 Ảnh hưởng của kanamycin lên sự phát triển của phôi chưa chuyển gen 42

Hình 4.7 Biểu hiện của lá mầm cây Jatropha curcas do ảnh hưởng của glufosinate 42

Hình 4.8 Biểu hiện của phôi cây Jatropha curcas chưa ảnh hưởng của glufosinate 43

Hình 4.9 Ladder và kết quả điện di của phản ứng PCR 43

Hình 4.10 Kết quả nhuộm GUS của phôi 45

Hình 4.11 Kết quả nhuộm GUS của lá mầm 45

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam cây dầu mè (Jatropha curcas L.) còn được gọi là cây cọc rào hay

cây ma phong thụ Cây cọc rào du nhập vào Việt Nam từ rất lâu, được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, trồng làm hàng rào và hạt được sử dụng để thắp sáng (Du, 2006) Sản phẩm quan trọng nhất vẫn là hạt lấy dầu cho sản xuất diesel sinh học Diesel

sinh học từ cây J.curcas có đặc tính là khó cháy nổ, có oxi trong phân tử và không có

sunphua nên được đốt cháy hết, giảm thiểu 40 - 80% khí gây hiệu ứng nhà kính và 100% khí gây ung thư Hơn nữa trồng cây còn giúp cố định trung bình 10 tấn CO2/ha/năm (Lê Võ Định Tường, 2006) Chính vì thế loài cây này đã được chọn là một trong các phương án nhiên liệu thay thế quan trọng nhất cho con người - nhiên liệu diesel sinh học (Saxena, 2007)

Hiện nay, do tình hình khủng hoảng năng lượng chất đốt trên thế giới và các vấn

đề ô nhiễm môi trường toàn cầu nên dầu diesel sinh học nói chung và dầu diesel sinh học từ hạt cây cọc rào nói riêng đã bắt đầu được sử dụng khá phổ biến ở các dạng B5, B10, B20, B30 và thậm chí B100 tại các nước như Đức, Anh, Tây Ban Nha, Mỹ, Ấn

và Adedire, 2006) Vì vậy đòi hỏi cần có các công cụ di truyền, chọn giống hiệu quả.

Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens đã trở thành một phương pháp

được lựa chọn cho các nghiên cứu cơ bản về thực vật, cũng như là kĩ thuật chính để tạo ra cây chuyển gen cho ngành công nghiệp công nghệ sinh học nông nghiệp (Stafford, 2000; Gelvin, 2003) Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kĩ thuật nuôi cấy

mô và tế bào thực vật Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng, các kĩ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen

Đề tài nhằm thiết lập quy trình chuyển gen và tái sinh cây hiệu quả ở J curcas Ứng dụng quy trình đó để chuyển nạp gen kháng thuốc diệt cỏ (bar) vào cây nhằm đánh giá hiệu

quả của quy trình được xây dựng Nghiên cứu này giúp tạo tiền đề cho các nghiên cứu chuyển

nạp gen tiếp sau nhằm mục đích cải thiện năng suất, tăng sản lượng dầu trong hạt và tăng tính

chống chịu của cây Jatropha curcas L

1.2 Yêu cầu

- Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hoàn chỉnh cho cây J curcas

- Bước đầu đánh giá hiệu quả của quy trình lây nhiễm Agrobacterium

tumefaciens vào phôi và lá mầm cây J curcas bằng phương pháp kiểm tra gen chỉ thị

gus A

1.3 Nội dung thực hiện

- Khảo sát các quy trình khử trùng hạt nhằm thiết lập nguồn mẫu nuôi cấy sạch ban đầu

- Thiết lập quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ mẫu phôi và lá mầm cây của J curcas

- Đánh giá ảnh hưởng của kanamycin và glufosinate lên sự phát triển của phôi và

lá mầm chưa chuyển gen Xác định nồng độ kanamycin và glufosinate tối thiểu gây chết 100% mẫu phôi và lá mầm chưa chuyển gen, nhằm sử dụng cho việc chọn lọc thể chuyển gen về sau

- Kiểm tra chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101pIB-GUS có mang gen bar trên plasmid pGII0229 bằng phương pháp PCR

- Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn vào mẫu phôi và lá mầm cây J curcas Bước đầu

đánh giá khả năng thu nạp gen của 2 loại mẫu trên ở các thời gian ủ khác nhau với vi

khuẩn dựa vào sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.) 

Tên tiếng Việt : Dầu mè, cọc rào, Dầu lai

2.1.2 Nguồn gốc

Cây dầu mè được cho là có nguồn gốc từ Trung Mỹ, sau đó du nhập vào khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới như: Châu Phi, Châu Á, Bắc Mỹ và hiện nay đã trở thành loài cây phổ biến trên toàn thế giới Ở Việt Nam, cây dầu mè có mặt từ rất sớm, mọc nhiều ở vùng núi chủ yếu được người dân trồng để làm hàng rào nên được gọi là cây cọc rào

2.1.3 Phân bố

Theo vùng khí hậu, J curcas thấy ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nóng, nó

còn có thể sống tốt ở vùng nhiệt độ thấp và có thể chịu lạnh nhẹ Nhu cầu về nước của

nó rất thấp và có thể chịu hạn trong thời gian dài bằng cách rụng lá để giảm lượng thoát hơi nước (Lele và Satish, 2006; Nguyễn Công Tạn, 2008)

2.1.4 Đặc điểm hình thái

Cây nhỏ, cao trung bình 1- 3 m, những cây để tự phát triển có thể cao 5 m Cành mập, mọng nước, khó cháy, có các vấu nổi lên do sẹo của lá rụng để lại Khi bị thương

sẽ chảy ra mủ trắng Lá đơn, mọc so le, sẻ chân vịt, chia làm 3 - 5 thùy nông, dài 10 -

13 cm, rộng 8 – 11 cm Hoa màu vàng, nhỏ, cùng gốc, mọc thành chùy tận cùng ngọn cành hoặc nách lá Hoa đực mọc ở đầu các nhánh với cuốn ngắn và có khuỷu Hoa cái mọc ở giữa nhánh với cuống không có khuỷu Quả non mọng, có cuốn dài, lúc đầu xanh lá cây sau chuyển sang vàng khi chín Khi khô thành quả nang, hình trứng, nâu,

Hình 2.1 Cây dầu mè

(Nguồn:http//www.jatropha.de/ news/jcl-news.htm)

đen nhạt hay đỏ nhạt, mở theo 3 mép Quả có 3 hạt, hạt có áo hạt hình trứng dài tùy theo giống nhưng thường dài 2 cm, rộng 1 cm, nhẵn, màu đen nhạt, có khi đốm nhạt (Lê Võ Định Tường, 2006)

Hình 2.2 Các bộ phận của cây J curcas

2.1.5 Điều kiện sinh thái

Thường thấy ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.Thời tiết nóng và ẩm ướt thích hợp cho sự nảy mầm và phát triển của cây Cây thích nghi tốt với các vùng khô hạn, có thể mọc trên đất đá, sỏi, có hàm lượng dinh dưỡng thấp Nó thích ánh sáng trực tiếp Dầu mè là loài có khả năng thích nghi rộng, tiềm năng sinh trưởng của chúng thể hiện

ưu thế nhất trên đất khô và nghèo kiệt

2.1.6 Giá trị của cây dầu mè

Cho năng suất từ 10 - 12 tấn/ha (phụ thuộc vào canh tác), hàm lượng dầu trong hạt trung bình 32 - 35% Đây là nguồn nguyên liệu dầu Diesel sinh học rất tiềm năng

để dần thay thế các tài nguyên nhiên liệu hoá thạch đang càng ngày càng bị cạn kiệt Cây dầu mè có chu kỳ sống dài (30 - 50 năm), khả năng cộng sinh với nấm rễ

Mycorrhiza cao, nên thích nghi sinh trưởng tốt trên những lập địa suy thoái, khô cằn

cỗi, thậm chí ô nhiễm và hoang hóa, do vậy cây có tác dụng cải tạo đất, cải tạo môi

A, B, C, D lần lượt là lá, hoa, quả và hạt của của J curas (

http://biocombustibles.blogspot.com/2009/08/mexico-biocombustibles-chiapas-la_3857.html ;http://www.export forum.com/africa/jatropha_seeds.htm;

http://database.prota.org/PROTAhtml/Jatropha%2520curcas_Fr.htm ;).

trường rất tốt Năng suất sinh học và hàm lượng chất dinh dưỡng cao, có thể sử dụng

bã ép dầu nguyên liệu làm phân bón hữu cơ, thành phần hoạt chất của phế liệu có khả năng sử dụng làm chế phẩm phòng trừ sâu bệnh Đây là loài cây có ý nghĩa to lớn trong cải thiện đời sống cộng đồng các vùng nông thôn xa xôi, khó khăn, đất đai nghèo kiệt, hoang hóa

Ngoài ra, trong thành phần của cây có những hợp chất chủ yếu như tecpen, flavon, coumarin, lipit, sterol và alkaloit Nhiều bộ phận của cây này có thể chữa bệnh như lá, vỏ cây, hạt và rễ Rễ trị tiêu viêm, cầm máu, trị ngứa; dầu của hạt có thể nhuận tràng; dịch nhựa trắng tiết ra từ vết thương của cành có thể trị viêm lợi, làm lành vết thương, chữa trị bệnh trĩ và mụn cơm; nước sắc từ lá dùng để chữa trị bệnh phong thấp, đau răng v.v Trong cây dầu mè có nhiều thành phần độc tố, nhất là phytotoxin (curcin) trong hạt, nếu được nghiên cứu sâu hơn rất có thể tạo ra hợp chất mới về nguồn dược, từ đó độc tố thực vật có thể trở thành một loại tài nguyên về nguồn dược liệu mới

2.2 Sự tái sinh in vitro

2.2.1 Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật

Đặc tính vốn có của cây là khả năng khôi phục lại tính nguyên vẹn đó bằng sự tái sinh Khác với động vật, thực vật có khả năng tái sinh mạnh mẽ hơn nhiều, từ một bộ phận tách rời khỏi cây mẹ trong điều kiện nhất định nó có thể tái sinh để tạo thành một cây mới hoàn chỉnh Sự tái sinh ở thực vật có thể chia thành 2 dạng là tái sinh sinh lý

và tái sinh bệnh

Tái sinh sinh lý được hiểu như là sự thay thế những bộ phận đã mất đi và điều này cần thiết cho đời sống của chúng, chẳng hạn như cây rụng lá vào mùa thu, mùa đông, sang mùa xuân chúng lại tái sinh ra lá mới để đảm nhận chức năng quang hợp tốt hơn

Tái sinh bệnh là quá trình tái sinh do vết thương gây ra Khi cây bị tổn thương sẽ xuất hiện sự tái sinh để làm lành vết thương hoặc phục hồi các phần đã mất đi hay tái sinh cho ra cơ quan mới để khôi phục tính nguyên vẹn của cây

Khả năng tái sinh của thực vật rất khác nhau phụ thuộc vào đặc tính của loài, giống, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển, mùa vụ và điều kiện sinh thái Từ lâu con người đã biết sử dụng đặc tính tái sinh này trong việc nhân giống vô tính các loại cây

trồng thông qua biện pháp giâm cành, chiết cành, ghép mắt và nuôi cấy mô tế bào thực

vật in vitro

2.2.2 Ý nghĩa của sự tái sinh trong quy trình chuyển nạp gen

Để tạo cây chuyển gen, trước hết phải tạo ra được cây tái sinh từ một bộ phận,

mô hoặc một tế bào duy nhất, phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro Đây là

bước rất quan trọng trong quy trình tạo ra cây trồng chuyển gen Nhờ con đường tái sinh này khi ta đưa một đoạn T-DNA mang gen có ích vào tế bào thực vật, ta có thể thu nhận cây tái sinh mang gen này Trong quá trình xây dựng hệ thống tái sinh cần xác định các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, nồng độ các chất này, vật liệu tái sinh, thời điểm tái sinh Khi đã xác định được bộ phận nuôi cấy tốt nhất, môi trường nuôi cấy thích hợp nhất thì hầu hết các thực vật đều có khả năng tái sinh

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh

2.2.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Thành công của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc rất nhiều vào sự lựa chọn môi trường dinh dưỡng, bao gồm cả chủng loại và nồng độ hóa chất sử dụng (Vũ Văn Vụ, 1999); nhu cầu dinh dưỡng cho việc sinh trưởng tối ưu của các loài thực vật

là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng có ít nhiều

sự khác nhau

Các hợp chất cung cấp nitơ (N)

Các hợp chất vô cơ chứa N được bổ sung vào môi trường in vitro dưới 2 dạng

nitrate (NO3-) và amon (NH4+) Lượng NO3- trong hầu hết các môi trường là nhiều hơn

NH4+ Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm nguồn N hữu cơ là các amino axit như glutamin hay L-asparagin (Narayanaswamy, 1994) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999)

L-Nguồn carbon

Đường được sử dụng làm nguồn carbon (C) cung cấp năng lượng cho các mô nuôi cấy (Hu và ctv, 1979) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Ngoài ra, đường còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Trong số nguồn carbon thì saccharose là loại đường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô Các loại đường khác cũng thường được sử dụng glucose, mannitol và mantose

Các vitamin

Hầu hết các mô nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cần thiết cho quá trình sinh trưởng phát triển nhưng thường không đầy đủ về số lượng

(Czosnowski, 1952; Paris, 1958) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Vitamin có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào Vì vậy, để các mô cấy đạt được

sự sinh trưởng tối ưu, người ta thường bổ sung vào môi trường một số vitamin như thiamin (B1), axit nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol Mỗi loài thực vật

sẽ cần số lượng và nồng độ các vitamin khác nhau

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Đây là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy in vitro

Nhóm auxin: bao gồm một số hợp chất có chứa nhân indol Auxin có nguồn gốc

từ tiếng Hi Lạp là auxein có nghĩa là sinh trưởng Auxin thúc đẩy quá trình phân chia

và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ và chồi (Bhojwani và Razdan, 1983) (trích dẫn bởi Vũ Văn

Vụ, 1999) Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp với nồng độ sử dụng từ 0,1 - 2 mg/l tùy theo mục đích và vật liệu nuôi cấy Nồng độ auxin thấp sẽ kích thích

sự phân hóa rễ và ngược lại nồng độ cao sẽ kích thích quá trình tạo mô sẹo Thông thường, người ta thường bổ sung các chất IBA, NAA vào trong môi trường để tạo rễ

và sử dụng chất 2,4-D để tạo mô sẹo

Bảng 2.1 Một số auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro

2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic axit

IBA Indole-3-butyric axit

MCPA 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic axit

(Bayrac, 2004)

Cytokinin: là nhóm phytohoocmon dẫn xuất của adenin Cytokinin được hình thành chủ

yếu trong hệ thống rễ và một số cơ quan đang sinh trưởng mạnh như chồi, lá non, quả non (Vũ Văn Vụ và ctv, 1998) Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin là kích thích sự phân

chia tế bào mạnh mẽ, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo

Bảng 2.2 Một số cytokinin được phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro

BAP 6-benzylaminopurine

Kinetin 6-furfurylaminopurine

Thidiazuron 1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea

Zeatin 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl amino purine

BA benzyladenine (Bayrac, 2004)

Theo Vũ Văn Vụ (1999), sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động

qua lại giữa 2 nhóm chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin Tỷ lệ

auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích sự tạo chồi Đây

là nguyên tắc chung, còn nồng độ cụ thể sẽ phụ thuộc vào từng loài thực vật

2.2.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Yêu cầu về khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của từng loại

cây in vitro cũng khác nhau Thông thường, người ta nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ

phòng từ 25 - 280C Theo các tác giả Shigenobu và Sakamoto (1981) (trích dẫn bởi Vũ

Văn Vụ, 1999) thì nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đổi

trong suốt thời gian nuôi cấy

Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng (bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ) có ảnh hưởng

mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Read, 1990; Dooley, 1991)

(trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Cường độ ánh sáng từ 2.500 – 3.500 lux thường

được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô Cường độ ánh sáng lớn hơn thì sự sinh

trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ (Murashige, 1977) (trích

dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999)

Thành phần quang phổ cũng có ảnh hưởng đáng kể đến mô nuôi cấy Ví dụ nuôi

cấy cây quỳ thiên trúc Pelar gonium ở ánh sáng đỏ sẽ làm tăng chiều cao chồi trong

khi ánh sáng xanh lại có biểu hiện ức chế (Appelgen, 1991) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ,

1999) Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và

chất liệu của bình nuôi cấy

2.2.4 Các nghiên cứu về vấn đề tái sinh cây J.curcas trong in vitro

Các nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự nuôi cấy, phát sinh phôi sinh dưỡng, chuyển gen và tái sinh cây đã được thực hiện khá nhiều bởi các

tác giả như Kim và ctv (2003, 2004, 2005); Rao và ctv (2006), Nakamura và Ishikawa(

2006)

Nghiên cứu về ảnh hưởng của loại mẫu và yếu tố tăng trưởng của thực vật lên sự

hình thành chồi từ J curcas cũng được tiến hành Mayuree Kaewpooa và Sompong Te-chato (2009) đã khảo sát khả năng tạo chồi từ các loại mẩu khác nhau của cây J curcas như thân, mầm nách (axillary bud), đỉnh sinh trưởng (shoot tip) Tất cả được

nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA (0,5 mg/l) and IBA (0,25 mg/l) tạo ra số chồi cao nhất lần lượt là 5,1; 5,3; và 5,25 trên một mẫu nuôi cấy sau 30 ngày nuôi cấy Chồi tái sinh được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 30 - 40 ngày

nuôi cấy Hệ thống tái sinh từ đĩa lá (leaf dish) của cây J.curcas đã được trình bày bởi

Deore và Johnson, 2008 Mầm chồi bất định được tạo ra từ lá non của cây con nảy

mầm in vitro và cây trưởng thành ngoài đồng khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ

sung TDZ 2,27 µM, 6-benzylaminopurine (BA) 2,22 µM và indole-3-butyric axit (IBA) 0,49 µM Sự hiện diện của TDZ trong môi trường có ảnh hưởng tốt lên việc tạo mầm chồi bất định Ngược lại nếu có BA mà không có TDZ thì kích thích tạo callus hơn là tạo mầm chồi Mầm chồi được nhân lên và kéo dài thành chồi khi chuyển lên môi trường MS bổ sung BA 4,44 µM, kinetin 2,33 µM, indole-3-acetic axit (IAA) 1,43

µM và gibberellic axit (GA3) 0,72 µM Chồi phát triển tốt được chuyển môi trường tạo rễ gồm MS bổ sung IBA 0,5 µM sau 30 ngày Kumar và Reddy (2010) nghiên cứu tái sinh cây thông qua việc tạo trực tiếp chồi mầm (shoot buds) từ mẫu cuốn lá của

Jatropha curcas L (không qua callus) Hiệu suất tạo mầm chồi cao nhất là 58,35%, số

mầm chồi trên 1 mẫu là 10,1 thu được khi đặt mẫu cuốn lá lên môi trường MS bổ sung 2,27 µM TDZ sau 6 tuần Mầm chồi được tạo thành chuyển lên môi trường MS chứa

10 µM kinetin (Kn), 4,5 µM 6-benzyl aminopurine (BAP) và 5,5 µM

α-naphthaleneacetic axit (NAA) để nhân chồi Môi trường MS bổ sung 2,25 µM BAP và 8,5 µM IAA thích hợp nhất để kéo dài chồi, khoảng 3,01 - 3,91cm trong 6 tuần nuôi

cấy Tác giả cho rằng hướng (ngang hoặc thẳng đứng) và nguồn (in vitro hay in vivo)

của mẫu cũng ảnh hưởng đến sự tái sinh cây Môi trường 1/2 MS bổ sung 15 µM IBA; 5,7 µM IAA; 5,5 µM NAA and 0,25 mg/ L than hoạt tính thích hợp cho việc tạo rễ

Kumar và ctv (2010) thực hiện tái sinh chồi từ lá mầm của Jatropha curcas Đây là

phương pháp nhân giống đơn giản, đạt hiệu quả cao nhờ sự tái sinh thành cây thông

qua việc phát sinh cơ quan từ mẫu lá mầm của cây Jatropha curcas Sử dụng môi

trường MS chứa TDZ thì có ảnh hưởng tốt hơn lên sự tái sinh so với BAP Mầm chồi được tạo ra chuyển lên môi trường MS chứa 10 µM kinetin (KN); 4,5 µM BAP và 5,5

µM a-naphthaleneacetic axit (NAA) cho sự nhân chồi Chồi được nhân có thể kéo dài trên môi trường MS chứa 2,25 µM BAP và 8,5 µM IAA cho kết quả tốt nhất Rễ được tạo thành khi ngâm chồi trong môi trường ½ MS lỏng trong 4 ngày sau đó chuyển lên môi trường ½ MS không chất kích thích sinh trưởng bổ sung 0,25 g/l than hoạt tính

2.3 Giới thiệu chung về chuyển gen ở thực vật

2.3.1 Khái niệm

Chuyển gen là quá trình chuyển đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) bằng các kĩ

thuật khác nhau (Agrobacterium, vi tiêm, bắn gen, xung điện v.v.) vào cơ thể của vật

chủ (động vật, vi sinh vật hay thực vật) (Trần Nguyễn Thúy An, 2007)

Thực vật chuyển gen: là thực vật mang một hoặc nhiều gen được đưa vào một cách nhân tạo thay vì thông qua lai tạo (www.agbiotech.com.vn)

2.3.2 Các biện pháp chuyển gen vào trong thực vật

2.3.2.1 Biện pháp sinh học

Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn gram âm sống trong đất, tác

nhân gây ra những khối u trên cây 2 lá mầm Khi có một vết thương ở rễ cây, vi khuẩn

sẽ xâm nhập và tạo khối u, khối u này sẽ phát triển không giới hạn và có thể đạt đến 1

m đường kính ở một vài loại cây Các khối u sẽ có nhiệm vụ tổng hợp một loại dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển Theo Schell và Van Montagu (1974) (trích dẫn bởi Trần Thị Lệ Minh, 2000) nguồn gốc của những gen tạo ra khối u nằm trong một plasmid có kích thước khoảng 200 kb Plasmid này được gọi là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid), chứa nhiều gen, đặc biệt là những gen qui định khả năng tự

sao chép Sự gắn kết giữa Agrobacterium vào tế bào cây bị thương được kiểm soát bởi

2 gen chvA và chvB định vị trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn, 2 gen này thể hiện rất ổn định trong tế bào vi khuẩn Gen chvA và chvB chỉ có thể hoạt động khi Agrobacterium

ở gần các tế bào bị thương do những tế bào này tiết ra các phân tử truyền tín hiệu làm

cho gen ở vùng vir (virulence) của Ti-plasmid hoạt động Các phân tử truyền tín hiệu

đã được ghi nhận là những hợp chất phenolic như acetosyringone (AS) và α-hydro acetosyringone (OH-AS)

Sau khi xâm nhập vào tế bào thực vật, một phần nhỏ của Ti-plasmid là T-DNA

sẽ xâm nhập vào bộ gen của tế bào và biểu hiện Các gen vir trên Ti-plasmid sẽ đóng vai trò điều khiển quá trình xâm nhiễm Có 6 loại gen vir là A, B, C, D, E và G Gen virA có nhiệm vụ truyền phân tử tín hiệu AS (acetosyringone) từ mô thực vật bị thương xuyên qua màng vào tế bào vi khuẩn AS sẽ hỗ trợ virG-protein để kích thích

sự thể hiện của các gen vir B, C, D, E Sự thể hiện của các gen này giúp cắt T-DNA ra

khỏi Ti-plasmid và chuyển nó vào tế bào thực vật Dựa vào đặc điểm này, người ta tiến hành cải tiến Ti-plasmid bằng cách loại bỏ các gen gây khối u (oncogene) và chèn thêm vào đó các gen mang tính trạng mong muốn Tiến trình này được thực hiện bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) và enzyme nối (ligase)

Nuôi tế bào thực vật trong môi trường có vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã cải tiến ta sẽ thu được những tế bào chuyển gen Hiện nay, sử dụng Agrobacterium tumefaciens là phương pháp phổ biến nhất trong chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao,

đặc biệt trên cây 2 lá mầm Gen được chuyển nạp bằng phương pháp này tỏ ra rất ổn định và thường di truyền các tính trạng theo định luật Mendel (De Block và ctv, 1984; Muller và ctv, 1987; Hiei và ctv, 1996) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Theo Fritsch và Kovalchuk (2000), phương pháp chuyển gen bằng

Agrobacterium tumefaciens không làm ảnh hưởng đến các bộ phận được chuyển gen

và các bộ phận này vẫn có thể sống và phát triển bình thường sau quá trình đồng nuôi cấy với vi khuẩn Quá trình chuyển nạp được xem là thành công khi có sự biểu hiện của các gen thông báo và chỉ thị chọn lọc trong các mô thực vật Tần số chuyển nạp từ

vi khuẩn vào tế bào thường phụ thuộc rất lớn vào loài thực vật, các điều kiện sinh trưởng, giai đoạn sinh trưởng của thực vật Tần số này còn phụ thuộc vào môi trường nuôi vi khuẩn và mật độ vi khuẩn trong môi trường xâm nhiễm (infiltration medium)

2.3.2.2 Biện pháp cơ học

Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation)

Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắn trong một điện trường cực mạnh để làm tăng khả năng xâm nhập của DNA cần chuyển vào tế bào trần (Nagara, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Phương pháp sử dụng xung điện đã được sử dụng trong chuyển nạp gen trên cả động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy còn nhiều khó khăn chưa giải quyết được về mặt kỹ thuật nhưng người ta cũng đã ghi nhận những trường hợp chuyển gen thành công trên cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988; Shimamoto và ctv, 1989), trên

cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây cải dầu (Guerche và ctv, 1987) (trích dẫn

bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)

Phương pháp bắn gen được John Stanford ở Đại học Cornell phát minh (Klein và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Đây là phương pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng Ưu điểm của phương pháp này là có thể

áp dụng trên tất cả các loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm, không cần vector hai nguồn (binary vector) và quy trình vận hành tương đối đơn giản

Hiện nay có 3 loại dụng cụ bắn gen khác nhau:

- Loại 1: là một bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng, gây nổ nhờ một kim hỏa (Klein và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

- Loại 2: hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đưa DNA phủ lên các phân tử bằng vàng cực mịn (DNA–coated gold particles) (Christou và ctv, 1988) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

- Loại 3: hoạt động bằng áp suất của khí từ một xi lanh chứa khí trơ như helium hoặc nitrogen Vận tốc của vi đạn khi bắn bằng dụng cụ này chậm hơn rất nhiều so với loại 1 nhưng nó tỏ ra rất có hiệu quả trong trường hợp chuyển plasmid DNA vào tế bào cây trồng (Cao và ctv, 1991) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2004) trong quy trình bắn gen trước tiên bột vàng hoặc tungsten sẽ được phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và được gắn lên viên đạn plastic Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng các hạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lưới kim loại với một vận tốc lớn xuyên vào

tế bào Mô được bắn xong sẽ được chuyển vào môi trường tái sinh có bổ sung các chất chọn lọc thích hợp Mô nhận gen sẽ xuất hiện mô sẹo sau 5 - 7 ngày nuôi cấy còn các

mô không nhận gen sẽ chết trong môi trường chọn lọc

2.3.2.3 Biện pháp vật lí

Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)

Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực vật Phương pháp này chuyển nạp gen vào tế bào trần dưới dạng plasmid DNA dựa trên nguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhập gen lạ vào tế bào Cao và ctv (1991) đã sử dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi 4, Taipei 309 và Nipponbare trong thí nghiệm chuyển gen bằng phương pháp PEG, kết quả là đã thu được những tế bào trần mang các gen chuyển nạp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Theo Fritsch và Kovalchuk (2000), nhìn chung mỗi phương pháp chuyển gen đều

có các ưu nhược điểm riêng Ví dụ phương pháp chuyển gen PEG có thể chuyển trực tiếp gen mục tiêu vào tế bào trần (protoplast) hay chuyển gen bằng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens qua mẫu lá thực vật còn có những hạn chế vì tế bào phải

trải qua quá trình tái sinh thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô Trong thực tế, có nhiều loài thực vật rất khó tái sinh hoặc các tế bào nuôi trong môi trường tái sinh thường phát sinh các biến dị soma và biến dị nhiễm sắc thể không mong muốn Phương pháp sử dụng súng bắn gen thường được áp dụng đối với những thực vật không phải là đối

tượng xâm nhiễm của Agrobacterium tumefaciens hay những đối tượng khó tái sinh

Phương pháp này có thể áp dụng trên cây trưởng thành, trên tế bào mầm (germ line cells) ở phát hoa Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi những máy móc đắt tiền và quy trình bắn gen phải được thiết lập rất nghiêm ngặt

2.3.3 Thành phần của gen chuyển nạp

2.3.3.1 Promoter

Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình

tự thích hợp đi kèm theo nó Với mỗi promoter cần có các vector tương ứng Hiện nay,

promoter CAMV35S của virus gây bệnh khảm trên cải bông là một promoter mạnh và

được sử dụng phổ biến nhất Theo Heldt (1997) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) promoter này bao gồm các enhancer có khả năng chuyển mã ở mức

độ cao

2.3.3.2 Gen thông báo (reporter gene)

Theo Jacobsen (2007) bất cứ phương pháp chuyển gen nào dù là chuyển nạp gen

gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen

vẫn cần một phương pháp tin cậy để xác định các tế bào đã nhận gen ngoại lai Với mục đích đó khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông báo Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào đó rất

dễ phát hiện trong cây Người ta thường sử dụng gen gusA của vi khuẩn E coli làm gen thông báo Gen gusA mã hóa enzyme β–glucuronidase Enzyme này xúc tác phản

ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thành sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng Glucuronidae thường dùng là 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide (X-gluc) Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase không tồn tại trong

thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật Mặt khác,

sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnh hưởng của pH môi trường nên rất thuận tiện cho việc theo dõi

2.3.3.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)

Sau quá trình chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng các tế bào đã nhận gen mục tiêu và cho vào môi trường tái sinh Thông thường, một plasmid được

sử dụng trong chuyển nạp gen sẽ mang các thành phần gen thông báo, chỉ thị chọn lọc

và gen mục tiêu Khi các chỉ thị chọn lọc thể hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục sinh trưởng trong môi trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng sinh hay

thuốc diệt cỏ Các chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay là gen nptII mã hóa enzyme

neomycin phospho transferase II Enzyme này sẽ xúc tác quá trình phosphoryl hóa kháng sinh kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này Một chỉ thị chọn lọc phổ biến

khác là gen hph mã hóa enzyme hygromycin phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng sinh hygromycin Gen hph tỏ ra rất thành công trên cây bắp (Walters và

ctv, 1992), cây lúa (Christon và ctv, 1991; Li và ctv, 1993) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu

và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể được sử dụng như gen mục tiêu nhưng đồng thời cũng là một chỉ thị chọn lọc Gen bar mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl

transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là thành phần chính trong

thuốc diệt cỏ Basta Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme phospho mannose isomerase đã

được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc Gen này hoạt động trên cơ sở phản ứng huỳnh quang trong môi trường có đường mannose Điều này đã mở ra một triển vọng lớn về

an toàn sinh học do không cần sử dụng chất kháng sinh hay hoạt chất diệt cỏ trong quá

trình chọn lọc (Hòa và Bổng, 2002) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.4 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến

Lần đầu tiên vào năm 1973 người ta tiến hành dòng hóa gen thành công Đến năm 1983 người ta đã làm cho gen của loài thực vật này biểu hiện trong cơ thể của loài thực vật khác khi chuyển thành công gen kháng thuốc diệt cỏ Roundup (glyphosate)

vào cây thuốc lá (Eisenman, 1996) Các nhà khoa học đã phân lập gen aroA kháng

glyphosate từ vi khuẩn, dòng hóa và chuyển vào tế bào mô sẹo cây thuốc lá

và ức chế sự hình thành diệp lục

Năm 1998, công ty Aventis CropScience (Mỹ) đã tiến hành chuyển thành công

gen bxn kháng hoạt chất diệt cỏ ioxynil (3,5-di-iodo-4-hydroxybenzonitrile) và

bromoxynil (3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile) vào trong cây canola Argentine

(Brassica napus var Westar) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng EHA

101 mang plasmid pRPA- BL–150a Eberlein và ctv (2000) đã tiến hành chuyển gen

bxn vào giống khoai tây Solanum tuberosum L cv Lemhi Russet bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Kết quả đã thu được các dòng khoai tây chuyển gen có

khả năng chịu được nồng độ bromoxynil cao gấp 70 lần so với cây khoai tây bình thường

2.3.4.2 Gen bar

Gen bar có nguồn gốc từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus (Thompson và

ctv, 1987) Vi khuẩn này có khả năng sản sinh ra một loại hợp chất thứ cấp là tripeptide bialaphos Bialaphos có chứa chất phosphinothricin, là một đồng dạng của glutamate Glutamate là chất gây ức chế enzyme glutamine synthetase Khi enzyme

này bị ức chế cây trồng sẽ không thể tổng hợp được glutamine dẫn đến sự tích lũy ammonia trong cây làm cây chết nhanh chóng

Vào năm 1986, Murakami và ctv đã tạo dòng gen bar và cho thử nghiệm tính

kháng với chất kháng sinh là bialaphos Bialaphos được sử dụng như một chất diệt cỏ không chọn lọc trong nông nghiệp Nó là một tripeptide với 2 gốc L-alanine và một đồng dạng của axit glutamic là phosphinothricin (PPT) (Ogawa và ctv, 1973; Kondo

và ctv, 1973) (trích dẫn bởi Thompson và ctv, 1987) Một tripeptide nguyên vẹn có rất

ít hoặc không có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme glutamine synthetase (Bayer

và ctv, 1972; Tachibana và ctv, 1986a) (trích dẫn bởi Thompson và ctv, 1987) nhưng khi vào trong cơ thể vi khuẩn hoặc cây trồng, enzyme peptidase trong tế bào sẽ loại bỏ

2 gốc alanine và giải phóng hoạt tính của PPT Đáp ứng của những cây trồng biến đổi

di truyền mang gen bar đối với glufosinate hay bialaphos đã cung cấp cho các nhà

khoa học một phương tiện chọn lọc rất hiệu quả trong quá trình tạo cây chuyển gen

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của Bialaphos (Mayer và ctv, 2004)

Glufosinate

Glufosinate (phosphinothricin; DL-homoalanin-4-yl (methyl) phosphinic axit) là một chất dẫn xuất của phosphinico amino axit Dạng muối của glufosinate là glufosinate-ammonium được sử dụng phổ biến làm thuốc diệt cỏ không chọn lọc (non-selective herbicide) Đây là hoạt tính của các chế phẩm thương mại như Basta, Buster, Challenge, Conquest, Dash, Final, Finale, Liberty và Ignite Đồng phân dạng L của glufosinate có cấu trúc tương tự như glutamate và vì vậy nó có thể ức chế enzyme glutamine synthetase (GS) trong cơ thể vi khuẩn và cây trồng (Bayer và ctv, 1972; Leason và ctv, 1982) (trích dẫn bởi OECD, 2002) Do enzyme GS bị ức chế nên trong

tế bào của cây trồng không biến đổi di truyền có sự tích lũy ammonia với số lượng lớn

do quá trình đồng hóa nitrate và quang hô hấp (Tachibana và ctv, 1986) Kết quả là

làm cho hàm lượng glutamine giảm thấp (Sauer và ctv, 1987) (trích dẫn bởi OECD, 2002) Điều này làm phá hủy màng tế bào và gây ức chế quang hợp, cuối cùng làm cho tế bào chết

Ở cây trồng biến đổi di truyền mang gen kháng glufosinate, đồng phân dạng L của glufosinate nhanh chóng bị biến đổi thành N-acetyl-L-glufosinate (NAG) không độc đối với cây trồng do tác động của enzyme phosphinothricin acetyl transferase (PAT)

Sự chuyển hóa của glufosinate-ammonium trong cây trồng biến đổi di truyền và cây trồng không biến đổi di truyền

Trong tế bào thực vật không biến đổi di truyền, khi xử lý với glufosinate sẽ xuất hiện một sản phẩm trung gian không bền do quá trình khử amin là 4-methylphosphinico-2-oxo-butanoic axit (PPO) Sản phẩm này sau đó sẽ bị decarboxyl hóa để tạo thành một sản phẩm bền và không độc đối với cây trồng là 3-methylphosphinico-propionic axit (MPP) Chất PPO cũng có thể được chuyển hóa thành một sản phẩm bền vững khác và không độc đối với cây là 4-methyl-phosphinico-2-hydroxy-butanoic axit (MHB) (Droege Laser và ctv, 1994) (trích dẫn bởi OECD, 2002) Sự chuyển hóa glufosinate ở cây trồng không chuyển gen thường rất hạn chế do cây thường chết rất nhanh khi phun thuốc

Việc chuyển gen bar mã hóa enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT)

đã cho phép cây trồng chuyển hóa nhanh chóng hoạt chất glufosinate-ammonium sang dạng không độc là N–acetyl–L–glufosinate (NAG) Sản phẩm này không được tìm thấy ở cây trồng không chuyển gen Ở cây trồng chuyển gen, có 2 con đường chuyển hóa glufosinate–ammonium:

- Quá trình khử amin của hoạt chất glufosinate và biến thành chất phosphinico-2-oxo-butanoic axit (PPO), sau đó PPO lại bị biến đổi thành 3-methylphosphinico-propionic axit (MPP) hoặc 4-methyl-phosphinico-2-hydroxy-butanoic axit (MHP)

4-methyl Quá trình acetyl hóa L4-methyl glufosinate bởi enzyme phosphinothricin acetyl transferase (PAT) (Droege Laser và ctv, 1994) (trích dẫn bởi OECD, 2002)

Khi enzyme PAT hoạt động mạnh thì con đường chuyển hoá ammonium thứ 2 chiếm ưu thế và ngược lại khi hoạt động của PAT yếu thì con đường chuyển hoá 1 chiếm ưu thế Trong trường hợp này, bên cạnh các sản phẩm bị acetyl

glufosinate-hoá và không bị acetyl glufosinate-hoá của L-glufosinate còn có các sản phẩm khác là phosphinico-2-oxo-butanoic axit (PPO), 3-methylphosphinico-propionic axit (MPP) và 4-methyl-phosphinico-2-hydroxy-butanoic axit (MHB) cùng tồn tại

4-methyl-2.3.5 Hiện trạng và xu hướng phát triển cây trồng biến đổi gen trên thế giới

Công nghệ sinh học đã có những bước tiến nhảy vọt góp phần mang lại những thành tựu to lớn cho loài người Trong 13 năm, từ 1996 đến 2008, số nước trồng GMC

đã lên tới con số 25 - một mốc lịch sử - một làn sóng mới về việc đưa GMC vào canh tác, góp phần vào sự tăng trưởng rộng khắp toàn cầu và gia tăng đáng kể tổng diện tích trồng GMC trên toàn thế giới lên 73,5 lần (từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên 125 triệu ha năm 2008) Trong năm 2008, tổng diện tích đất trồng GMC trên toàn thế giới từ trước tới nay đã đạt 800 triệu ha Năm 2008, số nước đang phát triển canh tác GMC đã vượt

số nước phát triển trồng loại cây này (15 nước đang phát triển so với 10 nước công

nghiệp)

Hình 2.4 Diện tích cây chuyển gen trên toàn cầu (Clive Jame, 2008)

Tính đến hết năm 2009, đã có 14 triệu nông dân trồng các giống cây này ở 25 quốc gia trên thế giới, trên diện tích 134 triệu ha (tương đương với 330 triệu mẫu Anh), tăng 7%, tương đương 9 triệu ha (22 triệu mẫu Anh) so với năm 2008 Tổng diện tích đất trồng cây CNSH qua các năm từ 1996 đến 2009 đã đạt gần 1 tỷ ha (949,9 triệu ha, tương đương với 2,3 tỷ mẫu Anh) Đáng chú ý là gần 1 nửa diện tích đất trồng cây CNSH trên thế giới (46%) nằm ở các nước đang phát triển, có tiềm năng vượt các

nước công nghiệp phát triển trước năm 2015 Cây trồng CNSH hiện đang có những đóng góp rất to lớn cho mục tiêu này và sẽ còn đóng góp đáng kể trong tương lai Cuộc cách mạng xanh trong quá khứ và CNSH trong nông nghiệp hiện tại đã, đang và

sẽ giúp đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng trên thế giới, trong khi vẫn bảo vệ được môi trường sống của chúng ta và các thế hệ trong tương lai (Mard, 2010)

2.3.6 Tình hình trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ trên thế giới

Sự xuất hiện của cây trồng kháng thuốc diệt cỏ đã tạo ra sự thay đổi lớn trong ngành hóa chất nông nghiệp Nhu cầu về thuốc diệt cỏ chọn lọc đã giảm đáng kể Ở một số nước có trồng cây kháng thuốc diệt cỏ người ta sẽ sử dụng thuốc diệt cỏ phổ rộng để quản lý cỏ dại vì chúng không ảnh hưởng đến cây trồng Những loại thuốc diệt

cỏ phổ rộng hiện nay như glufosinate, glyphosate có khả năng phân hủy sinh học, ít độc và ít tạo ra tính kháng ở cỏ dại (Mayer và ctv, 2004)

Khả năng kháng thuốc diệt cỏ phụ thuộc vào loại gen được chuyển vào cây trồng Bảng dưới đây sẽ trình bày các loại thuốc diệt cỏ phổ rộng được sử dụng phổ biến và các gen được chuyển nạp để kháng lại chúng

Bảng 2.3 Các loại thuốc diệt cỏ và gen kháng phổ biến

aroA, EPSPS (3-enoyl pyruvyl

shikimate 5-phosphate synthase) Agrobacterium sp.

Sulfonamides DHPS (dihydropteroate synthase),

và lúa mì kháng thuốc diệt cỏ đã được hoàn thiện nhưng chưa được sử dụng

Bông Bt/ chống chịu thuốc diệt cỏ 3,6

Tổng 90,0 (James C, 2005)

2.3.7 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen tại Việt Nam

Hiện nay lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, nghiên cứu chuyển gen

vào cây trồng đang được tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng với sự

chú trọng đặc biệt Các nghiên cứu tạo các sinh vật biến đổi gen, bước quan trọng đầu

tiên được thực hiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý có giá trị

ứng dụng cao tiến tới sử dụng để chuyển vào sinh vật nhận nhằm tạo nên những giống

lý tưởng Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao gồm gen chịu hạn,

lạnh, kháng bệnh ở lúa, gen cry và vip mã hóa các protein độc tố có hoạt tính diệt côn

trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hóa protein bất hoạt hóa ribosome ở

cây mướp đắng và gen mã hóa α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn

trùng; gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ, gen mã hóa

kháng nguyên vỏ của các chủng virus dại.v.v.Các gen có giá trị y dược phải kể đến các

gen mã hóa cho một số kháng nguyên của virus và vi khuẩn như gen mã hóa kháng

nguyên E của virus Dengue type I và type II sử dụng trong chẩn đoán sốt Dengue và

sốt xuất huyết Dengue Song song với những nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu thiết

kế các vector mang gen có giá trị chủ yếu để biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật

được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm trên cả nước Trên đối tượng thực vật, hướng

nghiên cứu hoàn thiện các phương pháp chuyển gen và các quy trình tái sinh cây khởi

đầu cho những nghiên cứu chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng cũng

nhận được sự quan tâm của nhiều nhóm tác giả

Nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau như phương pháp bắn gen, phương

pháp sử dụng vi khuẩn A tumefaciens đã được áp dụng thành công trên hàng loạt đối

tượng cây trồng quan trọng như lúa, cà chua, cà tím, đậu xanh, cà phê, thuốc lá, khoai lang

Các đề tài đã và đang thực hiện tại các viện nghiên cứu:

Viện Công nghệ sinh học (Hà Nội) đã chuyển thành công gen Xa21 kháng bệnh

bạc lá do vi khuẩn vào giống lúa Việt Nam sử dụng súng bắn gen Chuyển gen vào cây hoa, cây bông và cây lâm nghiệp, nhằm nâng cao sức chống chịu với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất lợi Chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ, chuyển gen

cry và gen chịu hạn vào cây bông, tăng cường tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa

bằng công nghệ GM

Tại Viện Sinh học nhiệt đới Tp HCM, các nhà khoa học đã tạo được các cây

thuốc lá, lúa, đậu xanh, cải bông, cải xanh và cây cà tím GM mang gen cry kháng côn

trùng, gen kháng thuốc diệt cỏ Hiện nay, viện đang thực hiện việc chuyển gen vào cây

thân gỗ sử dụng vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA105 chứa Ti-plasmid ITB mang gen cry kháng côn trùng, gen bar kháng thuốc diệt cỏ và gen chỉ thị gus

Tại Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, đã chuyển gen gus và gen kháng kanamycin vào cà chua Sử dụng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn đất A tumefaciens để chuyển gen vào cây Arabidopsis (Phan Tố Phượng và cộng sự) Gần đây, đã tiến hành thiết kế vector và chuyển gen cry vào cây cải bắp (nghiên cứu của

Đặng Trọng Lương) Các nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng bệnh khô vằn vào giống lúa DT 10, DT 13; gen kháng bệnh bạc lá vào giống lúa VL 902;

gen kháng sâu tơ vào cải bắp CB 26; gen cry, Gna, Xa21 và gen mã hoá B-caroten vào

lúa Indica đã và đang được triển khai với những kết quả khả quan

Kết quả của những nghiên cứu trên là cây chuyển gen được tạo ra và lưu giữ trong phòng thí nghiệm và trong nhà kính Tuy nhiên, những cây trồng này mới chỉ tồn tại ở quy mô thí nghiệm và chờ thử nghiệm Hiện nay, chúng ta chưa có quy chế cho việc tiến hành thử nghiệm các cây trồng này ở đồng ruộng (http://tusach.thuvienkhoahoc.com)

2.4 Các nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây dầu mè Jatropha curca bằng vi khuẩn Agrobacterium 

Các nghiên cứu về chuyển gen vào cây Jatropha curas được tiến hành rộng rãi trên

thế giới đã và thu được khá nhiều kết quả đáng chú ý. Năm 2006, Li và ctv đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc chuyển gen vào cây Jatropha curas L. thông qua trung gian

vi khuẩn Agrobacterium dựa trên các khảo nghiệm gen gus được chuyển vào. Meiru Li và ctv (2007) đã thiết lập phương pháp chuyển gen vào lá mầm (cotyledon disc) cây

Jatropha curcas L bằng Agrobacterium Đây là lần đầu tiên cây J curcas chuyển gen được tạo ra thành công Tác giả cho rằng sử dụng vi khuẩn Agrobacterium chủng

LBA4404 để chuyển gen và chọn lọc bằng phosphinothricin thì hiệu quả hơn chủng EHA105 và chọn lọc bằng hygromycin Kết quả của nghiên cứu là khoảng 55% mẫu lá mầm tạo được callus kháng phosphinothricin trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BA; 0,05 mg/l IBA; 1 mg/l phosphinothricin and 500 mg/l cefotaxime sau 4 tuần Tiếp theo là chuyển callus lên môi trường tạo chồi chứa 1,5 mg/l BA; 0,05 mg/l IBA; 0,5

mg /l GA3, 1 mg/ l phosphinothricin and 250 mg/ l cefotaxime, khoảng 33% callus kháng biệt hóa thành chồi Cuối cùng chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/ l IBA đạt tỉ lệ 78% Kết quả khoảng 13% mẫu nuôi cấy tạo được cây chuyển gen sau 4 tháng Li và ctv (2008) cũng đã có vài báo cáo về chuyển gen trong cây Jatropha curcas thu nhận biểu hiện của gen uidA (gusA) ở cây được tái sinh từ lá mầm của J.curcas sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium Mazumdar và ctv (2010)

trình bày hệ thống chuyển gen hiệu quả vào lá mầm của hạt, sử dụng kanamycin để chọn lọc Sử dụng môi trường tái sinh là MS-Jc1 (môi trường MS với 3 mg/l BA and 0,01 mg/l IBA) Môi trường tạo callus (CIM, MS-Jc1 bổ sung 300 mg/l cefotaxime)

trong 4 tuần đầu sau khi đồng nuôi cấy với Agrobacterium Sau đó chuyển lên môi

trường tạo chồi (SIM, MS-Jc1 with 20 mg/L kanamycin and 100 mg/L cefotaxime) để chọn lọc thể chuyển gen, chồi kháng kanamycin thu được sau 6 - 8 tuần nuôi cấy Tuy nhiên việc tạo rễ rất khó khăn, chỉ 1 trên 120 chồi tái sinh có thể tạo rễ thành công trên môi trường (RM, 1/2 MS with 0,3 mg/L IBA, 20 mg/L kanamycin và 100 mg/L cefotaxime) sau 4-5 tuần Các cây tái sinh kháng kanamycin đã được tạo ra thành công với hiệu suất là 30,8% Zong và ctv (2010) đã chuyển gen mã hóa kích thích tố tạo

chồi bên (Lateral Shoot-Inducing Factor-LIF) vào lá non của Jatropha curcas L bằng Agrobacterium Nghiên cứu đã phát triển quy trình chuyển gen đạt hiệu quả và ổn định

sử dụng Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 vào lá non của J curcas, tiến

hành tối ưu hóa các thông số chuyển gen Kết quả thu nhận nồng độ vi khuẩn tối ưu cho quá trình chuyển gen là OD600= 0,1, thời gian nhúng mẫu vào vi khuẩn là 10 phút, thời gian đồng nuôi cấy 5 ngày cho hiệu quả chuyển gen cao nhất Nồng độ cefotaxime cao nhất sử dụng diệt khuẩn là 300 mg/l, ở nồng độ này mẫu lá có thể tạo callus tái

sinh được mà không quan sát thấy sự hiện diện của vi khuẩn Đây là qui trình chuyển

gen đạt hiệu quả vào lá non của Jatropha curcas L và được tác giả Zong áp dụng để chuyển gen LIF vào trong bộ gen của J curcas