NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA NHỜ MARKER PHÂN TỬ SSR NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁNG BỆNH HÉO RŨ VI KHUẨN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA NHỜ MARKE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA NHỜ MARKER PHÂN TỬ SSR NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁNG BỆNH HÉO RŨ VI KHUẨN

Ralstonia solanacearum

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : HUỲNH THỊ XUÂN TRANG Niên khóa : 2007 – 2011

Tháng 07 năm 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA NHỜ MARKER PHÂN TỬ SSR

NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁNG BỆNH HÉO RŨ VI KHUẨN

Ralstonia solanacearum

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TRƯƠNG QUỐC ÁNH HUỲNH THỊ XUÂN TRANG

Tháng 07 năm 2011

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên con muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ và anh chị cùng những người thân trong gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc cho con và tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt

Xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng quý thầy cô đã giảng dạy tôi trong suốt bốn năm học

ThS Trương Quốc Ánh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

ThS Bùi Phú Nam Anh và các anh chị thuộc Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Toàn thể lớp DH07SH đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm qua

TÓM TẮT

Bệnh héo rũ vi khuẩn cây cà chua, được mô tả đầu tiên bởi Smith (1896) cách nay trên 100 năm, xếp vào một trong số bệnh nguy hiểm nhất của cây cà chua ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Hiện nay bệnh héo rũ là nguyên nhân chủ yếu làm giảm sản lượng cà chua ở nhiều vùng của Việt Nam Bệnh héo rũ do vi khuẩn trong đất là

Ralstonia solanacearum Bệnh gây hại trên tất cả các bộ phận của cây như lá, thân, rễ

Hiện nay, sử dụng các giống kháng là phương pháp hữu hiệu nhất để kiểm soát bệnh Tuy nhiên, phương pháp chọn giống kháng truyền thống thì khó khăn và tốn thời gian Vì thế mục tiêu của luận văn là nghiên cứu tính đa hình di truyền một số giống cà chua bằng chỉ thị phân tử SSR từ đó xác định giống kháng thích hợp đối với các nòi vi

khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập tại Việt Nam Phương pháp này cho ta vượt

qua nhiều vấn đề khó khăn khi chọn giống bằng phương pháp truyền thống

Kết quả phân tích đánh giá kiểu hình bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo ở giai đoạn cây con cho thấy rằng 7 nòi vi khuẩn phân lập trên 2 vùng sinh thái TP Hồ Chí Minh và Lâm Đồng xác định 3 nòi có độc tính Kết quả đánh giá xác định được giống số 10 là giống nhiễm, giống số 18 là giống kháng và các giống số 1, 4, 7, 12, 15 kháng trung bình Kết quả phản ứng PCR cho thấy SSR306 định vị ở NST 4, liên kết với gen kháng Bw4 cho đa hình giống 1, 4, 7, 12, 15, 18 Kết quả này tạo tiền đề cho công tác chọn, tạo giống cà chua kháng bệnh héo rũ bằng chỉ thị phân tử ở Việt Nam

SUMMARY

Title: The primary of research on polymorphism to tomato varieties by molecular

marker SSR for identifying resistant bacterial wilt Ralstonia solanacearum

Bacterial wilt of tomato, described by Smith (1896) over 100 years ago, caused among the most serious diseases of tomato in tropical and subtropical It is now the major constraint on production of tomato in many parts of VietNam Bacterial wilt is

caused by the soilborne bacterium Ralstonia solanacearum This oomycete pathogen

attacks on leaves, stems, roots of tomato

Introduction of resistant varieties is therefore the most effective measure to control this disease However, conventional breeding approach for disease resistance is difficult, labor and cost time The objective of this thesis is to research on genetic polymophism using molecular marker SSR for identifying to tomato varieties so that

we can define resistant varieties with Ralstonia solanacearum isolate that collected in

VietNam This method help us overcome difficult problems when we apply conventional approach

The result of phenotypic evaluation by artificial infection methods showed that

7 bacterial isolates separate of two ecological HoChiMinh city and LamDong province, 3 isolates are exhibited the virulence Result also showed line of 10 is susceptible, line of 18 is resistant and lines of 1, 4 and 7, 12, 15 are medium resistance.The result of PCR reaction showed that SSR306 was located on chromosome 4, linked

to Bw4 resistant gene, have polymorphism with 6 line od tomato as 1, 4, 7, 12, 15, 18 This result opens up for MAS (Marker Assisted Selection) of bacterial wilt resistant improvement of tomato varieties in Vietnam

Keywords: Ralstonia solanacearum, bacterial wilt, conventional breeding

approach, , genetic polymophism, molecular marker SSR, resistant gene

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iii

SUMM ARY ii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

D ANH SÁCH CÁC BẢNG vii

D ANH SÁCH C ÁC H ÌNH vi ii Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây cà chua Error! Bookmark not defined 2.1.1 Giá trị dinh dưỡng 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây cà chua 5

2.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam 6

2.2.1 Tình hình sản xuất cà chua trong nước 6

2.2.2 Tình hình sản xuất cà chua thế giới 7

2.3 Bệnh héo rũ trên cà chua 7

2.3.1 Triệu chứng và nguyên nhân gây bệnh 8

2.3.2 Đặc điểm phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh 10

2.3.3 Biện pháp phòng bệnh 10

2.4 Nghiên cứu về bệnh héo rũ 11

2.4.1 Các nghiên cứu trong nước 11

2.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước 12

2.5 Chỉ thị phân tử 15

2.5.1 Phân loại 16

2.5.2 Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống thực vật 17

2.5.3 Chỉ thị phân tử SSR 18

2.5.3.1 Khái niệm chỉ thị phân tử SSR 18

2.5.3.2 Phân loại chỉ thị phân tử SSR 19

2.5.3.3 Ưu, khuyết điểm của phương pháp SSR 20

2.5.3.4.Ứng dụng của microsatellite trong chọn tạo giống cà chua 20

2.6 Phương pháp PCR 21

2.6.1 Khái niệm 21

2.6.2 Nguyên tắc 21

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 22

3.2 Nguyên vật liệu 22

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.2.2 Nguồn vi khuẩn nhiễm bệnh 22

3.2.3 Hóa chất trong thí nghiệm 22

3.2.4 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 23

3.3.1 Đánh giá tính kháng héo rũ của các mẫu giống cà chua thu thập được 24

3.3.2 Phương pháp dánh giá kiểu gen 26

3.3.2.1 Quy trình ly trích DNA tổng số 26

3.3.2.2 Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di 26

3.3.2.3 Định lượng DNA bằng máy đo quang phổ kế 27

3.3.2.4 Thực hiện phản ứng PCR, xác định SSR cho kết quả đa hình 27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh héo rũ của các mẫu giống cà chua 28

4.2 Xác định đa hình các mẫu với SSR liên kết với gene kháng Bw4 bệnh héo rũ 29

4.2.1 Sản phẩm ly trích DNA tổng số 30

4.2.2 Tuyển chọn các chỉ thị SSR cho phản ứng PCR 30

4.2.3 Thực hiện phản ứng PCR, xác định SSR cho đa hình mẫu cà chua thu thập 32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

CtTNHH - TM Công ty nhiệm hữu hạn - thương mại

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

MAS Marker Assisted Selection

NST Nhiễm sắc thể

PCI Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25 : 24 : 1) PCR Polymerase Chain Reaction

PVP Polyvidon

QTL Quantitative Trait Loci

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SDS Sodium Dodecyl Sulfat

SSR Simple Sequence Repeat

Ta Annealing temperature

TE Tris - EDTA

TZC Triphenyltetrazolium chloride

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học trong 100 g cà chua .4

Bảng 2.2 Gen dự tuyển trên QTL 14

Bảng 2.3 Các loại chỉ thị phân tử 16

Bảng 3.1 Danh sách các nòi phân lập 22

Bảng 3.2Danh sách các mẫu hạt giống đánh giá tính kháng 25

Bảng 3.3Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 27

Bảng 3.4Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 27

Bảng 4.1Tính kháng bệnh của các mẫu giống cà chua 28

Bảng 4.2 Danh sách các chỉ thị SSR làm thí nghiệm 32

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây cà chua 3

Hình 2.2 Phần trăm sản lượng cà chua ở các nước sản xuất chính (2009) 7

Hình 2.3 Vườn cà chua nhiễm bệnh héo rũ vi khuẩn 8

Hình 2.4 Triệu chứng bệnh (a) dịch vi khuẩn ở thân; (b) rễ, (c) cây, (d) thân 8

Hình 2.5 Các nước thành viên tham gia dự án giải trình tự hệ gene cà chua 13

Hình 2.6 Bản đồ QTL gen kháng bệnh héo rũ trên NST số 3, 4, 6, 7, 10 15

Hình 2.7 Chỉ thị phân tử giữa các kiểu gene A, B, C, D 16

Hình 2.8 So sánh giữa (a) chỉ thị phân tử đồng trội và (b) chỉ thị phân tử trội 17

Hình 4.1 Khuẩn lạc Ralstonia solanacearum trên môi trường TZC 29

Hình 4.2 DNA tổng số của 14 mẫu cà chua nghiên cứu 30 Hình 4.3 Công cụ tìm kiếm marker SSR306 31

Hình 4.4 Nhiễm sắc thể số 4 trong vùng 51cM - 71cM 31

Hình 4.5 Sản phẩm PCR với mồi SSR72 33

Hình 4.6 Sản phẩm PCR với mồi SSR306 33

Hình 4.7 Sản phẩm PCR với mồi SSR306 33

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cà chua (Lycopersicon esculentum) là loại rau luôn được ưa chuộng vì rất bổ dưỡng, có thể chế biến trong nhiều món ăn hấp dẫn và ngon miệng Sản phẩm cà chua chế biến rất đa dạng như: cà chua cô đặc, cà chua đóng hộp nguyên quả, nước quả, nước xốt, tương cà chua Về mặt dinh dưỡng, cà chua có nhiều vitamin A, C và có hàm lượng cao chất chống oxy hóa lycopen, chất này còn có khả năng chống lại bệnh tim, ung thư

Cây cà chua có nguồn gốc ở vùng Nam Mĩ Ngày nay cà chua trở thành một trong những loại rau quả được trồng rộng rãi trên toàn thế giới Thống kê năm 2005, diện tích cà chua ở Việt Nam là 23,566 ha, sản lượng đạt 433,234 tấn chỉ đảm bảo cho bình quân đầu người 5,5 kg quả/năm, bằng 35% so với mức trung bình toàn thế giới, năng suất trung bình 19,78 tấn/ha chỉ bằng khoảng 62% năng suất chung toàn thế giới (Trương Quốc Ánh, 2009)

Một trong những nguyên nhân chính là cà chua bị nhiều sâu bệnh gây hại như sâu đục quả, dòi đục lá, bọ trĩ, bệnh sương mai, bệnh thán thư, bệnh héo rũ vi khuẩn

Trong đó bệnh héo rũ vi khuẩn do Ralstonia solanacearum là nguy hiểm nhất Bệnh lây

lan nhanh gây chết hàng loạt, thậm chí 100% làm giảm năng suất, có khi mất trắng, đặc biệt khi trồng trong vụ mưa (Trương Quốc Ánh, 2009) Cà chua trồng trong vụ mưa rất khó nên gọi là cà chua trái vụ (hay cà chua mùa nghịch) Đổi lại, nếu trồng trong mùa nghịch mà thành công thì hiệu quả cao, vì giá bán cao gấp nhiều lần so với chính vụ

Để hạn chế bệnh héo rũ có thể áp dụng một số kỹ thuật: luân canh cây trồng, sử dụng gốc cà tím ghép cà chua nhưng hạn chế là thời gian vườm ươm dài, không tương hợp giữa gốc ghép và ngọn ghép làm giảm năng suất cà chua ghép Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh héo rũ là hết sức cần thiết và là biện pháp ưu việt, trong

đó việc áp dụng kỹ thuật ở mức độ phân tử trong chọn giống sẽ rút ngắn thời gian, giảm bớt khó khăn trong phân tích so với sử dụng phương pháp chọn giống cổ truyền Nghiên cứu ban đầu tính kháng bệnh héo rũ trên cà chua đã xác định được một số gene kháng như: gene Bw1, Bw5 nằm trên NST số 6, gene Bw3 nằm trên nhiễm NST 10, gene Bw4 trên NST số 4 , Rrs3 trên NST số 3, Bw2 trên NST số 7 (Majid R Foolad, 2007) Hiện nay, nước ta cũng có nghiên cứu nào liên quan đến chọn giống có gene kháng bệnh héo

Các nhà khoa học đã phát hiện một loạt các chỉ thị phân tử như AFLP, RFLP,

SSR, RAPD, SNP…để nghiên cứu tính đa hình di truyền tính kháng bệnh của tập đoàn giống, xác định vị trí các gen mục tiêu mã hóa cho những tính trạng ưu việt Những chỉ thị này đóng góp lớn cho giải trình tự và lập bản đồ di truyền nhiều loại cây trồng quan trọng trong nông nghiệp, tạo tiền đề cho nghiên cứu tính kháng và tạo giống cây trồng mang tính kháng bền vững, trong đó chỉ thị phân tử simple sequence repeats (SSR) hay microsatellite đang được sử dụng rất phổ biến trong chương trình chọn giống và nghiên cứu di truyền nhờ các đặc tính đồng trội, cho đa hình cao, khả năng tái sử dụng cao(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007)

1.2 Yêu cầu

Thu thập mẫu, đánh giá kiểu hình qua lây nhiễm nhân tạo

Ly trích mẫu lá thu thập, thực hiện phản ứng PCR tối ưu hóa

Chọn lọc mẫu cho đa hình di truyền từ đó phân nhóm các giống có khả năng kháng bệnh héo rũ vi khuẩn

1.3 Nội dung thực hiện

Thu thập các chỉ thị phân tử phù hợp

Xác định, phân nhóm các giống cà chua kháng bệnh với các nòi khác nhau để tạo nguồn nguyên liệu phục vụ công tác chọn giống kháng bệnh héo rũ vi khuẩn

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây cà chua

Cà chua hoang dại có nguồn gốc vùng phía tây Nam Mỹ dọc từ bờ biển và dãy

núi cao Andes, từ trung tâm Ecuador đến Peru, bắc Chile, đảo Galápagos (Rick and

Holle, 1990) Cà chua từ Peru sau khi đến Mehico đã lan tỏa khắp thế giới theo 3 hướng

chính: từ Mehico đến Mỹ rồi Châu Âu, từ Mehico đến Tây Ban Nha, các nước Châu

Âu, Châu PhiTrung Đông, từ Mehico đến Phillipine, nước châu Á khác (Esquinas

Alcaza, 1981).Một số nhà nghiên cứu lại cho rằng cà chua được nhập vào Việt Nam từ

thời gian thực dân Pháp chiếm đóng Ngày nay, ở Việt Nam diện tích trồng cà chua

ngày càng tăng lên do cà chua có thể chế biến ra rất nhiều loại sản phẩm và được sử

dụng dưới nhiều phương thức và là loại sản phẩm thông dụng, là cây trồng có nhiều

triển vọng cho xuất khẩu, giúp tăng thu nhập cho nông dân Hơn nữa, cà chua rất dễ

trồng nên có thể trồng trong diện tích nhỏ ở vườn, hàng rào, trồng trong chậu ở ban

công, trồng trong giá thể và trong các dung dịch(Tạ Thị Thu Cúc, 1979).

2.1.1 Giá trị dinh dưỡng

Bởi vì giá trị dinh dưỡng rất phong phú, cà chua không chỉ giúp các hộ nông dân

nâng cao thu nhập, cải thiện đời sống mà còn giúp một phần cải thiện bữa ăn, thỏa mãn

nhu cầu các vitamin thiết yếu và các chất khoáng chủ yếu, tạo rau sạch cho các gia đình

sống trong thành phố

Hình 2.1 Cây cà chua

(www.vegetable – garden – guide.com)

B ảng 2.1 Thành phần hóa học trong 100 g cà chua

Magnesium 17,7 mg Potassium 244,0 mg

Panthothenic Acid 0,33 mg Vitamin B6 (pyridoxine) 0,10 mg Folacin (folic acid) 39,00 mcg Biotin 4,00 mcg Vitamin B12 0

tràng, kích thích sự tiết dịch của dạ dày và lọc máu, khử trùng ruột Nước ép cà chua kích thích gan, giữ dạ dày và ruột trong điều kiện tốt Licopen, thành phần tạo nên màu

đỏ của cà chua giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim Ngoài ra, Licopen là chất chống oxy

hóa tự nhiên có liên quan đến vitamin A, có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư tuyết tiền liệt, chất có khả năng ngừa sự hình thành các gốc tự do gây ung thư

2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây cà chua

Rễ cây: rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn

Rễ có thể ăn sâu từ 1 - 1,5 m, rộng 1,5 - 2,5 m Bộ rễ ăn sâu hay nông, mạnh hay yếu có liên quan đến mức độ phân cành và sinh trưởng của bộ phận trên mặt đất, do đó khi trồng cà chua mà bấm ngọn, tỉa cành, bộ rễ thường ăn nông và hẹp hơn so với điều kiện

trồng tự nhiên

Thân cây: thân cà chua khi còn non thì mềm, nhiều nước, có dịch màu vàng, thân giòn dễ gãy, toàn thân phủ lớp lông mỏng, về sau phía dưới thân dần dần hóa gỗ, nhất là phần sát mặt đất thấy rất rõ Các cành ở vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng khác nhau, thông thường cành mọc ra ở dưới chùm hoa thứ nhất sinh trưởng nhanh và khỏe

Lá ít không những ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của cây mà còn ảnh hưởng đến

chất lượng quả, bởi vì lá ít thường gây ra hiện tượng nứt quả và rám quả

Hoa: hoa mọc thành chùm trên thân, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Sự thụ phấn chéo khó xảy ra vì hoa cà chua tiết ra nhiều tiết tố chứa alkaloid độc nên không hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được Số lượng hoa trên chùm thay

đổi tùy giống và thời tiết, thường từ 5 - 20 hoa

Trái: trái thuộc loại mọng nước, có hình dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài

Vỏ trái có thể nhẵn hay có khía Màu sắc trái thay đổi tùy giống và thời tiết Màu sắc trái là phối hợp giữa màu vỏ trái và thịt trái Quá trình trái chín chia làm 4 thời kì: thời

kì trái xanh, thời kì chín xanh, thời kì chín vàng, thời kì chín đỏ

Hạt: hạt cà chua nhỏ, dẹt, nhọn, ở cuống hạt màu vàng sáng, vàng tối hoặc vàng nhạt, hạt của một số loài phủ lông tơ rất rõ Hạt khô có màu vàng, hạt nằm trong buồng hạt chứa đầy dịch tế bào kiềm hãm sự nảy mầm của hạt, thông thường những giống quả

to chứa số lượng hạt tương đối ít hơn so với giống quả nhỏ Trung bình có 50 - 350 hạt trong trái Hạt chín sớm hơn thịt quả, khi quả chưa chín hoàn toàn thì hạt đã có thể nảy

mầm Sức nảy mầm của hạt có thể giữ 4 - 5 năm trong điều kiện bảo quản đơn giản

2.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất cà chua trong nước

Sản xuất rau ở nước ta những năm gần đây có mức tăng đáng kể về năng suất và sản lượng nhờ sự đóng góp của công tác chuyển đổi cơ cấu cây trồng, khuyến nông, bảo

vệ thực vật, do đó việc sử dụng giống rau đã có vai trò đặc biệt quan trọng Mỗi năm ở Việt Nam sử dụng hết khoảng 8000 tấn hạt giống rau, trong đó hơn một nửa được nhập khẩu, 41% do người dân tự sản xuất và chỉ có 7% là do các công ty giống, các viện, trường trong nước cung cấp

Theo số liệu thống kê năm 2005, diện tích trồng cà chua cả nước là 23566 ha tăng 32% so với năm 2001 (17834 ha) Với năng suất trung bình 19,78 tấn/ha , sản lượng đạt 433234 tấn cũng chỉ đảm bảo cho bình quân đầu người 5,5 kg quả/năm, bằng

35% so với mức trung bình toàn thế giới Năng suất cà chua ở nước ta rất thấp, mới chỉ bằng 62% so với năng suất chung toàn thế giới

Diện tích cà chua hàng năm khoảng 18000 - 20000 ha, 60% được trồng ở các tỉnh phía Nam, tỉnh Lâm Đồng có diện tích trồng cà chua lớn nhất nước từ 6000 - 7000 ha/năm Năng suất cà chua bình quân hiện nay khoảng 20 tấn/ha, nơi đạt cao 40 - 50 tấn như Lâm Đồng, Bắc Giang, Hà Tây, Hải Dương (Trương Quốc Ánh, 2009)

Sản xuất cà chua ở nước ta có một số tồn tại chủ yếu: chưa có bộ giống tốt cho từng vụ trồng, sản xuất còn manh mún, chưa có sản phẩm hàng hoá lớn cho chế biến công nghiệp Quá trình canh tác, thu hái diễn ra hoàn toàn thủ công So với các nước trong khu vực, sản xuất cà chua ở Việt Nam có lợi thế rõ rệt về khí hậu, thời tiết và đất đai, đặc biệt các tỉnh phía Bắc phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của cà chua nếu được đầu tư tốt, năng suất cà chua sẽ rất cao Diện tích cho phát triển cà chua còn rất lớn vì trồng trong vụ Đông, không ảnh hưởng đến 2 vụ lúa nhưng sản phẩm lại là trái vụ so với Trung Quốc, nước có khối lượng cà chua rất lớn ở thế giới (trên 8 triệu tấn/năm)

2.2 2 Tình hình sản xuất cà chua thế giới

Cà chua được xếp vào loại rau có

mức tiêu dùng nhiều đứng thứ 2 trên thế

giới sau khoai tây, được sản xuất ở hầu

hết các nước trên toàn thế giới với hàng

nghìn giống khác nhau Hiện nay, Mỹ là

quốc gia đứng đầu về sản lượng cà chua

với 12,6 triệu tấn chiếm 28,5% sản lượng

toàn cầu và được trồng hầu hết ở bang

California lên đến 12,073 triệu tấn, kế đến

là Trung Quốc với 8,55 triệu tấn, chiếm

20,5 sản lượng toàn cầu, các nước EU5

chiếm 25,3% với sản lượng 10,55 triệu tấn

Các nước sản lượng trên 1 triệu tấn là Thổ

Nhĩ Kỳ 1,8 triệu tấn, Brazil là 1,15triệu

Hình 2.2 Phần trăm sản lượng cà chua ở các nước sản xuất chính (2009) EU5 gồm

Ý, Pháp, Hy Lạp, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha (www.researchingchina.com)

2.3 Bệnh héo rũ trên cà chua

Cà chua là một trong số những cây rau màu quan trọng, được phân bố rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, việc gieo trồng cà chua vẫn gặp nhiều khó khăn, trở ngại Một trong những nguyên nhân làm hạn chế sự phát triển sản xuất và làm giảm năng suất cà chua đó là sâu bệnh hại Ở giai đoạn cây con vườn ươm và giai đoạn trồng ngoài sản xuất cà chua bị rất nhiều loài nấm, vi khuẩn xâm nhiễm, ký sinh gây ra các bệnh hại rễ, thân, lá, quả Trong đó, đáng chú ý là bệnh hại vùng rễ, hại hệ thống bó

mạch phát sinh phát triển gây tác hại nghiêm trọng là héo rũ do vi khuẩn Ralstonia

solanacearum (Nguyễn Văn Viên và Đỗ Tấn Dũng, 2008) Bệnh héo rũ có tên là Southern Wilt (cách gọi ở Mỹ), Bacterial wilt (cách gọi ở Anh), ở Việt Nam là bệnh héo xanh hay héo rũ

Hình 2.3 Vườn cà chua nhiễm bệnh héo rũ vi khuẩn ( http://ias-cnsh.org).

2.3.1 Triệu chứng và nguyên nhân gây bệnh

Triệu chứng bệnh

Cà chua biểu hiện bệnh sau khi vi khuẩn xâm nhập vào cây Ở cây bị bệnh ban ngày lá mất màu nhẵn, bóng, tái xanh, héo cụp xuống Ở giai đoạn cây con thường biểu hiện trên toàn cây, ở giai đoạn cây trưởng thành triệu chứng thường biểu hiện ở lá ngọn trước Ở 1, 2 ngày đầu cây có thể phục hồi lại được lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau

2, 3 ngày lá héo không thể hồi phục lại nữa và toàn cây bị héo rũ rồi chết Cắt ngang đoạn thân cây gần mặt đất ta thấy bó mạch hóa nâu trong điều kiện ẩm độ cao thân cây

bị bệnh dần dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cắt có thể thấy dịch nhờn vi khuẩn tiết ra màu trắng sữa Rễ có màu nâu đen và thối (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001)

Hình 2.4Triệu chứng bệnh (a) dịch vi khuẩn ở thân; (b) rễ, (c) cây, (d) thân

(http://isuagcenter.com)

Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh héo rũ (Bacterial wilt) do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây hại các bộ

phận thân, lá, rễ của cà chua Vi khuẩn có hình gậy, hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở

một đầu, kích thước 0,5 - 1,5 μm vi khuẩn gram âm, tồn tại trong đất thường xuyên gây

bệnh chết héo trên nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây, ớt thuốc lá gây tác hại lớn cho sản xuất Theo đặc tính gây hại vi khuẩn phân chia: nòi và biovar

Dựa trên phạm vi kí chủ chia làm 4 nòi:

Nòi 1: tấn công trên nhiều vùng địa lý, loại cây trồng khác nhau như cà chua, khoai tây, cà tím, ớt, thuốc lá, đậu phộng Chúng thường gây thiệt hại nặng ở vùng ấm

áp, nhiệt đới

Nòi 2: Chủ yếu tấn công cây thuộc họ chuối như chuối tam bội, chuối lá

Nòi 3: Chủ yếu tấn công trên khoai tây Race 3 khác với race 1 vì thường gây hại

ở vùng có nhiệt độ thấp hơn, những vùng ở vĩ độ cao

Nòi 4: Tấn công trên cây dâu tằm ở Trung Quốc

Sự phân chia nòi rất phức tạp do phụ thuộc thành phần cây kí chủ, phạm vi phân

bố của chúng Nòi 1 lưu tồn nhiều năm trong đất, ngược lại nòi 3 thường xu hướng giảm sau vài năm nếu không có khoai tây dại làm ký chủ (Martin và French, 1997)

Biovar : dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hóa khác nhau của các mẫu phân lập, 5 biovar có thể nhân dạng dựa vào khả năng sử dụng và oxi hóa 3 disaccharides (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rượu 6 carbon (dulcitol, mannitol, sorbitol) Thông thường ta có:

và di chuyển ở các bó mạch từ thân đến lá, tiết hợp chất polisaccharids và những protein, độc tố bít các lỗ mạch tắt nghẽn sự vận chuyển nước và chất dinh dưỡng, làm

2.3.2 Đặc điểm phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh

Ảnh hưởng của môi trường: vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ 30 - 370C, nhiệt độ tối thiểu là 100C, tối đa là 410C, nhiệt độ gây chết là 520

C, mẩn cảm môi trường khô hạn

Mật độ trồng cao tỉ lệ bệnh thường cao do tạo một vùng khí hậu thuận lợi cho sự phát sinh phát triển bệnh.Nước là nguồn lây lan chủ yếu của bệnh, phương pháp tưới không đúng là một trong những yếu tố gia tăng tỷ lệ gây hại của bệnh

Nòi: thời gian vi khuẩn tồn lưu trong đất phụ thuộc nhiều yếu tố như ẩm độ, nhiệt

độ, hóa lý đất Bên cạnh đó còn phụ thuộc nòi gây bệnh, nòi 1 thường tồn lưu lâu trong đất, nòi 3 thường giảm sau vài năm do khả năng thích ứng thấp hơn Vi khuẩn có thể tồn lưu trong đất từ 5 - 6 năm, trong cơ thể kí chủ thực vật hoặc trong hạt giống đến 7 tháng, bám dính trên bề mặt hạt chỉ 2 - 7 ngày ( Vũ Triệu Mân và Lương Văn Tề, 1998)

Ảnh hưởng đất đai: địa thế và tính chất đất có ảnh hưởng đến mức độ bệnh vì quan hệ nhiều với chế độ nước, chế độ dinh dưỡng của cà chua Ở đất thịt, đất thấp trũng bệnh thường nặng hơn ở nơi đất cát, đất cao thoát nước Khi trồng luân canh cũng

giảm tác hại bệnh đặc biệt khi luân canh cây lúa nước (Đỗ Tấn Dũng, 2001)

Thời vụ: là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển bệnh, trồng khi mưa nhiều, ẩm độ cao làm gia tăng mức độ bệnh Miền Bắc từ tháng 4 - 10 thường

có nhiệt độ cao và mưa nhiều, gây ngập úng cục bộ, tạo điều kiện cho bệnh phát triển làm giảm năng suất và chất lượng của cà chua vụ thu đông rõ rệt so với vụ đông chính

vụ Trong khi ở miền Nam, bệnh gây thiệt hại lớn vào tháng mùa mưa với nhiệt độ cao phù hợp cho sự phát triển và lây lan của vi khuẩn

Tính chống bệnh của giống cà chua: các giống cà chua trồng ở nước ta có mức

độ nhiễm bệnh khác nhau Một số giống có khả năng chống bệnh héo rũ như Caraibo, Caravel, HW96, AN1, AN2 (Trương Quốc Ánh, 2009)

2.3.3 Biện pháp phòng bệnh

Hiện nay, biện pháp luân canh cây trồng là một biện pháp tốt nhằm giảm thiệt hại

do bệnh héo rũ gây ra (Smith và ctv, 1896) Khi luân canh cà chua với lúa nước thì mức

độ nhiễm bệnh giảm xuống rõ rệt, tỷ lệ bệnh trung bình từ 47% (Võ Cường - Bắc Ninh, 1998) xuống còn 6,9% Kết quả nghiên cứu cho thấy nếu luân canh với cây trồng cạn, với những cây trồng là ký chủ của bệnh thì bệnh thường phát sinh phát triển nhiều và tác hại của bệnh về sau thường nặng

Hai loài vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis và Pseudomonas fluorescens được

sử dụng như là biện pháp sinh học trong phòng trừ tổng hợp bệnh héo rũ hại cà chua Khi nhúng rễ cây con trước khi trồng hoặc đưa vi khuẩn đối kháng vào vùng rễ sau khi trồng, vi khuẩn đối kháng sẽ cạnh tranh, đối kháng, ức chế sự xâm nhiễm gây hại của

Ralstonia solanacearum (Đỗ Tấn Dũng, 2001) Sử dụng chế phẩm V58 chứa vi sinh vật đối kháng trên đồng ruộng cà chua ở Tiền Phong, Mê Linh, Vĩnh Phúc giúp tỷ lệ chết giảm còn 25% so với đối chứng 80%

Trồng cà chua trong nhà kính, nhà lưới cách ly cao, tất cả đều khử trùng loại bỏ

vi khuẩn trước khi đưa vào nhà lưới

Trên thế giới hiện chưa có thuốc đặc hiệu phòng trừ bệnh héo rũ trên cây cà chua, biện pháp hóa học dùng thuốc như kasuran, dithan, rovral gây kháng thuốc, ô nhiễm môi trường và sức khỏe con người nghêm trọng (Ngô Quang Vinh, 2006) Nên nhu cầu giống cà chua kháng bệnh là vấn đề rất được quan tâm

Giống cà chua có thể kháng bệnh ở vùng này nhưng lại nhiễm bệnh ở vùng khác (Hanson và ctv, 1996) Sự đa dạng về tính độc giữa các nòi khác nhau và các yếu tố ngoại cảnh cũng gây sự thay đổi tính kháng bệnh (Hayward, 1991) Vì vậy phải có chương trình chọn giống thích hợp cho từng vùng, việc sử dụng gốc cà tím chống chịu bệnh ghép giống cà chua E203 nhưng vẫn có hạn chế là thời gian vườm ươm dài, không tương hợp giữa gốc ghép và ngọn ghép làm giảm năng suất cà chua ghép Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh héo rũ hết sức cần thiết và là biện pháp ưu việt, trong đó việc áp dụng kỹ thuật ở mức độ phân tử trong chọn giống sẽ rút ngắn thời gian, giảm bớt khó khăn khi phân tích so với sử dụng phương pháp chọn giống cổ truyền

2.4 Nghiên cứu về bệnh héo rũ

2.4.1 Các nghiên cứu trong nước

Công tác chọn tạo giống rau của nước ta trải qua từng giai đoạn đã thay đổi tiến

bộ Từ năm 1968 - 1985 chủ yếu là thu thập, khảo nghiệm và tuyển chọn giống, từ năm

1986 - 1995 tập trung tạo giống thuần (giống cà chua Hồng Lan, CS1), từ năm 1996 -

2000 đã có giống lai F1 đầu tiên (cà chua HT7), từ năm 2001 - 2005, một số giống cà chua F1 đã được tạo ra

Một số nghiên cứu chọn tạo giống trong nước chủ yếu là chọn tạo dòng thuần từ nguồn gen của AVRDC (nguồn tập trung theo hướng chịu nóng, ẩm, phục vụ cho nước

rau giống An Hải, Hải Phòng, chọn từ nguồn nhập của Nhật, từ năm 1974 đến 1988 được công nhận, giống C95, VT3 của Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm, giống

214 chọn tạo từ 1980 đến 1989 được công nhận, giống 7 chọn lọc từ nguồn nhập nội Hungary từ 1973 đến 1988 được công nhận Giống SB2 của viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam chọn lọc từ 1989 đến 1993, giống cà chua phục vụ chế biến PT18 ở Viện Nghiên Cứu Rau Quả Giống được công nhậnlà các giống cà chua lai F1: FM20, FM29, lai số 4, lai số 9 của Viện Nghiên Cứu Rau Quả, HT5, HT7, HT21 của Nguyễn Hồng Minh trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

Bên cạnh các giống cà chua được đưa vào sản xuất trong thời gian qua, tại Viện Nghiên Cứu Rau Quả còn có trên 1000 dòng, giống cà chua đã được xác định có các tính trạng quí: kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, kháng bệnh virus xoăn vàng lá, chất lượng quả tốt Các dòng cà chua này đã được nghiên cứu phân lập thành từng nhóm theo yêu cầu của chọn giống: nhóm cà chua chín sớm, nhóm cà chua có chất lượng cao, nhóm cà chua có đặc điểm nông sinh học phù hợp cho chế biến, nhóm giống cà chua dùng cho ăn tươi, nhóm cà chua dạng quả nhỏ Một số dòng thể hiện tính kháng bệnh héo rũ ngoài đồng ruộng tốt Hàng trăm dòng đã được ứng dụng Công nghệ sinh học để đánh giá đa dạng di truyền, đó là nguồn vật liệu quí giá và là cơ sở dùng để tạo các giống cà chua trong giai đoạn tới

Chọn tạo giống ở nước ta chủ yếu áp dụng việc chọn lai thuần và lai bằng phương pháp truyền thống nên rất lâu và rủi ro, vì vậy đã có một số nghiên cứu lập bản

đồ gene và QTL liên quan đến bệnh đạo ôn, rầy nâu, kháng phèn, chịu mặn, chịu ngập úng, chịu hạn… ở lúa thực hiện tại Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tính kháng bệnh héo rũ ở cây bông được thực hiện tại Viện Di Truyền Nông Nghiệp nhưng chưa

có nghiên cứu nào liên quan đến lập bản đồ gene và QTL hay chọn giống có gene kháng bệnh nhờ chỉ thị phân tử trên cây cà chua (Trương Quốc Ánh, 2009)

2.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Dự án hệ gene họ cà (Solanaceae Genomics Project) được thực hiện với sự hợp tác của nhiều nhà khoa học trên thế giới Dự án là quá trình đọc trình tự những vùng chứa nhiều gene trên cả 12 nhiễm sắc thể cà chua, chiều dài 950 Mbp AND, chứa 59% vùng không giải mã, 28% vùng giải mã, 11% vùng gene nhảy, 2% vùng cơ quan tử ( Y Wang và ctv, 2005), genome cà chua chứa 35.000 gene, độ dài trung bình một gene 6,7 Kbp tương tự như lúa, 12 nhiễm sắc thể được các nước thành viên tham gia giải mã như

Hàn Quốc (nhiễm sắc thể số 2), Trung Quốc (nhiễm sắc thể số 3, 11), Vương Quốc Anh (nhiễm sắc thể số 4), Ấn Độ, Mỹ (nhiễm sắc thể số 5), Hà Lan (nhiễm sắc thể số 6), Pháp (nhiễm sắc thể số 7), Nhật Bản, Mỹ (nhiễm sắc thể số 8), Tây Ban Nha (nhiễm sắc thể số 9), Ý (nhiễm sắc thể số 12) Hiện nay, mới chỉ có Nhật Bản, Mỹ hoàn thành việc giải trình tự nhiễm sắc thể số 8

Hình 2.5 Các nước tham gia dự án giải trình tự hệ gene cà chua

(http://www.sgn.cornell.edu/solanaceae – project)

Hầu hết nguồn gene kháng bệnh của cà chua được tìm thấy ở 8 loài hoang dại, tất

cả đều có thể lai với cà chua trồng Với phương pháp lai tạo giống truyền thống sẽ gặp rất nhiều khó khăn để sử dụng các gene có trong loài hoang dại Các dạng dại thường thiếu các tính trạng cần thiết cho nhu cầu con người, thường cho năng suất thấp, chất lượng quả kém Để hạn chế hàng loạt các gene không cần thiết đi kèm với một số ít gene cần trong quá trình lai tạo, phương pháp lai lại với dạng trồng trọt được sử dụng Nghiên cứu ban đầu tính kháng bệnh héo rũ trên cà chua đã xác định được một số gene kháng (hình 2.6): gene Bw1, Bw5 nằm trên nhiễm sắc thể số 6, gene Bw3 nằm trên nhiễm sắc thể số 10, gene Bw4 trên nhiễm sắc thể số 4, Rrs3 trên NST số 3 vùng TG

388 và TG 515, Bw2 trên NST số 7 vùng CT 266 và TG 183(Majid R Foolad, 2007)

Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng sự kiểm soát tính kháng ở cà chua do nhiều gen kiểm soát, vùng dự đoán QTL nằm trên nhiễm sắc thể số 6 cho tính kháng ổn định

và cho kháng với nhiều nòi Với sự trợ giúp của sinh học phân tử, bản đồ liên kết gene

xác định được chính xác từng gene hay QTL và vị trí của nó trên nhiễm sắc thể Các QTL cần thiết sẽ được đưa vào cây trồng, các tính trạng không cần thiết sẽ loại bỏ nhanh chóng trong quá trình chọn lọc có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS) Trong những năm qua, bản đồ chỉ thị phân tử đã được phát triển cho nhiều loại cây, trong đó

có cây cà chua và đã sử dụng thành công trong lĩnh vực di truyền, chọn giống ứng dụng

Tại Đài Loan, bằng phương pháp PCR với cặp primer PS-IS đặc hiệu với vi khuẩn héo rũ, kết quả phân tích cho thấy dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thu thập trên cà chua, khoai tây, ớt, thuốc lá, cà tím, dâu tây… đều thuộc nòi 1 Phân tích

trên 120 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà chua khắp 5 châu lục

cho thấy vi khuẩn thuộc khu vực Châu Á gồm biovar 3 và 4, khu vực Châu Mỹ bao gồm biovar 1, 2

Bảng 2.2 Gen dự tuyển trên QTL

Chủng Nòi Nguồn Vùng địa lý Tài liệu Vị trí trên QTL

kháng 2 3 4 6 8 10 12 RS145 L285 Thái DaraCaros

+ +

GMI8217 3 H7996 Đảo

Ruadeloupe

Thoquet và ctv (1996)

+ + + +

JT516 3 H7996 Đảo

Ruadeloupe

Carmellevà ctv (2006)

+ + + +

(www sol-symposium2011.com/sci/18-6.pdf)