Những kết quả đã đạt được sau thời gian nghiên cứu: Thực hiện phản ứng RT-LAMP với bộ primer theo nghiên cứu của Chen Qin 2007 chẩn đoán được vi-rút PRRS từ các mẫu vi-rút vaccine PRRS v
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
HIHI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-LAMP PHÁT HIỆN VI-RÚT PRRS (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS) GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO
Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : ĐINH QUỐC THƯỢNG Niên khóa : 2007 - 2011
Tháng 7/2011
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
HIHI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-LAMP PHÁT HIỆN VI-RÚT PRRS (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS) GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO
KS VÕ KHÁNH HƯNG
Tháng 7/2011
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải và
KS Võ Khánh Hưng đã hết lòng hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp
Tôi xin chân thành cảm ơn:
¾ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã dạy kiến thức hay và tác phong làm việc tốt cho tôi trong suốt 4 năm học
¾ Tập thể cán bộ và quý Thầy - Cô viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập
¾ Cô chủ nhiệm Biện Thị Lan Thanh và cô Lê Hồng Thủy Tiên đã cung cấp thông tin trong suốt quá trình thực tập của tôi
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến:
¾ Anh Nguyễn Phan Thành và chị Ngô Thị Tú Trinh đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực tập tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
¾ Các bạn trong nhóm nghiên cứu đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài
¾ Tập thể lớp DH07SH đã cùng học tập trong suốt 4 năm học qua
Con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình anh trai và em đã luôn yêu thương, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để con có thể học tập, nghiên cứu
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 07, năm 2011
Đinh Quốc Thượng
Trang 4Những kết quả đã đạt được sau thời gian nghiên cứu:
Thực hiện phản ứng RT-LAMP với bộ primer theo nghiên cứu của Chen Qin (2007) chẩn đoán được vi-rút PRRS từ các mẫu vi-rút vaccine PRRS và đặc hiệu cho
cả hai dòng vi-rút PRRS châu Âu và Bắc Mỹ
Phương pháp RT-LAMP có độ nhạy cao với ngưỡng phát hiện là 10-1 copies/µl Ngưỡng này nhạy hơn phương pháp RT-PCR 100 lần (RT-PCR có ngưỡng phát hiện
là 101 copies/µl
Khảo sát trên các mẫu vi-rút PRRS thực địa, phương pháp RT-LAMP cho kết quả nhạy hơn RT-PCR khi phát hiện được 19/23 mẫu dương tính (so với 18/23)
Trang 5SUMMARY
Recently, the Vietnamese pig livestock industry has been influenced by infection diseases Especially, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) which caused by PRRS virus is detrimental for economy There are some current methods are expensive and spend long times for reactions RT-LAMP is quicker, more economic and simple than previous methods Therefore, the study “Using RT-LAMP method for detecting PRRS virus” was carried out to help control PRRS more efficiently
The thesis indicated the optimum condition for RT-LAMP reactions, confirmed the specificity and sensibility of RT-LAMP in PRRS virus detection
These results were achieved:
RT-LAMP detected PRRS virus in serums that were positive in RT-PCR The optimum temperature was 650C in 40 minutes RT-LAMP with primer set based on research of Chen Qin et al (2007) is specific for PRRS RT-LAMP could detect both strains of PRRS virus (European and North American PRRS virus strains)
The sensibility of RT-LAMP method was very high The limit range of the detection was 10-1 copies/µl The RT-LAMP was as much higher sensible 100 times as RT-PCR (the limit range of detection was 101 copies/µl)
LAMP was sensible as much as PCR in detection PRRS virus LAMP detected 19/23 possitive samples while 18/23 were positive with RT-PCR
RT-Key words: RT-LAMP method, PRRS virus detection
Trang 6MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
SUMMARY iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH x
Chương 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích-yêu cầu 2
1.2.1 Mục đích 2
1.2.2 Yêu cầu 2
1.3 Nội dung thực hiện 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) 3
2.2 Vi-rút PRRS: đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại 3
2.2.1 Đặc điểm hình thái của vi-rút PRRS 3
2.2.2 Tổ chức bộ gene của vi-rút PRRS 4
2.2.3 Chủng loại và phân bố của vi-rút PRRS 6
2.3 Một số phương pháp chẩn đoán vi-rút PRRS 7
2.4 Phương pháp RT-LAMP 7
2.4.1 Khái niệm phương pháp RT-LAMP 7
2.4.2 Thành phần phản ứng RT-LAMP 8
2.4.3 Thiết kế primer RT-LAMP phát hiện vi-rút PRRS 8
2.4.4.Nguyên tắc hoạt động phản ứng RT-LAMP 9
2.4.5 Sản phẩm và tính đặc hiệu của phản ứng RT-LAMP 11
2.4.6 Nhận biết kết quả phản ứng RT-LAMP 11
2.5 Một số nghiên cứu liên quan 11
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11
Trang 72.5.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 12
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1 Thời gian và địa điểm 14
3.2 Nội dung nghiên cứu 14
3.3 Vật liệu và hóa chất 14
3.3.1 Vật liệu 14
3.3.2 Hóa chất 14
3.4 Phương pháp tiến hành 16
3.4.1 Thu nhận mẫu 16
3.4.2 Ly trích RNA vi-rút 16
3.4.3 Thực hiện phản ứng RT-PCR 17
3.4.4 Thực hiện phản ứng RT-LAMP trên các mẫu vi-rút vaccine PRRS 19
3.4.4.1 Thực hiện phản ứng RT-LAMP 19
3.4.4.2 Điện di sản phẩm RT-LAMP 21
3.4.4.3.Sản phẩm phản ứng RT-LAMP với thuốc thử SYBR Green 21
3.4.5 Xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp RT-LAMP 21
3.4.5.1 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng RT-LAMP 21
3.4.5.2 Xác định độ nhạy của phương pháp RT-LAMP và so sánh với RT-PCR 23
3.4.6 Khảo sát phương pháp RT-LAMP trên mẫu vi-rút PRRS thực địa 25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
4.1 Xác định các mẫu vaccine nhiễm vi-rút PRRS bằng RT-PCR 26
4.2 Thực hiện phản ứng RT-LAMP với các mẫu vi-rút vaccine PRRS 27
4.3 Khảo sát tính đặc hiệu của phản ứng RT-LAMP 29
4.4 Xác định độ nhạy của phản ứng RT-LAMP 32
4.5 Khảo sát phương pháp RT-LAMP trên mẫu vi-rút PRRS thực địa 35
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36
5.1 Kết luận 36
5.2 Đề nghị 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO 37
Trang 8DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
5’NTR : 5’Nontranslated Region
AMV : Avian Myeloblastosis Virus
BIP : Backward Inner Primer
cDNA : complementary Deoxyribonucleotide Acid
Ctv : cộng tác viên
DNA : Deoxyribonucleotide Acid
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EU : European (Châu Âu)
F primer : Forward primer
FA : Fluorescent Antibody Staining
FIP : Forward Inner Primer
FMDV : Foot Mouth Disease Virus
IFA : Indirect Immunoflourescence Assay
M protein : Membrain protein
N protein : Nuclecapside protein
Nsp : non-structural protein
ORF : Open Reading Frame
PCR : Polymerase Chain Reaction
PCV : Porcine Circovirus
PPV : Porcine Parvovirus
PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus
PRV : Pseudorabies Virus
R primer : Reverse Primer
RNA : Ribonucleotide acid
RT-LAMP : Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SFV : Swine Flu Virus
TGEV : Replication of Transmissible Gastroenteritis Coronavirus
Tp.HCM : thành phố Hồ Chí Minh
US : United States (châu Mỹ)
UTR : Untranslate Region
Trang 9DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Vai trò của các protein cấu trúc của vi-rút PRRS 4
Bảng 2.2 Tỷ lệ tương đồng trình tự gene của các dòng vi-rút PRRS 6
Bảng 3.1 Thành phần và nồng độ hóa chất trong phản ứng RT-PCR 18
Bảng 3.2 Quy trình nhiệt của phản ứng RT-PCR đoạn ORF7 18
Bảng 3.3 Thành phần và nồng độ phản ứng RT-LAMP 20
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng cắt với enzyme HeaIII 22
Bảng 3.5 Trình tự nucleotide của các cặp primer dùng cho phản ứng RT-PCR 24
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng RT-PCR theo bộ kit QIAGEN OneStep RT-PCR 24
Bảng 3.7 Quy trình nhiệt theo bộ kit QIAGEN OneStep RT-PCR 24
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện RNA vi-rút PRRS bằng RT-PCR với primer ORF7 35
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát trên mẫu vi-rút PRRS thực địa của RT-LAMP 35
Trang 10DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc của vi-rút PRRS 4
Hình 2.2 Tổ chức bộ gene của vi-rút PRRS 5
Hình 2.3 Sơ đồ phân bố vi-rút PRRS trên thế giới 6
Hình 2.4 Primer trong phương pháp RT-LAMP 9
Hình 2.5 Nguyên tắc hoạt động của phản ứng RT-LAMP 10
Hình 2.6 Sản phẩm RT-LAMP 11
Hình 3.1 Trình tự ORF6 của vi-rút PRRS 19
Hình 3.2 Vị trí cắt của enzyme HeaIII trên ORF6 22
Hình 4.1 Kết quả phản ứng RT-PCR và realtime RT-PCR 26
Hình 4.2 Kết quả thực hiện phản ứng RT-LAMP 28
Hình 4.3 Tính đặc hiệu của phương pháp RT-LAMP 29
Hình 4.4 Kết quả align trình tự acid amin được dịch mã bởi ORF6 30
Hình 4.5 Vị trí cắt của các enzyme trên ORF6 hai vaccine 32
Hình 4.6 Vị trí cắt của enzyme HeaIII vi-rút PRRS 32
Hình 4.7 Độ nhạy của phản ứng RT-LAMP 33
Hình 4.8 Độ nhạy của phản ứng RT-PCR 34
Trang 11
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Chăn nuôi heo là một trong những ngành nông nghiệp mũi nhọn của nước ta với
tỷ trọng 60% giá trị sản xuất toàn ngành (Cục chăn nuôi, 2008) Ngành chăn nuôi heo không ngừng phát triển về số lượng lẫn chất lượng nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng trong nước cũng như xuất khẩu
Hiện nay, ngành chăn nuôi heo nước ta đang đối mặt với nhiều khó khăn trong đó dịch bệnh luôn là mối lo ngại hàng đầu Một trong số dịch bệnh nguy hiểm là bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-PRRS) do vi-rút PRRS gây ra Bệnh PRRS diễn biến phức tạp, gây thiệt hại lớn về kinh tế vì đối tượng nhiễm bệnh chủ yếu là heo nái và heo con sau cai sữa Đặc biệt bệnh chưa có thuốc đặc trị nên công tác chẩn đoán sớm bệnh là rất cần thiết để tránh
sự lây lan của bệnh
Trước đây, chẩn đoán lâm sàng bệnh PRRS thường không chính xác vì thời gian
ủ bệnh dài, khi có triệu chứng rõ ràng thì bệnh đã tiến triển nặng và lây lan trên diện rộng Một số phương pháp chẩn đoán hiện tại như ELISA, FA, IFA, IMPA, nuôi cấy tế bào có nhược điểm phức tạp, hiệu quả không cao và tốn nhiều thời gian Trong những năm gần đây, phương pháp RT-PCR, nested RT-PCR được phát triển để chẩn đoán vi-rút PRRS khá hiệu quả Tuy nhiên hai phương pháp này vẫn khá tốn kém và thời gian thực hiện dài Những phương pháp chẩn đoán trên không đáp ứng được tiêu chuẩn của một phương pháp xét nghiệm cần có trong tình hình dịch bệnh ngày càng có xu hướng xấu tại Việt Nam Để giúp cho công tác phòng chống dịch bệnh PRRS lây lan thì cần
có một phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả hơn
Phương pháp RT-LAMP là một phương pháp chẩn đoán đơn giản, chính xác, nhạy cùng với đó là chi phí thấp và thời gian thực hiện nhanh Phương pháp này vẫn chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều tại Việt Nam Do đó, đề tài “Ứng dụng phương pháp RT-LAMP chẩn đoán vi-rút PRRS gây rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” được thực hiện nhằm giúp công tác phòng chống dịch bệnh nguy hiểm này tại Việt Nam được hiệu quả và tiết kiệm hơn
Trang 121.2 Mục đích-yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Chuẩn hóa quy trình thực hiện phản ứng RT-LAMP trên mẫu vi-rút vaccine PRRS
và mẫu nghi nhiễm vi-rút PRRS trên thực địa
1.2.2 Yêu cầu
Thực hiện phản ứng RT-LAMP trên các mẫu vi-rút vaccine PRRS dòng châu Âu
và Bắc Mỹ đã xét nghiệm bằng phản ứng RT-PCR
Xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp RT-LAMP
So sánh kết quả xét nghiệm trên mẫu vi-rút PRRS thực địa giữa phương pháp LAMP và RT-PCR tại: Đồng Nai, Bình Dương và thành phố Hồ Chí Minh
RT-1.3 Nội dung thực hiện
Thực hiện phản ứng RT-PCR xác định mẫu vi-rút vaccine PRRS làm nguyên liệu cho nghiên cứu
Thực hiện phản ứng RT-LAMP trên mẫu vi-rút vaccine PRRS ở trên
Xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng RT-LAMP So sánh độ nhạy của phương pháp RT-LAMP và RT-PCR
Đánh giá phương pháp RT-LAMP trên mẫu vi-rút PRRS thực địa thu được tại Đồng Nai, Bình Dương và thành phố Hồ Chí Minh
Trang 13Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (Porcine Reductive and Respiratory Syndrome-PRRS) được ghi nhận lần đầu tại Mỹ năm 1987 Và rất nhanh chóng, bệnh lây sang nhiều nước trên thế giới như : Canada năm 1988, châu Âu năm 1990, châu Á năm 1988 (William và ctv, 1994; Zimmerman, 2003) Bệnh được xác định do một loại
vi-rút thuộc họ Arteriviridae có khả năng xâm nhiễm vào đại thực bào và mô
Tại Việt Nam bệnh được phát hiện năm 1997 trên đàn heo giống nhập về từ Mỹ, trong đó có 10/51 mẫu huyết thanh dương tính với vi-rút PRRS Bệnh thực sự trở nên nguy hiểm và gây thiệt hại lớn về kinh tế ở nước ta vào tháng 3/2007 khi có tới 31.750 lợn bị mắc bệnh, 7.296 lợn bị chết ở 7 tỉnh miền Bắc Từ đó bệnh trở nên phổ biến và lan rộng trên khắp các vùng miền trên cả nước (Phòng Dịch Tễ – Cục Thú y, 2007)
2.2 Vi-rút PRRS: đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại
2.2.1 Đặc điểm hình thái của vi-rút PRRS
PRRS do Arterivirus gây nên – loại vi-rút này được phân lập và xác định loại vào năm 1991, được xếp vào loài Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus, gần với Equine Arteritis virus (EAV), Lactic Dehydrogenase virus (LDHV) và Simian
Hemorrhagic Fever virus (SHFV) (Dea và ctv, 2000) Vi-rút PRRS là vi-rút hình cầu với đường kính của virion vào khoảng 45 - 55nm, nucleocapsid có đường kính khoảng
30 - 35 nm Đây là vi-rút RNA với bộ gene là RNA mạch đơn có những đặc điểm
chung với nhóm Arteriviridae Sợi RNA này có kích thước khoảng 15 kilobase, có 9
khung đọc mở ORF (open reading frame) mã hóa cho 9 protein cấu trúc
Trang 14Hình 2.1 Cấu trúc của vi-rút PRRS (http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-virus
PRRS-structure.asp)
Vi-rút PRRS có 6 protein chính có khả năng bị trung hòa bởi kháng thể gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 protein màng (M) và 1 protein vỏ vi-rút (N) Những protein có kích thước khoảng 45,31 và 25 kD bị trung hòa kháng thể mạnh (bảng 2.1)
Bảng 2.1 Vai trò của các protein cấu trúc của vi-rút PRRS
(Yan-Jun Zhou và ctv, 2005)
2.2.2 Tổ chức bộ gene của vi-rút PRRS
Bộ gene của vi-rút PRRS là một RNA sợi đơn dương đóng vai trò là gene mã hóa cho các sản phẩm protein vừa có vai trò là RNA thông tin có kích thước khoảng 15,1 -
Trang 1515,5 kb với 9 khung đọc mở (ORF) trong đó có 8 ORF nằm bên sườn hai vùng không dịch mã (untranslate region - UTR) 5’UTR và 3’UTR (hình 2.2)
ORF1 gồm ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 75% của bộ gene và ghi mã protein không cấu trúc, liên quan đến sự nhân bản của vi-rút (Meulenberg và ctv, 1997; Dinten
và ctv, 1999)
Dựa vào những nghiên cứu về Arteritisvirus, cysteine protease (nsp2) và serine
protease (nsp4) giúp phân tách sản phẩm của ORF1ab thành 12 protein không cấu trúc
Sự liên kết chức năng của ORF1b mã hóa cho enzyme sao chép cho protein nsp9 và 10 được nhận biết dựa vào so sánh trình tự (Dal Young Kim, 2007)
7 ORFs nhỏ từ 2 - 7 nằm trên đầu 3’ của genome và mã hóa cho protein cấu trúc Nucleocapsid protein N (ORF7) và protein màng M (ORF6) không phải là glycoprotein Trong khi đó GP2a (ORF 2a), GP3 (ORF3), GP4 (ORF4), GP5 (ORF5)
là các N-glycoprotein
Protein được dịch mã từ ORF 2 - 7 được chuyển từ đầu 3’ của một bộ subgenomic mRNAs Subgenomic mRNAs là một trình tự leader gắn với đầu 5’ của genome vi-rút và khởi đầu bởi một cấu trúc dịch mã không liên tục Vùng khởi đầu được gọi là vùng liên kết leader-body và bảo tồn một trình tự gồm 6 nucleotides: UUAACC (Dal Young Kim, 2007)
Hình 2.2 Tổ chức bộ gene của vi-rút PRRS Gene mã hóa enzyme sao chép bao gồm ORF1a
và ORF1b, mã hóa cho polyprotein có kích thước nhỏ được cho là protein không cấu trúc (nsp 1 - 12) Tiếp đến là các ORF 2 - 5 mã hóa cho glycoprotein GP2-GP5; ORF6 mã hóa cho protein màng M; ORF7 mã hóa cho vỏ capsid N Một ORF bên trong ORF2 mã hóa cho 2b Đầu 3’ của subgenomic mRNAs được tổng hợp trong quá trình nhân lên của vi-rút PRRS Đầu 5’ leader gắn với RNA và khởi đầu của subgenomic RNAs Leader TRS (Transcription regulating sequence), body TRS; RFS (Ribosomal frameshifting) (Dal Young Kim, 2007)
Trang 162.2.3 Chủng loại và phân bố của vi-rút PRRS
Hiện nay, theo kết quả phân lập có hai vi-rút PRRS chính là vi-rút PRRS dòng
châu Mỹ (NA) và châu Âu (EU) (Meulenberg và ctv, 1993) Các nghiên cứu phân tử
cho thấy giữa vi-rút gây PRRS tại châu Âu và châu Mỹ chỉ tương đồng 60% về
nguyên liệu di truyền (bộ gene vi-rút) Các kiểm tra huyết thanh học và vi-rút học cho
thấy PRRS cũng đã có mặt tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mỹ, các nước
vùng Caribe (Zimmerman, 2003) Trong những năm gần đây, bệnh đã xuất hiện tại
nhiều địa phương ở nước ta Cũng như các vi-rút khác, vi-rút gây PPRS cũng tạo điều
kiện cho nhiều loại vi khuẩn cư trú trong cơ thể như liên cầu khuẩn (Streptococcus
suis) tăng độc lực và gây bệnh
Bảng 2.2 Tỷ lệ tương đồng trình tự gene của các dòng vi-rút PRRS tại một số quốc gia
Hình 2.3 mô tả sự phân bố giống loài vi-rút PRRS trên thế giới Ở đây có hai kiểu
gene chính là châu Âu và châu Mỹ Sự tương đồng của các dòng phụ thuộc vào chuỗi
trình tự nucleotide và dựa vào cấu trúc protein của chúng Những khác biệt về di
truyền giữa các dòng rút PRRS giúp cho việc chẩn đoán và phân loại các chủng
vi-rút PRRS khác nhau bằng kỹ thuật gene
Trang 172.3 Một số phương pháp chẩn đoán vi-rút PRRS
¾ Chẩn đoán vi-rút PRRS trên môi trường nuôi cấy tế bào
¾ Phương pháp kháng thể huỳnh quang (Fluorescent Antibody Staining - FA)
và hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry staining - IHC)
¾ Kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp (Immunoperoxidase Monolayer Assay IMA)
¾ Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunoflourescence assay – IFA)
¾ Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán vi-rút PRRS: phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại trình tự RNA đích của vi-rút PRRS dưới tác dụng của enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) để tổng hợp cDNA cDNA này sẽ làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại dưới tác dụng của enzyme DNA polymerase
Kỹ thuật RT-PCR có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm ngắn vì thế được dùng rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện vi-rút PRRS Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán vi-rút PRRS có thể dùng kỹ thuật nestesd RT-PCR (RT-nPCR) RT-PCR được thực hiện với các cặp mồi khác nhau cho phép phát hiện gene của các ORF7, ORF6 hay ORF1b của vi-rút PRRS Vi-rút PRRS có 2 dòng: Châu Âu
và châu Mỹ Hai dòng này có độ tương đồng về gene khoảng 52 đến 81% Dựa trên cở
sở đó nhiều cặp primer đã được thiết kế đề phát hiện vi-rút PRRS nói chung và để phân biệt dòng vi-rút PRRS châu Mỹ với châu Âu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Tuy nhiên, hai phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR khá tốn kém và tốn nhiều thời gian để thực hiện phản ứng
2.4 Phương pháp RT-LAMP
2.4.1 Khái niệm RT-LAMP (reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification)
Phương pháp RT-LAMP là phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trình tự RNA Phương pháp này hoạt động dựa trên sự bắt cặp của 4 loại primer vào 6 vị trí đặc biệt trên gene mục tiêu Dưới tác dụng của enzyme reverse transcriptase, cDNA được tổng hợp từ khuôn mẫu RNA có trong mẫu Tiếp theo, DNA polymerase có hoạt tính thay mạch (DNA polymerase bị bất hoạt hoạt tính exo nên có khả năng kéo dài một đoạn DNA rất dài) tổng hợp và kéo dài trình tự DNA mạch đôi trên khuôn mẫu cDNA
Trang 182.4.2 Thành phần phản ứng RT-LAMP
Thành phần và vai trò của chúng trong phản ứng RT-LAMP bao gồm:
+ RNA mẫu: trong mẫu bệnh phẩm có vai trò làm khuôn cho phản ứng RT-LAMP + Buffer (thường là thermopol buffer): tạo môi trường thuận lợi cho enzyme và các thành phần phản ứng khác hoạt động
+ Betain: có vai trò trong việc tách mạch đôi cDNA ở điều kiện nhiệt độ 60 -
650C Bentain làm cho cầu nối hydro trong mạch đôi của cDNA trở nên lỏng lẻo và dễ dàng tách ra ở nhiệt độ thấp 60 - 650C Đây chính là yếu tố giúp phản ứng RT-LAMP
có thể thực hiện được ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn nhiều so với phản ứng PCR thông thường khi nhiệt độ biến tính là khoảng 90 - 950C
+ Mg2+ (thường là MgSO4): giúp cho enzyme hoạt động tốt Ở phản ứng LAMP
và RT-LAMP thường sử dụng MgSO4 vì gốc SO42- sẽ kết hợp với gốc PO32+ ở đầu 5’ của các dNTP được giải phóng ra dung dịch sau phản ứng Khi kết hợp lại chúng tạo ra phức hợp kết tủa (P2(SO4)3) làm cho dung dịch sau phản ứng bị đục và giúp nhận diện phản ứng bằng mắt thường
+ dNTP: nguyên liệu cho quá trình tổng hợp cDNA và DNA trên khuôn mẫu RNA
+ Primer (4 - 6 primer) gồm 2 outer primer (B3, F3), 2 inner primer (FIP và BIP)
và 2 loop primer (LF và LB): thành phần quan trọng giúp phản ứng xảy ra và đặc hiệu cho khuôn mẫu RNA Trong đó FIP và BIP có khả năng đóng vòng (loop) giúp cho phản ứng RT-LAMP xảy ra liên tục và tổng hợp sợi DNA có kích thước lớn
+ Reverse transcriptase enzyme: enzyme giúp tổng hợp cDNA từ khuôn mẫu RNA
+ DNA polymerase có hoạt tính thay mạch (thường là bst polymerase): có nhiệt
độ tối ưu ở 60 - 650C Enzyme này là một enzyme DNA polymerase đã bị khử hoạt tính exo do đó giúp cho phản ứng tổng hợp sợi đôi DNA xảy ra liên tục, kéo dài một đoạn DNA có kích thước lớn
+ Nuclear free water: dung môi giúp cân bằng nồng độ các thành phần phản ứng
2.4.3 Thiết kế primer cho phản ứng RT-LAMP phát hiện vi-rút PRRS
Các dòng vi-rút PRRS châu Âu và châu Mỹ có vùng gene bảo tồn là khung đọc
mở ORF6 Hai dòng vi-rút PRRS có sự tương đồng về gene từ 82 - 98% trên ORF6 Dựa trên cơ sở đó, các primer của phản ứng RT-LAMP được thiết kế dựa vào 6 vị trí đặc hiệu trên ORF6 này cho phép phát hiện được cả hai dòng vi-rút PRRS
Trang 19Một bộ primer trong phản ứng RT-LAMP gồm 4 - 6 primer: outer primer (F3, B3), inner primer (FIP, BIP) và loop primer (LF, LF) Trong đó outer và inner primer giữ vai trò quyết định đến thành công của phản ứng khuếch đại Đầu 5’ của các inner primer được thiết kế sao cho đầu 3’ của chúng có nhiệt độ nóng chảy (Tm) thấp hơn đầu 5’ để đảm bảo sẽ bắt cặp bổ sung với gene đích trước Các outer primer có khả năng bắt cặp với gene đích ở một vị trí nằm ngoài 2 vùng gene thiết kế inner primer Các outer primer sẽ giúp tách các mạch đơn cDNA mới được tổng hợp bởi inner primer Mạch đơn cDNA này có khả năng đóng vòng nhờ vào trình tự bổ sung ở đầu 5’ của các primer inner với gene đích (hình 2.4) Cấu trúc cDNA vòng này là yếu tố giúp phản ứng xảy ra liên tục và tổng hợp được nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau có khi lên đến vài chục kb Các loop primer giúp làm tăng khả năng tạo vòng của cDNA giúp phản ứng nhạy hơn
Hình 2.4 Primer trong phương pháp RT-LAMP F1, F2, F3, B1, B2, B3: các vùng gene dùng để thiết kế primer; F1c, F2c, F3c, B1c, B2c, B3c: các trình tự bổ sung với các vùng gene F1, F2, F3, B1, B2, B3 (Eiken Chemical co.ltd, Japan http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/rt_index.html)
2.4.4 Các bước trong phản ứng RT-LAMP
Bước 1: primer BIP chứa trình tự B2 bổ sung vào mạch RNA ở vị trí B2c
Bước 2: enzyme reverse transcriptase kéo dài sợi DNA mới từ primer BIP tạo nên sợi cDNA
Bước 3: primer B3 bổ sung với sợi RNA tại vị trí B3c và tách sợi DNA mới tổng hợp ở bước 2 bởi primer BIP ra khỏi mạch đôi của cDNA Sợi đơn DNA bị đẩy ra này đóng vòng tại vị trí B1 và B1c Tiếp theo, primer FIP chứa trình tự F2 bổ sung với sợi đơn này tại vị trí F2c
Bước 4: DNA polymerase thực hiện kéo dài sợi DNA mới từ primer FIP
Trang 20Bước 5: primer F3 bổ sung vào F3c và được kéo dài Sợi DNA mới được tổng hợp nhờ primer F3 và enzyme DNA polymerase dẫn đến giải phóng sợi DNA tổng hợp từ primer FIP
Bước 6: sợi đôi DNA được hình thành từ sợi khuôn và primer F3
Bước 7: sợi đơn DNA được tổng hợp từ mồi FIP và khuôn được giải phóng Vì đầu 5’ của sợi này có chứa 2 trình tự bổ sung nhau là F1c và F1 nên hình thành cấu trúc vòng và 2 trình tự B1 và B1c cũng tạo ra cấu trúc vòng Đây là bước quan trọng quyết định thành công của phản ứng RT-LAMP
Bước 8 – 12: các primer FIP, BIP bổ sung với các vị trí F2 và B2 trên cấu trúc DNA vòng ở bước 7 và tổng hợp nên những mạch DNA có kích thước rất khác nhau Kết quả phản ứng RT-LAMP tạo ra một lượng lớn DNA Các sợi DNA này có trình tự lặp lại trình tự của gene mục tiêu
Hình 2.5 Các bước trong phản ứng RT-LAMP
(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/rt_index.html)
Trang 212.4.5 Sản phẩm và tính đặc hiệu của phản ứng RT-LAMP
Sản phẩm của phản ứng RT-LAMP là tập hợp gồm nhiều sợi DNA mạch đôi có kích thước khác nhau từ vài trăm bp đến vài chục kb Các đoạn DNA này lặp lại trình
tự của gene đích.Tính đặc hiệu của phản ứng RT-LAMP phụ thuộc vào các primer Do
bộ primer được thiết kế trên 6 vị trí trên gene mục tiêu nên tính đặc hiệu là rất cao Tính đặc hiệu của phản ứng RT-LAMP được khẳng định với phản ứng cắt với enzyme Do sản phẩm của phản ứng RT-LAMP có sự lặp lại trình tự gene đích nên khi cắt với enzyme sẽ cho các đoạn DNA có kích thước xác định Enzyme cắt được sử
dụng trong nghiên cứu này là enzyme HeaIII Enzyme này có hai vị trí cắt tại vị trí cặp
base thứ 90 và 107 trên ORF6 của vi-rút PRRS Hai vị trí cắt này nằm giữa hai vùng gene dùng để thiết kế primer Sản phẩm của phản ứng cắt dự đoán sẽ có 4 band DNA kích thước 116, 67, 49 và 17 bp Khi sản phẩm cắt có kích thước như dự đoán sẽ
chứng tỏ phản ứng RT-LAMP đã khuếch đại gene đích
2.4.6 Nhận biết kết quả phản ứng RT-LAMP
Kết quả của phản ứng RT-LAMP được xác định bằng điện di sản phẩm trên gel agarose với thuốc nhuộm ethidium bromide hoặc bằng mắt thường với thuốc nhuộm SYBR Green (hình 2.6)
Hình 2.6 Sản phẩm của phản ứng RT-LAMP trên gel điện di và với thuốc nhuộm SYBR
Green A: sản phẩm trên gel điện di; B: sản phẩm với thuốc nhuộm SYBR Green (M): thang
DNA chuẩn; 1: phản ứng dương tính trước khi cắt với enzyme RsaI; 2: sản phẩm sau khi cắt với enzyme RsaI; 1’: phản ứng dương tính với thuốc nhuộm SYBR Green; 3, 3’: đối chứng
Trang 22Trên gel điện di, sản phẩm của phản ứng RT-LAMP hoặc LAMP cho hình ảnh đặc trưng là band DNA với nhiều đoạn DNA kích thước khác nhau và có độ sáng tăng dần khi kích thước sợi DNA càng lớn Khi điện di, đoạn DNA càng dài thì di chuyển chậm và liên kết nhiều với thuốc nhuộm ethidium bromide tạo ra hình ảnh sáng rõ dưới đèn UV tại vị trí gần giếng load mẫu
Khi nhuộm sản phẩm với thuốc thử SYBR Green, phản ứng dương tính làm đổi thuốc thử từ màu cam sang màu xanh lá cây. SYBR Green là một thuốc nhuộm cyanine bất đối xứng được sử dụng như một chất nhuộm acid nucleic trong sinh học phân tử SYBR Green liên kết với DNA hình thành phức hợp DNA-nhuộm hấp thụ ánh sáng màu xanh (λmax = 488 nm) và phát ra ánh sáng màu xanh lá cây (λmax =
522 nm) SYBR Green ưu tiên gắn với DNA sợi đôi, nhưng sẽ vẫn liên kết với DNA sợi đơn nhưng với hiệu suất thấp hơn Nguyên tắc nhuộm của SYBR Green là khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang, số lượng DNA càng nhiều thì lượng huỳnh
quang phát ra càng cao (www.roche-applied-science.com)
2.5 Một số nghiên cứu liên quan
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Albert Rovira và ctv (2008), phát triển phương pháp RT-LAMP để chẩn đoán rút PRRS dòng châu Âu và Bắc Mỹ; kết quả cho thấy độ nhạy của phương pháp này ở mức 102-104TCID 50 và độ nhạy kém hơn so với phương pháp RT – PCR
vi-Kết quả sử dụng RT-LAMP trong chẩn đoán vi-rút PRRS và so sánh với realtime RT-PCR của Changmu Chen và ctv (2009) cho thấy RT-LAMP rất hữu dụng trong việc chẩn đoán vi-rút PRRS
Nghiên cứu của Youjun Feng và ctv (2007) cho thấy có mối liên hệ di truyền giữa dòng vi-rút PRRS tại Việt Nam và dòng vi-rút PRRS tại Trung Quốc, hai dòng này có mối liên hệ di truyền với dòng vi-rút PRRS Bắc Mỹ
Chen Qin và ctv (2007), phát hiện nhanh vi-rút PRRS bằng RT-LAMP Kết quả cho thấy phương pháp RT-LAMP chẩn đoán nhanh vi-rút PRRS và có độ nhạy cao hơn 100 lần so với phương pháp RT-PCR
2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước
Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2007), chẩn đoán vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản
và hô hấp trên heo (PRRS) bằng kỹ thuật RT – PCR, thực hiện với cặp primer Rovira
Trang 231 và Rovira 2 (Rovira, 2000), và cặp primer P1, P2 (Donadeau M, 1999) nhằm phát hiện vi-rút PRRS trong huyết thanh, tinh dịch, mô phổi, mô hạch
Đề tài ứng dụng kỹ thuật nested RT-PCR trong chẩn đoán vi-rút PRRS của Nguyễn Ngọc Hải (2009) cho thấy độ nhạy của phương pháp nested RT-PCR trong phát hiện vi-rút PRRS cao hơn hẳn phương pháp RT-PCR
Trong khi đó, Võ Khánh Hưng (2009), phân tích trình tự gene ORF5 và ORF7 của vi-rút gây rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (vi-rút PRRS) ở một số tỉnh miền namViệt Nam Kết quả cho thấy các dòng vi-rút tại một số tỉnh miền Nam Việt Nam chủ yếu là dòng vi-rút Bắc Mỹ và Trung Quốc
Các nghiên cứu trên đã cho thấy có khả năng chẩn đoán vi-rút PRRS dựa vào những điểm khác nhau về di truyền giữa các chủng Đồng thời cho thấy, việc sử dụng các kỹ thuật gene trong chẩn đoán vi-rút PRRS là rất hiệu quả, cho kết quả tin cậy trong thời gian khá ngắn
Trang 24Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2011 đến tháng 6/2011 tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
3.2 Nội dung nghiên cứu
Thực hiện phương pháp RT-PCR xác định mẫu vi-rút vaccine PRRS
Thực hiện phản ứng RT-LAMP chẩn đoán vi-rút PRRS trên các mẫu vi-rút vaccine PRRS ở trên
Xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp RT-LAMP
So sánh kết quả xét nghiệm giữa hai phương pháp RT-LAMP và RT-PCR trên mẫu vi-rút thực địa thu được tại Đồng Nai, Bình Dương và TP.Hồ Chí Minh
3.3 Vật liệu và hóa chất
3.3.1 Vật liệu
Vật liệu cho đề tài là các mẫu vi-rút vaccine PRRS dòng châu Âu (vaccine Amervac do hãng Hipra - Tây Ban Nha sản xuất), dòng Bắc Mỹ (vaccine Ingelvac do hãng Boehringer Ingelheim VET của Đức sản xuất) đã xác định dương tính bằng phương pháp RT-PCR Các mẫu vi-rút PRRS thực địa đã xét nghiệm bằng phương pháp RT-PCR
Dung dịch chứa RNA vi-rút PRRS (nồng độ 107 copies/µl) ly trích từ mẫu vaccine Amervac
Trang 25+ Dung dịch đệm AVE
+ Carrier RNA (poly A)
- Hóa chất và dụng cụ trong điện di gel TBE:
+ Dung dịch đệm TBE 10 X (Promega)
+ Agarose (Promega)
+ Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 6 X (Promega)
+ Dung dịch ethidium bromide (invitrogen)
+ Thang DNA chuẩn (Promega)
- Hóa chất sử dụng trong phản ứng RT-LAMP là bộ hóa chất RT-LAMP của hãng New England Biolabs gồm:
+ Bộ primer RT-LAMP theo báo cáo của Chen Qin và ctv (2007)
- Hóa chất dùng trong phản ứng RT-PCR là bộ kit QIAGEN OneStep RT-PCR gồm: + QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix
+ QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer, 5 X
+ dNTP Mix
+ RNase-free water
- Hóa chất dùng trong phản ứng enzyme cắt (Promega):
+ RNase free water