PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC HIỆN DIỆN TRÊN TRÉ

PHÂN L ẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHU ẨN LACTIC HIỆN DIỆN TRÊN TRÉ Tác giả ỪNG THỊ MỸ LINH Khóa luận tốt nghiệp được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngà

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHÂN L ẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN

C ỦA VI KHUẨN LACTIC HIỆN DIỆN TRÊN TRÉ

H ọ và tên sinh viên: ỪNG THỊ MỸ LINH

Ngành: BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN NÔNG SẢN THỰC PHẨM

Niên khóa: 2007 – 2011

Tháng 08/2011

PHÂN L ẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA

VI KHU ẨN LACTIC HIỆN DIỆN TRÊN TRÉ

Tác giả

ỪNG THỊ MỸ LINH

Khóa luận tốt nghiệp được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng Kỹ sư ngành Bảo quản và chế biến nông sản thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

TS HỒ THỊ NGUYỆT THU

Tháng 08 năm 2011

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ

Thực phẩm, Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm tp Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến cô Hồ Thị Nguyệt Thu - người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, chỉ bảo, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn cô Vũ Thị Lâm An, cô Nguyễn Minh Hiền đã giúp đỡ và

tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ cho em khi thực hiện đề tài

Và cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn Lê Thị Minh Nguyệt, các bạn lớp DH07BQ, các bạn thực tập tại phòng vi sinh, hóa sinh, kỹ thuật thực phẩm thuộc khoa Công nghệ

Thực phẩm đã chia sẽ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thời gian

thực hiện luận văn

Chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2011

Ừng Thị Mỹ Linh

TÓM T ẮT

Tré là một sản phẩm lên men truyền thống khá phổ biến ở miền trung Việt Nam Đây là một trong hàng trăm món ăn xứ Huế đã được bà Trương Đăng Thị Bích dạy làm món ăn bằng thơ thất ngôn tứ tuyệt Tré có hương vị đặc biệt của nhiều thành phần và gia vị khác nhau trong công thức chế biến Tuy nhiên, sản phẩm này được chế biến theo quy mô thủ công nên vấn đề chất lượng vệ sinh an toàn thực

phẩm vẫn là mối quan tâm lớn của người tiêu dùng

Chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng sinh bacteriocin

của vi khuẩn lactic hiện diện trên tré” với mong muốn cải thiện chất lượng sản

phẩm, định hướng chế biến thành thực phẩm chức năng thông qua việc tìm ra chủng

vi khuẩn lactic có khả năng kháng lại một số chủng vi sinh vật gây bệnh thường gặp

Nghiên cứu được tiến hành trên các mẫu tré vào ngày ăn được của 3 cơ sở sản

xuất (Đông Ba, Bà Đệ và Bình Định) Trong đó, thời điểm khảo sát của tré Đông Ba

là sau 2 ngày lên men, tré Bà Đệ sau 3 ngày lên men và tré Bình Định là 5 ngày

Việc đo pH và đếm tổng lượng vi khuẩn lactic của tré vào ngày lên men, khảo sát các phản ứng sinh hóa và khả năng sinh bacteriocin của những chủng vi khuẩn lactic phân lập đã được thực hiện

Kết quả nghiên cứu cho thấy, giá trị pH của các mẫu tré ở 3 cơ sở khảo sát khác nhau rất có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,001) Trong đó, tré Đông Ba có pH

thấp nhất (4,03 ± 0,03), kế đến là tré Bình Định (4,52 ± 0,04) và cao nhất là tré Bà

Đệ (4,58 ± 0,08)

Vào ngày ăn được của sản phẩm, tổng lượng vi khuẩn lactic trên tré của 3 cơ

sở khảo sát không có sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% Trong đó, tổng lượng vi khuẩn lactic trên tré vào thời điểm khảo sát của 3 cơ sở Đông Ba, Bình Định và Bà Đệ lần lượt là 6,62.108

, 5,6.108 và 5,3.108 CFU/g

Chúng tôi ghi nhận có 5 dạng khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tại 3 cơ sở khảo sát; trong đó, phần lớn là vi khuẩn có hình thái tế bào dạng que chiếm 86,67%, dạng

cầu trực chiếm 10% và dạng cầu chiếm 3,33% (các chủng khảo sát) Cơ sở tré Đông

Ba đa dạng về hình dạng khuẩn lạc nhất (4 dạng), hai cơ sở còn lại đều có

3 dạng Xét về sự phân bố các dạng tế bào, cơ sở tré Bình Định là đa dạng nhất (có

đủ 3 loại hình dạng tế bào), kế đến là cơ sở tré Bà Đệ có 2 dạng và cơ sở tré Đông

Ba chỉ có một dạng (dạng que)

Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng lactic phân lập cho thấy mẫu tré Bình Định có 1 chủng dạng III, tré Đông Ba có 1 chủng dạng IV, tré Bà

Đệ có 1 chủng dạng V là có khả năng kháng lại Staphylococcus aureus spp aureus

CIP 20256 Một chủng dạng IV của cơ sở tré Bình Định cũng ghi nhận được có khả

năng kháng lại Salmonella indiana LMBA

M ỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục v

Danh sách chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Các sản phẩm thịt lên men truyền thống 3

2.2 Quá trình lên men lactic 4

2.2.1 Lên men lactic đồng hình 5

2.2.2 Lên men lactic dị hình 6

2.3 Vi khuẩn lactic 6

2.3.1 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 6

2.3.2 Phân loại vi khuẩn lactic 7

2.3.3 Vai trò của vi khuẩn lactic đối với sức khỏe con người 7

2.3.4 Ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm 8

2.4 Bacteriocin 9

2.4.1 Khái niệm 9

2.4.2 Phân loại 10

2.4.3 Cơ chế hoạt động 11

2.4.4 Lợi ích và hạn chế 12

2.4.4.1 Lợi ích của bacteriocin 12

2.4.4.2 Hạn chế của bactericin 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm 14

3.2 Vật liệu nghiên cứu 14

3.2.1 Nguyên liệu thí nghiệm 14

3.2.2 Môi trường, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 14

3.2.2.1 Môi trường và thuốc thử 14

3.2.2.2 Dụng cụ 15

3.2.2.3 Thiết bị 15

3.3 Nội dung nghiên cứu 15

3.4 Phương pháp nghiên cứu 15

3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên tré 15

3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu 16

3.4.1.2 Đồng nhất mẫu 16

3.4.1.3 Kỹ thuật đo pH 16

3.4.1.4 Pha loãng mẫu và cấy đĩa 17

3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền 17

3.4.2 Định danh sơ bộ bằng các phản ứng sinh hóa 18

3.4.2.1 Nhuộm Gram 18

3.4.2.2 Thử catalase 18

3.4.2.3 Kiểm tra khả năng di động 18

3.4.2.4 Kiểm tra khả năng lên men lactic 18

3.4.2.5 Kiểm tra kiểu lên men 19

3.4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 19

3.4.3.1 Tăng sinh và thu hoạch dịch ly tâm 19

3.4.3.2 Khảo sát sơ bộ khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 20

3.4.3.3 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 20

3.5 Xử lý số liệu 21

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên tré 22

4.1.1 Khảo sát pH của sản phẩm tré vào ngày ăn được 22

4.1.2 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên tré 23

4.2 Tỷ lệ phần trăm các dạng khuẩn lạc 24

4.3 Tính chất sinh hóa của các dạng khuẩn lạc phân lập 28

4.4 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 30

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề nghị 35

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 42

DANH SÁCH CH Ữ VIẾT TẮT

ACE Angiotensin Converting Enzyme

ATCC American Type Culture Collection

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CIP Collection of Institut Pasteur

EMP Embden – Meyerhof – Parnas Pathway

FDP Fructose - 1,6 diphosphate

LMBA Laboratoire de Microbiologie et de Biochimie Appliquée

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Trang

B ảng 4.1: Giá trị pH trên tré của 3 cơ sở khảo sát 22

Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn lactic (CFU/g) trên tré của 3 cơ sở khảo sát 23

Bảng 4.3: Các dạng khuẩn lạc điển hình trên tré của 3 cơ sở khảo sát 24

B ảng 4.4: Phần trăm các dạng khuẩn lạc 27

Bảng 4.5: Đặc tính sinh hóa của các dạng khuẩn lạc phân lập 29

Bảng 4.6: Số lượng và phần trăm các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn sơ bộ 31

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Quá trình lên men lactic theo hai con đường EMP và PKP 5

Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của bacteriocin nhóm I và nhóm II 12

Hình 3.1: Trình tự thao tác pha loãng và định lượng tổng số vi khuẩn lactic trên tré 16

Hình 3.2: Tăng sinh và thu hoạch dịch ly tâm 19

Hình 3.3: Mô tả cách bố trí các giếng và vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin 20

Hình 4.1: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng I 25

Hình 4.2: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng II 25

Hình 4.3: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng III 26

Hình 4.4: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng IV 26

Hình 4.5: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng V 26

Hình 4.6: Vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc dạng IV tré Đông Ba (I.9) đối với Staphylococcus aureus spp aureus CIP 20256 31

Hình 4.7: Vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc dạng III tré Bình Định (III.33) đối với Staphylococcus aureus spp aureus CIP 20256 32

Hình 4.8: Vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc dạng V tré Bà Đệ (II.31) đối với Staphylococcus aureus spp aureus CIP 20256 32

Hình 4.9: Vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc dạng IV tré Bình Định (III.42) đối với Salmonella indiana LMBA 33

128000 ca nhập viện và 3000 người tử vong do ngộ độc thực phẩm Nguyên nhân chủ

yếu là các vi sinh vật gây bệnh phát triển trong thực phẩm như Salmonella,

phẩm phải vừa đảm bảo chất lượng cảm quan vừa bảo quản được lâu mà phải không gây hại đến sức khỏe người tiêu dùng (Jeevaratnam và ctv, 2004) Để đáp ứng nhu cầu trên, hiện tại người ta thường bổ sung các chất bảo quản vào trong thực phẩm

Cùng với sự phát triển của xã hội, trình độ của con người càng được nâng cao

Người tiêu dùng đã nhận thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với sức khỏe và ưa chuộng các loại thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học tổng hợp Xuất phát từ yêu cầu cao về chất lượng của sản phẩm từ phía người tiêu dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về vấn đề an toàn thực phẩm, các nghiên cứu, tìm hiểu về các chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên ngày càng được quan tâm và khuyến khích trong lĩnh vực thực phẩm

Theo xu hướng nghiên cứu trên, một trong những đối tượng được chú ý đó là nhóm vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic, trong quá trình lên men, ngoài việc tạo ra sản

phẩm chính là acid lactic, chúng còn có thể sinh ra một số chất có khả năng kháng khuẩn như hydrogen peroxide, cacbon dioxide, diacetyl, bacteriocin, reuterin, reutericyclin (Ouwehand và Vesterlund, 2004) Đặc tính kháng khuẩn của nhóm vi khuẩn này đã được chứng minh bằng những khám phá các chất kháng khuẩn đặc hiệu

từ những thập niên 40 như diplococcin sinh ra bởi Streptococcus cremoris (Oxford,

1944), nisin sinh ra bởi Lactococcus lactis (Mattick và Hirsch, 1947; trích bởi

Thomas và Delves-Broughton, 2005),… Từ đó trở đi, người ta ngày càng quan tâm hơn đến việc sử dụng vi khuẩn lactic để bảo quản sản phẩm chống lại những vi sinh

vật không mong muốn, đặc biệt là trong các sản phẩm thịt và sữa (Vermeiren và ctv, 2006; Kouakou và ctv, 2009; Alegría và ctv, 2010; Nielsen và ctv, 2010; Hartmann và ctv, 2011)

Đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic hiện

diện trên tré” được thực hiện nhằm tìm ra các chủng vi khuẩn lactic trên sản phẩm tré

có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh Từ đó, có thể sử dụng làm giống

khởi động cho quá trình lên men và cải thiện chất lượng sản phẩm tré cũng như các thực phẩm lên men khác

1.2 Mục đích và yêu cầu

Đề tài được thực hiện với mục đích tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin hiện diện trên tré

Yêu cầu của đề tài:

- Khảo sát pH sản phẩm tré của 3 cơ sở sản xuất vào ngày ăn được

- Phân lập các chủng vi khuẩn lactic có trong 3 loại tré khác nhau vào ngày ăn được của sản phẩm

- Thực hiện một số phản ứng sinh hóa nhằm định danh sơ bộ vi khuẩn lactic

- Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập

Chương 2

T ỔNG QUAN

2.1 Các sản phẩm thịt lên men truyền thống

Thịt là sản phẩm giàu protein đóng vai trò quan trọng trong hầu hết các nền văn hóa ẩm thực và xã hội (Heinz và Hautzinger, 2007) Ở các vùng khác nhau, sự khác biệt về thị hiếu trên hương vị của sản phẩm là khác nhau Chính vì vậy mà các sản

phẩm thịt rất đa dạng, đặc biệt là các sản phẩm thịt lên men

Ở châu Âu, xúc xích lên men tự nhiên là sản phẩm truyền thống có nguồn gốc

từ các nước vùng Địa Trung Hải trong suốt thời kì La Mã Sau đó, sản phẩm này lan

rộng sang Đức, Hungary và một số nước khác như Mỹ, Argentina và Úc Trong đó xúc xích lên men ở vùng phía Bắc có pH thấp hơn 5, còn xúc xích lên men ở vùng Địa Trung Hải được làm khô hơn và có pH trong khoảng 5,3 - 6,2 (Comi và ctv, 2005; Demeyer, 2004; trích bởi Talon và ctv, 2007) Một số xúc xích khô lên men nổi tiếng trên thế giới như salami của Hungari và Ý, chorizo của Tây Ban Nha,… Bên cạnh xúc xích lên men, châu Âu còn có những sản phẩm thịt lên men truyền thống khác, đặc

biệt là món jambon tươi lên men (Parma Ham của Ý, Jamo Serrano của Tây Ban Nha, Black Forest và Guestphalia của Đức) (Heinz và Hautzinger, 2007)

Ở Nam Mỹ, Argentina là quốc gia có nhiều sản phẩm thịt chế biến nhất Một trong những sản phẩm thịt truyền thống của vùng này là salami, ở dạng tươi và có lên men Thành phần chính của sản phẩm gồm 53% thịt heo, 33% thịt bò và 14% mỡ Salami là sản phẩm có quá trình ủ chín nhanh (khoảng 10 ngày), quá trình ủ chín và lên men diễn ra trong phòng lạnh (Heinz và Hautzinger, 2007)

Ở châu Á, các sản phẩm thịt lên men truyền thống tập trung chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á Các sản phẩm thịt lên men sử dụng nguyên liệu chính là thịt heo Philippin nổi tiếng với longanisa là một loại xúc xích lên men không triệt để Trước khi lên men, hổn hợp nguyên liệu được trữ ở nhiệt độ 2 – 4 o

C trong 2 - 3 ngày Sản

phẩm lên men nhờ hệ vi khuẩn lactic tự nhiên có sẵn trên thịt ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn từ 12 đến 24 giờ làm pH của bột thịt giảm từ 6 xuống 5,2 Bên cạnh đó,

sản phẩm nham của Thái Lan cũng khá nổi tiếng với thời gian sử dụng sản phẩm khá dài (khoảng từ 1 đến 2 tháng) Nham có pH khoảng 4,45 - 4,55 sau 7 ngày lên men ở nhiệt độ 25 – 45 oC (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2006)

Ở Việt Nam, khi nói đến sản phẩm thịt lên men người ta luôn nhắc đến nem chua Nem chua là một món ăn chơi và cũng là món ăn khá phổ biến ở vùng Đông Nam Á Thịt heo xay, da heo cắt sợi, muối, tiêu đen, tỏi,… được trộn lẫn và gói trong

lá chuối, tiếp xúc trực tiếp với bột thịt có thể gói thêm lá ổi hay lá chùm ruột để tạo hương vị đặc biệt cho sản phẩm Nem chua được lên men ở nhiệt độ phòng (28 – 30 oC) và ăn được vào khoảng ngày thứ 3 của quá trình lên men Nem chua có

thể bảo quản ở nhiệt độ thường 5 ngày, sau đó phải bảo quản lạnh (Nguyễn Đức Lượng, 2006; Heinz và Hautzinger, 2007) Tré cũng là một sản phẩm lên men từ thịt nhưng ít được nhắc đến như nem chua Tré khá phổ biến ở miền Trung Việt Nam, đặc

biệt là Huế, Đà Nẵng và Bình Định Đây là sản phẩm lên men từ thịt chín Nguyên liệu

sử dụng chủ yếu là thịt đầu heo, có thể dùng thịt ba chỉ (một số cơ sở có bổ sung thịt

bò rim), riềng, tiêu, muối, đường, thính,… Tré thường được gói bằng lá chuối, bên trong có thể gói thêm lá ổi và bao nilon, riêng đối với tré Bình Định người ta còn bó thêm lớp rơm bên ngoài

2.2 Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vào vi sinh

vật Lên men lactic được phân thành hai dạng: lên men đồng hình và lên men dị hình

Sở dĩ tồn tại hai kiểu lên men trên là do sự khác biệt về hệ enzyme có hoặc thiếu một

số enzyme chính của con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) và phosphoketolase (PKP) (Axelsson, 2004) Quá trình lên men chuyển hóa đường thành acid lactic được tóm lược trong Hình 2.1

Hình 2.1: Quá trình lên men lactic theo hai con đường EMP và PKP

(nguồn: Wink, 2007)

2.2.1 Lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men bằng con đường Parnas (EMP) nhờ sự có mặt enzyme FDP aldolase và tạo thành pyruvate Acid pyruvic được chuyển thành acid lactic nhờ enzyme lactate dehydrogenase (LDH) Lactate có hai dạng đồng phân là L và D có thể là sản phẩm của hai enzyme L-LDH và D-LDH khác nhau, cả hai enzyme này đều được tìm thấy có trong hầu hết các

2 phân tử ATP/1 mol hexose Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình như

(Mozzi và ctv, 2010; Axelsson, 2004)

Tùy thuộc vào điều kiện sống như sự thiếu hụt hay dư thừa cacbon trong quá trình chuyển hóa đường mà nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình này có thể tạo thêm các sản phẩm khác như formate, acetate, ethanol, CO2,… (Mozzi và ctv, 2010)

2.2.2 Lên men lactic dị hình

Quá trình lên men dị hình thường diễn ra theo con đường pentose-phosphate (hay còn gọi là con đường phosphoketolase (PKP)) nhờ sự có mặt của enzyme phosphoketolase Quá trình lên men đường pentose tạo ra pyruvate, acetyl-P và sản

phẩm tiếp theo của sự chuyển hóa chính là lactate và acetate Kết quả của quá trình lên men dị hình là 1 mol acid lactic, 1 mol ethanol, 1 mol CO2 và 1 ATP/1 mol hexose Các vi khuẩn lactic lên men dị hình như Leuconostoc, Oenococcus và một số chủng

của nhóm Lactobacillus Nhóm vi khuẩn này cũng có thể chuyển hóa đường hexose

thành lactate, CO2, ethanol,… (Mozzi và ctv, 2010; Axelsson, 2004)

Theo Axelsson (2004), bên cạnh 2 nhóm vi khuẩn lactic trên còn một nhóm trung gian Nhóm vi khuẩn này có cả 2 hệ thống enzyme của quá trình EMP và PKP Chính vì vậy nên chúng lên men đồng hình với cơ chất là đường hexose và lên men dị hình với đường pentose

2.3 Vi khu ẩn lactic

Năm 1872, nhà hóa học Thụy Điển Karl W Scheele lần đầu tiên đã tách được acid lactic trong sữa bò lên men chua (Coley, 2004) Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh được rằng sự hình thành acid lactic trong quá trình lên men sữa có liên quan đến một nhóm vi khuẩn đặc biệt (Koertge và ctv, 2008) Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (Lister, 1878) (hiện

nay gọi là Streptococcus lactis) Từ đó đến nay các nhà khoa học liên tiếp phân lập

được các chủng vi khuẩn lactic khác nhau

2.3.1 Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn lên men từ các loại đường khác nhau, đặc biệt

là khả năng sử dụng đường lactose Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu, lưỡng cầu hoặc hình que; chúng có thể đứng đơn độc hoặc sắp xếp với nhau dạng bắt cặp hoặc dạng chuỗi Đây là nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không có khả năng di động Chúng phân giải nitrat, phản ứng catalase âm và là nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi (Larpent, 1989; trích bởi Mai Huỳnh Cang, 2005)

Vi khuẩn lactic khó nuôi cấy, chúng đòi hỏi môi trường phải có thành phần dinh dưỡng cao Ngoài nguồn cơ chất là carbohydrate, để sinh trưởng và phát triển bình thường thì trong môi trường nuôi cấy cần có tương đối đầy đủ các acid amin, các

hợp chất chứa nitro, một số vitamin B1, B2, B6, PP,… (Lương Đức Phẩm, 2000)

2.3.2 Phân loại vi khuẩn lactic

Theo Axelsson (2004), các vi khuẩn lactic thường phân loại dựa trên hình dáng

tế bào và nhìn chung vi khuẩn lactic chia thành hai nhóm:

- Tế bào hình que: Carnobacterium và Lactobacterium

- Tế bào hình tròn: Aerococcus, Enterococccus, Lactococcus, Vangococcus,

Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus và Weissella

2.3.3 Vai trò c ủa vi khuẩn lactic đối với sức khỏe con người

Theo Luckey (1977), tổng số vi sinh vật trên cơ thể con người khoảng

1013 - 1014 tế bào và con số này lớn hơn tổng số tế bào của cơ thể 10 lần Trên cơ thể con người, nơi tập trung nhiều vi sinh vật nhất là đường tiêu hóa, đường sinh sản và da (Mikelsaar và ctv, 2004) Cũng theo tác giả này, vi sinh vật trên người bao gồm rất nhiều nhóm và chủng khác nhau, có khoảng 500 chủng trong đó có Lactobacillus Các

mẹ và tinh trùng

quan đến việc tạo thành rào cản vi khuẩn, chống lại các vi khuẩn gây bệnh tiềm ẩn và đặc biệt là các bệnh liên quan tới nhiễm trùng đường tiêu hóa (Mikelsaar và ctv, 2004) Ngoài ra, chúng còn có tác dụng giúp cơ thể vật chủ chống dị ứng, chống oxi hóa và giảm cholesterol (Lichtenstein và Goldin, 2004)

Các thí nghiệm cho thấy vi khuẩn lactic có hiệu quả chống đột biến và được ứng dụng trong phòng chống ung thư đại tràng Điều này có thể là do khả năng gắn kết với hetrocylic amin – chất gây ung thư hình thành trong các sản phẩm thịt nấu chín (Wollowski và ctv, 2001) Thử nghiệm trên người cho thấy rằng vi khuẩn lactic cũng

có khả năng chống ung thư bằng cách giảm hoạt động của enzyme β-glucuronidase (Hosoda, 1996)

Một vài thử nghiệm lâm sàng cho thấy khi tiêu thụ sữa lên men với một số chủng vi khuẩn lactic khác nhau có thể giảm huyết áp Người ta cho rằng điều này là

do chất ức chế ACE sinh ra trong quá trình lên men (Sanders, 2000)

Vi khuẩn lactic được cho rằng có tác động có lợi đối với hệ thống miễn dịch của cơ thể, chúng có khả năng c ải thiện chức năng miễn dịch và phòng chống nhiễm trùng của cơ thể Các vi khuẩn lactic chống lại những tác nhân gây bệnh bằng cách ức

chế cạnh tranh và có nhiều bằng chứng cho thấy chúng cải thiện chức năng miễn dịch bằng cách gia tăng số lượng tế bào sản xuất IgA, tăng hoặc cải thiện thực bào cũng như tăng tỷ lệ tế bào lympho T (Reid và ctv, 2003)

Một số tác giả cho rằng trong điều trị nhiễm khuẩn âm đạo như HIV, bệnh lậu ở

phụ nữ, sự gia tăng Lactobacillus trong âm đạo có thể giảm nguy cơ mắc các bệnh

trên Tuy nhiên cần lưu ý rằng chỉ có một số chủng Lactobacillus có thể tồn tại ở âm

đạo (Reid và ctv, 2003)

2.3.4 Ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau mà các chủng vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất và chế biến Khoảng 6000-1000 trước công nguyên, con người đã tạo ra các sản phẩm lên men như bia, bánh mì, rượu, phô mai, bơ, yaourt,…

 Trong ngành công nghệ thực phẩm

 Chế biến các sản phẩm từ sữa như bơ, yaourt, phô mai, nhờ các chủng vi khuẩn lactic như Lb bulgaricus, Streptococcus thermophillus, Lb

 Muối chua rau quả không những nhằm mục đích bảo quản rau quả mà còn tăng giá trị dinh dưỡng và cảm quan nhờ quá trình lên men của các vi khuẩn

như Leuconostoc mesenteroides, Lb brevis, Lb plantarum và Pediococcus

 Sản xuất acid lactic và muối lactate Tùy vào nguyên liệu của quá trình sản

xuất acid lactic và muối lactate khác nhau mà người ta chọn các chủng vi khuẩn khác nhau Một số chủng vi khuẩn thường sử dụng như Lb

Việt Hoa, 2006)

2.4 Bacteriocin

2.4.1 Khái niệm

Colicin là bacteriocin do Escherichia coli sinh ra, được khám phá lần đầu tiên

bởi Gratia vào năm 1925 Dựa vào các đặc điểm của colicin, ban đầu bacteriocin được xác định là một protein kháng khuẩn, có phổ kháng khuẩn rất hẹp, được hấp thụ vào các receptor trên màng tế bào xác định (Jacob và ctv, 1953; trích bởi Hoover và Chen, 2005) Sau đó, việc khám phá ra bacteriocin của vi khuẩn Gram dương đã mở rộng khái niệm bacteriocin Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương không có các receptor trên màng tế bào mục tiêu, có khối lượng phân tử nhỏ hơn colicin, cơ chế hoạt động khác nhau, có phổ kháng khuẩn rộng hơn (Jack, 1995; Jame, 1991; Riley, 1998) Bacteriocin của LAB là phân tử tích điện dương, kỵ nước hoặc lưỡng cực, cấu tạo từ

20 - 60 acid amin (Nes và Holo, 2000)

Theo De Vugst và Vandamme (1994), bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có

bản chất là protein và hoạt động của bacteriocin cho thấy khả năng chống lại một số

chủng có quan hệ gần với chủng sản xuất ra nó (trích bởi Ogunbanwa và ctv, 2003)

Theo Ouwehand và Vesterlund (2004), bacteriocin có quan hệ với các antibiotic nhưng nó khác antibiotic ở một vài đặc điểm sau:

- Bacteriocin do ribosome tổng hợp

- Tế bào chủ miễn dịch với bacteriocin do chúng sinh ra

- Cách thức tác động khác với antibiotic

- Chúng có phổ kháng khuẩn hẹp, thông thường chỉ có tác dụng kháng lại các

vi sinh vật có quan hệ gần với chủng vi khuẩn sinh ra chúng

cấu trúc hóa học, nhóm lantibiotic được chia ra thành 2 nhóm nhỏ: lantibiotic A và lantibiotic B

- Nhóm lantiobitic A: gồm các peptide thuôn dài, tích điện dương Một vài bacteriocin đại diện cho nhóm lantiobitic A như nisin, lactocin S, lacticin 481,…

- Nhóm lantiobitic B: gồm các peptide hình cầu nhỏ hơn, tích điện âm hoặc không tích điện Một vài bacteriocin đại diện cho nhóm lantiobitic B như mersacidin, cinnamycin, ancovenin, duramycin, actagardine,…

2.4.2.2 Nhóm II

Đây là nhóm bacteriocin lớn nhất, nhóm này bao gồm các bacteriocin có khối lượng phân tử nhỏ (< 10 kDa), thông thường nhóm II ổn định nhiệt, không chứa lantionine và có peptide hoạt động màng Có thể nhóm này hoạt động thông qua các phân tử receptor trên màng tế bào mục tiêu Tuy nhiên điều này cần được làm rõ thêm (Ouwehand và Vesterlund, 2004) Nhóm II được chia thành 3 nhóm nhỏ là:

- Nhóm IIa bao gồm các peptide giống pediocin, chúng có đều có dãy các acid amin sau –Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys Nhóm này thu hút được nhiều sự chú ý nhờ khả năng kháng lại Listeria (Ennahar và ctv, 2000) Một

số bacteriocin nhóm IIa như pediocin PA – 1/AcH, sakacin A và P (Hoover

và Chen, 2005)

- Nhóm IIb là nhóm bacteriocin cần có hai peptide cho hoạt động, hai peptide này trình tự các acid amin khác nhau (Cleveland và ctv, 2001) như lactococcin G và M, plantaricin A, S, EF và JK (Hoover và Chen, 2005)

- Nhóm IIc là nhóm bacteriocin kích hoạt bởi thiol và nhân tố sec- điều tiết hoạt động của bacteriocin (Ouwehand và Vesterlund, 2004) như acidocin B, carnobacteriocin A, divergicin A, enterocin P và B (Hoover và Chen, 2005)

2.4.2.3 Nhóm III

Là nhóm bacteriocin có khối lượng phân tử lớn (> 30 kDa), không bền nhiệt nhóm này có thể có những enzyme ngoại bào chống lại các vi khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin Một số bacteriocin thuộc nhóm III như helveticin J và V-1829 (Hoover và Chen, 2005)

Ngoài ra, theo Klaenhammer (1993), bacteriocin còn có nhóm IV là những bacteriocin phức tạp cần thiết có một nửa là carbohydrate hay lipid cho sự hoạt động

của chúng (trích bởi Hoover và Chen, 2005)

2.4.3 Cơ chế hoạt động

Hầu hết các bacteriocin của nhóm LAB tương tác với các lipid tích điện âm và hình thành các lỗ trên màng cytoplasmic của vi khuẩn Gram dương Độ dẫn thông và tính bền của các lỗ này tạo ra bởi nhóm I có thể tăng thêm nhờ sự sắp xếp các phân tử (lipid II, tiền chất peptidoglycan); trong khi đó, đối với nhóm II, các receptor trên màng có mục tiêu hoạt động rõ ràng để xác định đặc tính Nhóm I có thể tạo ra dạng lỗ theo mô hình cái nêm và nhóm II có thể có chức năng tạo các lỗ bằng cách uốn cong tạo dạng thùng chứa tròn hoặc theo cơ chế tấm lót, theo đó peptide định hướng song song với bề mặt của màng và tiếp xúc vào cấu trúc màng (Abee, 1995; Moll và ctv, 1999; Venema và ctv, 1995; trích bởi Hoover và Chen, 2005)

Các bacteriocin thuộc nhóm I có cơ chế hoạt động giống như nisin Nisin được xem như một chất tẩy rửa tích điện dương hoạt động bề mặt, việc hấp thụ qua thành tế bào là cần thiết cho bước phá vỡ màng tế bào, tiếp theo là sự ngừng hoạt động của nhóm sulfhydryl Bruno và ctv (1992) chỉ ra rằng nisin làm mất hoàn toàn động lực

proton cơ bản của Listeria monocytogenes Scott A Các chủng khác của Li

năng màng của tế bào (trích bởi Hoover và Chen, 2005)

Theo Zajdel và ctv (1985), lactostrepcin, las 5 ức chế quá trình sinh tổng hợp AND, ARN và protein Đây có thể là kết quả của sự phá vỡ màng tế bào và thất thoát các chất nội bào (trích bởi Hoover và Chen, 2005)

Có thể thay đổi tính nhạy cảm của tế bào vi khuẩn Gram (-) đối với bacteriocin của một vài chủng Lb plantarum bằng sự chuyển đổi chúng thành những tế bào trần

Sự bất hoạt các vi khuẩn gây bệnh Gram âm bởi bacteriocin của vi khuẩn Gram dương thông thường đòi hỏi phải sử dụng chất nắm bắt (chelating agent) Các chất nắm bắt này giảm bớt sự cản trở của lipopolysacharide (LPS) ngoài màng tế bào (Andersson, 1986; Stevens và ctv, 1991; Shefet và ctv, 1995; Sanell và ctv, 1997; Helander và ctv, 1997; trích bởi Hoover và Chen, 2005)

Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của bacteriocin nhóm I và nhóm II

(nguồn: Cotter và ctv, 2005)

2.4.4 Lợi ích và hạn chế

2.4.4.1 Lợi ích của bacteriocin

Ngày nay, các bacteriocin dần thay thế các chất bảo quản hóa học vì những ưu điểm sau:

 Theo Cleveland và ctv (2001), tính độc của bacteriocin chưa được biết đến còn đối với các antibiotic, sẽ gây ra tính độc nếu sử dụng ở liều lượng cao Bacteriocin được coi là một phụ gia thực phẩm an toàn (Gillor và ctv, 2005)

 Với bản chất là các peptide hay protein nên bacteriocin nhanh chóng bị thoái biến bởi các tác nhân như enzyme, nhiệt độ,… Vì vậy, sẽ không ảnh hưởng đến môi trường

 Bacteriocin chỉ có tác dụng trên những chủng vi khuẩn gần nó cho nên các bacteriocin không ảnh hưởng đến những chủng vi khuẩn có lợi

 Có thể sử dụng kết hợp với các chất bảo quản sinh học khác nhằm đem lại hiệu quả cao trong việc sử dụng như một chất kháng khuẩn (Jeevaratnam và ctv, 2004)

2.4.4.2 H ạn chế của bactericin

Mặc dù được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhưng bacteiocin

vẫn tồn tại những hạn chế như:

 Ít được biết đến như chất bảo quản hóa học

 Có phổ kháng khuẩn hẹp nên chỉ có tác dụng đối với một số vi sinh vật

 Bản chất của bacteriocin là protein nên bị thoái biến nhanh chóng bởi các tác nhân như enzyme, nhiệt, UV,…

 Chi phí cao nếu sử dụng chế phẩm bacteriocin tinh khiết

Chương 3

V ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ ngày 03/05/2011 đến ngày 30/07/2011 tại phòng thí nghiệm vi sinh, phòng hóa sinh và xưởng chế biến thịt cá thuộc khoa Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm, tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Nguyên liệu thí nghiệm

 Dựa trên sự nổi tiếng của thương hiệu trên các phương tiện truyền thông, báo chí, internet chúng tôi đã chọn mua tré tại 3 cơ sở:

- Salmonella indiana LMBA

 Kháng sinh đối chứng: Ofloxacin 200 mg mua tại cửa hiệu thuốc tây

3.2.2 Môi trường, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

3.2.2.1 Môi trường và thuốc thử

 Môi trường MRD (Maximum Recovery Diluent) dùng để pha loãng mẫu

 Môi trường canh và thạch MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) dùng để đếm, phân lập, tăng sinh và giữ giống vi khuẩn lactic

 Môi trường NB (Nutritive Broth, Difco) tăng sinh và giữ giống các chủng vi khuẩn gây bệnh

 Môi trường TSA (Tryptone Soy Agar, Difco) dùng để khảo sát khả năng sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic phân lập

 Môi trường carbohydrate kiểm tra khả năng lên men đường của vi khuẩn

 Thuốc thử Uffelmann là chất chỉ thị để kiểm tra khả năng sinh acid lactic

của vi khuẩn

 Peroxide hydrogen 10%: dùng để thử phản ứng catalase

 Hóa chất sử dụng cho nhuộm Gram (cristal violet, lugol, fuchsine, cồn)

3.2.2.2 D ụng cụ

Đĩa petri bằng nhựa và thủy tinh, ống nghiệm, ống ly tâm, ống eppendorf, pipet, micropipette, que cấy, đèn cồn, cốc đong, bình thủy tinh,…

3.2.2.3 Thi ết bị

Cân điện tử, máy dập mẫu stomacher 400 (Seward, Anh), vortex (Velp, Ý), tủ

cấy vô trùng Class II BSC (ESCO, Mỹ), nồi hấp tiệt trùng MC-30L (ALP, Nhật), tủ

ấm (Memmert, Đức), tủ sấy (Memmert, Đức), tủ lạnh LG, kính hiển vi (Olympus, Nhật), máy đếm khuẩn lạc (Stuart, Anh), máy ly tâm MISTRAL 1000 (MSE, Anh), máy đo pH (Metrohm, Mỹ),…

3.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài thực hiện với các nội dung sau:

 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên tré của 3 cơ sở sản xuất

 Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic bằng một số phản ứng sinh hóa

 Khảo sát khả năng sinh bacterocin của các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập được

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên tré

Trình tự thao tác pha loãng và định lượng tổng số vi khuẩn lactic trên các mẫu tré thử nghiệm được tóm lược trong Hình 3.1

Hình 3.1: Trình tự thao tác pha loãng và định lượng tổng số vi khuẩn lactic trên tré

3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu lặp lại 3 lần từ các lô sản xuất khác nhau của các cơ sở sản xuất được lựa chọn để khảo sát Mẫu lấy được vận chuyển một cách sớm

nhất về phòng thí nghiệm

3.4.1.2 Đồng nhất mẫu

Bao dập mẫu vô trùng, MRD, đèn cồn, dao và mẫu được chuẩn bị sẵn trước khi cân mẫu Sau khi tiệt trùng bề mặt xung quanh cân bằng cồn, dao được vô trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội Làm sạch bề mặt bao bì chứa mẫu bằng

cồn, dùng dao đã tiệt trùng cắt khoảng 10 g mẫu cho vào bao dập mẫu vô trùng và đem cân Kế đến, hút dung dịch MRD cho vào bao dập mẫu theo tỷ lệ trọng lượng

9 MRD/1 tré Mẫu được đồng nhất bởi máy stomacher trong thời gian 4 phút (với vận

tốc trung bình 230 vòng/phút ± 5%) Sau khi đồng nhất, thu được dịch huyền phù mẹ (10-1)

3.4.1.3 Đo pH

Sau khi đồng nhất, dịch huyền phù mẹ được đo pH ngay Đầu dò của máy đo

pH được làm sạch trước khi đo và sau mỗi lần đo Mỗi mẫu được tiến hành đo 3 lần

lặp lại và kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo

3.4.1.4 Pha loãng mẫu và cấy đĩa

Đối với dung dịch huyền phù mẹ (nồng độ 10-1), chúng tôi tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ pha loãng 10-7 Sau đó, dùng micropipette hút 0,1 mL dịch huyền phù cho lên bề mặt đĩa petri MRS thạch Dùng que cấy trang đã tiệt trùng dàn đều dịch cho đến khi bề mặt thạch khô Tiến hành cấy đĩa ở 3 nồng độ liên tiếp 10-5

, 10-6 và 10-7

Mỗi nồng độ pha loãng tiến hành lặp lại 2 lần Mẫu được đem ủ ở 37 o

C trong 72 giờ Lưu ý trong thao tác đổ đĩa và trang luôn được tiến hành bên cạnh ngọn lửa đèn cồn

3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền

N: tổng số tế bào trên 1 g mẫu

C: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa đã chọn

V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào đĩa petri

n1: số lượng đĩa đổ ở nồng độ pha loãng thứ nhất

n2: số lượng đĩa đổ ở nồng độ pha loãng thứ hai

d: nồng độ pha loãng thứ nhất

Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần nên số lượng vi khuẩn của mỗi mẫu được tính theo công thức:

N =𝑁𝑁1 + 𝑁𝑁23 + 𝑁𝑁3 (𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶/𝑔𝑔) Trong đó: N1, N2, N3 lần lượt là số lượng vi khuẩn của lần lặp lại thứ nhất, thứ hai và thứ ba được tính theo công thức trên

Sau khi đếm số lượng khuẩn lạc, việc nhận dạng dạng khuẩn lạc được tiến hành

bằng mắt thường Hình dạng, kích thước và số lượng của mỗi dạng khuẩn lạc được ghi

nhận lại

Đối với mỗi dạng khuẩn lạc ghi nhận, chúng tôi lấy 2 khuẩn lạc đại diện trên

mỗi đĩa đếm và cấy chuyền vào ống eppendorf vô trùng đã chứa sẵn 1 mL môi trường

3.4.2 Định danh sơ bộ bằng các phản ứng sinh hóa

Phản ứng nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase của một số vi sinh vật

hô hấp hiếu khí và kị khí tùy ý Catalase giúp vi sinh vật hiếu khí không bị ngộ độc khi trong môi trường cóH2O2 Sử dụng que cấy vô trùng lấy tâm khuẩn lạc cho lên một lame sạch, sau đó nhỏ một giọt hydrogen peroxide 10% lên trên Phản ứng catalase dương khi xuất hiện bọt khí và ngược lại là catalase âm

3.4.2.3 Kiểm tra khả năng di động

Chuẩn bị những ống nghiệm chứa sẳn 10 mL môi trường MRS thạch mềm (4 g agar/L môi trường) Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy khuẩn lạc và cấy sâu vào trong

thạch Sau khi ủ ở 37 o

C trong 48 giờ, khả năng di động được nhận biết trên đường

cấy: nếu có vi khuẩn mọc loang ra khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động và ngược lại nếu chúng chỉ mọc trong đường cấy thì chúng không có khả năng di động

3.4.2.4 Ki ểm tra khả năng lên men lactic

Các chủng vi khuẩn phân lập được cấy chuyền vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường carbohydrate có bổ sung chất chỉ thị màu bromocresol tía và ủ ở 37 o

C trong 48 giờ Sau đó, trung hòa môi trường trong ống nghiệm bằng NaOH 0,1N để môi trường chuyển sang màu tím, tiếp theo thêm 2 mL dung dịch thuốc thử Uffelmann vào môi trường Sự chuyển màu của môi trường từ tím sang vàng chứng tỏ trong môi trường đó có chứa acid lactic