XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 BẰNG KỸ T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN

STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2

BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Họ và Tên sinh viên: CAO ANH THI Ngành: BQCBNS VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2007 - 2011

Tháng 8/2010

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUẨN PHÁT HIỆN VI KHUẨN

STREPTOCOCCUS SUIS VÀ STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 BẰNG KỸ

THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Tác giả

CAO ANH THI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành

Bảo Quản Chế Biến Nông Sản Và Vi Sinh Thực Phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

Ths Uông Nguyễn Đức Ninh

LỜI CẢM ƠN

 Em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã tạo mọi đều kiện cho

em trong suốt thời gian học tập tại trường

Toàn thể Thầy, Cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã trang bị cho em những kiến thức quý báu

Ban Giám Đốc Viện Pasteur TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện đề tài tốt nghiệp

 Đặc biệt em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến:

Bs Nguyễn Thị Kim Hoàng, Ths Uông Nguyễn Đức Ninh và chị Võ Thị Trang Đài phòng Vi khuẩn hô hấp, Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur TP.HCM đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến chân thành trong suốt thời gian thực hiện báo cáo tốt nghiệp

 Xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ và tất cả những người thân trong gia đình, bạn bè luôn là nguồn động viên, khích lệ to lớn giúp em vượt qua mọi khó khăn trong suốt thời gian qua

TP.HCM, ngày 30 tháng 7 năm 2011

Cao Anh Thi

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Sinh viên thực hiện: Cao Anh Thi, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn: Bs Nguyễn Thị Kim Hoàng, Ths Uông Nguyễn Đức Ninh

Đề tài: “Xây dựng quy trình chuẩn phát hiện Streptococcus suis và

Streptococcus suis type 2 bằng kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR)” được

thực hiện tại phòng xét nghiệm Vi Khuẩn Hô Hấp – Khoa Vi Sinh Miễn Dịch – Viện Pasteur TP.HCM từ tháng 03/2011 đến tháng 07/2011

Đề tài thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 16S-195(s), 16S-489(as) để phát

hiện S.suis Mồi được xây dựng dựa trên gen mã hóa thành phần câu tạo tiểu đơn vị 30S ribosome của S.suis Để phát hiện S.suis type 2, phản ứng PCR sử dụng mồi

cps2JF và cps2JR để khuếch đại một đoạn thuộc gen cps2J mã hóa cho vách tế bào của

S.suis type 2 Bên cạnh đó, đề tài cũng thử nghiệm kỹ thuật Multiplex PCR để tìm S.suis type 2 và so sánh chất lượng DNA được tách chiết bằng bộ kit thương mại và từ

phương pháp tách nhanh theo quy trình của CDC Kết thúc đề tài, chúng tôi có những ghi nhận sau đây:

Phản ứng PCR có tổng thể tích 25 µl với thành phần như sau: 1x PCR Buffer, 2,5 units Taq DNA Polymerase, 200 µM cho mỗi loại dNTP, 0,4 µM 16S-195(s) và 16S-

489(as), 0,26 µg DNA S.suis Đây là quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát hiện S.suis Đối với S.suis type 2, phản ứng chỉ thay đổi dùng 0,26 µg DNA S.suis type 2,

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH SÁCH CÁC BẢNG vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nhiễm Streptococcus suis ở người trên thế giới và Việt Nam 3

2.1.1 Trên thế giới 3

2.1.2 Tại Việt Nam 3

2.2 Tổng quan về Streptococcus suis 4

2.2.1 Hình thể 4

2.2.2 Tính chất nuôi cấy 4

2.2.3 Tính chất sinh hóa 4

2.2.4 Các yếu tố độc lực 5

2.2.5 Cư trú và đường lây truyền 5

2.2.6 Khả năng gây bệnh 6

2.2.6.1 Gây bệnh ở lợn 6

2.2.6.2 Gây bệnh ở người 6

2.2.7 Chẩn đoán vi sinh 7

2.3 Điều trị và dự phòng bệnh liên cầu lợn 8

2.3.1 Điều trị 8

2.3.2 Dự phòng 9

2.3.2.1 Phòng bệnh cho lợn 9

2.3.2.2 Phòng bệnh cho người 9

2.4 Giới thiệu kỹ thuật PCR 9

2.4.1 Lịch sử hình thành 9

2.4.2 Phản ứng PCR 10

2.4.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose 11

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 11

2.4.5 Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR 13

2.4.5.1 Ưu điểm 13

2.4.5.2 Hạn chế 14

2.5 Tổng quan các nghiên cứu về S.suis 14

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 17

3.2 Vật liệu thí nghiệm 17

3.3 Thiết bị và dụng cụ 17

3.4 Môi trường, hóa chất và sinh phẩm 19

3.4.1 Môi trường 19

3.4.2 Hóa chất và sinh phẩm 19

3.5 Nội dung đề tài 20

3.6 Phương pháp nghiên cứu 20

3.6.1 Nuôi cấy 20

3.6.2 Tách chiết DNA 21

3.6.2.1 Tách DNA bằng bộ kit thương mại 21

3.6.2.2 Phương pháp tách DNA nhanh theo quy trình của CDC 21

3.6.3 Quy trình thực hiện phản ứng PCR 22

3.6.4 Xây dựng quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát hiện S.suis 23

3.6.4.1 Khảo sát nồng độ mồi tối ưu 23

3.6.4.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu 23

3.6.4.3 Khảo sát lượng DNA tối ưu 23

3.6.5 Xác định độ đặc hiệu 24

3.6.7 So sánh chất lượng DNA từ hai phương pháp tách chiết 24

3.6.8 Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện S.suis type 2 24

3.6.9 Phản ứng Multiplex PCR phát hiện S.suis type 2 25

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Xây dựng quy trình chuẩn cho phản ứng PCR phát hiện S.suis 26

4.1.1 Khảo sát nồng độ mồi tối ưu 26

4.1.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu 26

4.1.3 Khảo sát lượng DNA tối ưu 27

4.2 Xác định độ đặc hiệu 28

4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection) 29

4.4 Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện S.suis type 2 30

4.5 So sánh chất lượng DNA từ hai phương pháp tách chiết 31

4.6 Phản ứng Multiplex PCR phát hiện S.suis type 2 32

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

S.suis : Streptococcus suis

16S rRNA : 16S Ribosomal ribonucleic acid

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: S.suis sau khi nhuộm Gram trên mẫu bệnh phẩm 4

Hình 2.2: Nuôi cấy S.suis trên thạch máu tạo tiêu huyết α 4

Hình 2.3: Hình ảnh triệu chứng lâm sàng của các bệnh nhân nhiễm liên cầu lợn 7

Hình 2.4: Một chu kỳ phản ứng PCR 10

Hình 2.5: Cấu trúc của phân tử dNTP 12

Hình 2.6: Các mồi dựa trên gen cps của S.suis type 2 15

Hình 2.7: Các mồi sử dụng cho phản ứng PCR phát hiện S.suis type 1 và 9 15

Hình 3.1: Bể ủ nhiệt 18

Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh 18

Hình 3.3: Máy PCR 18

Hình 3.4: Tủ cấy vi sinh 18

Hình 3.5: Máy chụp hình gel 19

Hình 3.6: Máy điện di 19

Hình 4.1: Khảo sát nồng độ mồi tối ưu 26

Hình 4.2: Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu 27

Hình 4.3: Khảo sát lượng DNA tối ưu 27

Hình 4.4: Xác định độ đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện S.suis 28

Hình 4.5: So sánh chất lượng DNA từ hai phương pháp tách chiết 32

Hình 4.6: Xác định độ đặc hiệu cho S.suis type 2 33

Hình 4.7: Phản ứng Multiplex PCR phát hiện S.suis type 2 34

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Streptococcus suis hay còn gọi là liên cầu lợn, gây bệnh thứ phát sau khi lợn bị

một số bệnh khác như bệnh tai xanh, viêm phổi… Liên cầu lợn tồn tại ở lợn bệnh và

cả lợn khỏe mạnh dẫn đến nguy cơ gây bệnh trên người cao Vi khuẩn này có thời gian

ủ bệnh ngắn, bệnh diễn biến nhanh và phức tạp đe dọa tính mạng của bệnh nhân Kể từ khi ca nhiễm liên cầu lợn đầu tiên được phát hiện trên người vào năm 1968 ở Đan

Mạch, đến nay số bệnh nhân ngày càng gia tăng, xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới

Việt Nam là một trong những quốc gia sản xuất và tiêu thụ thịt lợn với số lượng cao, cùng với sự bùng phát dịch lợn tai xanh trong những năm gần đây, dẫn đến sự gia tăng nguy cơ mắc bệnh liên cầu lợn ở người Việc xét nghiệm chẩn đoán nhanh để đưa

ra hướng điều trị thích hợp và kịp thời mang ý nghĩa quan trọng đối với bệnh nhân

nhiễm trùng cấp tính do S.suis S.suis có nhiều type huyết thanh khác nhau nhưng

trong đó type 2 được phân lập từ hầu hết những bệnh nhân nhiễm liên cầu lợn ở nhiều nước trên thế giới Trong đề tài này, chúng tôi xây dựng một quy trình chuẩn phát hiện

Streptococcus suis và Streptococcus suis type 2 bằng kỹ thuật PCR – một ứng dụng

của lĩnh vực sinh học phân tử PCR giúp chẩn đoán nhanh cùng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao làm cho thời gian trả lời kết quả được rút ngắn Ngoài ra, đề tài cũng bước

đầu thử nghiệm tìm S.suis type 2 bằng phản ứng đa mồi

1.2 Mục đích đề tài và mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục đích

Xây dựng quy trình phát hiện Streptococcus suis và Streptococcus suis type 2

bằng kỹ thuật PCR

1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình chuẩn phát hiện Streptococcus suis và S.suis type 2 bằng kỹ

thuật PCR

- Xác định độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện

- So sánh phương pháp tách chiết DNA bằng bộ kit và phương pháp tách DNA nhanh dùng cho liên cầu khuẩn (Fast Extraction of DNA for Streptococcal culture isolates)

- Phát triển kỹ thuật Multiplex PCR để phát hiện S.suis type 2

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nhiễm Streptococcus suis ở người trên thế giới và Việt Nam

2.1.1 Trên thế giới

Tính đến năm 2007, trên toàn thế giới ghi nhận được 409 ca nhiễm S.suis ở

người Các trường hợp người mắc bệnh liên cầu lợn đã được thông báo ở các nước: Hoa Kỳ, Canada, Brazil, Anh, Pháp, Hà Lan, Đan Mạch, Na Uy, Tây Ban Nha, Đức, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và Việt Nam (Wertheim và ctv, 2009) Tại Trung Quốc, 3 vụ dịch nhiễm liên cầu lợn ở người đã xảy ra ở tỉnh Giang Tô vào năm 1998,

1999 và tỉnh Tứ Xuyên năm 2005 Kết quả xét nghiệm cho biết tác nhân gây bệnh chủ

yếu là S.suis type 2.Vụ dịch năm 1998 có 25 ca nhiễm, 14 trường hợp tử vong (Tang

và ctv, 2006) Năm 2005 ghi nhận được 204 trường hợp nhiễm bệnh và có 38 người tử vong (Sriskandan và ctv, 2006; Tang và ctv, 2006)

2.1.2 Tại Việt Nam

Giai đoạn từ năm 1996 đến 1998, mỗi năm chỉ ghi nhận được khoảng 3 bệnh nhân Năm 1999 đến năm 2003, trung bình mỗi năm là 13 trường hợp Trong năm

2004, có 19 trường hợp Tính đến tháng 7 năm 2007, tổng số các bệnh nhân nhiễm

Streptococcus suis vào khoảng 230 trường hợp (Trần Tịnh Hiền và ctv, 2010; Huỳnh

Hồng Quang, 2010) Nghiên cứu thực hiện tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới từ năm 1996

đến năm 2005 về viêm màng não mủ ở người lớn thì S.suis là tác nhân gây bệnh hàng đầu (38,6%), kế đến là Streptococcus pneumoniae (18,4%) (Trần Tịnh Hiền, 2010)

Theo điều tra của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương, chỉ 2 tuần đầu của tháng 5 năm 2011, cả nước đã có 14 trường hợp nhiễm liên cầu lợn Bên cạnh đó, trong một cuộc khảo sát ở các lò mổ tại TP.HCM của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới đã cho thấy

khoảng 10% S.suis type 2 có trong thịt lợn dù đã kiểm dịch S.suis type 2 được tìm

thấy nhiều nhất ở những người mắc bệnh liên cầu lợn tại miền nam Việt Nam (http://www.tienphong.vn/Thoi-Su/538509/Hiem-hoa-mang-ten-lien-cau-lon.html)

2.2 Tổng quan về Streptococcus suis

Về phân loại khoa học, Streptococcus suis được xếp loại vào:

Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Lactobacillales; Họ:

Streptococcaceae; Giống: Streptococcus; Loài: Streptococcus suis

(http://en.wikipedia.org/wiki/Streptococcus_suis)

S.suis thuộc nhóm D theo phân loại của Lancefield (xem phụ lục 1)

2.2.1 Hình thể

Cầu trùng Gram dương, đường kính 1 – 2 µm,

đứng riêng lẻ, xếp đôi hoặc tạo chuỗi ngắn (xem hình

2.1) Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào và

tạo vỏ (capsule) trong cơ thể kí chủ Một số trường

hợp, (dưới ảnh hưởng kháng sinh, đột biến) vi khuẩn

có các dạng giả trực trùng, hình thể bất thường hoặc

đôi khi bắt màu Gram sai (bắt màu Gram âm)

(Nguyễn Thị Kim Hoàng, 2009) Hình 2.1: S.suis sau khi

nhuộm Gram trên mẫu bệnh phẩm (Nguồn: http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/ttyh/bshkhkt/nck1.pdf)

2.2.2 Tính chất nuôi cấy

S.suis là vi khuẩn kị khí tùy ý, phát triển

được trong khoảng nhiệt độ từ 10 – 450C nhưng

tốt nhất là 370

C Nuôi cấy S.suis trên thạch máu,

vi khuẩn tạo khuẩn lạc nhỏ, lồi, tròn, bờ đều,

màu xám hoặc trong, hơi nhầy Trên thạch máu

cừu tạo ra những vùng tan máu không hoàn toàn

(tan máu α), xung quanh khuẩn lạc có màu xanh

Tuy nhiên gây tan máu β (tan máu hoàn toàn)

trên thạch máu ngựa, tạo vòng sáng đường kính Hình 2.2: Nuôi cấy S.suis trên

3 – 4 mm xung quanh khuẩn lạc thạch máu tạo tan máu α

2.2.3 Tính chất sinh hóa (xem phụ lục 3)

- Thử nghiệm catalase âm tính

- Thử nghiệm thủy phân esculin dương tính

- Không phát triển trong môi trường chứa 6,5% NaCl

- Kháng optochin (không có vòng vô khuẩn xung quanh đĩa optochin)

- Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) âm tính

- Sinh acid trong canh thang 1% lactose, trehalose

- Ngưng kết kháng huyết thanh nhóm D (Lancefield)

- Thử nghiệm ADH dương tính

2.3.4 Các yếu tố độc lực

Dựa vào kháng nguyên vỏ cấu trúc polysaccharides, liên cầu lợn được chia thành

35 type huyết thanh Các type được đánh số thứ tự từ 1 đến 34 và type ½

Một số yếu tố độc lực của vi khuẩn đã được ghi nhận, đó là vách vi khuẩn CPS (capsular polysaccharide), protein phóng thích MRP (muramidase related protein), protein ngoài tế bào EF (extracellular factor), haemolysin (suilysin) và adhesin Tuy

nhiên cơ chế sinh bệnh của S.suis vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng

(http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/ttyh/bshkhkt/nck1.pdf) Độc lực vi khuẩn tùy thuộc serotype Không phải tất cả các type đều có khả năng gây bệnh và không phải các chủng của cùng một type gây cùng một thể bệnh lâm sàng (Nguyễn Thị Kim

Hoàng, 2009) Hầu hết nghiên cứu độc lực của S.suis được thực hiện trên type 1, 2, ½,

7, 9 và 14, vì đây là các type gây bệnh cho người thường gặp nhất (Okwumabua và ctv, 2006)

2.3.5 Cư trú và đường lây truyền

Lợn là ký chủ chính của S.suis, tuy nhiên cũng được tìm thấy ở các loài vật khác

như ngựa, chó, mèo, chim Ruồi và chuột được ghi nhận là vật trung gian truyền bệnh cho các đàn lợn (http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/ttyh/bshkhkt/nck1.pdf)

S.suis thường trú ở đường hô hấp trên (amygdales, khoang mũi), và cũng có thể được

tìm thấy ở đường tiêu hoá và sinh dục (Wertheim và ctv, 2009) Vi khuẩn xâm nhập vào các vết thương, vết trầy xước qua đường hô hấp, đường tiêu hóa hay lây nhiễm từ lợn mẹ sang lợn con trong quá trình sinh

S.suis từ lợn bệnh hay lợn mang vi khuẩn nhưng không có triệu chứng đều có thể

lây truyền sang người Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể người thông qua các vết thương, vết trầy xước trên da hoặc niêm mạc mũi, miệng do sự tiếp xúc trực tiếp với lợn, hít phải các hạt khí dung có chứa mầm bệnh lơ lửng trong không khí, hay ăn thịt lợn bệnh

mà chưa được nấu chín kỹ Hiện nay vẫn chưa có báo cáo bệnh liên cầu lợn có thể lây truyền từ người sang người (Wertheim và ctv, 2009; Sriskandan và ctv, 2006)

2.3.6 Khả năng gây bệnh

2.3.6.1 Gây bệnh ở lợn

Tần suất mắc bệnh thường xảy ra ở những quốc gia có mật độ gia súc đông đúc

Tỉ lệ mang liên cầu lợn không triệu chứng trong một đàn lợn khoảng 60% - 100% (TS Trần Đình Bình, 2007) Mặc dù tỉ lệ lợn mang trùng cao nhưng tỉ lệ mắc bệnh thấp, hiếm khi quá 5% và trong một trại chăn nuôi có sự xuất hiện lặp đi lặp lại của những

ca bệnh riêng lẻ thường gặp hơn là xảy ra dịch thật sự (Nguyễn Thị Kim Hoàng, 2009; Wertheim và ctv, 2009)

Bệnh do S.suis gây ra là bệnh thứ phát sau khi lợn bị một bệnh khác như viêm

phổi, viêm màng phổi hoặc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản…Bên cạnh đó, theo Wisselink và ctv (2002) lợn con từ 3 đến 12 tuần tuổi là đối tượng rất dễ mắc bệnh Lợn bệnh có biểu hiện lâm sàng đa dạng: lợn chết mà không có dấu hiệu báo trước (đột tử), viêm màng não, nhiễm trùng huyết, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, sẩy thai, viêm phổi…(http://www.wpro.who.int/media_centre/fact_sheets/fs_20050802.htm)

2.3.6.2 Gây bệnh ở người

Bệnh nhiễm liên cầu lợn ở người được xem là bệnh có yếu tố nghề nghiệp Bệnh thường xảy ra ở những người chăn nuôi lợn, giết mổ lợn, buôn bán, chế biến thịt lợn, bác sĩ thú y Ngoài ra những người có khả năng miễn dịch kém như nhiễm HIV, lao, đái tháo đường, ung thư, cắt lách, nghiện rượu…cũng là đối tượng dễ bị lây nhiễm (Trần Tịnh Hiền, 2010) Theo ghi nhận của Wertheim và ctv (2009) bệnh nhân thường

ở độ tuổi 47 – 55, tỉ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ giới là 3,5:1 đến 6,5:1 Nhiễm S.suis

có thể gây ra những bệnh nguy hiểm, hay gặp nhất là viêm màng não, nhiễm trùng huyết hay hội chứng sốc nhiễm độc Thời gian ủ bệnh kéo dài 1 - 3 ngày, có thể tới 10 ngày (Bộ Y Tế, 2007) Bệnh thường xảy ra vào các tháng nắng nóng trong năm,

thường là từ tháng 3 đến tháng 8 (Nguyễn Thị Hồng Lan, Trần Tịnh Hiền, 2007; Wertheim và ctv, 2009)

Bệnh nhân mắc thể viêm màng não thường có biểu hiện sốt, đau đầu, nôn, có thể

đi vào hôn mê Các biểu hiện lâm sàng bị viêm màng não do S.suis tương tự như các

bệnh nhân mắc bệnh viêm màng não mủ do các vi khuẩn khác.Tỉ lệ rối loạn tri giác là 68,1%, đặc biệt tỉ lệ giảm hay mất thính lực rất cao 51,9% đến 64% (Nguyễn Thị Hồng Lan, Trần Tịnh Hiền, 2007) Những bệnh nhân viêm màng não, nếu phát hiện sớm có thể điều trị kịp thời, nhưng nếu để muộn có thể dẫn đến phù não, tử vong hoặc

để lại các di chứng thần kinh nặng nề như động kinh, ngớ ngẩn…

Bệnh nhân nhiễm trùng huyết sốt cao liên tục, nhanh chóng xuất hiện các tử ban (xuất huyết hoại tử dưới da) Các tử ban này nhanh chóng lan khắp người kèm theo tình trạng choáng, sốc, tụt huyết áp, suy chức năng hô hấp, tuần hoàn, thận, gan và nhanh chóng tử vong

Hình 2.2: Hình ảnh triệu chứng lâm sàng của các bệnh nhân nhiễm liên cầu lợn

(Nguồn: lon.htm;http://quang.health.officelive.com/Documents/9.nhiem%20S.%20suis%20BS

http://dantri.com.vn/c7/s162-434924/co-the-tai-nhiem-benh-lien-cau-khuan-%20LAN.pdf)

2.3.7 Chẩn đoán vi sinh

Sử dụng các mẫu bệnh phẩm khác nhau như máu, dịch não tủy, đàm…để tiến hành xét nghiệm chẩn đoán Kỹ thuật phân lập và định danh vi khuẩn dựa trên các tính chất sinh hóa là chuẩn vàng Do đó, đây vẫn là phương pháp chẩn đoán chủ yếu, được

sử dụng phổ biến hiện nay

Bệnh phẩm Gram (+)

Nuôi cấy trên thạch máu cừu

Catalase – Tan máu α

Streptococci

Thử nghiệm các tính chất sinh hóa API 20Strep (xem phụ lục 6)

Ngưng kết kháng huyết thanh nhóm D Ngưng kết kháng huyết thanh nhóm D

Phương pháp huyết thanh học: có thể dựa vào những kỹ thuật khác nhau, nhưng thông thường là thử nghiệm ELISA dùng kháng nguyên vỏ được tinh chế

Phương pháp miễn dịch học (thử nghiệm tụ Latex)

Thử ngiệm sinh học phân tử: PCR, Multiplex PCR, RT - PCR…

2.3 Điều trị và dự phòng bệnh liên cầu lợn

2.3.1 Điều trị

S.suis dễ bị tiêu diệt bởi các chất sát khuẩn thông thường như chloramin B, nước javel…(Hoàng Văn Năm, 2008) Các chủng S.suis phân lập từ lợn đã kháng lại một số kháng sinh như penicilline, macrolides (erythromycine), lincosamides S.suis gây bệnh

Nhuộm Gram

nhìn chung vẫn còn nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh (Nguyễn Thị Kim Hoàng, 2009) Vì vậy nên sử dụng phối hợp nhiều loại kháng sinh Hiện nay kháng sinh được lựa chọn để điều trị là cephem thế hệ thứ 2 – 3 Khi có kết quả kháng sinh đồ có thể thay đổi thuốc điều trị nếu thấy cần thiết hoặc tùy theo tình huống cụ thể

2.3.2.2 Phòng bệnh cho người

- Không giết mổ, mua, bán thịt lợn không rõ nguồn gốc, thịt lợn bệnh; không ăn thịt lợn chưa nấu chín kỹ

- Nên chọn mua thịt đã qua kiểm định của cơ quan thú y

- Trang bị bảo hộ lao động khi tiếp xúc với lợn, các sản phẩm tươi sống của lợn

Hiện chưa có vaccin phòng bệnh cho người Một vài nước đã nghiên cứu phát triển vaccin để phòng bệnh cho vật nuôi và người như các loại vaccin sản xuất từ vi khuẩn bị làm chết, vi khuẩn còn sống giảm độc lực, vaccin điều chế từ protein của vi khuẩn; tuy nhiên hiệu quả chưa được đánh giá đầy đủ (Nguyễn Thị Kim Hoàng, 2009; http://www.huemed-univ.edu.vn/Upload/vikhuan%20lien%20cau%20lon.pdf)

2.4 Giới thiệu kỹ thuật PCR

2.4.1 Lịch sử hình thành

Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Kỹ thuật phân tích PCR đã được sử dụng phổ biến nhờ 2 bước tiến quan trọng Đó là sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt và máy chu kỳ nhiệt Enzym polymerase chịu

nhiệt được trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth)…Nhiệt độ phản ứng PCR có thể đưa lên cao hay hạ

xuống thấp trong một thời gian rất ngắn trong buồng ủ của máy chu kỳ nhiệt (máy luân nhiệt hay máy PCR)

2.4.2 Phản ứng PCR

PCR cần rất nhiều thành phần Những thành phần chủ yếu là:

+ DNA mẫu (DNA template) chứa đoạn DNA cần khuếch đại

+ Cặp mồi (primer) xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại

+ DNA polymerase xúc tác cho việc nhân lên của DNA

+ dNTP là nguyên liệu để xây dựng DNA mới

+ Dung dịch đệm

Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu

kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi

Hình 2.4: Một chu kỳ phản ứng PCR

(Nguồn: http://i479.photobucket.com/albums/rr159/freeman456/nguyentacPCR.gif)

 Giai đoạn biến tính:

Liên kết hydro bị phá vỡ, DNA biến tính từ mạch đôi thành dạng mạch đơn ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử

 Giai đoạn bắt cặp:

Nhiệt độ được hạ xuống thấp hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của mồi, giúp cho các mồi tìm kiếm và bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA đích

 Giai đoạn kéo dài chuỗi:

Nhiệt độ phản ứng nhanh chóng tăng lên, thích hợp với hoạt động của enzyme

DNA polymerase DNA polymerase sẽ lấy các dNTP từ môi trường phản ứng để gắn

vào đầu 3’ của mồi theo nguyên tắc bổ sung với trình tự DNA đích

2.4.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose

Sau nhiều chu kỳ khuyếch đại (thường từ 30 - 40 chu kỳ) từ một phân tử DNA đích đã tạo ra vô số bản sao (khoảng 106) có kích thước xác định mong muốn

Đệm điện di (Tris acetate EDTA (TAE) hay Tris borate EDTA (TBE)) tạo môi trường có pH ổn định “Loading dye” (chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue

và 0,25% xylencyanol) kéo DNA xuống đáy bản gel để chúng không khuếch tán vào dung dịch đệm điện di (http://cnsh-vn.org/diendan/thread/ky-thuat-pcr-696-1-1.html) Gel agarose được nhuộm với Ethidium bromide, là một chất màu chèn vào DNA và phát sáng khi chịu tác động của tia UV

Sản phẩm PCR trộn với “loading dye” rồi chuyển vào các giếng trên gel agarose đặt trong dung dịch đệm điện di Nguyên tắc điện di dựa trên khả năng tích điện âm của phân tử DNA trong dung dịch đệm điện di Khi chịu tác động bởi điện trường, DNA di chuyển trong gel agarose nhanh hay chậm tùy theo kích thước của chúng Kết thúc quá trình điện di, chụp hình gel dưới tia UV Sản phẩm PCR hiển thị dưới dạng băng vạch sáng tại những vị trí khác nhau tương ứng với chiều dài của chúng

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

 DNA mẫu (DNA Template)

Việc tách chiết DNA phải được coi trọng, đặc biệt trong các phòng thí nghiệm áp dụng PCR để chẩn đoán phát hiện bệnh, tránh trường hợp âm tính giả do không tách chiết được hay gây tổn hại làm đứt gãy DNA

 Enzyme polymerase

Bị phân hủy bởi nhiệt độ cao trong giai đoạn biến tính phân tử DNA Nhờ sử dụng enzym polymerase chịu nhiệt mà phản ứng PCR trở nên đơn giản và đặc hiệu hơn (tăng khả năng bắt cặp chính xác của mồi)

 Mồi (Primer)

Việc thiết kế mồi phải tuân thủ một số nguyên tắc:

+ Có khoảng 18 đến 30 oligonucleotides, bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn DNA đích

+ Chọn mồi đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

+ Trình tự nằm giữa hai mồi không quá lớn Mồi càng ngắn thì quá trình gắn vào khuôn mẫu DNA càng nhanh, tạo thành sợi đôi ổn định trong tổng hợp DNA

+ Trình tự của mồi đƣợc chọn có khoảng 40% - 60% G và C Tránh G và C ở đầu 3’ của mồi vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo ra hiện tƣợng primer-dimers (hai mồi bắt cặp với nhau và tránh sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi) + Nhiệt độ nóng chảy Tm = 4(G+C) + 2(A+T) khoảng 65 - 700C và không cách biệt quá xa giữa hai mồi

Hình 2.5: Cấu trúc của phân tử dNTP