XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC VÀ SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN TRÁI THANH LONG (Hylocereus undatus L.)

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC VÀ SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN TRÁI THANH LONG (Hylocereus undatus L.) Xem nội dung đầy đủ tại: https://123doc.org/document/4971626-pham-quoc-vinh.htm

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC VÀ SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN TRÁI

THANH LONG

(Hylocereus undatus L.)

NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT KHÓA: 2007-2011

SINH VIÊN THỰC HIỆN: PHẠM QUỐC VINH

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08/2011

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC VÀ SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN TRÁI

THANH LONG (Hylocereus undatus L.)

LỜI CẢM ƠN

Thành kính khắc ghi công ơn ông bà, cha mẹ đã suốt đời tận tụy, hy sinh để con

có được ngày hôm nay

Xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm

 Ban chủ nhiệm khoa Nông Học

Xin cảm ơn anh Nguyễn Thành Hiếu cùng toàn thể các anh chị trong phòng Bảo

Vệ Thực Vật của Viện cây ăn quả Miền Nam đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và làm việc tại đây

Cảm ơn bạn bè cùng anh chị em đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài

Tiền Giang, ngày tháng 08 năm 2011

Người thực hiện

Phạm Quốc Vinh

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Xác định tác nhân và khảo sát hiệu lực một số loại thuốc

hoá học trong phòng trừ bệnh thối nhũn trái thanh long (Hylocereus undatus L.)” được

tiến hành tại xã Quơn Long – Chợ Gạo – Tiền Giang và Phòng thí nghiệm Bộ môn

Bảo Vệ Thực Vật – Viện Cây Ăn Quả Miền Nam thuộc ấp Đông, xã Long Định - Châu Thành - Tiền Giang, thời gian từ tháng 2/2011 đến 7/2011

Việc nghiên cứu một số biện pháp phòng trừ thối nhũn đầu trái thanh long nhằm xác định tác nhân gây bệnh và tìm ra biện pháp phòng trừ bệnh một cách có hiệu quả

Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2011 đến tháng 7/2011 tại Tiền Giang Đề tài ghi nhận một số kết quả sau:

Tác nhân gây bệnh: có hai tác nhân xuất hiện với tỷ lệ nhiều nhất là vi khuẩn Vk5 xuất hiện với tần xuất là 68,42% và một loại nấm xuất hiện với tần xuất 70,21% Qua giám định theo tài liệu của Clements (1973) thì nấm phân lập được là nấm

Rhizopus sp

Dựa vào một số đặc trưng về phản ứng sinh hóa và gây thối nhũn khoai tây có

thể kết luận vi khuẩn Vk5 phân lập được thuộc chi vi khuẩn Erwinia sp.(Schaad,

MỤC LỤC Nội dung Trang

TRANG TỰA i

MỤC LỤC ii

TÓM TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT viii

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Giới hạn đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây thanh long 3

2.1.1 Phân loại khoa học cây thanh long 3

2.1.2 Nguồn gốc 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật học 3

2.2 Thành phần bệnh hại trên cây thanh long 5

2.3 Tổng quan về bệnh thối nhũn 7

2.3.1 Triệu chứng bệnh thối nhũn 7

2.3.2 Tác nhân gây ra bệnh thối nhũn 7

2.3.3 Vi khuẩn gây thối nhũn cây trồng Erwinia sp 8

2.3.4 Nấm gây bệnh Rhizopus sp 11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Vật liệu 13

3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

3.2.1 Phân lập, nuôi cấy và xác định tác nhân 13

3.2.2 Kiểm chứng tác nhân thông qua quy trình Koch 14

3.2.4 Phản ứng sinh hóa 15

3.2.4.1 Thí nghiệm khả năng thủy phân tinh bột 15

3.2.3 Thí nghiệm khả năng gây thối nhũn khoai tây 16

3.2.5 Khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học đến khả năng kiểm soát bệnh thối đầu

trái thanh long ở điều kiện in vitro 17

3.2.6 Nghiên cứu hiệu quả quản lý tổng hợp bệnh bằng một số loại thuốc ở điều kiện ngoài đồng 18

3.3.7 Phương pháp thống kê số liệu 19

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Phân lập tác nhân gây bệnh thối trái thanh long 20

4.2 Kết quả chủng Koch ngoài đồng 20

4.3 Kết quả phản ứng sinh hóa 21

4.4 Kết quả thí nghiệm khả năng gây thối nhũn khoai tây 23

4.5 Nhuộm gram, quan sát hình dạng vi khuẩn và nấm 24

4.6 Kết quả khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học đến khả năng kiểm soát bệnh thối đầu trái thanh long ở điều kiện in vitro 25

4.7 Kết quả khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học đến khả năng kiểm soát bệnh thối đầu trái thanh long ở điều kiện ngoài đồng 26

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Đề nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC 31

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long 5

Bảng 2.2: Thành phần bệnh gây hại trên thanh long 6

Bảng 3.1: Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm in vitro 17

Bảng 3.2: Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm ngoài đồng 18

Bảng 4.1: Kết quả phân lập tác nhân gây bệnh thối trái thanh long ở hai tỉnh Long An và Tiền Giang 20

Bảng 4.2: Kết quả chủng Koch vi khuẩn trên bông thanh long 20

Bảng 4.3: Kết quả phản ứng sinh hóa của dòng vi khuẩn 5 21

Bảng 4.4: Hiệu quả một số loại thuốc hóa học đến khả năng kiểm soát bệnh thối đầu trái thanh long trong điều kiện in vitro 25

Bảng 4.5: Mức độ kháng của vi khuẩn đối với từng nghiệm thức 26

Bảng 4.6: Hiệu quả kiểm soát bệnh thối trái sau xử lý thuốc 27

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1: Triệu chứng thối nhũn trái thanh long 7

Hình 4.1: Chủng vi khuẩn Vk5 vào bông búp 21

Hình 4.2: Phản ứng Catalase 22

Hình 4.3: Trước và sau khi nhuộm Lugol 22

Hình 4.4 : Môi trường chứa vi khuẩn và đối chứng 23

Hình 4.5 Chủng vi khuẩn Vk5 vào khoai tây và các dòng đối chứng 23

Hình 4.6: Hình dạng vi khuẩn nhuộm gram 24

Hình 4.7: Bào tử nấm 24

Hình 4.8: Nấm Rhizopus sp 24

Hình 4.9: Bông trước khi phun 26

Hình 4.10: Bông sau khi phun lần 4 26

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cây thanh long (Hylocereus undatus L.), thuộc họ xương rồng, có nguồn gốc ở

vùng Nam Mỹ, được du nhập bởi người Pháp và trồng ở Việt Nam trên 100 năm nay (Peter Lo, 2001) So với các nước khác trong khu vực, Việt Nam hiện nay là nước có diện tích trồng thanh long tương đối tập trung trên qui mô thương mại với diện tích ước lượng 14.000 hecta, phần lớn tập trung tại tỉnh Bình Thuận với khoảng trên 11.000 hecta (Sở Nông Nghiệp và PTNT Bình Thuận, 2009), phần diện tích còn lại được canh tác ở Long An, Tiền Giang và rải rác ở một số nơi khác

Thanh long là cây trồng đặc sản có lợi thế cạnh tranh đứng thứ nhất trong 11 loại trái cây ở nước ta mà Bộ Nông Nghiệp và PTNT đã xác định trong hội nghị trái cây có lợi thế cạnh tranh tại Tp Hồ Chí Minh ngày 7/06/ 2004 Thanh long được xuất khẩu sang nhiều nước như Trung Quốc, các nước Đông Nam Á, châu Âu, gần đây thanh long được xuất cả sang Hoa Kỳ, Nhật Bản, Hàn Quốc và chuẩn bị xuất khẩu sang Úc, Newzealand Thanh long đem lại hiệu quả kinh tế cao và nâng cao thu nhập đáng kể cho nông dân ở các vùng trồng thanh long Đặc biệt thanh long còn góp phần rất lớn trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp và chương trình xóa đói giảm nghèo làm thay đổi bộ mặt nông thôn của các huyện trồng thanh long

Thời gian gần đây, trong thực tế sản xuất đã xuất hiện một loại dịch hại mới gây ảnh hưởng không nhỏ cho cây thanh long, đó là bệnh thối nhũn trái thanh long Tuy chỉ mới xuất hiện nhưng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng trái thanh long và đặc biệt bệnh có chiều hướng lây lan nhanh và rất khó phòng trị Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên và được sự chấp thuận của khoa Nông học, trường Đại

học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, tôi tiến hành đề tài “Xác định tác nhân và khảo sát

hiệu lực một số loại thuốc hoá học trong phòng trừ bệnh thối nhũn trái thanh long (Hylocereus undatus L.)”

1.2 Mục đích

Xác định tác nhân gây bệnh thối trái thanh long và khảo nghiệm một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh

1.3 Yêu cầu

 Xác định và phân lập tác nhân gây bệnh thối nhũn trái

 Khảo nghiệm tìm ra loại thuốc phòng trị bệnh thối nhũn trái hiệu quả

1.4 Giới hạn đề tài

 Thời gian thực hiện: đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2011 đến tháng 07 năm 2011

 Địa điểm thực hiện: Quơn Long – huyện Chợ Gạo – tỉnh Tiền Giang

 Đề tài chỉ thực hiện đánh giá hiệu quả cuả một số loại thuốc bảo vệ thực vật trên diện hẹp ở tỉnh Tiền Giang (Long An)

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây thanh long

2.1.1 Phân loại khoa học cây thanh long

Theo kết quả phân loại khoa học, cây thanh long có tên khoa học là Hylocereus

undatus Haw thuộc:

Họ (familia): Cactaceae

Chi (genus): Hylocereus

Loài (species): H undatus

Tên tiếng Anh: Dragon Fruit

(Nguồn: Nguyễn Văn Kế, 2003)

2.1.3 Đặc điểm thực vật học

Rễ cây: rễ thanh long không mọng nước nên nó không phải là nơi tích trữ nước giúp cây chịu hạn Thanh long có hai loại rễ là: địa sinh và khí sinh Rễ địa sinh phát triển từ phần lồi của gốc hom, sau khi đặt hom từ 10 – 20 ngày thì từ gốc hom xuất hiện các rễ tơ màu trắng, số lượng rễ và kích thước của chúng cũng tăng dần theo tuổi cây, những rễ lớn đạt kích thước từ 1 – 2 cm Rễ địa sinh có nhiệm vụ bám vào đất và hút các chất dinh dưỡng nuôi cây Rễ phân bố chủ yếu ở tầng mặt (0 – 15 cm)

Rễ khí sinh mọc dọc theo thân cây phần trên không, bám vào cây chống nhằm giúp cây leo lên giá đỡ Những rễ khí sinh nằm gần đất sẽ đi dần xuống đất Khi đất khô rễ sợi sẽ chết đi, các rễ lớn hơn sẽ hoá bần làm giảm sự dẫn nước gần 10 lần để ngăn

chặn sự mất nước thông qua rễ khi đất ẩm rễ mọc lại một cách dễ dàng (Phan Kim Hồng Phúc, 2002; Nguyễn Văn Kế, 2003)

Thân, cành: thân chứa nhiều nước có thể chịu hạn trong thời gian dài Cành thường có 3 cánh dẹp, xanh, hiếm khi có 4 cánh Ở các nước khác có thứ 3, 4, 5 cánh Tiết diện ngang cho thấy có 2 phần: bên ngoài là nhu mô chứa diệp lục, bên trong lõi cứng hình trụ Mỗi cánh chia làm nhiều thùy có chiều dài 3 – 4 cm Đáy mỗi thùy có

từ 3 – 5 gai ngắn Chúng sử dụng C02 quang hợp theo hệ CAM (Crassulacean Acid Metabolism) cho các cây mọc ở sa mạc Mỗi năm cây cho từ 3 – 4 đợt cành, đợt cành thứ nhất là cành mẹ của đợt cành thứ 2 và cứ như thế cành sắp sếp thành từng lớp trên đầu trụ Trong mùa ra cành khoảng thời gian giữa hai đợt cành từ 40 – 50 ngày Số lượng cành trên cây tăng theo tuổi cây, cây một tuổi trung bình có khoảng 30 cành, 2 tuổi khoảng 70 cành, 3 tuổi khoảng 100 cành, 4 tuổi khoảng 120 cành, ở cây 5 – 6 tuổi cây chỉ duy trì khoảng 150 – 170 cành (Nguyễn Văn Kế, 2003)

Hoa: thanh long là cây ngày dài Cây ra hoa khi được chiếu sáng đủ Hoa lưỡng tính, rất to có chiều dài trung bình 25 – 35 cm, nhiều lá đài và cánh hoa dính thành ống, nhiều tiểu nhị và một nhụy cái dài 18 – 24 cm, đường kính 5 – 8 mm Hoa thường nở tập trung từ 20 – 23 giờ đêm và đồng loạt trong vườn Từ khi hoa nở đến tàn kéo dài độ 2 – 3 ngày, các đợt nụ đầu tiên rụng từ 30% đến 40% về sau tỉ lệ này giảm dần khi gặp điều kiện thuận lợi

Quả và hạt: sau khi thụ phấn, bầu noãn sẽ phát triển thành quả mọng Trong 10 ngày đầu tốc độ phát triển tương đối chậm, sau đó gia tăng nhanh cả về kích thước lẫn trọng lượng Thời gian từ khi hoa thụ phấn đến khi thu hoạch chỉ từ 25 – 35 ngày Quả thanh long hình bầu dục, có nhiều tai xanh (do phiến hoa còn lại), đầu quả lõm sâu tạo thành “hốc mũi” Khi còn non quả màu xanh, lúc chín chuyển sang màu đỏ đậm (Nguyễn Văn Kế, 1997; Trịnh Thị Cảnh, 1997)

Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long:

Sau một năm trồng thì cây bắt đầu cho trái bói, các năm 3, 4, 5 là những năm

có năng suất cao Nếu cây được chăm sóc tốt, thời tiết thuận lợi sẽ làm năng suất cao

và ổn định nhiều năm (Vũ Công Hậu, 1996; Phan Kim Hồng Phúc, 2002)

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long

Thành Phần Hàm lượng

(mg/100 gr thịt trái) Thành Phần

Hàm lượng (mg/100 gr thịt trái)

Nước 85,5 Vitamin C 3,00 Protein 1,10 Niacin 2,80 Glucose 0,57 Vitamin A 0,01

Năng lượng 67,7 Natri 2,90

(Nguồn : Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam, 2007)

2.2 Thành phần bệnh hại trên cây thanh long

Theo Gunasena (2007) thì trên thanh long có một số bệnh quan trọng như thối

nhũn thân do vi khuẩn Xanthomonas compistris bệnh này có liên quan đến sự tưới nước quá nhiều và ẩm độ cao được báo cáo ở Mỹ và Úc Bệnh đốm nâu do Dothiorella

và loét cũng được báo cáo ở vùng trồng thanh long ở Florida và Nicaragua Bệnh thối thân cũng được tìm thấy trên cây thanh long hoang dại và thanh long trồng ở Mexico

nguyên nhân do Botryosphaeria dothidea (Gunasena, 2007) Những tác nhân gây bệnh

khác nhau tạo những vết thương khác nhau về kích thước và vị trí Bệnh loét có thể tấn

công lên trái, Fusariium oxysporum có thể tấn công lên dây leo (Gunasena, 2007) Ở

Colombia, hầu hết những vùng trồng thanh long đều bị nhiễm bệnh do nấm ở vùng rễ (Gunasena, 2007 trích dẫn từ Bibliowicz, 1998)

Nhiều bệnh khác nhau ảnh hưởng lên cây thanh long ở nhiều nơi được nhiều công trình khoa học báo cáo như: bị ảnh hưởng bởi virus X, thối thân, thối trái ở Đài Loan và Nhật Bản, đốm thân ở Mexico và loét ở Nhật Bản và Mỹ Bệnh loét trên thanh long cũng được báo cáo ở Brazil (Masyahit, 2009) Cũng theo Masyahit (2009) thì

bệnh loét trên thanh long nguyên nhân đo nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra

Theo Nguyễn Văn Hòa (2006) trên thanh long có khoảng 10 loại bệnh gây hại,

phổ biến nhất là bệnh thán thư và bệnh thối bẹ, nấm bồ hóng và còn những bệnh không

gây hại nghiêm trọng

Bảng 2.2: Thành phần bệnh gây hại trên thanh long

Bệnh

hại

Tác nhân gây bệnh

Bộ phận bị hại

Thời điểm ghi nhận

Mức độ phổ biến

Thán thư Collectotrichum

gloeosporioides

Trái, hoa Mùa mưa +++

Thối trái Fusarium sp Trái Trái sắp chín ++

Ghi chú: + mức độ bệnh thấp, ++ mức độ bệnh trung bình, +++ mức độ bệnh khá phổ biến

(Nguồn: Nguyễn Văn Hòa, 2006)

2.3 Tổng quan về bệnh thối nhũn

2.3.1 Triệu chứng bệnh thối nhũn

Triệu chứng thối nhũn biểu hiện đầu tiên là một vùng mụn nước mất màu, mọng nước, sau đó lan rộng ra nhanh chóng về đường kính do sự chết của tế bào Vùng bị nhiễm trở nên mềm nhũn ra và bề mặt trở nên mất màu Mô bên trong vùng bị nhiễm bệnh có màu như kem và nhày nhụa, tan chảy trong một khối chất nhày của nhũng tế bào cây bị phá vở Mặt ngoài của vùng bị nhiễm bệnh có thể vẫn còn giữ được trạng thái nguyên vẹn trong khi bên trong thì các mô đã chuyển đổi hoàn toàn thành một khối chất nhày nhụa, khối chất nhày này từ từ rịnh ra bên ngoài qua những khe hở trên bề mặt vết bệnh, khi ra ngoài không khí chúng sẽ chuyển sang màu hơi nâu đến nâu hoặc nâu đậm Tất cả trái hoặc củ có thể bị thối nhũn hoàn toàn trong khoảng 3 – 5 ngày Trái hoặc củ bị nhiễm bệnh của nhiều cây hầu hết không có mùi thối cho đến khi chúng biểu hiện triệu chứng thối nhũn ra bên ngoài, và vi khuẩn thứ cấp phát triển trên mô đang bị phân hủy sinh ra mùi hôi thối Tuy nhiên, cây họ thập

tự và cây hành khi bị nhiễm bởi vi khuẩn gây thối nhũn thì luôn luôn tạo ra một mùi khó chịu (Agrios, 2005)

Hình 1.1: Triệu chứng thối nhũn trái thanh long 2.3.2 Tác nhân gây ra bệnh thối nhũn

Theo nhiều tác giả thì triệu chứng thối nhũn trên cây trồng do một trong những

tác nhân như sau: Erwinia nguyên nhân gây ra hiện tượng thối nhũn trên nhiều loại trái cây, rau (E.carotovora pv carotovora) và bệnh đốm đen ở khoai tây (E

carotovora pv atroseptica) (Agrios, 1997) Cũng theo Agrios (1997) thì Bacillus là

nguyên nhân gây thối nhũn khoai tây, lá thuốc lá, cà chua và đậu Ngoài ra

Pseudomonas, Clostridium cũng là những tác nhân gây ra hiện tượng thối nhũn

(Agrios, 1997) Theo một báo cáo của Jin-Hyeuk Kwon và ctv (2000), thì Rhizopus

stolonifer là nguyên nhân gây ra thối nhũn quả bí ở Hàn Quốc Rhizopus còn gây ra

thối nhũn khoai lang ở Hawaii theo báo cáo của Scot Nelson (2009) Ngoài những tác nhân gây trên hiện tượng thối nhũn còn có nguyên nhân do nấm Mocor gây ra (Michailides, 1990) Nấm Mocor gây ra hiện tượng thối trái được báo cáo bởi T.J Michailides và R.A Spotts vào năm 1990

Erwinia bao gồm 11 loài với những khả năng gây bệnh khác nhau Tất cả

những dòng không gây ra bệnh thối nhũn có một số đặc điểm như sau: kị khí không bắt buột, có tiêm mao, hình roi, gram âm và sản xuất acid từ fructose, glucose,

galactose và sucrose Erwinia gây thối nhũn thuộc 3 nhóm: amylovora, herbicola, và

carotovora (Schaad, 1988)

Vi khuẩn Erwinia gây bệnh bằng cách gây mềm nhũn tế bào cây ký chủ, làm

mô cây bị thối, biến dạng Lúc trước, tác nhân gây bệnh thối nhũn Erwinia được nhóm trong một loài đơn, Erwinia carotovora được chia trong loài phụ Sau này, nhóm này được chia thành hai loài chính, Erwinia chrysanthemi và Erwinia carotovora Xa hơn, chúng được chia thành ba loài phụ là carotovora, atroseptica và betavasculorum Hai

tác nhân thứ yếu khác với sự giới hạn cây ký chủ cũng được bao gồm trong nhóm vi

khuẩn gây thối nhũn là Erwinia cypripedii và Erwinia rhapontici Vi khẩn gây thối nhũn Erwinia có thể tấn công nhiều loại cây trồng ngoài đồng cũng như sản phẩn tồn

trữ trong kho (Kotoujansky, 1987)

2.3.3 Vi khuẩn gây thối nhũn cây trồng Erwinia sp

Vi khuẩn gây thối nhũn hiện diện trong mô cây đang thối nhũn trên đồng và cả trong kho chứa, chúng tạo ra một mùi hôi rất khó chịu do quá trình thối nhũn mô tạo

ra Mô bị nhiễm bệnh thường bị biến dạng và bị tan rã bởi ảnh hưởng của vi khuẩn

Mô đang thối trở nên mền nhũn, hóa loãng ra như nước và trơ thành một khối nhầy nhớt của vi khuẩn và mảnh vụng của mô tế bào chết rịnh ra bên ngoài (Agrios, 2005) Nhiều trường hợp thối nhũn không do tác nhân gây bệnh cây trồng gây ra, như trường hợp chúng không tấn công trực tiếp tế bào sống mà đúng hơn là chúng là sinh vật hoại sinh hay là tác nhân kí sinh thứ cấp theo sau tác nhân gây bện chính, chúng phát triển

trên mô cây đã bị giết chết bởi tác nhân gây bệnh hoặc bị chết bởi điều kiện môi trường, hay chúng tấn công những tế bào bị yếu đi không còn khả năng đối kháng lại với bất cứ sự tấn công của sinh vật nào Tuy nhiên, nhiều loài vi khuẩn tấn công tế bào sống và là nguyên nhân gây thối nhũn cây trồng trên đồng và trong kho chứa (Agrios,

2005) Erwinia nhóm carotovora hay nhóm gây triệu chứng thối nhũn là nguyên nhân gây thối nhũn trên nhiều loại trái cây, rau cải và trên cây cảnh (E carotovora pv

carotovora) và thối đen trên khoai tây (E carotovora pv atroseptica) (Agrios, 2005)

2.3.3.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Erwinia thuộc họ Enterobacteriaceae, không sinh bào tử, có dạng hình

roi kích thước từ 0,5 – 1,0 µm đến 1,0 – 3,0 µm (Elphistone, 1987) Và cũng theo

Elphinstone thì vi khuẩn Erwinia là nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy ý, nghĩa là vi khuẩn có

thể sống trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí nhận định này được Mantesano khẳng định lại vào năm 2002 trong một bài báo cáo của ông và nhiều bài báo cáo của nhiều

tác giả khác Theo Hossain và ctv năm (2005) thì roi của vi khuẩn Erwinia carotovora

ssp carotovora có dạng hình xoắn ốc, roi là cơ quan giúp vi khuẩn có thể chủ động di

chuyển được trong môi trường loãng để tìm kiếm kí chủ và xâm nhiễm cũng phù hợp với một báo cáo của Hossain (2005) nói về sự di động của vi khuẩn này và cũng theo

Hossain thì vi khuẩn Erwinia carotovora ssp carotovora di động được bằng cách cử

động roi vòng tròn

2.3.3.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa

Một số đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Erwinia carotovora: nhiệt độ tối

thích từ 25 – 300C, nhiệt độ gây chết trong 10 phút từ 48 – 51oC, thủy phân được gelatin, khử được nitrat, không có phản ứng Indol Khi sử dụng glucoza hoặc seccaroza làm nguồn carbon vi khuẩn tạo ra được cả khí và acid, nhưng khi sử dụng lactoza hoặc manitol làm nguồn carbon chỉ tạo ra acid (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Vi khuẩn Erwinia carotovora là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, có khả năng sống được ở

nhiệt độ trên 36ºC và có khả năng sản xuất acid từ α – methyl glucoside (Hyytiainen,

2005) Cũng theo nhiều nguồn tài liệu thì vi khuẩn Erwinia carotovora là loại vi khuẩn

có hoạt tính của một số emzym như: pectase, lysase, polygalacturonase, cellulase và protease (Hossain và ctv, 2005; Hyytiainen, 2005) Đây cũng là hệ enzym thể hiện tính

độc của vi khuẩn Erwinia carotovora nhóm gây triệu chứng bệnh thối nhũn Để duy trì

và tổng hợp được những enzym này vi khuẩn Erwinia carotovora cũng yêu cầu một số

chất nhất định, một báo cáo của Palomaki chỉ ra rằng để tích lũy enzym

polygalacturonase ở vi khuẩn Erwinia carotovora thì chất C – Terminus là một chất

cần thiết

Erwinia carotovora có khả năng sống được ở nhiệt độ 36ºC và gây bệnh nặng

nhất trong điều kiện nóng ẩm, đất ẩm ướt làm bệnh nặng hơn trong khi đất khô ẩm độ không khí thấp làm bệnh kém phát triển (Elphinstone, 1987) Dựa vào những đặc điểm này chúng ta có thể đề ra những biện pháp canh tác thích hợp để hạn chế tác hại của vi

khuẩn Erwinia gây ra

Trong nghiên cứu giám định vi khuẩn, người ta dựa vào những đặc điểm sinh lý – sinh hóa khác nhau này để phân biệt và phân loại vi khuẩn Mỗi loài vi khuẩn có những đặc điểm sinh lí – sinh hóa khác nhau đặc trưng cho loài và chỉ có loài đó mới

có và đây là cơ sở của việc giám định và định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa

2.3.3.3 Phổ kí chủ của vi khuẩn Erwinia

Theo Sharma (2006) thì vi khuẩn Erwinia carotovora có thể tấn công được trên

khoai tây, rau cải, củ cải, hành, dưa hấu, cải bắp, hoa kiểng và nhiều loại cây trồng khác Cũng trong năm đó Henz và ctv cũng báo cáo vi khuẩn này gây thối nhũn trên những nhóm cây trồng như trên Cũng theo Hossaain thì vi khuẩn này cũng là nguyên nhân gây thối nhũn nhiều loại cây trồng và là vi khuẩn gây ra nhiều bệnh quan trọng

Montesano cũng khẳn định vi khuẩn Erwinia carotovora là nguyên nhân gây bệnh thối

nhũn trên nhiều loại cây trồng trong giai đoạn ngoài đồng và cả trong giai đoạn tồn trữ

trong kho (Montesano, 2002) Fuckovsky (2002) nhắc đến vi khuẩn Erwinia

carotovora như là một bệnh quan trọng đối với cây trồng trong vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới

sinh sản hữu tính là sinh ra bào tử tiếp hợp Zygomyecetes là lớp nấm khí bắt buộc, bào

tử nấm bay trong không khí và lan truyền nhờ gió Các loài trong lớp nấm

Zygomyecetes đa số là nấm hoại sinh hoặc ký sinh yếu trên cây trồng Một số loài còn

gây bệnh trên người (Agrios, 2005)

Các nấm trong lớp Zygomyecetes là nguyên nhân gây thối nhũn trên nhiều loại cây trồng, rau, trái cây, hoa, cây thân hành, thân củ, và cả cây lấy hạt Zygomycyecetes

ký sinh yếu, hầu hết chúng là loài hoại sinh trên tế bào chết và nông sản sau thu hoạch Ngay cả khi chúng tấn công cây ngoài đồng thì sự tấn công đầu tiên là ở những vùng cây tổn thương trước đó do cơ giới hay bị yếu do bệnh Sau đó, sợi nấm được sinh ra

và lan rộng, tiết enzym phân giải vách tế bào, xâm nhập và giết chết những tế bào lân cận (Agrios, 2005)

Rhizopus gây thối nhũn trên cây ăn trái, rau màu đã được phát hiện khắp nơi

trên thế giới Chúng gây hại nông sản sau thu hoạch và cả cây trồng ngoài đồng

Rhizopus được tìm thấy gây bệnh trên khoai tây, dâu tây, cây họ bầu bí, cây đào, cây

anh đào, đậu nành và nhiều loại trái cây rau cải khác Bắp và nhiều loại ngũ cốc bị gây hại nặng ở điều kiện ẩm độ cao Cây thân hành, thân củ, rễ củ, và cây lấy hoa cũng bị

tấn công bởi nấm Rhizopus sp Trong điều kiện thuận lợi bệnh sẽ tiến triển nhanh hơn

và thời gian gây hại sẽ ngắn hơn (Agrios, 2005)

Nấm Rhizopus gây hại quanh năm Bào tử nấm được hình thành và phóng thích

vào mọi thời điểm trong năm Bào tử được phóng thích vào không khí và rơi xuống bề mặt cây trồng Bào tử nào rơi xuống bề mặt bị tổn thương trước đó của cây trồng sẽ nhanh chóng nảy mầm và xâm nhập vào cây Khi xâm nhập chúng tiết ra enzym pectinolytic để phân hủy pectic của vách tế bào và xâm nhập vào tế bào lân cận Những tế bào bị enzym phân hủy sẽ mất khả năng liên kết với nhau và tạo thành một khối nhầy nhụa gây ra triệu chứng nhũn ở vùng bị bệnh trên cây trồng Khi tế bào bị

vỡ ra, sợi nấm bắt đầu mọc ra ngoài và hình thành bào tử trên bề mặt bị tổn thương của

cây bệnh Trong điều kiện không thuận lợi của môi trường như nhiệt độ và ẩm độ không thích hợp sẽ làm chậm sự phát triển của bệnh Điều này đã tạo điều kiện về thời gian cho cây ký chủ hình thành những phản ứng tự vệ chống lại mầm bệnh như hình thành tầng mô rỗng, tầng rụng và những cấu trúc khác để hạn chế sự phát triển của nấm bệnh Khi điều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của nấm bệnh như nguồn cung cấp dinh dưỡng cho nấm bị giảm, nấm có thể hình thành bào tử tiếp hợp để tồn tại trong điều kiện không thuận lợi đó (Agrios, 2005)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các dụng cụ quan sát nấm và vi khuẩn: Kính hiển vi, lam, lamen, đèn cồn, nước cất và các dụng cụ cần thiết trong phòng Lab

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phân lập, nuôi cấy và xác định tác nhân

Mẫu bệnh được thu thập và nhanh chóng mang về phòng thí nghiệm bệnh cây của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Viện cây ăn quả miền Nam để phân lập và định danh tác nhân gây bệnh

Thu mẫu bệnh: Mẫu bệnh được thu thập ở những bông trái có biểu hiện bệnh rõ ràng, mẫu bệnh được đựng trong túi nylon riêng cho từng mẫu, ghi rõ địa chỉ nơi thu thập và thời gian thu mẫu

Xử lý mẫu: mẫu trái bệnh được lau sạch bằng cồn 70 độ trước khi được cắt nhỏ Dùng dao mổ đã được khử trùng trên ngọn đèn cồn cắt mẫu bệnh thành từng mảnh nhỏ khoảng 2 x 2 mm Mảnh cắt là nơi tiếp giáp giữa vùng mô khỏe và mô bệnh Sau đó những mảnh cắt được xử lý với cồn 70 độ trong khoảng 30 giây đến 1 phút và đem rửa lại với nước cất vô trùng 3 – 4 lần và để khô tự nhiên trong tủ cấy trước khi cấy vào môi trường dinh dưỡng Mẫu bệnh được cấy trên môi trường NA, PDA và giữ ở nhiệt

 Giám định tác nhân vi khuẩn

Dựa vào hình dạng, phản ứng khi nhuộm gram, hình dạng khuẩn lạc….Các phản ứng sinh hóa dùng để định danh cho từng loại vi khuẩn riêng biệt được thực hiện dựa trên tài liệu của N.S.Schaad (1988) bao gồm các phản ứng: khả năng phân giải các nguồn cacbon khác nhau, khả năng khử nitrate, sống hiếm khí, sinh acid…

 Phương pháp nhuộm và quan sát hình dạng vi khuẩn

Nhuộm gram

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí

- Soi kính: dùng vật kính đầu 100x để xem vi khuẩn

Xem kết quả:

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng hoặc đỏ

3.2.2 Kiểm chứng tác nhân thông qua quy trình Koch

Tác nhân sau khi phân lập được nhân nhanh sinh khối trên môi trường NA và chủng nhân tạo trở lại lên trái thanh long để kiểm chứng tác nhân gây bệnh

Thí nghiệm chủng bệnh nhân tạo ngoài đồng: thí nghiệm được bố trí tại vườn thanh long ruột trắng ở Trại Thực Nghiệm – Viện Cây Ăn Quả Miền Nam, vườn thanh long đang có nụ dưới 10 ngày tuổi và trái non (vừa rút râu) (đây là hai giai đoạn thanh long dễ mẫn cảm nhất đối với bệnh thối trái)

Tiến hành chủng riêng từng loại vi khuẩn phân lập đã được chuẩn bị sẵn ở nồng

độ 3,6 10-6 cfu/ml Dùng ống tiêm y tế hút khoảng 1ml dung dịch chứa vi khuẩn và tiêm vào nụ (20 nụ) Sau khi chủng tác nhân tiến hành bao nụ và trái để tránh lây nhiễm bởi tác nhân bên ngoài