ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NỀN, NƯỚC DỪA, ĐƯỜNG VÀ DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CÂY LAN VŨ NỮ (Oncidium sp.) IN VITRO

Kết quả đạt được: - Đối với thí nghiệm 1: khảo sát sự ảnh hưởng của liều lượng nước dừa trong môi trường MS, môi trường ½ MS và môi trường Knudson C lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NỀN, NƯỚC DỪA, ĐƯỜNG VÀ

DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA

CÂY LAN VŨ NỮ (Oncidium sp.) IN VITRO

NGÀNH : NÔNG HỌC NIÊN KHÓA : 2007 – 2011 SINH VIÊN THỰC HIỆN : LÊ THỊ THANH HÀ

Tháng 8/2011

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NỀN, NƯỚC DỪA, ĐƯỜNG

VÀ DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA

CÂY LAN VŨ NỮ (Oncidium sp.) IN VITRO

Tác giả

Lê Thị Thanh Hà

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành Nông học

Giảng viên hướng dẫn ThS Hồ Tấn Quốc

KS Lê Thị Lệ Hằng

Tháng 08/2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Cha mẹ cùng những người thân trong gia đình đã nuôi dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập được như ngày hôm nay

Thầy Hồ Tấn Quốc và cô Lê Thị Lệ Hằng đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi thực hiện đề tài và hoàn thành tốt khóa luận này

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm khoa Nông học

Quý Thầy Cô Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt

và trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường Tập thể lớp DH07NH, cùng tất cả các anh chị, bạn bè đã gắn bó và giúp sức cùng tôi trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận vừa qua

Cuối cùng một lần nữa tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc!

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Thanh Hà

TÓM TẮT

Đề tài “ Ảnh hưởng của môi trường nền, nước dừa, đường và dịch chiết đến khả

năng sinh trưởng của cây lan vũ nữ (Oncidium sp.) in vitro” Được tiến hành từ

15/02/2011 đến tháng 15/06/2011, tại phòng nuôi cấy mô, bộ môn Di Truyền Giống, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Thí nghiệm được thưc hiện nhằm xác định sự ảnh hưởng của môi trường nền, nước dừa, đường và dịch chiết lên sự sinh trưởng của cây lan, từ đó đưa

ra môi trường thích hợp để ứng dụng vào sản xuất đại trà và mang lại hiệu quả kinh tế cho người sản xuất

Kết quả đạt được:

- Đối với thí nghiệm 1: khảo sát sự ảnh hưởng của liều lượng nước dừa trong môi trường MS, môi trường ½ MS và môi trường Knudson C lên sự sinh trưởng của cây

lan Vũ Nữ Oncidium sp in vitro:

- Môi trường MS là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng về chiều cao, số lá/cây, chiều dài và chiều rộng và đường kính thân lớn nhất (0,90 cm/cây, 2,24 lá/cây, 2,28 và 0,44 cm/lá và 0,64 cm/cây)

- Hàm lượng nước dừa 150 ml/l là cho chiều cao cây (0,93 cm/cây), chiều rộng lá (0,44 cm/lá), đường kính thân (0,58 cm/cây) và trọng lượng lớn nhất (1,23 g)

+ Môi trường cho chiều cao cây cao nhất là: ½ MS + 150 ml/l CW (1,09 cm/cây)

+ Môi trường cho số lá/cây, chiều rộng lá cao nhất là: ½ MS + 170 ml/l CW (5,44 lá/cây, 0,55 cm/lá và 2,23 rễ/cây)

+ Môi trường cho số chồi/cây và số rễ/cây đạt cao nhất: ½ MS + 130 ml/l CW (1,48 chồi/cây và 4,87 rễ/cây)

+ Môi trường cho đường kính thân và chiều dài lá lớn nhất: MS + 170 ml/l CW (0,72 cm/cây và 2,28 cm/lá)

+ Môi trường cho chiều dài rễ và trọng lượng thân lớn nhất là Knudson C + 130 ml/l CW (3,52 cm/rễ và 1,39 g)

- Đối với thí nghiệm 2: khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng dịch chiết và các

mức đường trong môi trường MS lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ Oncidium sp

in vitro

- Dịch chiết dứa là dịch chiết tốt nhất chó sự sinh trưởng về chiều cao cây (1,40 cm/cây), số lá/cây (2,27 lá/cây), chiều dài lá và chiều rộng lá (1,48 và 1,16 cm/lá), số chồi (1,36 chồi/cây), số rễ/cây (1,55 rễ/cây) và trọng lượng (1,30 g) là lớn nhất Hàm lượng đường ở mức 30 g/l là cho số lá/cây (2,12 lá/cây), đường kính thân (1,27 cm/cây) và trọng lượng (1,35 g) lớn nhất

+ Môi trường cho chiều cao cây (1,41 cm/cây), số lá/cây (2,34 lá/cây) và đường kính thân (1,37 cm/cây) cao nhất là: dứa + 30 g/l đường

+ Môi trường cho số chồi/cây (1,25 chồi/cây), số rễ/cây (2,36 rễ/cây) và trọng lượng tươi (1,58 g) của cây đạt cao nhất: đu đủ + 30 g/l đường

+ Môi trường cho chiều dài rễ (1,67 cm/rễ) lớn nhất là: chuối + 0 g/l đường

MỤC LỤC

Trang tựa .i

Lời cám ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xii

Chương 1:GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Giới hạn của đề tài 2

Chương 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Ngành sản xuất hoa lan trên thế giới và Việt Nam 3

2.1.1 Ngành sản xuất hoa lan trên thế giới 3

2.1.2 Ngành sản xuất hoa lan tại Việt Nam 4

2.2 Giới thiệu về Oncidium sp 4

2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 4

2.2.2 Vị trí phân loại 5

2.2.3 Đặc điểm hình thái 5

2.2.4 Đặc điểm sinh thái 6

2.3 Các phương pháp nhân giống cây hoa lan 7

2.4 Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật 8

2.4.1 Lịch sử của nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.4.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam 9

2.4.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô 10

2.4.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.4.5 Quy trình nhân giống in vitro 12

2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 13

2.4.7 Vai trò của nước dừa và các dịch chiết từ trái cây ảnh hưởng đến

nhân giống in vitro 15

2.5 Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô trên hoa lan 18

Chương 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 22

3.2 Vật liệu thí nghiệm 22

3.2.1 Giống 22

3.2.3 Môi trường nuôi cấy 22

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm 23

3.2.5 Các loại dịch chiết hữu cơ và cách ly trích dịch chiết 24

3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của liều lượng nước dừa trong môi trường nền MS, ½ MS và Knudson C lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ

Oncidium sp in vitro 24

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 24

3.3.2 Quy mô thí nghiệm 25

3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của một số dịch chiết và hàm lượng đường lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ in vitro 25

3.4.1 Bố trí thí nghiệm 25

3.4.2 Quy mô thí nghiệm 26

3.5 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 26

3.6 Xử lý số liệu 26

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của liều lượng nước dừa trong môi

trường nền MS, ½ MS và Knudson C lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ

Oncidium sp in vitro 27

4.1.1 Ảnh hưởng của nước dừa và các môi trường đến chiều cao của lan Vũ Nữ in vitro 27

4.1.2 Ảnh hưởng của các liều lượng nước dừa và các môi trường nuôi cấy đến

số lá/cây, chiều dài và chiều rộng lá của lan Vũ Nữ in vitro 30

4.1.3 Ảnh hưởng của liều lượng nước dừa và các môi trường nuôi cấy đến

số chồi/cây của lan Vũ Nữ in vitro 33

4.1.4 Ảnh hưởng của các môi trường và liều lượng nước dừa đến số rễ,

chiều dài rễ của lan Vũ Nữ in vitro 35

4.1.5 Ảnh hưởng của nước dừa và các môi trường đến đường kính thân và trọng lượng của lan Vũ Nữ in vitro 38

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của một số dịch chiết và hàm lượng đường lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ in vitro 40

4.2.1 Ảnh hưởng của dịch chiết và các mức đường đến chiều cao của lan Vũ Nữ in vitro 40

4.2.2 Ảnh hưởng của dịch chiết và các mức đường đến số lá/cây, chiều dài và chiều rộng lá của lan Vũ Nữ in vitro 43

4.2.3 Ảnh hưởng của dịch chiết và các mức đường đến số chồi/cây

của lan Vũ Nữ in vitro 47

4.2.4 Ảnh hưởng của dịch chiết và các mức đường đến số rễ/cây và

chiều dài rễ của lan Vũ Nữ in vitro 49

4.2.5 Ảnh hưởng của dịch chiết và các mức đường đến đường kính thân và

trọng lượng tươi của lan Vũ Nữ in vitro 51

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận 54

5.2 Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 60

Phụ lục 1: Một số hình ảnh thí nghiệm 60

Phụ lục 2: Kết quả xử lý thống kê trên phần mềm MSTATC 62

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CV Cofficient of Variation

MS Môi trường Murashige and Skoog

DANH SÁCH CÁC BẢNG

trang Bảng 4.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và liều lượng nước dừa 

đến chiều cao cây (cm/cây) lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   29 

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và liều lượng nước dừa 

đến số lá/cây (lá/cây) cây lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   31 

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và liều lượng nước dừa 

đến chiều dài và chiều rộng lá (cm/cây) của cây lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   32 

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và liều lượng nước dừa 

đến số chồi/cây (chồi/cây) của lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   34 

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và liều lượng nước dừa 

đến số rễ/cây (rễ/cây), chiều dài rễ (cm/rễ) của cây lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   36 

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và liều lượng nước dừa 

đến đường kính thân (cm/cây) của cây lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   38 

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và liều lượng nước dừa 

đến trọng lượng tươi (g) của cây lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   39 

Bảng 4.8: Ảnh hưởng dịch chiết và hàm lượng đường đến chiều cao 

cây (cm/cây) lan vũ nữ Oncidium sp in vitro.   41 

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của dịch chiết và hàm lượng đường đến

số lá/cây (lá/cây)của lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   45 

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của dịch chiết và hàm lượng đường đến 

chiều dài và chiều rộng lá (cm/lá) của cây lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   46 

Bảng 4.11: Ảnh hưởng dịch chiết và hàm lượng đường đến số chồi (chồi/cây) của lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   48 

Bảng 4.12: Ảnh hưởng dịch chiết và hàm lượng đường đến số rễ/cây (rễ/cây)

lan vũ nữ Oncidium sp in vitro.   50 

Bảng 4.13: Ảnh hưởng dịch chiết và hàm lượng đường đến

chiều dài rễ (cm/rễ) của lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   51 

Bảng 4.14: Ảnh hưởng của dịch chiết và hàm lượng đường đến

đường kính thân (cm/cây) của cây lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   52 

Bảng 4.15: Ảnh hưởng của dịch chiết và hàm lượng đường đến  trọng lượng (g) của cây lan vũ nữ Oncidium sp in vitro   52 

_

DANH SÁCH CÁC HÌNH

trang

Hình 1: Toàn bộ các NT của thí nghiệm 1 giai đoạn 90 NSC 60

Hình 2: NT ½ MS + 170 ml/l CW cho số lá/cây và chiều dài lá cao nhất giai đoạn 90 NSC 60

Hình 3: Toàn bộ các NT của thí nghiệm 2 giai đoạn 90 NSC 61

Hình 4: NT đu đủ + 30 g/l đường cho số chồi/cây, số rễ/cây và trọng lượng

cao nhất giai đoạn 90 NSC 61

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Trước đây, ngành hoa kiểng được xem như một ngành nghề chỉ dành cho giới thượng lưu, do đầu tư chi phí cao và khoảng không gian lớn để trồng và chăm sóc nhưng ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đời sống con người càng ngày càng được nâng cao Những nhu cầu về đời sống vật chất và tinh thần ngày càng được đáp ứng cao hơn Trong đó nhu cầu thưởng thức cái đẹp là một trong số những nhu cầu về đời sống tinh thần được con người quan tâm đến nhiều nhất Hoa, là một tượng trưng cho nhu cầu về thưởng thức cái đẹp của con người

Mỗi loại hoa đều mang một vẻ đẹp, một ý nghĩa riêng, do đó tùy vào sở thích của người chơi hay vấn đề tài chính mà lựa chọn loại hoa mình ưa thích Trong đó, lan là một trong số những loài hoa được ưa chuộng nhiều nhất

Có thể do lan là loại hoa đẹp, đa dạng và có giá trị cả về mặt kinh tế lẫn tinh thần đối với con người trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, do đó, hoa lan có thị trường tiêu thụ rất mạnh cả trong nước lẫn xuất khẩu Bên cạnh đó, kết hợp với khí hậu nhiệt đới ẩm của Việt Nam nên thích hợp để trồng một số loại lan như

Dendrobium, Cattleyas, Mokara, Vanda, Oncidium và một số ít thuộc nhóm Phalaenopsis Nhưng đa số các giống lan hiện nay tại Việt Nam đều được nhập khẩu

từ các nước như Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan là chủ yếu Lan vũ nữ (Oncidium

sp.) là một trong những giống lan được nhập từ Thái Lan, hiện đang rất được thị trường Việt Nam ưa chuộng

Tuy nhiên, đa số các giống lan nhập về là cây nuôi cấy mô nên giá thành cây giống cao, vì vậy để đầu tư vào một vườn lan nhằm mang lại giá trị kinh tế cho người trồng đòi hỏi chi phí đầu tư ban đầu cao Mặt khác, số lượng người chơi lan hiện nay,

đang ngày càng tăng nhưng thị trường nhập khẩu vẫn không cung ứng đủ hoặc chất lượng cây giống không đảm bảo

Để giải quyết vấn đề trên, ngành nuôi cấy mô đã được đầu tư phát triển mạnh nhằm đáp ứng cho thị trường trong nước và trong tương lai là xuất khẩu sản phẩm nuôi cấy mô nhưng vẫn chưa đạt được hiệu quả cao do môi trường nuôi cấy hay do các yếu

tố môi trường ảnh hưởng đến Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của môi trường nền, nước dừa, đường và dịch

chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Vũ Nữ (Oncidium sp.) in vitro”

1.2 Mục đích của đề tài

- Xác định môi trường nền (MS, ½ MS và Knudson C) và liều lượng nước dừa

thích hợp cho khả năng sinh trưởng và phát triển của cây lan Vũ Nữ in vitro

- Đánh giá ảnh hưởng của liều lượng đường và ba dịch chiết đến sự sinh trưởng

của cây lan Vũ Nữ in vitro

1.3 Yêu cầu của đề tài

Bố trí thí nghiệm và tiến hành theo dõi sau cấy các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng qua chiều cao cây, đường kính giả hành, số lá, chiều dài và chiều rộng lá, số rễ, chiều dài rễ và trọng lượng tươi của cây lan vũ nữ nuôi cấy mô

1.4 Giới hạn của đề tài

Do thời gian làm đề tài ngắn, từ 15/02/ 2011 đến 15/06/2011, nên không thể tìm hiểu tất cả các vấn đề liên quan. 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Ngành sản xuất hoa lan trên thế giới và Việt Nam

Lan là họ duy nhất và lớn thứ hai trong ngành Ngọc Lan về số lượng loài, chỉ đứng sau họ Cúc Lan gồm khoảng 800 chi và hơn 30.000 loài phân bố ở khắp nơi trên thế giới, nhưng phát triển và tập trung nhiều nhất ở các rừng nhiệt đới của vùng Đông Nam Á và Trung Mỹ

2.1.1 Ngành sản xuất hoa lan trên thế giới

Thị trường hoa lan trên thế giới rất sôi động cả về mặt hàng lan cắt cành lẫn lan trồng trong chậu Tại Châu Á, lan được sản xuất tập trung chủ yếu ở các nước như Thái Lan, Đài Loan, Mỹ, Trung Quốc, Singapore, Indonesia Trong các nước trên thì Thái Lan là nước có ngành công nghiệp hoa lan phát triển nhất, nhờ tiếp thu thành tựu công nghệ sinh học của thế giới cũng như cải tiến quy trình và luôn tạo ra các sản phẩm mới do đạt được thành quả từ những nghiên cứu đa ngành, vì vậy ngành công nghệ sinh học vẫn sẽ là yếu tố chính trong sự phát triển công nghệ hoa tại Thái Lan Mặt khác thị trường về hoa của Thái Lan rất rộng, sản phẩm của Thái Lan có mặt

ở cả các nước phát triển như Nhật Bản, Anh, Pháp, Đức, Mỹ và các nước đang phát triển như Việt Nam, một số nước Châu Phi và Đông Âu Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu về lan, Thái Lan có hơn 1000 giống lan khác nhau với các màu chủ yếu là trắng, vàng và đỏ gạch (Tình hình sản xuất – kinh doanh hoa và cây cảnh của một số nước trên thế giới và khu vực Đông Nam Á, 2008)

Đồng thời tại Châu Âu, Hà lan là quốc gia duy nhất có nền công nghiệp trồng hoa lan xuất khẩu lớn nhất Do trồng trong nhà kính nên có thể xuất khẩu quanh năm, đặc

biệt là Cymbidium Ngược lại, Ý là quốc gia nhập khẩu lan nhiều nhất ở Châu Âu, sau

đó đến Ðức và Pháp, chủ yếu nhập khẩu từ Thái Lan, Singapore, Hà Lan

2.1.2 Ngành sản xuất hoa lan tại Việt Nam

Theo Nguyễn Thị Nguyên (2009), Việt Nam được đánh giá là nước có tiềm năng lớn trong sản xuất hoa phong lan Nhưng thực tế hiện nay Việt Nam vẫn phải chi hàng

tỷ đồng mỗi năm để nhập hoa phong lan từ các nước láng giềng để đáp ứng cho nhu cầu nội địa Mặc dù, qua khảo sát tình hình thực tế sản xuất phong lan tại một số công

ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt, Tp Hồ Chí Minh, Đồng Nai thì diện tích trồng rất lớn, từ 50 – 60 ha/doanh nghiệp

Đồng thời trong thời gian qua, Viện di truyền Nông nghiệp Việt Nam cũng đã thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống phong lan theo công nghệ được chuyển giao từ Thái Lan Và theo Nguyễn Thị Nguyên (2009), tại một số địa phương như Sa

Pa, Phú Yên, Đà Lạt,…cũng đã tiến hành khảo sát và nghiên cứu phương pháp nhân giống để hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan

2.2 Giới thiệu về Oncidium sp

2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Giống Oncidium được mô tả đầu tiên bởi Olof Swartzin (1800) với lan

Oncidium altissimum Tên của nó bắt nguồn từ Hy Lạp “onkos”, nghĩa là “u bướu” Hầu hết các loài trong giống Oncidium là loài phụ sinh Giống Oncidium được phân bố

rộng rãi ở Nam Mỹ và có khoảng 750 loài với hình dạng, màu sắc hoa đẹp, đa dạng

Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004), tại Việt Nam, các giống lan Vũ Nữ đa số được nhập nội và lai tạo cho ra nhiều loài hoa khác nhau, đặc biệt là vùng Lâm Đồng

có nhiều loài vũ nữ rất đẹp

Loài: Oncidium sp.

2.2.3 Đặc điểm hình thái

™ Rễ thuộc loại rễ thịt, dạng thô, mập mạp, màu trắng ngả màu vàng nhạt hơi

trong, chính giữa là một lõi dạng sợi, chất gỗ Mặt khác, Oncidium là lan đa thân nên

rễ không tăng trưởng liên tục và có thời gian nghỉ sau mùa tăng trưởng (Việt Chương

và Nguyễn Việt Thái, 2008)

™ Thân lan hay còn gọi là thân vẩy giả hoặc thân củ giả, ngọn lau Thân vẩy giả

có nhiều hình dáng khác nhau, tùy giống, do đó, nó là một đặc trưng để phân biệt giữa các giống Thân vảy giả là cơ quan giữ nước và chất dinh dưỡng, mầm hoa và mầm lá đều mọc từ phần gốc của bộ phận thân rễ Thân vảy giả càng mập thì càng no đầy, mầm non càng khỏe tỷ lệ mọc mầm, mọc hoa càng cao (Phan Thúc Huân, 1993) Phong lan có 2 nhóm thân chính là đơn thân và đa thân Đối với nhóm lan đơn thân gồm những cây lan tăng trưởng theo chiều cao và thân ngày càng dài ra, có thể phân nhánh trên thân, thường có nhiều rễ gió mọc dọc theo thân Đối với nhóm đa thân, cơ thể là một hệ thống gồm nhiều nhánh, sống lâu năm, bộ phận nằm ngang của

chúng tạo nên thân Nhóm đa thân bao gồm các giống như Dendrobium, Cymbidium, Cattleya, Oncidium (Phan Thúc Huân, 1993)

™ Theo Phan Thúc Huân (1993), lá lan là lá đơn, mọc cách, mép lá nguyên, độ dày mỏng của lá rất khác nhau, độ cứng hoặc mềm của lá cũng khác nhau, lá thường

có bẹ và ít khi có cuống Lá thường có hình bầu dục hay hình giáo thuôn dài, một số loài có dạng lá hình trụ đầu nhọn hay phiến lá dày có rãnh

™ Hoa: hình thái cơ bản của các loại hoa lan đều gồm 3 phần: 3 lá đài, 3 cánh hoa và 1 trụ nhị 3 lá đài khác với các cánh hoa nhưng thường có màu giống cánh hoa

và rời nhau Giống như 3 lá đài, 3 cánh hoa rời nhau và trong 3 cánh hoa thì 2 cánh hoa 2 bên to bằng nhau còn cánh hoa sau thường khác hẳn về hình dạng, độ lớn, màu sắc, cánh này thường lớn hơn, có màu sắc sặc sỡ hơn nên được gọi là cánh môi Ở gốc của cánh môi thường có một cựa mang tuyến mật ngắn

Bộ nhị thường tiêu giảm, các nhị khác hoặc biến thành nhị lép hoặc không còn nhị Nhụy do 3 noãn dính liền với nhau tạo thành bầu dưới Vòi nhụy dính liền với chỉ nhụy và mang 3 đầu nhụy Ở những loài một nhị thì 2 đầu nhụy bên sinh sản, còn đầu nhụy thứ 3 làm thành bản ngăn cách bao phấn với các đầu nhụy sinh sản Thường thì 2 đầu nhụy sinh sản nằm trong một chỗ lõm trên trụ nhị, nhụy và đầu nhụy không sinh sản lồi ra thành bản ngăn cách gọi là mỏ, ở gốc mỏ có 2 túi nhỏ đựng gót của các túi phấn Do có cấu tạo hoa như mô tả trên nên hoa lan không thể tự thụ phấn mà phải nhờ côn trùng hay các loài chim mồi thụ phấn

Đối với lan Vũ Nữ Oncidium, hình dáng hoa giống như chiếc váy của người phụ

nữ và có nhiều màu sắc khác nhau, thông thường là màu vàng và nâu đen, đặc biệt một

số loài còn có hương thơm nhẹ

™ Quả lan là quả nang mở, có 6 kẽ nứt đặt ở 2 bên các giá noãn thành 6 mảnh

vỏ và một trái thì có rất nhiều hạt Hạt lan nhỏ, không có nội nhũ, có phôi hình cầu và thường không phân hóa thành cơ quan Hạt lan nhẹ nên dễ dàng phát tán nhờ gió và hạt muốn nảy mầm phải có nấm cộng sinh

2.2.4 Đặc điểm sinh thái

Theo Bùi Đăng Quang (2008) lan cần những đặc điểm sinh thái để sinh trưởng và phát triển:

™ Ánh sáng: Oncidium sp cần nhiều ánh sáng nhưng không chịu ánh sáng trực tiếp, ánh sáng tốt nhất cho sinh trưởng, phát triển của cây là ánh sáng 70%

™ Ẩm độ: Oncidium sp là loài cây cần ẩm độ cao, nhất là trong thời kỳ tăng trưởng

™ Nhiệt độ thích hợp để cây sinh trưởng và phát triển khoảng 20 – 250C

™ Giá thể sử dụng để trồng Oncidium cũng tương tự như giá thể trồng

Dendrobium, Catlleya, Mokara, nhưng không nên trồng chậu lớn Chất trồng có thể là

dớn, xơ dừa, than, nếu giá thể là than thì kích thước của giá thể và chậu phải nhỏ hơn

so với trồng các loại khác

™ Về nhu cầu dinh dưỡng: Oncidium là loài lan đòi hỏi về mặt dinh dưỡng cao,

có thể dùng phân bón dưới nhiều dạng khác nhau Khi sử dụng các loại phân vô cơ, nên pha loãng để tưới tùy vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của nó Mặt khác, đối với phân hữu cơ như phân bò khô thì nên vò thành từng viên và đặt trên bề mặt giá thể, điều này sẽ hữu hiệu cho việc hấp thu của cây qua quá trình tưới nước hàng ngày (Việt Chương và Nguyễn Việt Thái, 2008)

2.3 Các phương pháp nhân giống cây hoa lan

Theo Phan Thúc Huân (1993), có hai phương pháp để nhân giống lan là nhân giống hữu tính và vô tính Nhân giống hữu tính có nghĩa là dùng hạt lan để gieo trồng Trong thiên nhiên, lan được thụ phấn bởi côn trùng và phát tán đi nhờ gió, nhưng ngày nay lan được thụ phấn nhờ con người Phương pháp nhân giống hữu tính có thể dùng trong lai tạo giống mới.nhằm tạo ra các cá thể lan lai với màu sắc, hình thái đa dạng Đối với nhân giống vô tính có 2 phương pháp để thực hiện là tách chiết và nuôi cấy mô Trong đó, phương pháp tách chiết là phương pháp được sử dụng phổ biến trong nhân giống vô tính nhưng chỉ nhân giống với số lượng ít, bên cạnh đó, cây dễ bị sâu bệnh hại do các dụng cụ tách chiết không được vô trùng Mặt khác, các cá thể lan trong quần thể có thể không đồng đều nên ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng của cây lan (Nguyễn Thiện Tịch và ctv, 2004)

Ngày nay, các cây lan hầu như đều được tạo ra từ nuôi cấy mô Do nuôi cấy mô

là phương pháp nhân giống nhanh, các cá thể đồng nhất với nhau do được tạo ra từ một khởi đầu và không nhiễm bệnh Mặt khác, mầm cấy luôn có sẵn, do đó khi cần tạo giống không cần phải tốn nhiều thời gian chờ đợi cây phục hồi như phương pháp tách chiết

2.4 Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật

2.4.1 Lịch sử của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Vào năm 1983, hai nhà sinh vật học người Đức là Matthias Jakob Schleiden và Theodor Schwann đưa ra thuyết tế bào và nêu rõ rằng mọi cơ thể sinh vật dù phức tạp đến đâu cũng đều được tạo nên bởi sự kết hợp của rất nhiều đơn vị rất nhỏ, các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền đã có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

Và người đầu tiên thực hiện nuôi cấy mô tế bào thực vật là Gottlieb Haberlandt Năm 1902, ông đã thử nghiệm nuôi cấy mẫu lá tách rời và một số tế bào biệt hóa có chức năng khác, nhưng tế bào chỉ sống được vài ngày Theo Kyte và Kleyn (1996) thì ngày nay, người ta đã biết rõ lý do thất bại là ông đã chọn cây một lá mầm, và mẫu cây ban đầu đã biệt hóa hoàn toàn, đồng thời ông sử dụng môi trường khoáng để nuôi cấy với nồng độ rất thấp, bổ sung thêm sucrose, asparagine (một amino acid) và peptone

mà không hề có sự hỗ trợ của 1 chất kích thích nào

Đến năm 1922, Kotte và Robins lập lại thí nghiệm của Haberlandt trên vật liệu là đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo Trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của muôi khoáng và glucose làm rễ sinh trưởng khá mạnh và tạo nên một hệ rễ nhỏ, có

cả rễ phụ Tuy nhiên sự sinh trưởng này chỉ diễn ra trong thời gian ngắn, sau đó chậm

và ngừng hẳn, mặc dù đã chuyển sang môi trường mới

Năm 1934, F.Kogl, A.J.Haagen-Smit, và H.Erxleben đã phân lập được chất kích thích tố thực vật đầu tiên là indole-3-acetic acid hay IAA Cùng năm đó, P.R.White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm men trong một thời gian dài Theo Thorpe (2006) trong thời gian đó, R.J.Gautheret là người đầu tiên tạo được cây nuôi cấy mô thực vật thực sự từ

mô phân sinh thứ cấp của Acer pseudoplatanus, Ulmus campestre, Robinis pseudoacacia, và Salix capraea Theo Kyte và Kleyn (1996), đến năm 1939, với sự bổ

sung kích thích tố IAA, Gautheret, White và Nobecourt đã nghiên cứu độc lập và thành công trong việc duy trì sự phát triển của mô sẹo cây cà rốt và thuốc lá

Các thập niên tiếp theo chứng kiến nhiều nghiên cứu mang tính đột phá trong lĩnh vực nuôi cấy mô Thorpe cho rằng (2006) vào năm 1941, nước dừa lần đầu tiên được sử dụng bởi Overbeek, Conklin, và Albert đã cho thấy hiệu quả trong việc nuôi cấy mô các phôi mầm và một số loại mô khó nuôi cấy, kể cả các mô cây một lá mầm Năm 1954, Skoog tình cờ nhận thấy nếu bổ sung thêm một ít chế phẩm đã để lâu của acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân thuốc lá thì các mảnh mô này được kích thích tăng trưởng rõ rệt

Năm 1955, Miller là người đầu tiên phát hiện kinetin, một loại cytokinin Sau đó nghiên cứu của Miller và Folke K Skoog năm 1957 đã cho thấy ảnh hưởng của cytokinin trong việc phát sinh hình thái của cây Tỷ lệ auxin/cytokinin cao kích thích

rễ phát triển, trong khi tỷ lệ thấp dẫn đến sự hình thành chồi, và tỷ lệ cân bằng tạo nên

mô sẹo

Đến năm 1960, George Morel thử nghiệm nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của cây địa lan để tạo ra cây sạch virus không chỉ thành công trong việc tạo được cây con sạch virus, ông còn nhận thấy sự nhân lên của cây con trong quá trình nuôi cấy Từ đó, thuật ngữ vi nhân giống lần đầu tiên xuất hiện và đã tạo nên một cuộc cách mạng trong lĩnh vực nuôi vấy mô thực vật

Năm 1962, dựa vào nghiên cứu trên mô sẹo cây thuốc lá, Murashige và Skoog đã làm một cuộc cách mạng khác trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật bằng cách thiết lập một môi trường nuôi cấy mới, được biết đến với tên gọi là môi trường MS, với nồng

độ muối khoáng cao cùng một số biến đổi, cho phép nuôi cấy nhiều loại cây

2.4.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam

Theo Trần Văn Minh (1997), nuôi cấy mô tế bào thực vật tại Việt Nam được bắt đầu từ năm 1975, phòng nuôi cấy mô đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh học, Viện Khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Do ý thức được triển vọng to lớn của ngành khoa học hiện đại này trong chọn và nhân giống cây trồng nông nghiệp, các cơ sở thuộc Trung Tâm nghiên cứu Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia Hà Nội, Tp Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Bộ Lâm nghiệp, Bộ Y Tế, Viện nghiên cứu hạt nhân đã xây dựng phòng

nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm lực khoa học và đào tạo cán bộ nghiên cứu về ngành này

Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv (1995), nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã đạt được một số thành tựu như: nhân giống khoai tây bằng nuôi cấy mô thực vật, nhân giống vô tính cây cà phê, nhân giống vô tính cây cải ngọt

Theo Vũ Thị Liên, nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng phổ biến trong

nhân giống chuối (Musa spp.), cây bắt mồi (Nepenthes madagascariens), dứa Cayenene và Queen, cây mía đường (Sacharum offcinarum), cây vani (Vanilla sp.),

các giống hoa như cúc, đồng tiền, cẩm chướng, lan, và một số cây thân gỗ quý hiếm

2.4.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô

Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), phương pháp nhân giống nuôi cấy mô thường được thực hiện trong điều kiện vô trùng do đó về mặt lý tưởng thì cây thành phẩm hoàn toàn sạch nấm và vi khuẩn Thậm chí có một số phương pháp cho phép làm sạch virus trong cây như:

+ Xử lý nhiệt

+ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

+ Xử lý nhiệt, sau đó tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

+ Tạo chồi bất định và sau đó tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Từ đó, người ta cố gắng tạo ra các cây giống hoàn toàn không có mầm bệnh bên trong

Phương pháp nhân giống nuôi cấy có thể dùng để nhân giống một số loài cây mà trong điều kiện thông thường không thể nhân giống hoặc nhân giống bằng phương pháp truyền thống như hoa lan, hoa lily

Mặt khác, khi nhân giống bằng nuôi cấy mô ta có thể tác động để điều chỉnh các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây như nồng độ dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng Do nuôi cấy mô được thưc hiện trong phòng thí nghiệm nên không chịu sự tác động bởi yếu tố mùa vụ, vì vậy, có thể nhân giống quanh năm Dựa vào các điều kiện

sinh trưởng thuận lợi như vậy nên hệ số nhân giống của nuôi cấy mô cao hơn so với các phương pháp khác

Bên cạnh đó, quá trình nhân giống được bắt đầu với những mẫu cây rất nhỏ như đoạn thân, đoạn rễ, đoạn chồi, phôi mầm Do đó có thể bảo tồn được cây mẫu cũng như cung cấp mẫu nhiều hơn với một số ít mẫu ban đầu Số lượng cây mẫu được cung cấp này vẫn giữ được những đặc tính vốn có của mẫu ban đầu

2.4.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Dương Công Kiên (2002) cho rằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật bao gồm các phương pháp sau:

™ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Bao gồm nuôi cấy chồi bên và chồi đỉnh

Sau khi vô trùng mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ dinh dưỡng khoáng chất vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ đỉnh sau thời gian nuôi cấy mẫu phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển thành cây hoàn chỉnh

™ Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức chưa phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của Auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành một cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo

mô sẹo Mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

™ Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường thạch đặc biệt để tăng sinh khối Sau một thời gian nuôi cấy dài trong môi trường lỏng tế bào đơn sẽ tách ra và trải ra trên môi trường thạch

™ Nuôi cấy protoplast – lai protoplast

Protoplast hay còn gọi là tế bào trần có nghĩa là tế bào đã tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tạo lại lớp vỏ tế bào, sau đó tiếp tục phân chia và tạo thành cây hoàn chỉnh Hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau để tạo ra tế bào lai, áp dụng đặc tính này nhằm cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

™ Nuôi cấy hạt phấn

Hạt phấn được nuôi cấy trên môi trường thích hợp để tạo thành mô sẹo và tái sinh cây đơn bội. 

2.4.5 Quy trình nhân giống in vitro

Theo George và Deberge (2008) đã tổng hợp thì nhân giống in vitro bao gồm 5

giai đoạn:

™ Giai đoạn 1: Lựa chọn và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi thực hiện nhân giống in vitro cây mẹ phải được chọn lựa kỹ Có nghĩa

là cây mẹ phải là cây khỏe mạnh, sức sống tốt, không nhiễm bệnh vì nếu bệnh sẽ ảnh hưởng đến cây con cấy mô sau này Trong một số trường hợp có thể làm một số bước

để phát hiện mầm bệnh, làm giảm hay loại bỏ sự tạp nhiễm của vi sinh vật gây bệnh nhằm tăng khả năng thành công và giảm chết mẫu khi vào mẫu

™ Giai đoạn 2:Thiết lập môi trường vô trùng

Giai đoạn này cần thiết nhất là chuyển mẫu cây từ điều kiện bên ngoài vào điều kiện vô trùng, thông thường sẽ có nhiều mẫu cây được chuyển vào nuôi cấy cùng một lúc Sau một thời gian nuôi cấy, nếu các bình chứa mẫu bị nhiễm nấm hoặc không phát triển sẽ bị loại bỏ, những mẫu còn lại được nuôi dưỡng phát triển tạo nên một lượng cây con sạch bệnh và tương đối về số lượng

™ Giai đoạn 3: Tạo cây con thích hợp

Giai đoạn này nhằm tạo ra các cây con thích hợp, phát triển thành cây hoàn chỉnh

mà không cần sự tác động đặc biệt nào Thông thường trong giai đoạn này cây được

nhân lên từ những cây con đã tạo thành ở trên bằng các chồi bên hay chồi bất định hay phôi sinh dưỡng hay các cơ quan dự trữ, sinh sản sinh dưỡng…nhằm tăng nhanh số lượng cây có được Do đó, giai đoạn này còn được gọi là giai đoạn nhân nhanh

™ Giai đoạn 4: Chuẩn bị đưa ra môi trường tự nhiên

Cây con được tạo ra giai đoạn 3 còn nhỏ, chưa có khả năng sinh trưởng trên giá thể Và để giúp cây con có khả năng tự quang hợp và hút chất dinh dưỡng mà không cần nguồn dinh dưỡng hỗ trợ Do đó, để giúp cây sống được cần phải tạo rễ cho cây con nên giai đoạn này hay được gọi là giai đoạn tạo rễ

™ Giai đoạn 5:Thuần hóa cây in vitro

Về cơ bản, cây con sau giai đoạn 4 sẽ tự quang hợp và phát triển trên đất hay giá

thể nhưng vì điều kiện môi trường in vitro khác biệt so với môi trường bên ngoài, cho

nên giai đoạn này cần thiết để cây con thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, vì vậy giai đoạn này là giai đoạn quan trọng quyết định số lượng cây vì nếu không cẩn thận

sẽ bị thất thoát một số lượng cây rất lớn

2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

™ Ánh sáng

Là nguồn cung cấp năng lượng cho quang hợp, giúp tạo năng lượng và sinh khối cho cây sinh trưởng, đồng thời ánh sáng cũng ảnh hưởng nhất định đến hình thái của cây Ánh sáng được sử dụng trong nuôi cấy mô thường là ánh sáng đèn huỳnh quang

vì tiện dụng, tiết kiệm năng lượng và ít tạo nhiệt Tuy nhiên, ánh sáng trắng làm giảm khả năng quang hợp và sinh trưởng của cây do cường độ ánh sáng yếu (Dương Công Kiên, 2002)

™ Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của thực vật qua quang hợp, hô hấp, biến dưỡng Nhiệt độ cao có thể làm ức chế quang hợp, sinh trưởng kém và có thể làm tổn thương các cơ quan của cây Nhiệt độ nuôi cấy khá ổn định, nhưng có thể thay đổi theo các giai đoạn sáng và tối nếu sử dụng ánh sáng Trong giai đoạn sáng, nhiệt

độ thường lớn hơn nhiệt độ phòng 1 – 30C, còn trong giai đoạn tối, nhiệt độ ánh sáng lúc nầy tương đương với nhiệt độ phòng Sự chênh lệch này có thể được khắc phục

bằng cách tăng sự lưu thông không khí bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy (Dẫn theo Nguyễn Thị Phương Ngọc Huyền, 2008)

™ Độ ẩm tương đối

Theo George và Davies (2008), độ ẩm cao gây nhiều bất lợi về mặt sinh lý, cây điều hòa, cân bằng nước kém và khó thích ứng khi đưa ra trồng Mặt khác độ ẩm thấp, cây dễ bị mất nước hay làm môi trường dinh dưỡng bị khô

™ Nồng độ CO2

Nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy thấp trong giai đoạn sáng sẽ gây ức chế quang hợp, gia tăng ảnh hưởng của ethylene, gây ra hiện tượng quang oxy hóa khi cường độ ánh sáng cao Để tăng nồng độ CO2 trong bình nuôi cần nâng nồng độ CO2 trong phòng nuôi cấy hoặc gia tăng sự trao đổi khí bên trong và bên ngoài bằng các loại bình

có lỗ thông khí (Dẫn theo Nguyễn Thị Phương Ngọc Huyền, 2008)

™ Nồng độ O2

Nồng độ O2 trong không khí chiếm khoảng 21% và thay đổi tương ứng với nồng

độ CO2 Tuy nhiên, theo Kozai và Kubota (2005), sự thay đổi nồng độ không khí bên trong bình nuôi cấy thường khá nhỏ so với tổng lượng O2 nên không ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của cây (Dẫn theo Nguyễn Thị Phương Ngọc Huyền, 2008)

™ Sự lựa chọn mẫu cấy

™ Theo Hartmam và Kester (1983) các mô non như đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây Mẫu cấy thích hợp phải

có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng

™ Môi trường nuôi cấy

Môi trường của Murashige và Skoog thích hợp cho phần lớn các cây trồng Để hình thành chồi nách, thường yêu cầu nồng độ của Auxin và Cytokinin thấp Để sản xuất mô sẹo cần nồng độ Auxin cao kết hợp với Cytokinin thấp (luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Ngọc Huyền khoa Nông học, 2008)

™ Đường

Trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ giúp tế bào phân chia và tăng sinh khối là do đường (Trần Văn Minh, 1997)

2.4.7 Vai trò của nước dừa và các dịch chiết từ trái cây ảnh hưởng đến nhân

giống in vitro

Bên cạnh các yếu tố ảnh hưởng trên, một yếu quan trong được nhắc đến ở đây là chất hữu cơ hay còn gọi là dịch chiết được đưa vào môi trường nuôi cấy Dịch chiết được sử dụng có thể là dứa, chuối, khoai tây, cà rốt, cà chua, nước dừa…Mỗi loại dịch chiết đều có một nồng độ ảnh hưởng nhất định đến cây cần nuôi cấy mô

™ Dứa

Dứa hay còn gọi là thơm hay khóm, tên khoa học Ananas comosus, là một loại

quả nhiệt đới Dứa là cây bản địa của và miền nam Brazil Quả dứa có hàm lượng axit hữu cơ cao (axit malic và axit citric) và là nguồn cung cấp mangan dồi dào cũng như

có hàm lượng Vitamin C và Vitamin B1 khá cao Theo một số nghiên cứu, cứ 100g dứa thì có 25 kcal, 0,03 mg caroten, 0,08mg vitamin B1, 0,02mg vitamin B2, 16mg vitamin C (dứa tây) Các chất khoáng: 16mg ca, 11mg phospho, 0,3mg Fe, 0,07mg Cu, 0,4g protein, 0,2g lipit, 13,7g hydrat cacbon, 85,3g nước, 0,4g xơ

™ Chuối

Chuối là tên gọi các loài cây thuộc chi Musa, trái của nó là trái cây được ăn rộng

rãi nhất Chuối có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Úc Ngày nay, nó được trồng khắp vùng nhiệt đới Trong chuối, hàm lượng kali (potassium) chiếm tỉ lệ cao và chứa nhiều loại đường thiên nhiên như: fructose, sucrose, glucose Chuối cũng

là nguồn cung cấp fructooligosaccharides, một chất quan trọng để nuôi dưỡng những loại vi khuẩn có lợi trong đường ruột, giúp chức năng ruột hoạt động tốt hơn, nhờ đó,

cơ thể sẽ hấp thu vitamin và các chất dinh dưỡng một cách hiệu quả hơn

™ Nước dừa

Dừa có tên khoa học là Cocos nucifera, là một loài cây trong (Arecaceae) Trong

nước dừa có gần như toàn bộ dưỡng chất như một số nhóm B và chất khoáng Mặt khác hàm lượng trong nước dừa tương tự như dịch tế bào của người nên nó thường được dùng cho bệnh nhân bị tiêu chảy, thậm chí làm dịch truyền

2.5 Những vấn đề tồn tại trong nhân giống cây trồng

Theo Dương Công Kiên (2002), trong nuôi cấy mô tồn tại những vấn đề sau:

™ Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại Việc nuôi cấy mô sẹo tế bào đơn thường tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tần số biến dị xảy

ra còn phụ thuộc các yếu tố:

+ Kiểu di truyền

+ Loại mô cấy

+ Số lần cấy chuyền nhiều hay ít, trong đó loại biến dị về nhiễm sắc thể sẽ xuất hiện cao khi thời gian nuôi cấy kéo dài Số lần cấy chuyền ít và thời gian cấy chuyền giữa hai lần ngắn sẽ làm giảm khả năng gây biến dị

tế bào nhu mô chưa xảy ra quá trình biệt hóa

™ Sử dụng kháng sinh

Có nhiều loại thuốc kháng sinh được sử dụng trong nuôi cấy mô, nhằm hạn chế sự hại mẫu của vi sinh vật như: penicillin, rifambicin, vancomycin Mô thực vật rất nhạy cảm với tác động của kháng sinh và phản ứng khác nhau lên gen, do đó cần cẩn thận trong khi sử dụng

™ Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấy

Hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu là hiện tượng thường thấy trong nuôi

cấy in vitro, sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay làm hư mẫu Hiện tượng này là do

mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tannin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn

mô non Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thu hợp chất phenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu hay đen mẫu Hoặc dùng polyvinylpyrolidone, một chất thuộc loại polyamide Có nhiều phương pháp làm giảm sự hóa nâu được đề nghị và được nhiều nhà khoa học đồng ý như:

- Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non

- Gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid và citric acid vài giờ trước khi cấy

- Nuôi cấy trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có đèn 1 – 2 tuần

- Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng thấp sang môi trường có nồng độ cao hơn

™ Hiện tượng thủy tinh thể

Hiện tượng này có đặc điểm là thân, lá phồng to, chứa nhiều nước, cây có dạng trong Đây là một dạng bệnh lý thường thấy khi cây được nuôi trên môi trường

mà việc trao đổi khí giữa cây và môi trường bên ngoài bị ngưng lại, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây

Qua quá trình nghiên cứu, có một số phương pháp làm giảm quá trình hóa thủy tinh thể như sau:

+ Giảm sự tăng hấp thu nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao

+ Giảm sự gây vết thương trên mẫu cấy qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất

+ Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy

+ Giảm khí ethylene trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy

2.5 Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô trên hoa lan

Qua khảo sát của Lê Thị Mỹ Hạnh và Nguyễn Thị Huyền (2005), hiện mới chỉ có một số công ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt,

TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng 50 – 60 ha/doanh nghiệp Một vài địa phương khác cũng tiến hành trồng phong lan nhưng mới dừng ở quy mô gia đình, trên diện tích từ vài m2 đến vài nghìn m2, cá biệt có vài hộ trồng trên 1 – 2 ha chứ chưa có các vùng quy hoạch trồng lan tập trung ứng dụng công nghệ hiện đại

Tuy nhiên một số Sở Khoa học - Công nghệ cũng đã bắt đầu khảo sát và nghiên cứu các phương pháp nhân giống nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan như trung tâm ứng dụng và Chuyển giao Công nghệ, Sở Khoa học – Công nghệ Phú Yên

đang nuôi cấy 6 dòng Vanda, 5 dòng Cattleya, 4 dòng Mokara, 17 dòng Dendrobium,

23 dòng Phalaenopsis và 2 dòng Oncidium Hay trung tâm ứng dụng tiến bộ Khoa học

và Công nghệ sở Khoa học – Công nghệ tỉnh Bình Định đã tiến hành thực hiện đề tài:”Nghiên cứu quy trình sản xuất hoa phong lan công nghệ cao để xây dựng mô hình sản xuất theo quy mô hộ gia đình” Sau hơn 1 năm triển khai, đề tài đã xây dựng mô

hình sản xuất phong lan bằng công nghệ cao quy mô hộ gia đình với diện tích 600 m2chia làm 2 vườn khác nhau tại trạm thực nghiệm Khoa học – Công nghệ của trung tâm tại xã Phước An (Tuy Phước) Lê Thị Mỹ Hạnh và Nguyễn Thị Huyền cho rằng trung tâm ứng dụng tiến bộ Khoa hoc và Công nghệ thuộc sở Khoa học đã nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và trồng thử nghiệm thành công hơn 20 dòng hoa thuộc 2

loại Dendrobium (Hoàng lan) và Phalaenopsis (Hồ điệp) và một số giống phong lan

khác

Theo nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và Dương Tấn Nhựt (2005) về khả năng tạo

chồi hoa Dendrobium mild yumi trong nuôi cấy in vitro cho thấy rằng sau 8 tuần gieo

hạt sẽ nảy mầm và hình thành protocorm tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa và 1g/l than hoạt tính Quá trình chuyển hóa từ protocorm thành cây hoàn chỉnh diễn ra từ tuần thứ 9 đến tuần thứ 20 trên môi trường tương tự có

bổ sung BA Và cây không xuất hiện hoa trên môi trường bổ sung NO3-, môi trường bổ sung PO3- tạo số chồi nụ nhiều nhất, tăng gấp 3 lần so với đối chứng, môi trường có bổ sung K+ cho số nụ hoa ít hơn nhưng lại giúp giữ nụ hoa cho đến khi hé nở và nụ hoa tạo được sắc tố

Theo nghiên cứu của Cung Hoàng Phi Phượng và các đồng sự (2007) về “Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống lan Hồ Điệp lai -

Phalaenopsis hybrid” cho thấy kết quả rằng tỷ lệ nhân giống protocorm gấp 3 lần trên

môi trường thạch và gấp 1,3 lần trên môi trường lỏng Mặt khác, đối với giai đoạn tái sinh chồi và nhân chồi, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời cho tỷ lệ chồi gấp 3,6 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch Từ đó giúp gia tăng tỷ lệ tạo cây con lên 10.8 lần so với phương pháp nuôi cấy mô truyền thống

“Nhân nhanh phôi và protocorm – like body cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis

amabilis) bằng hệ thống Bioreactor” là hệ thống tự động hóa trong vi nhân giống thực

vật theo nghiên cứu của Nguyễn Cửu Thành Nhân, Nguyễn Thành Hải và Dương Tấn Nhựt (2005 – 2007) Kết quả thí nghiệm này cho thấy tỷ lệ sống sót (58,32%) và đường kính protocorm của hệ thống bioreactor là 5,5 mm, cao hơn tỷ lệ sống sót

(26,55%) và đường kính protocorm của hệ thống đối chứng là 1,5 mm

Trong giai đoạn hiện nay, để vừa tăng số lượng và chất lượng vừa hạ giá thành sản phẩm là vấn đề tất yếu cần xảy ra Do đó, Viện Sinh học Nhiệt đới đã tiến hành

nghiên cứu “Nhân giống vô tính phong lan in vitro ở điều kiện ánh sáng tự nhiên” trên các đối tượng là lan Dendrobium, Catleya, Doritanopsis Kết quả của nghiên cứu cho

thấy trong điều kiện ánh sáng tự nhiên chiếu mạnh, cây có sắc tố tím đỏ và việc sử dụng carbonhydrat ở dạng tinh bột tốt hơn ở dạng đường Mặt khác theo Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du và Trịnh Mạnh Dũng (2005), cây được nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng tự nhiên khi đem trồng nhanh thích nghi với điều kiện vườn ươm hơn là cây được nuôi cấy trong phòng máy lạnh, ánh sáng đèn

Nghiên cứu triển khai phương pháp ứng dụng các nguồn hydratcacbon khác nhau (nhất là các loại dịch chiết tự nhiên: cà rốt, khoai tây, cà chua, dưa leo, dứa, ) trong môi trường nuôi cấy phong lan ở điều kiện ánh sáng tự nhiên và nhân tạo

Theo nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và ctv (2007) về xác định loại đường và nồng độ sử dụng thích hợp nhất cho quá trình phát sinh phôi vô tính cây lan Hồ Điệp

(Phalaenopsis amabilis) để từ đó thiết lập một hệ thống phát sinh phôi nhanh chóng

với tần số cao Kết quả của thí nghiệm cho thấy monosaccharide không thích hợp cho

nuôi cấy phát sinh phôi vô tính cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis amabilis), đặc biệt

D-fructose lại có tác động rất xấu đến mẫu cấy (gây chết 100% mẫu cấy) và disaccharide lại thích hợp hơn cho việc phát sinh phôi vô tính từ mẫu mô sẹo Môi trường nuôi cấy

có bổ sung 20g/l sucrose sẽ cho hiệu quả phát sinh phôi cao nhất

Hiện nay, có 25 loài virus đã được phát hiện trên cây hoa lan, trong đó,

Cymbidium mosaic virus (CyMV) và Odontoglossum ringspot virus (ORSV), chúng

gây hại phổ biến trên các giống lan thương phẩm và phân bố rộng khắp thế giới Do

đó, Viện Khoa học Kỹ thuật Miền Nam đã “Ứng dụng phương pháp RT-PCR trong

chẩn đoán virus gây bệnh khảm vàng CYMV và bệnh đốm vòng trên cây hoa lan Denrobium và Phalaenopsis” nhằm xác định sớm và chính xác virus ngay từ nguồn chồi hay protocorm ban đầu, phục vụ cho sản xuất cây giống in vitro sạch bệnh

(Nguyễn Quỳnh Chi, 2007)

Từ những nghiên cứu trên cho thấy, ngành nuôi cấy mô của Việt Nam phát triển rất nhanh nhưng bên cạnh đó còn gặp phải những vấn đề về nguồn giống, hay các môi

trường còn chưa thích hợp nên chưa thể áp dụng rộng rãi nhằm tạo một thương hiệu về hoa lan cho Việt Nam trên thị trường thế giới

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 15/02/2011 đến tháng 06/2011, tại phòng nuôi cấy mô Bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm

Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Giống

Giống lan Vũ Nữ (Oncidium sp.) được lấy từ phòng nuôi cấy mô Bộ môn Di

truyền – Giống, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), một phòng thí nghiệm cấy tế bào thường phải có:

+ Phòng rửa dụng cụ: bồn rửa, tủ đựng các dụng cụ thủy tinh

+ Phòng chuẩn bị môi trường phải có chỗ để hóa chất, bình thủy tinh và các dụng cụ để pha môi trường như pH kế, cân, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng, tủ lạnh đựng hóa chất, dụng cụ nấu môi trường, các dụng cụ thủy tinh khác

+ Phòng cấy vô trùng: đèn UV, tủ cấy (đèn trắng và đèn UV)

+ Phòng nuôi mẫu cấy: kệ, đèn trắng, máy điều hòa nhiệt độ và nhiệt kế

3.2.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy dùng trong các thí nghiệm là môi trường cơ bản MS và môi trường Knudson C

Thành phần của các môi trường cơ bản, tính theo nồng độ (mg/l)

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh bằng NaOH và HCl để pH = 5,8

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Môi trường được khử trùng bằng Autoclave ở áp suất 1 atm, nhiệt độ 1210C trong

20 phút

Ẩm độ trung bình 70 – 80 %, cường độ chiếu sáng: 2000 lux, thời gian chiếu sáng: 26 ± 20C

3.2.5 Các loại dịch chiết hữu cơ và cách ly trích dịch chiết

- Các loại dịch chiết được sử dụng trong thí nghiệm là dứa, đu đủ và chuối

- Cách ly trích dịch chiết:

+ Gọt bỏ vỏ

+ Dùng máy xay và lọc để loại bỏ xác

+ Sau đó cho vào môi trường nuôi cấy

3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của liều lượng nước dừa trong môi trường nền MS, ½ MS và Knudson C lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ

Oncidium sp in vitro

3.3.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại nhằm xác định ảnh hưởng của nước dừa và các môi trường cấy lên sự sinh trưởng của cây

Yếu tố A: môi trường cơ bản, gồm có 3 môi trường là MS, ½ MS, Knudson C Yếu tố B: liều lượng nước dừa, có 4 mức nước dừa: 0, 130, 150 và 170 ml/l Hai yếu tố A và B kết hợp thành 12 nghiệm thức

Các nghiệm thức được bố trí như sau:

Môi trường (A) Liều lượng nước dừa (ml/l) (B)

0 130 150 170

½ MS A2B1   A2B2   A2B3   A2B4  

Knudson C A3B1   A3B2   A3B3   A3B4  

3.3.2 Quy mô thí nghiệm

- Số nghiệm thức: 12

- Số lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức: 3

- Số mẫu/chai: 3

- Số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 2 x 3 = 6

- Số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 6 x 3 = 18

- Tổng số mẫu: 12 x 18 = 216

- Mẫu: cây con của lan Vũ Nữ Oncidium sp

3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của một số dịch chiết và hàm

lượng đường lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ in vitro

3.4.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại nhằm xác định ảnh hưởng của 3 loại dịch chiết và hàm lượng đường lên sự sinh trưởng của cây

Yếu tố A: dịch chiết, gồm có 3 loại dịch chiết là dứa, đu đủ và chuối già chín Yếu tố B: hàm lượng đường, có 4 mức nước dừa: 0, 10, 20 và 30 g/l

Hai yếu tố A và B kết hợp thành 12 nghiệm thức

Các nghiệm thức được bố trí như sau:

Dịch chiết (A) Hàm lượng đường (g/l) (B)

0 10 20 30 Dứa A1B1  A1B2  A1B3  A1B4 

Đu đủ A2B1   A2B2   A2B3   A2B4  

Chuối A3B1   A3B2   A3B3   A3B4  

Các liều lượng dịch chiết được sử dụng trong thí nghiệm có các nồng độ như sau: dứa 100 ml/l, đu đủ 25 ml/l và chuối 100 ml/l

3.4.2 Quy mô thí nghiệm

- Số nghiệm thức: 12

- Số lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức: 3

- Số mẫu/chai: 3

- Số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 2 x 3 = 6

- Số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 6 x 3 = 18

- Tổng số mẫu: 12 x 18 = 216

- Mẫu: cây lan Vũ Nữ Oncidium sp

3.5 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Chiều cao cây: đo từ mặt thạch lên đến chữ V trên cùng

Số lá: đếm toàn bộ số lá trên cây

Chiều dài lá: đo từ nách lá đến đỉnh lá sau 90 ngày cấy

Chiều rộng lá: đo từ mép lá bên này sang mép lá bên kia sau 90 ngày cấy

Số chồi: đếm toàn bộ số chồi trên cây

Số rễ: đếm toàn bộ số rễ và đo toàn bộ số rễ/cây

Đường kính thân: dùng thước đo đoạn thân lớn nhất của cây sau 90 ngày cấy Trọng lượng tươi: dùng cân điện tử cân và tính trung bình trọng lượng tươi trong cùng một bình sau 90 NSC bằng cân điện tử

Các chỉ tiêu được đo sau 15 NSC và kết thúc sau 90 NSC

3.6 Xử lý số liệu

Số liệu được tính toán bằng EXCEL, và phân tích thống kê bằng chương trình MSTATC

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của liều lượng nước dừa trong môi trường nền MS, ½ MS và Knudson C lên sự sinh trưởng của cây lan Vũ Nữ

Oncidium sp in vitro

Kinetin là hoạt chất có nhiều trong nước dừa, là một chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào, kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy trong nuôi cấy mô

Nhằm xác định sự kết hợp giữa các liều lượng nước dừa 0, 130, 150, 170 ml/l và các môi trường nền MS, ½ MS, Knudson C ảnh hưởng như thế nào đến quá trình nuôi

cấy cây lan vũ nữ Oncidium sp., do đó, chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm này

4.1.1 Ảnh hưởng của nước dừa và các môi trường đến chiều cao của

lan Vũ Nữ in vitro

Chiều cao cây là một trong những chỉ tiêu quan trọng đánh giá sự sinh trưởng

và phát triển, chiều cao cây tăng dần theo từng giai đoạn sinh trưởng của cây và trong môi trường nuôi cấy khác nhau thì sự sinh trưởng cũng khác nhau Để đánh giá sự khác nhau qua các giai đoạn chúng ta hãy theo dõi kết quả bảng 4.1:

- Giai đoạn 15 – 30 NSC, sự khác biệt giữa các NT không có ý nghĩa thống kê, dao động từ 0,34 đến 0,49 cm/cây ở 15 NSC và từ 0,39 đến 0,56 cm/cây ở 30 NSC

- Giai đoạn 45 NSC, môi trường MS và liều lượng nước dừa ở mức 150 ml/l đạt chiều cao cây cao nhất (0,60 và 0,64 cm/cây), và thấp nhất là môi trường Knudson C

và mức 0 ml/l CW (0,52 và 0,52 cm/cây) Yếu tố môi trường và liều lượng nước dừa

có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê Đối với tương tác giữa 2 yếu tố, sự khác biệt rất có có ý nghĩa về mặt thống kê, chiều cao cây đạt cao nhất là 0,65 cm/cây (MS

và ½ MS + 150 ml/l CW), 0,64 cm/cây (MS + 170 ml/l CW), 0,62 cm/cây (1/2 MS +