ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ VÀ KIỂM CHỨNG TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ CHANH VOLKA (Citrus volkarmeriana)

− Chỉ kiểm chứng 3 tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ là tuyến trùng Pratylenchus spp., nấm Fusarium sp.. 2.2 Bệnh vàng lá thối rễ cây có múi và tác nhân 2.2.1 Một số nghiên cứu trong nư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ VÀ KIỂM CHỨNG TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI

RỄ CHANH VOLKA (Citrus volkarmeriana)

NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT KHÓA: 2007 - 2011 SINH VIÊN THỰC HIỆN: ĐỖ THỊ NHẠN

Tiền Giang, tháng 07 năm 2011

ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ VÀ KIỂM CHỨNG TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI

RỄ CHANH VOLKA (Citrus volkarmeriana)

Tiền Giang, tháng 07/2011

LỜI CẢM TẠ

Đầu tiên, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành, tha thiết đến cha mẹ, người đã sinh

ra, hết lòng nuôi dạy, động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập

Chân thành biết ơn:

− TS Từ Thị Mỹ Thuận - Khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và ThS Đặng Thùy Linh - Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Cây Ăn Quả Miền Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

− Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm khoa Nông học cùng toàn thể các quý thầy cô đã luôn hết lòng giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian tôi theo học tại trường

− Ban lãnh đạo Viện Cây Ăn Quả Miền Nam, các anh chị trong Viện, đặc biệt các anh chị trong Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

− Ngoài ra còn có những người bạn đã giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong học tập và động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tiền Giang, tháng 07/2011

Đỗ Thị Nhạn

TÓM TẮT

Đỗ Thị Nhạn, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm

2011 Thực hiện đề tài “Điều tra tình hình bệnh vàng lá thối rễ và kiểm chứng tác

nhân gây bệnh vàng lá thối rễ chanh Volka (Citrus volkarmeriana)”

Giáo viên hướng dẫn:

TS Từ Thị Mỹ Thuận - Khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

ThS Đặng Thùy Linh - Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Cây Ăn Quả Miền Nam

Đề tài thực hiện từ tháng 02/2011 đến 07/2011 tại Bộ Môn BVTV - Viện Cây

Ăn Quả Miền - Long Định - Châu Thành - Tiền Giang

Gồm các nội dung:

− Điều tra tình hình bệnh vàng lá thối rễ, thu mẫu và trích lọc tuyến trùng

Pratylenchus spp trên các vườn cam sành sử dụng gốc ghép chanh Volka tại huyện

Cái Bè - Tiền Giang

− Xác định mật số của tuyến trùng Pratylenchus spp ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và phát triển của chanh Volka

− Đánh giá ảnh hưởng của các mức mật số bào tử ở 2 dòng nấm Fusarium sp và Phytophthora sp đến sự đến sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka

− Đánh giá ảnh hưởng tương tác giữa tuyến trùng Pratylenchus spp., nấm Fusarium

sp và Phytophthora sp trong sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka

Một số kết quả đạt được:

™ Qua điều tra:

− Cho thấy tất cả vườn điều tra ở Mỹ Lương và Mỹ Lợi A (Cái Bè - Tiền Giang) đều nhiễm vàng lá thối rễ

− Tuyến trùng Pratylenchus spp có liên quan các vườn cam sành sử dụng gốc ghép chanh Volka ở Mỹ Lương và Mỹ Lợi A với mật số Pratylenchus spp trong 1g rễ (63

con; 35 con) và trong 200 ml đất (49 con; 48con)

™ Trong điều kiện nhà lưới:

− Tuyến trùng Pratylenchus spp đã gây triệu chứng vàng lá thối rễ và với mật số

10 con/chậu đã làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của chanh Volka

− Nấm Fusarium sp và Phytophthora sp đều gây ra triệu chứng bệnh vàng lá thối

rễ trên chanh Volka Tất cả các mức mật số bào tử thí nghiệm của nấm Fusarium sp

và Phytophthora sp đều có ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chanh Volka Chủng nấm Phytophthora sp thì các chỉ tiêu sinh trưởng của chanh Volka giảm nhiều hơn nấm Fusarium sp

− Chủng đơn hay chủng kết hợp giữa tuyến trùng Pratylenchus spp., nấm Fusarium

sp và Phytophthora sp đều gây ra triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka Trong đó, chủng đồng thời 3 tác nhân tuyến trùng Pratylenchus spp., nấm Fusarium sp và Phytophthora sp thì bệnh trầm trọng hơn chủng đơn hay chủng kết hợp 2 tác nhân với

nhau

MỤC LỤC

Trang

TRANG TỰA i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH ix

Chương 1   GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1Mục đích 2

1.2.2Yêu cầu 2 1.3Giới hạn nghiên cứu 3

Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1Sơ lược về chanh Volka - Citrus volkameriana 4

2.2Bệnh vàng lá thối rễ cây có múi và tác nhân 4

2.2.1Một số nghiên cứu trong nước 4

2.2.2Một số nghiên cứu ngoài nước 6

2.3Tổng quan về tuyến trùng Pratylenchus spp 7

2.3.1Phân loại 7

2.3.2Sơ lược về đặc điểm hình thái và sinh học của tuyến trùng Pratylenchus spp 7

2.3.3Phân bố và phổ kí chủ của tuyến trùng Pratylenchus spp 10

2.3.4Phương thức gây hại của tuyến trùng Pratylenchus spp 11

2.4Sơ lược về nấm Fusarium sp 12

2.4.1Phân loại 12

2.4.2Đặc điểm hình thái của nấm Fusarium sp 12

2.4.3Sự phân bố và phổ kí chủ 13

2.4.4Đặc điểm và điều kiện gây hại của nấm Fusarium sp đối với cây trồng 14

2.4.5Quá trình xâm nhiễm của nấm Fusarium sp 14

2.5Sơ lược về nấm Phytophthora sp 15

2.5.1Phân loại (theo Hawksworth và ctv, 1995) 15

2.5.2Đặc điểm hình thái, sinh học và điều kiện gây hại 15

2.5.3Sự phân bố và phổ kí chủ 16

2.5.4Tác hại do Phytophthora sp 17

2.6Sự tương tác gây hại cây trồng giữa tuyến trùng và nấm 17

Chương 3   VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

3.2Nội dung nghiên cứu 20

3.3Vật liệu và phương tiện nghiên cứu 20

3.4Phương pháp nghiên cứu 22

3.4.1Phương pháp điều tra tình hình bệnh vàng lá thối rễ, thu mẫu và trích lọc tuyến trùng Pratylenchus spp 22

3.4.2Phương pháp xác định mật số của tuyến trùng Pratylenchus spp ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chanh Volka 23

3.4.3Đánh giá ảnh hưởng của mật số bào tử ở 2 dòng nấm Fusarium sp và Phytophthora sp đến sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka 26

3.4.4Đánh giá ảnh hưởng tương tác giữa tuyến trùng Pratylenchus spp và nấm Fusarium sp., Phytophthora sp trong sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka 30 3.4.5Phương pháp xử lý số liệu 32

Chương 4   KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1Tình hình bệnh vàng lá thối rễ và kết quả trích lọc tuyến trùng trên các vườn cam sành sử dụng gốc ghép chanh Volka 33

4.2Ảnh hưởng của mật số tuyến trùng Pratylenchus spp đến sự sinh trưởng và pháttriển của chanh Volka 38

4.3Kết quả ảnh hưởng của mật số bào tử nấm Fusarium sp và Phytophthora sp đến sự sinh trưởng và phát triển của chanh Volka 44

4.4 Ảnh hưởng tương tác giữa tuyến trùng Pratylenchus spp và nấm Fusarium sp.,

Phytophthora sp trong sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka 54

Chương 5   KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

5.1Kết luận 61

5.2Đề nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 68

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BVTV: Bảo Vệ Thực Vật

CCM: cây có múi Ctv: cộng tác viên

CV: Coefficient of Variation - Độ lệch tiêu chuẩn tương đối ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long

F solani: Fusarium solani

P coffeae: Pratylenchus coffeae

P citrophthora: Phytophthora citrophthora

PDA: Potato Dextrose Agar VCAQMN: Viện Cây Ăn Quả Miền Nam

VLTR: vàng lá thối rễ

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Các nghiệm thức trong thí nghiệm xác định mật số của tuyến trùng

Pratylenchus spp ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chanh Volka 24

Bảng 3.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của mật số bào tử

nấm Fusarium sp đến sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka 26

Bảng 3.3 Các nghiệm thức sử dụng trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của mật số

bào tử nấm Phytophthora sp đến sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka

28

Bảng 3.4 Các nghiệm thức trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng tương tác giữa tuyến

trùng Pratylenchus spp và nấm Fusarium sp., Phytophthora sp 31

Bảng 4.1: Kết quả điều tra tình hình bệnh vàng lá thối rễ trên các vườn cam sành sử

dụng gốc ghép chanh Volka tại Cái Bè - Tiền Giang 36

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của mật số Pratylenchus spp đến sự sinh trưởng và phát triển

của chanh Volka và các chỉ tiêu theo dõi về tuyến trùng ở 13 tuần sau chủng 42

Hình 4.5: Tuyến trùng Pratylenchus spp trong vỏ rễ chanh Volka sau nhuộm rễ 44 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của mật số bào tử nấm Fusarium sp đến sự sinh trưởng và phát

triển của chanh Volka ở 11 tuần sau chủng 45

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của mật số bào tử nấm Phytophthora sp đến sự sinh trưởng và

phát triển của chanh Volka ở 11 tuần sau chủng 49

Bảng 4.5: Ảnh hưởng kết hợp giữa Pratylenchus spp và nấm Fusarium sp.,

Phytophthora sp lên sự sinh trưởng và phát triển của chanh Volka và các chỉ tiêu theo dõi về tuyến trùng Pratylenchus spp ở 9 tuần sau chủng 58

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1: Tuyến trùng Pratylenchus spp 21 Hình 3.2: Nấm Fusarium sp 21 Hình 3.3: Nấm Phytophthora sp 22 Hình 4.3: Tán lá chanh Volka sau 13 tuần chủng tuyến trùng Pratylenchus spp so

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Những năm gần đây, cây có múi thuộc họ Rutaceae phát triển mạnh tại vùng ĐBSCL với diện tích gần 80.000 ha, và sản lượng khoảng 532.000 tấn/năm Cây có múi là một trong những loại cây trồng có nhiều lợi thế, mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà vườn (baonongnghiep, 2008) Mặc dù diện tích gia tăng nhưng năng suất đạt được của các vườn trồng cây có múi thường rất bấp bênh, nông dân gặp rất nhiều khó khăn trong canh tác, không những do vấn đề giá cả mà còn do vấn đề dịch hại gây ra trên cây có múi

Bệnh vàng lá thối rễ là một bệnh phổ biến và là nguyên nhân làm cho các vườn cây có múi ở các tỉnh ĐBSCL thiếu tính bền vững Trong đó, tuyến trùng cũng là một trong các tác nhân gây hại quan trọng (Reddy và Singh, 1979) Trên thế giới có khoảng hơn 40 loài tuyến trùng gây hại cây có múi

Năm 2000, khoảng trên 1.300 ha quýt tiều Lai Vung bị chết do bệnh vàng lá thối rễ Trong các năm 2001 - 2004, vùng trồng cam mật tại hai huyện Trà Ôn và Tam Bình của tỉnh Vĩnh Long cũng bị bệnh thối rễ và chết dần Theo đánh giá của cán bộ địa phương số cây bị chết có thể lên đến 40% diện tích cam của hai huyện tại thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang, bệnh vàng lá thối rễ cũng gây hại khá nghiêm trọng ở các vườn trồng cam và quýt đường (Phạm Văn Kim, 2004)

Trước tình hình trên để hạn chế bệnh vàng lá thối rễ của các vườn cây có múi ở ĐBSCL thì một trong những biện pháp hữu hiệu nhất là chọn trồng giống có gốc ghép kháng bệnh Và hiện nay loại gốc ghép được sử dụng phổ biến nhất tại ĐBSCL là cây chanh Volka Sở dĩ, chanh Volka được chọn làm gốc ghép là do nó có một số ưu điểm như sinh trưởng mạnh, dễ tương dung, chịu đất thịt pha cát, chống chịu bệnh Tristeza, làm cho cây mọc mạnh, ra quả sớm, năng suất cao, quả to (Nguyễn Văn Kế, 2008)

Phạm Văn Kim (1997) đã chứng minh tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ của

cam mật (Citrus cinensis) và quýt tiều (C reculata) là do nấm Fusarium solani Đến

năm 2002, Lê Thị Thu Hồng và Lâm Thị Mỹ Nương cho rằng nguyên nhân gây ra

bệnh vàng lá thối rễ quýt Hồng ở Lai Vung, Đồng Tháp chủ yếu là do nấm Fusarium, Phytophthora và Pythium Bên cạnh đó, cũng có sự hiện diện của các loại tuyến trùng hại rễ như Pratylenchus cofeae, Radopholus similis, Tylenchulus semipenetrans, Meloidogyne sp Theo những ghi nhận gần đây thì tuyến trùng Pratylenchus spp hiện

diện rất phổ biến và với mật số rất cao trong rễ cây có múi bị vàng lá thối rễ mà đặc biệt là những vườn cây có múi sử dụng gốc ghép là chanh Volka

Vì vậy, đề tài “Điều tra tình hình bệnh vàng lá thối rễ và kiểm chứng tác

nhân gây bệnh vàng lá thối rễ chanh Volka (Citrus volkarmeriana)” được thực

− Chuẩn bị chậu, đất và trồng chanh Volka từ cành giâm

− Thu mẫu và trích lọc tuyến trùng Pratylenchus spp từ rễ cây có múi phục vụ cho

các thí nghiệm chủng bệnh nhân tạo trong nhà lưới

− Phân lập nấm Fusarium sp từ rễ cây có múi biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ

− Nhân sinh khối nấm Fusarium sp.và Phytophthora sp., trong điều kiện in vitro

− Tiến hành chủng tuyến trùng Pratylenchus spp., nấm Fusarium sp., Phytophthora

sp vào gốc chanh Volka con bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo vào đất

− Theo dõi ảnh hưởng của tuyến trùng Pratylenchus spp và nấm Fusarium sp., Phytophthora sp đến sự sinh trưởng và sống sót của chanh Volka trong điều kiện nhà

lưới

− Điều tra và trích lọc tuyến trùng Pratylenchus spp trên cây cam sành sử dụng gốc

ghép chanh Volka tại huyện Cái Bè - Tiền Giang

1.3 Giới hạn nghiên cứu

− Chỉ tiến hành điều tra bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam sành sử dụng gốc ghép chanh Volka tại huyện Cái Bè - Tiền Giang

− Chỉ kiểm chứng 3 tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ là tuyến trùng Pratylenchus spp., nấm Fusarium sp và Phytophthora sp

− Các thí nghiệm chủng bệnh nhân tạo được tiến hành trong điều kiện nhà lưới

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về chanh Volka - Citrus volkameriana

Giống chanh Volka (Citrus volkameriana) là giống lai giữa chanh tây và cam

chua, có nguồn gốc từ Ý (Nguyễn Thanh Bình và ctv, 2007) Chanh Volka là loại gốc ghép “đa năng” nhất là khi ghép với chanh, chanh ta và một số cây có múi khác (Nguyễn Công Thiện và ctv, 1999)

Theo Castle và ctv (1993) chanh Volka được chọn làm gốc ghép là do nó có các đặc tính: sinh trưởng tốt, dễ ghép, dễ nhân giống, tỉ lệ nảy mầm cao, dễ giâm cành, gốc ghép tạo nên tổ hợp với giống được ghép, độ đồng đều cao: giống đa phôi, thích nghi điều kiện nơi trồng như đất đai, nguồn nước, thời tiết và cuối cùng là kháng và chống chịu với một số dịch hại nguy hiểm Ngoài ra, nó có khả năng kháng các muối clorua, thích ứng tốt với các vùng đất khô hạn nhưng cần các loại đất thoáng khí, chịu đựng trung bình ở đất nặng và chịu đựng kém các loại đất yếm khí, không thông thoáng (Nguyễn Công Thiện và ctv, 1999)

Loại gốc ghép chanh Volka này kháng tốt bệnh chảy mủ do Phytophthora và nó

tạo nên các tổ hợp kháng các bệnh virus (Tristeza, exocortis), chống chịu bệnh sẹo ghẻ, nhưng lại mẫn cảm với bệnh cháy lá (Nguyễn Công Thiện và ctv, 1999) Tuy nhiên, Labuschagne và ctv (1996) cho rằng chanh Volka là giống rất mẫn cảm với nấm

Fusarium solani

2.2 Bệnh vàng lá thối rễ cây có múi và tác nhân

2.2.1 Một số nghiên cứu trong nước

Phytophthora citrophthora được ghi nhận lần đầu tiên trên cam ở vùng ĐBSCL

vào năm 1950 và sau đó không được quan sát thấy, cho đến tận năm 1970 đã được tìm thấy trên cây cam ở miền Bắc và miền Trung của Việt Nam Sau đó, bệnh đã nhanh

chóng lan rộng và hiện nay có ảnh hưởng đến quả của tất cả các vùng như Thanh Trà (Thừa Thiên Huế), Ninh Bình, Tiền Giang (Viện Cây Ăn Quả Miền Nam, 2005)

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Kim và ctv (1997) đã chứng minh tác

nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cam mật (Citrus sinensis) và quýt tiều (Citrus reticulata) qua các bước của quy trình Koch đã công bố tác nhân gây bệnh là do nấm

F solani

Đến năm 2002, Nguyễn Thị Thu Cúc và Phạm Hoàng Oanh cho rằng tác nhân

gây ra bệnh vàng lá thối rễ là do nấm F solani tấn công vào chóp rễ và làm thối rễ Nếu cây bị ngập úng làm rễ suy yếu hoặc do tuyến trùng (Pratylenchus coffeae, Radopholus similes, Tylenchulus semipenetrans, Meloidogyne sp.) chích hút tạo vết thương và từ đó nấm (Fusarium spp., Phytophthora sp., Pythium sp.) tấn công gây hại

làm cây bị bệnh trầm trọng và chết nhanh hơn Ngoài ra, nấm còn kích thích cây tạo ra ethylene làm lá vàng nhanh và rụng sớm

Lê Thị Thu Hồng và Lâm Thị Mỹ Nương (2002) cho rằng bệnh vàng lá chết

nhanh trên quýt tiều tại Lai Vung - Đồng Tháp là do Fusarium sp., Phytophthora sp., Pythium sp và bên cạnh đó cũng có sự xuất hiện của tuyến trùng ký sinh Trong đó Fusarium solani là tác nhân quan trọng Ngoài ra, do bệnh vàng lá thối rễ thường kết

hợp với các bệnh Greening và Tristeza nên gây triệu chứng chết nhanh cho cây quít tiều

Dương Minh và ctv (2003) đã chủng Koch trên cây quýt tiều con với biện pháp

trồng cây con trên đất không hữu cơ và chủng vào bào tử nấm F solani với mật số

105/300 gram đất và có kết luận là nấm F solani là tác nhân gây bệnh VLTR trên cây

có múi tại các tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Tiền Giang

Theo kết quả điều tra và phân lập các vườn cây có múi tại huyện Châu Thành, Cái Bè (Tiền Giang), huyện Tam Bình, Trà Ôn, Bình Minh (Vĩnh Long), phường Long Tuyền (Tp Cần Thơ) và Lai Vung (Đồng Tháp) cho thấy hầu hết các vườn bị vàng lá

thối rễ do tập đoàn nấm đất gây ra như: Fusarium sp., Pythium sp., Phytophthora trong

đó Fusarium có tần số xuất hiện cao nhất và có sự hiện diện của tuyến trùng

Pratylenchus sp., Tylenchulus sp., Radopholus sp., Meloidogyne sp., …(Nguyễn Ngọc

Anh Thư và ctv, 2005)

Nguyễn Ngọc Anh Thư và Nguyễn Văn Hòa (2006) đã tiến hành thử nghiệm khả

năng nhiễm P nicotianae và F solani trên 8 giống cây có múi trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả trong đĩa Petri và trong ly nhựa cho thấy nấm P nicotianae gây hại nặng hơn và phát triển nhanh hơn nấm F solani

2.2.2 Một số nghiên cứu ngoài nước

Theo báo cáo của Siddiqi (1964) hầu hết cây có múi ở Ấn Độ, Nhật và Mỹ bị thối

rễ là do P coffeae

Theo Timmer và ctv (1979) thì ở Florida, F oxysporum là nguyên nhân gây héo

và chết ngọn ở chanh Mexico Còn F solani chủ yếu tấn công vào bộ rễ (Agrios,

2004)

Sự kết hợp giữa F solani và P parasitica hay giữa F solani và P citrophthora đều gây VLTR cây có múi nhưng phụ thuộc vào thời điểm chủng F solani hay Phytophthora spp Chủng F solani và P parasitica hay giữa F solani và P citrophthora thì mức độ thối rễ sẽ nặng hơn so với chỉ chủng P citrophthora hay P parasitic Chủng F solani vào đất trước sau đó nhúng rễ cây vào dung dịch chứa động bào tử của Phytophthora rồi trồng cây lại vào chậu đất đã chủng F solani Nhưng bệnh thối rễ không tăng khi chủng Fusarium và Phytophthora cùng lúc hay khi chủng Fusarium trước Ở hầu hết các thí nghiệm nhưng không phải tất cả các thí nghiệm, F solani làm giảm sự phát triển chiều cao cây hay chiều dài rễ (Dandurand and Menge,

1992)

Labuschagne và ctv (1996) cho rằng nấm Fusarium solani tấn công và gây hại nặng trong điều kiện bất lợi kéo dài Bệnh thối rễ cây có múi do nấm Fusarium solani

sẽ nặng hơn trong điều kiện ngập nước, bón nhiều phân ure, tinh bột dự trữ trong rễ

giảm và có sự hiện diện của tuyến trùng Tylenchulus semipenetrans

Olsen và ctv (2000) cho rằng bệnh vàng lá thối rễ cây có múi xảy ra khi cây bị suy yếu gặp điều kiện ngập úng và các điều kiện bất lợi kéo dài như thừa phân, tuyến trùng và kèm theo nhiệt độ khá cao (>25oC) là điều kiện cho nấm Fusarium phát triển mạnh Ngoài ra, Phytophthora parasitica và P citrophthora là hai loại nấm gây thối

gốc phổ biến trên những giống cam quýt ở Arizona Trong điều kiện khô ráo thì chúng tấn công gây hại vào rễ và phần mô vỏ ở gốc cây Còn trong điều kiện ẩm ướt, 2 loại

nấm này gây hại ở trái và mô vỏ ở thân P parasitica và P citrophthora phát tán rất

nhanh do động bào tử bơi được trong nước và lây lan nhờ nước mưa, nước tưới Những động bào tử này tấn công vào chóp rễ, làm cho rễ bị mục nát và thối đen (Olsen

và ctv., 2000)

Theo nhận định của Koizumi và ctv (2006) thì bệnh vàng lá thối rễ cây có múi là

do nấm Phytophthora tấn công gây hại trước, rồi Fusarium là nấm tấn công và gây hại sau nhưng nấm Fusarium lại phát triển nhanh và mạnh hơn nấm Phytophthora

2.3 Tổng quan về tuyến trùng Pratylenchus spp

2.3.1 Phân loại

Hệ thống phân loại theo Siddiqi (2000)

Ngành: Nematoda Rudolphi, 1808 Lớp: Secernentea von Linstow, 1905 Phân lớp: Tylenchida Inglis, 1983

Bộ: Tylenchida Thorne, 1949

Bộ phụ: Tylenchina Thorne, 1949 Liên họ: Hoplolaimoidea Filipjev, 1934

Họ: Pratylenchidae Thorne, 1949 Phân họ: Pratylenchidae Thorne, 1949

Giống: Pratylenchus Filipjev, 1936

2.3.2 Sơ lược về đặc điểm hình thái và sinh học của tuyến trùng Pratylenchus spp Đặc điểm hình thái

Pratylenchus cả con đực lẫn con cái đều có dạng giun tròn, dài từ 0,4 - 0,7 mm

và đường kính 20 - 25 µm (Agrios, 2004) Chiều dài cơ thể ở những loài Pratylenchus

có giá trị khác nhau, chiều dài trung bình là 0,5 mm ở loài P neglectus, ngắn nhất là 0,36 mm ở P angulatus và dài nhất là 0,74 mm ở P morettoi, P coffeae dài không

quá 1mm (Castillo và ctv, 2007) Cơ thể con cái thẳng hoặc hơi cong về phía bụng Cơ

thể P coffeae đực thường mảnh hơn con cái (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ

Thanh, 2000)

P coffeae có đặc trưng là vùng đầu ngắn và phẳng, vùng môi được chia thành 2

- 4 đốt (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 2000)

Kim chích của Pratylenchus thì ngắn và khỏe Chiều dài kim chích ở những loài Pratylenchus khác nhau khoảng 1 - 3 µm Chiều dài kim chích là 1,8 µm ở P brachyurus và P penetrans; 2,4 µm ở loài P vulnus, P coffeae và P scribneri; 3,0

µm ở P Zeae (Castillo và ctv, 2007)

Theo Castillo và ctv (2007) đuôi Pratylenchus có các hình dạng như hình chóp

đầu tròn , hình ngón đầu nhọn, hình chóp đầu nhọn, hình bán cầu, hình chóp cụt, hình

ngón đầu tròn; còn đỉnh đuôi thì có vòng, khe hay trơn P brachyurus, P scribneri, P coffeae thì đuôi có dạnh hình chóp, đỉnh đuôi tròn và nhẵn P brachyurus có đỉnh đuôi dài hơn 2 loài còn lại, đỉnh đuôi có lớp cutin dày và trong suốt P zeae, P penetrans

và P vulnus có những hình dạng đuôi khác nhau P zeae thì hình dạng đuôi có những

dạng khác nhau như hình ngón đỉnh tròn, nhẵn, hình chóp đỉnh tròn, nhẵn, hình ngón

đỉnh nhọn có khe Đuôi của P vulnus dạng nhọn và hình chóp cụt với nhiều loại khác

nhau đỉnh bầu, trơn và có vòng đốt

P coffeae có tuyến thực quản kéo dài che phủ ruột Con cái có lỗ sinh dục cái ở

phía dưới đuôi khoảng 70 - 80% chiều dài cơ thể tính từ đầu Cơ thể con cái thẳng hoặc hơi cong về phía bụng Khoảng cách từ lỗ sinh dục cái đến lỗ hậu môn bằng 3 - 4

lần đường kính cơ thể Đuôi con P coffeae cái bằng, đỉnh đuôi nhẵn Con P coffeae

đực đuôi hình chóp, gai sinh dục cong về phía bụng, tuyến sinh dục đực chiếm ½ chiều dài cơ thể Cánh đuôi của con đực kéo dài đến tận cùng mút đuôi, đường viền của đuôi hơi nhăn nheo như dạng sóng (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 2000)

Đặc điểm sinh học

Pratylenchus spp là tuyến trùng nội kí sinh di động hút dinh dưỡng cây kí chủ,

sinh sản và di chuyển tự do trong mô cây Cả con đực, con cái, ấu trùng Pratylenchus

đều tấn công và gây hại rễ Sau khi xâm nhập vào rễ, chúng di chuyển gây hại giữa các

mô rễ, đẻ trứng vào mô rễ Trứng nở và tiếp tục vòng đời khoảng 27 ngày ở 27 - 30oC

(Brown và ctv, 1997) Pratylenchus là tuyến trùng di động với khả năng di chuyển 1 -

2 m từ vùng rễ mà chúng gây hại Sự xuất hiện của nó trong đất và cây trồng chỉ khi nước, cấu trúc đất thích hợp và nhiệt độ đất nằm trong phạm vi hoạt động (Castillo và ctv, 2007)

Chủng Pratylenchus coffeae với mật số ban đầu 140 con, sau chủng 2 tháng mật

số đạt 7653 con/1g rễ Tuyến trùng Pratylenchus coffeae làm trọng lượng tươi của Citrus jambhiri giảm 38% và trọng lượng rễ giảm 47% (Radewald và ctv 1971)

Vòng đời của Pratylenchus được nghiên cứu trên một vài cây kí chủ ở điều kiện phòng thí nghiệm như sau: trên cỏ 3 lá đỏ Pratylenchus penetrans đã hoàn thành 1 thế

hệ trong 54 - 65 ngày và 1 con cái đẻ ra 16 - 35 trứng với tỷ lệ 1 - 2 trứng /ngày Vòng

đời của P vulnus trên những đĩa cà rốt dưới những điều kiện kiểm soát mất 3 - 4 tuần

(Castillo và ctv, 2007) Theo báo cáo của O’Bannon và Tomerlin (1969) khi chủng vào

cây con C limon mật số số 20 P coffeae thì sau 36 tuần mật số tăng lên 10.000 P coffeae/g rễ

Vòng đời của P coffeae khoảng 30 ngày (Whitehead, 1998) Đối với P coffeae

thì tất cả các dạng ấu trùng và thành trùng đều có khả năng xâm nhập vào trong rễ Chúng có thể rời khỏi mô rễ bất cứ lúc nào, sống một thời gian trong đất và tìm đến

vật chủ mới, sau khi xâm nhập vào trong rễ chúng có thể sinh sản nhanh và tăng số

lượng lên rất lớn Toàn bộ chu kỳ sống của tuyến trùng P coffeae có thể xảy ra trong

mô thực vật (Nguyễn Ngọc Châu và ctv, 2001) Thời gian yêu cầu để hoàn thành vòng đời thay đổi đáng kể phụ thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm

™ Nhiệt độ

Tuyến trùng Pratylenchus là sinh vật biến nhiệt, do đó nhiệt độ ảnh hưởng tiến

trình sinh lý như sự di chuyển, phát triển và sinh sản Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển

của các loài Pratylenchus là khác nhau Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh sản của P coffeae trên rễ Citrus jambhiri là 29,5oC (Radewald và ctv, 1971)

™ Ẩm độ đất

Độ ẩm đất là cần thiết cho tiến trình sống của Pratylenchus và là yếu tố quan

trọng trong quá trình tăng mật số của tuyến trùng Nghiên cứu mối quan hệ giữa ẩm độ đất và hoạt động của tuyến trùng cho thấy rằng 70 - 80% đất trồng có khả năng cung

cấp điều kiện tốt nhất P coffeae có thể tồn tại 8 tháng trong đất ẩm khi không có mặt

cây kí chủ (Colbran, 1954)

™ pH đất

Đất chua là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của tuyến trùng

Tuyến trùng Pratylenchus thích nghi rộng với nhiều mức pH khác nhau của đất và vì

vậy mật số nó vẫn tăng ở điều kiện pH thấp Có một vài nghiên cứu cho biết pH tốt

nhất cho những loài Pratylenchus tùy thuộc vào cây kí chủ (Castillo và ctv, 2007)

2.3.3 Phân bố và phổ kí chủ của tuyến trùng Pratylenchus spp

Pratylenchus xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới và có phổ kí chủ rộng Pratylenchus vulnus xuất hiện trên cây có múi ở nước Ý và California Chúng tấn công

gây hại rễ của nhiều loại cây trồng như ngũ cốc, rau cải, cây ăn trái (Agrios, 2004) Ở

Australia, những loài Pratylenchus gây hại quan trọng như Pratylenchus brachurus, Pratylenchus thornei, Pratylenchus neglectus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus zeae (Brown và ctv, 1997)

Pratylenchus coffeae phân bố rộng khắp thế giới, và gây hại nghiệm trọng ở cà phê, chuối và các cây họ cam chanh và nhiều loại cây trồng khác Pratylenchus zeae

là loài phân bố toàn cầu, tuy nhiên ít phổ biến hơn ở vùng ôn đới Kí sinh trên nhiều loại cây trồng họ hòa thảo (Poaceae) như ngô, kê, lúa, lúa miến, mía, thuốc lá, lạc và

cây cỏ khác Ở Việt Nam theo những loài P coffeae, Helicotylenchus multicinctus, Meloidogyne incognita và Meloidogyne javanica được tìm thấy gây hại trên chuối ở

Việt Nam (Chau và ctv, 1997; Van den Bergh và ctv, 2002)

Pratylenchus penetrans kí sinh gây hại gần 400 loài cây trồng quan trọng (Evans

và ctv, 1993) và phân bố toàn cầu, tuy nhiên ít phổ biến hơn vùng ôn đới Loài này là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng và phổ biến trong đất ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất cây dâu tây ở Đông Bắc Mỹ (LaMondia and Martin, 1989)

2.3.4 Phương thức gây hại của tuyến trùng Pratylenchus spp

Pratylenchus spp thuộc chi tuyến trùng nội ký sinh di động, chích hút, sinh sản trong rễ và là loài ký sinh bắt buộc di chuyển tự do trong rễ, xuyên qua các thớ rễ và

chỉ sống trong vỏ rễ P coffeae tấn công lan rộng trên vỏ rễ Nhưng vỏ rễ chỉ bị thiệt

hại khi mật số tuyến trùng này rất cao cùng xâm nhập vào tại cùng một vị trí

(Radewald và ctv, 1971) Pratylenchus tấn công tất cả các gốc ghép cây có múi thương

mại (Timmer và ctv, 2000)

Tất cả các giai đoạn sinh trưởng của Pratylenchus spp (trừ giai đoạn trứng và ấu trùng tuổi 1 nằm trong vỏ trứng) đều có khả năng tấn công và rời bỏ rễ Đối với P coffeae trước khi xâm nhập vào rễ cây nó thường tấn công ở bề mặt rễ và dùng kim

chích châm vào rễ Khi kim chích đã cấm được vào bên trong tế bào tuyến trùng bắt đầu tiết men tiêu hóa và hòa tan các chất trong tế bào để dinh dưỡng Bằng sự co bớp

của diều giữa, tuyến trùng P coffeae hút thức ăn đã tiêu hóa vào ruột Quá trình dinh

dưỡng của tuyến trùng tiếp tục xảy ra bằng sự châm chích nhiều lần như vậy, kết quả làm cho rễ bị hủy hoại một phần Men tiêu hóa do tuyến trùng tiết ra cũng làm trương

nở nhân tế bào rễ (Whitehead, 1998)

Theo Nguyễn Ngọc Châu và ctv (2001) thì tuyến trùng P coffeae xâm nhập vào

bên trong mô vỏ rễ, di chuyển song song với trụ giữa và dinh dưỡng theo kiểu chu kỳ

Trong quá trình di chuyển nó châm chích vào thành tế bào làm cho thành tế bào bị cắt

và tuyến trùng di chuyển đến thành tế bào tiếp theo Sự di chuyển như vậy làm cho tế bào chất bị tách khỏi các vách tế bào làm cho các tế bào bị chết Đôi khi tuyến trùng còn nằm cuộn lại bên trong tế bào Khi tuyến trùng xâm nhập vào rễ để hút dinh dưỡng

đã làm cho rễ bị thương tổn, và do đó theo sau sự gây hại của tuyến trùng thường là

các vi sinh vật gây hại khác, đặc biệt là các loài nấm Khi tuyến trùng P coffeae xâm

nhập vào rễ thì mật số tuyến trùng trong đất thường giảm xuống Khi nấm tấn công theo vết loét do tuyến trùng tạo ra thì rễ cây bị thối và trở nên không còn ưa thích với tuyến trùng nữa, lúc này tuyến trùng thường phát tán từ rễ ra ngoài đất

2.4 Sơ lược về nấm Fusarium sp

2.4.2 Đặc điểm hình thái của nấm Fusarium sp

Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già Hình dạng bào tử là một chỉ tiêu quan trọng giúp phân biệt chính xác các

loài Fusarium (Seifert, 1996) Theo Burgess và ctv (2009) có thể phân biệt được một

số loài khác nhau của Fusarium spp dựa vào sắc tố của sợi hay tản nấm mọc trên môi

trường chuyên biệt

Một số loài Fusarium có giai đoạn sinh sản hữu tính nhưng phần lớn các loài Fusarium có hình thức sinh sản vô tính là chính Ở hình thức sinh sản vô tính thì Fusarium tạo ra các loại bào tử như: đại bào tử, tiểu bào tử và hậu bào tử

Đại bào tử dài, nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống bào tử

Phần lớn đại bào tử của các loài Fusarium đều có từ 3 - 7 vách ngăn ngang, số ngăn

ngang thường khác nhau ở các loài Fusarium và ở một số loài Fusarium có vách ngăn

không xác định được rõ ràng (Keith Seifert, 1996)

Tiểu bào tử có nhiều hình dạng khác nhau như hình oval, hình thận, hình trứng ngược, hình quả lê, hình cầu Tiểu bào tử có từ 1 - 2 tế bào, có kích thước bé, không màu và không có vách ngăn ngang (Cao Ngọc Điệp và ctv, 2010)

Trong khi đó, hậu bào tử có hình tròn hoặc hình trứng là cơ quan lưu tồn của nấm Hậu bào tử có lớp vách dầy, có khi xù xì, chịu đựng tốt với điều kiện khắc nghiệt của môi trường và khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nẩy mầm cho ra sợi nấm mới (Phạm Văn Kim, 1998) Theo Keith Seifert (1996) hậu bào tử có thể được sinh ra đơn độc, thành đôi, thành chuỗi hay thành cụm

2.4.3 Sự phân bố và phổ kí chủ

Theo Bùi Xuân Đồng (1986), thì nấm bệnh phân bố rất rộng trên khắp thế giới,

Fusarium gây thiệt hại trên các loại cây trồng và gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế, đặc

biệt ở vùng Châu Phi, Châu Mỹ và các nước như Australia, Panama, Mỹ, Philippines,

Đài Loan và các nước Đông Nam Á F solani có phổ kí chủ rộng bao gồm 66 họ cây

trồng như lê tàu, cây có múi, dưa gang tây, tiêu, khoai tây…

Fusarium có rất nhiều loài khác nhau nên khả năng kí chủ rất rộng trên nhiều

loại cây trồng khác nhau như: cây ăn quả, cây rau màu và một số cây trồng khác và có thể sống trong đất trong một thời gian dài, trong xác bã thực vật dưới nhiều dạng khác nhau, bào tử nấm có thể tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài sau đó gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ phát triển và lây lan (Bùi Xuân Đồng, 1986)

F solani gây bệnh thối khô cây có múi phân bố ở một số nơi trên thế giới như California, đảo Canary, Ý, Arizona, Florida, Brazil, Nam Châu Phi Bên cạnh đó, F oxysporum cũng là tác nhân gây bệnh trên nhiều loài cây như ngũ cốc, cây có múi, cà

chua, khoai tây, dưa chột và một số loại cây khác (Agrios, 2004)

2.4.4 Đặc điểm và điều kiện gây hại của nấm Fusarium sp đối với cây trồng

Thối rễ do nấm Fusarium sẽ nặng hơn trong điều kiện ngập nước, tỉ lệ

ammonium nitrate cao và được tưới phân ure, khả năng dự trữ tinh bột của rễ bị yếu

cùng với sự hiện diện của tuyến trùng Tylenchus semipenetrans Những nòi gây bệnh

thu được từ rễ cây có múi ở Nam Phi có thể sản xuất ra chất độc naphthazarin và gây độc cho cây có múi (Labuschagne và ctv, 1996)

Theo Phạm Văn Kim (1998), nấm Fusarium spp hiện diện khắp nơi trong đất

và là nấm kí sinh cơ hội Khi rễ cây trồng bị tổn thương, chúng có thể tấn công và gây hại nặng nề Khi cây ra trái, trái rất dễ rụng vì vậy làm giảm năng suất rất lớn (Lê Thị

Thu Hồng và ctv, 2002) Nấm F solani dễ tấn công và gây hại nghiêm trọng khi pH

đất thấp (4,3 - 4,5) kết hợp với tình trạng cây trồng gặp điều kiện bất lợi kéo dài (Phạm

Văn Kim, 2003) F oxysporum gây bệnh héo do tắc bó mạch, trong khi F solani chủ

yếu gây thối rễ và cổ rễ

2.4.5 Quá trình xâm nhiễm của nấm Fusarium sp

Labuschagne và ctv (1996) cho rằng nấm Fusarium solani có chứa nhiều độc tố

chủ yếu là fusaric acid, độc tố này kiềm hãm hoạt động của hệ thống enzyme cây kí chủ phá vỡ độ thẩm thấu của màng tế bào và kiềm hãm hoạt động hô hấp của cây làm giảm mức độ đề kháng của cây

Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998) cho biết độc tố Fusarinic,

Fumonisis B1, Fumonisis B2 do nấm Fusarium tiết ra đã kiềm hãm hoạt động của hệ

thống enzyme và hoạt động hô hấp, phá vở quá trình trao đổi chất, giảm tính thấm của màng tế bào và làm giảm sức đề kháng của cây trồng Sợi nấm và bào tử vô tính của

nấm Fusarium nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào rễ con còn non

và lan dần vào các mạch gỗ (Burgess và ctv, 2009)

2.5 Sơ lược về nấm Phytophthora sp

2.5.1 Phân loại (theo Hawksworth và ctv, 1995)

Giới: Stramenopiles Ngành: Oomycota Lớp: Omycetes Bộ: Peronosporales Họ: Pythiaceae

Giống: Phytophthora

2.5.2 Đặc điểm hình thái, sinh học và điều kiện gây hại

Hệ sợi khuẩn ty của Phytophthora hình ống gồ ghề, trong suốt, phân nhánh và cùng tán, tuy nhiên vách ngăn có thể phát triển ở ống già Sợi nấm không có vách ngăn

(Burgess và ctv, 2009) Khuẩn ty có bề rộng 3 - 8 µm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010)

Theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010) Phytophthora sinh sản vô

tính tạo thành các cấu trúc gọi là bọc bào tử (túi bào tử), bọc bào tử có vách dày, trong suốt, đa nhân có hình hạt đậu hay quả lê và chứa nhủ ở giai đoạn cuối và nó là nơi hình thành và giải phóng động bào tử Sự nảy chồi của bọc bào tử phụ thuộc vào nhiệt độ

và ẩm độ Nếu nhiệt độ thấp và điều kiện ẩm ướt thì bọc bào tử sẽ mọc mầm gián tiếp

và ngược lại nhiệt độ cao và điều kiện khô ráo bọc bào tử sẽ mọc mầm trực tiếp Sự nảy chồi gián tiếp của bọc bào tử xảy ra khi nhiệt độ thấp (<15oC) và độ ẩm cao, bọc bào tử trở thành túi bào tử động và việc phân cắt nhân bên trong thành những bào tử động và sau đó động bào tử được phóng thích Còn ở nhiệt độ cao và điều kiện khô ráo, bọc bào tử bắt đầu hoạt động như bào tử riêng lẻ và nảy chồi trực tiếp bằng cách tạo ống phôi đa nhân

Sinh sản hữu tính của nấm Phytophthora có cả hai trường hợp đồng tán và dị tán

Sinh sản hữu tính liên quan đến sự hình thành các túi noãn (thể cái) và túi đực (thể đực) Sau khi thụ tinh, noãn cầu (giao tử cái) trong túi noãn phát triển thành bào tử trứng có vách dày (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010)

Nấm Phytophthora phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ 16 - 32oC, nhiệt độ dưới 10oC hay trên 35oC nấm ngừng phát triển, ẩm độ không khí 80 - 95% Nhiệt độ

thích hợp cho sự phát triển của sợi nấm P nicotianae là 30 - 32oC, P palmivora là 27

- 30oC và P citrophthora là 24 - 28oC (Timmer và ctv, 2000)

Nấm Phytophthora tồn tại dưới dạng túi bào tử, hậu bào tử có khả năng sống sót

và tồn tại bên ngoài mô kí chủ trong thời gian dài, trong mọi điều kiện bất lợi (Drenth

và Guest, 2004)

Các bệnh do Phytophthora thích hợp với điều kiện ẩm ướt Cách thức xâm nhiễm

tùy thuộc từng loài Tuy nhiên, bào tử trứng, bọc bào tử động và du động bào tử tạo điều kiện cho việc xâm nhiễm vào các bộ phận khác của cây Động bào tử có thể do nước mưa, nước tưới làm phân tán lên bộ lá của cây vì vậy quá trình xâm nhiễm có thể

bắt đầu từ thân, lá và quả tùy thuộc vào loài Phytophthora Côn trùng bò hoặc bay

cũng có thể mang nấm từ đất tới các bộ phận phía trên của cây (Burgess và ctv, 2009)

2.5.3 Sự phân bố và phổ kí chủ

Giống Phytophthora có khoảng 60 loài gây hại cây trồng và nó có tên gọi là kẻ hủy diệt cây trồng (Erwin và Ribeiro, 1996) Các bệnh do Phytophthora gây hại cho

cây lâu năm, rau và các loại cây trồng khác làm tổn thất đáng kể về kinh tế cho vùng

Đông Nam Á Ở Việt Nam, Phytophthora là nguyên nhân gây rất nhiều bệnh trên cây

ăn quả, rau màu và cây công nghiệp

Phổ kí chủ của Phytophthora tùy thuộc vào từng loài cụ thể Phytophthora cũng

đã được ghi nhận xuất hiện trên tất cả các vùng trồng cây có múi trên thế giới Bệnh gây thiệt hại nặng đối với sản xuất nông nghiệp ở Thái Lan, Malaysia, Indonesia và Philippines (Drenth và Guest, 2004) Các bệnh bao gồm thối rễ, thối thân và quả sầu riêng, thối rễ ớt, thối nõn dứa, thối gốc chảy nhựa cây có múi, mốc sương khoai tây, cà chua, thối rễ, thân và quả đu đủ, tàn lụi cao su và các cây trồng khác (Burgess và ctv,

2009) Một số loài như P palmivora có phổ kí chủ rộng, trong khi P infestans có phổ

kí chủ hẹp (Burgess và ctv, 2009)

2.5.4 Tác hại do Phytophthora sp

Phytophthora citrophthora và P nicotianae var paracitica gây hại quan trọng

trên rễ và cổ rễ cây có múi ở Australia Sự gây hại của chúng có liên quan đến nhiệt độ

và khu vực địa lý; P citrophthora gây hại cho cây ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn P parasitica Chúng phát triển mạnh trong điều kiện ẩm độ đất cao và được cung cấp đầy

đủ oxy Ở New South Wales, P citrophthora là một trong những tác nhân gây bệnh phá hoại các vườn cam quýt Ở Queensland, P parasitica gây hại khá quan trọng P citrophthora, P parasitica, Phytophthora syringae Kleb và P hibernalis gây thối rễ

và thối gốc CCM ở California (Gholl và Schoultiesl, 1987)

Ở California đất bị nhiễm mặn là một vấn đề hết sức quan trọng, bệnh thối rễ

trên CCM do Phytophthora gây hại nặng nhưng không thường xuyên Đất bị nhiễm

mặn làm gia tăng tính nghiêm trọng của bệnh thối rễ do động bào tử tấn công vào rễ làm mất khả năng bảo vệ của rễ (Blaker và Macdonald, 1986)

Ở Thái Lan nấm gây bệnh thối rễ và thối trái trên cây có múi là P nicotianae,

một số vườn cây bị chết sau khi trồng và cả những vườn đang cho thu hoạch khi nhiễm loại nấm này Bệnh nặng bắt đầu từ tháng 5 (ẩm độ cao và nhiệt độ khoảng 28 - 31oC

thích hợp cho P nicotianae gây hại) và giảm vào tháng 10 (Drenth và ctv, 2004)

Theo kết quả nghiên cứu của Timmer (2000), cho rằng nguyên nhân gây hiện

tượng chảy nhựa thân, thối rễ, thối nâu trên cây có múi đều do P parasitica và P citrophthora Nấm P parasitica gây hại trên hầu hết các loại cây có múi gây hiện

tượng thối rễ, chảy nhựa thân, thối thân ở vị trí sát mặt đất ít khi gây hại thân ở vị trí

trên mặt đất, trong khi đó nấm P citrophthora cũng gây chảy nhựa thân và thối rễ

nhưng nấm này thường gây hại ở những bộ phận trên mặt đất Ngoài ra trên cây có

múi theo tác giả ghi nhận có P hibernalis và P syringae gây bệnh ở những vùng có khí hậu lạnh và ẩm ướt, P palmivora và P citricola cũng được ghi nhận tấn công cây

có múi ở vùng nhiệt đới

2.6 Sự tương tác gây hại cây trồng giữa tuyến trùng và nấm

Trên cà phê thì giống cà phê Arabica bị tuyến trùng P coffeae gây hại nặng nhất, đặc biệt ở Nam Ấn Độ (Palanichamy, 1973) Tuyến trùng P Coffeae là tác nhân gây

hại chính và tạo điều kiện cho nấm Fusarium, Rosellina làm thối rễ cà phê, thậm chí

cả 2 loài tuyến trùng P coffeae và Meloidogyne spp cùng xuất hiện gây hại trên cà phê rất nghiêm trọng Nấm Fusarium oxysporum và tuyến trùng P coffeae kết hợp gây

hại trên cà phê với mật số 80 con/50g đất đã gây hại nghiêm trọng trên cà phê 1 - 2 năm tuổi (Nguyễn Văn Nam, 1996) Theo Nguyễn Kim Loang (2002) thì tuyến trùng

P coffeae là tác nhân gây vàng lá trên cà phê tại vùng Đắc Lắc, P coffeae phá hoại vùng rễ cây ở tất cả các giai đoạn phát triển của chúng Khi nó kết hợp với nấm F oxysporum và F solani gây hại nghiêm trọng hơn Mật số 20 con/50g đất và 70 con/5g

rễ thì cây cà phê vối đã có khả năng bị bệnh vàng lá thối rễ Bệnh này gia tăng vào các tháng cuối mùa khô, đầu mùa mưa trong điều kiện của vùng trồng cà phê Đắc Lắc (trích dẫn Vũ Triệu Mân, 2007)

Ở khoai tây, theo báo cáo của MacGuidwin và Rouse (1990) thì sự tương tác giữa

P penetrans và Verticillium dahliae làm giảm năng suất và chất lượng củ, làm vỏ củ

khoai tây bị nâu đỏ

Pratylenchus penetrans tương tác với nhiều loại nấm gây hại trên đậu Hà Lan,

yến mạch, cỏ linh lăng, khoai tây, cà chua, dâu tây (Kleynhans và ctv, 1996) Trên dâu

tây P penetrans tấn công tạo những vết hoại tử trên rễ làm cấu trúc vỏ rễ dễ bị nấm Phytophthora fragariae xâm nhập gây bệnh mốc sương rễ (Townshend, 1963)

Lamondia (1999) đã báo cáo các nghiệm thức chủng tuyến trùng P penetrans hay nấm Rhizoctonia fragariae hay cả hai tác nhân làm giảm đáng kể năng suất của

dâu tây so với nghiệm thức đối chứng không chủng ở cả hai vùng Ở Hamden, nghiệm

thức không chủng bệnh thì tổng năng suất là 217,3 g; nghiệm thức chủng R fragariae

là 119,4 g; nghiệm thức chủng P penetrans là 87,6 g; còn nghiệm thức chủng cả 2 mầm bệnh P penetrans và R fragariae thì năng suất quả là 76,8 g Còn ở Windsor thì nghiệm thức không chủng bệnh thì tổng năng suất là 224 g; nghiệm thức chủng R fragariae là 172,9 g; nghiệm thức chủng P penetrans là 183,5 g; còn nghiệm thức chủng cả 2 mầm bệnh P penetrans và R fragariae thì năng suất quả là 158,4 g

Trên đu đủ, các thí ngiệm đánh giá ảnh hưởng tương tác giữa tuyến trùng R reniformis và nấm P palmivora lên sự sinh trưởng, sống sót của cây đu đủ đã được

thực hiện bởi Alston và ctv (2003) R reniformis được chủng với mật số 0, 1.000,

5.000, 20.000 con/chậu (đường kính 10 cm) khi cây 4 tuần tuổi, sau khi cây được 11

tuần tuổi thì họ tiến hành chủng P palmivora với mật số 1.000 động bào tử/chậu Kết

quả ở 14 tuần sau chủng thì trọng lượng khô (p = 0,04) nhỏ hơn trọng lượng khô của

các thí nghiệm chỉ chủng P palmivora hay R reniformis (p > 0,05); tỷ lệ chết của thí nghiệm chủng R reniformis và P palmivora là 20 - 100% trong khi thí nghiệm chủng chỉ chủng R reniformis hay P palmivora thì chỉ có 30 - 40%

Pratylenchus loosi là loài tuyến trùng gây hại nghiêm trọng nhất trên chè ở Iran

Sự tương tác giữa P loosi với 4 loại nấm đã được phân lập ở tỉnh Guilan (Rhizoctonia solani, Fusarium proliferatum, F pallidoroseum and Sclerotium rolfsii) đã làm giảm

chiều cao, trọng lượng tươi và khô của cây chè trong điều kiện nhà lưới (Hoseini và ctv, 2010)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 02/2011 đến 06/2011 tại Bộ Môn BVTV – Viện Cây Ăn Quả Miền Nam (xã Long Định, huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang)

3.2 Nội dung nghiên cứu

− Điều tra tình hình bệnh vàng lá thối rễ, thu mẫu và trích lọc tuyến trùng

Pratylenchus spp trên các vườn cam sành sử dụng gốc ghép chanh Volka tại huyện

Cái Bè - Tiền Giang

− Xác định mật số của tuyến trùng Pratylenchus spp ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và phát triển của chanh Volka

− Đánh giá ảnh hưởng của các mức mật số bào tử ở 2 dòng nấm Fusarium sp và Phytophthora sp đến sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka

− Đánh giá ảnh hưởng tương tác giữa tuyến trùng Pratylenchus spp., nấm Fusarium sp và Phytophthora sp trong sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh

Volka

3.3 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu

− Chanh Volka được trồng từ cành giâm

− Nhà lưới, chậu trồng, đất, cát phục vụ cho việc trồng chanh Volka

− Vật dụng phục vụ việc điều tra và thu mẫu: phiếu điều tra, túi nylon, dao, kéo, xẻng, bút lông, máy ảnh…

− Vật dụng phục vụ việc ly trích tuyến trùng: rây lọc {số 30 (710 µm); số 60 (300 µm); số 360 (45 µm)}, thau, cốc, đĩa Petri, giấy thấm…

− Vật dụng phục vụ cho việc giám định nấm và tuyến trùng: kính hiển vi, kính lúp, kẹp nhỏ, que cấy, đèn cồn, đĩa đếm tuyến trùng, …

− Tuyến trùng Pratylenchus spp được trích lọc từ rễ chanh Volka

− Dòng nấm Phytophthora sp đã được phân lập và lưu giữ tại Bộ Môn BVTV

− Dòng nấm Fusarium sp được phân lập từ rễ cây có múi bị vàng lá thối rễ

− Các môi trường nuôi cấy nấm WA, PDA, V8

™ Công thức môi trường

− Thành phần môi trường WA gồm có: Agaz 15 - 20 g, nước cất 1.000 ml

− Thành phần môi trường PDA gồm có: Khoai tây 200 g, đường dectrose 20 – 25

Hình 3.3: Nấm Phytophthora sp

A: Đĩa nguồn Phytophthora sp B: Bào tử Phytophthora sp

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp điều tra tình hình bệnh vàng lá thối rễ, thu mẫu và trích lọc

tuyến trùng Pratylenchus spp

™ Phương pháp điều tra

Điều tra theo phiếu điều tra soạn sẵn 20 hộ nông dân trồng cam sành sử dụng gốc ghép chanh Volka tại huyện Cái Bè - Tiền Giang Các vườn trồng cam sành sử dụng gốc ghép chanh Volka có diện tích từ 2000 m2 trở lên và từ 3 năm tuổi trở lên

™ Phương pháp thu mẫu

- Dùng xẻng đào, thu mẫu đất và rễ ở vùng rễ tơ sâu cách mặt đất 12 - 15cm cho mẫu vào túi nilon, lấy mẫu ở 4 hướng của cây, mẫu lấy ngẫu nhiên 40 - 50 cây/ha, lấy theo đường zig - zag

- Kí hiệu ngoài túi: ngày, tháng, năm, tên người lấy và tên chủ vườn đã được mã hóa

™ Phương pháp trích lọc tuyến trùng từ rễ

− Từ mẫu đất và rễ thu về từ các vườn điều tra chọn rễ để riêng vào cốc thủy tinh, sau đó rữa sạch rễ dưới vòi nước chảy, rồi cho rễ vào máy xay cho nhuyễn, sau

đó lọc qua rây số 30, 60, 360

− Sau đó rót phần rễ lẫn tuyến trùng lên giấy thấm lót trên lưới rây và đặt trên

đĩa Petri có chứa nước cất

− Sau 24 - 36 giờ thì quan sát trên kính hiển vi

™ Phương pháp trích lọc tuyến trùng từ đất

Trích lọc tuyến trùng dựa vào phương pháp kết hợp của kỹ thuật gạn và rây lọc tuyến trùng của Cobb và kỹ thuật phễu lọc Baermann hiệu chỉnh (Hooper, 1986)

− Từ phần đất thu về, loại bỏ đất, đá to lẫn vào, trộn đều phần đất thu về và loại

bỏ theo hình chóp lập lại cho đến khi còn 200cc đất, thêm vào 0,5 lít nước và để khoảng 15 - 20 phút

− Khuấy đều phần đất trong cốc, đợi 1 phút Lọc qua rây số 30, loại bỏ phần đất sỏi trên rây, lặp lại 1 - 2 lần

− Tiếp theo sử dụng rây 60 lọc lại phần phần huyền phù đã lọc ở trên, giữ lại phần nước lẫn đất qua rây và loại bỏ phần đất trên rây, lặp lại 1 - 2 lần

− Cuối cùng, lấy phần huyền phù đã lọc ở rây 60 lọc qua rây 360, lặp lại 1 - 2 lần, phần trên rây 360 được chuyển sang cốc 100 ml

− Rót phần đất lẫn tuyến trùng lên giấy thấm lót trên lưới rây và đặt trên đĩa Petri có chứa nước cất

− Để chúng qua đêm và ngày hôm sau quan sát trên kính hiển vi

− Lấy ống hút, hút một 1 ml cho vào đĩa đếm dàn đều dung dịch tuyến trùng lên đĩa hoặc đưa sang lam để kiểm tra dưới kính hiển vi

3.4.2 Phương pháp xác định mật số của tuyến trùng Pratylenchus spp ảnh hưởng

đến sự sinh trưởng và phát triển của chanh Volka

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố, 5 nghiệm thức (5 mức độ tuyến trùng) và mỗi nghiệm thức được lập lại 10 lần Mỗi lần lập lại là một chậu trồng một cây chanh Volka

Bảng 3.1: Các nghiệm thức trong thí nghiệm xác định mật số của tuyến trùng

Pratylenchus spp ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chanh Volka

Nghiệm thức Mật số Pratylenchus spp Đơn vị tính

Chanh Volka sau trồng 8 ngày thì tiến hành chủng tuyến trùng Pratylenchus spp

(không phân biệt giới tính và độ tuổi) Số lần chủng là một

™ Phương pháp chuẩn bị đất và trồng chanh volka

− Đất lấy từ đáy ao, phơi khô, đập nhỏ và cát cồn thu về loại bỏ sỏi đá

− Đất và cát được hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 650C trong 2 giờ

− Đất được trộn với cát theo tỉ lệ 5:1 Hỗn hợp này đổ vào các chậu đường kính 15cm, và lượng đất 1.000 cc

− Chanh Volka đã được giâm cành trước đó 3 tuần, khi rễ mọc dài 5 cm thì được nhổ ra khỏi bầu ươm, rửa sạch rễ và trồng vào chậu đất đã được chuẩn bị sẵn, cây chanh trồng vào chậu không được bón phân

™ Phương pháp chuẩn bị và chủng huyền phù tuyến trùng Pratylenchus spp

Tuyến trùng Pratylenchus spp sử dụng trong thí nghiệm được trích lọc từ rễ

chanh Volka thu thập tại các vườn trồng cam sành tại Cái Bè - Tiền Giang Cách trích lọc giống như phương pháp trong mục 3.4.1 Sau đó ta tiến hành đếm số lượng tuyến trùng dưới kính hiển vi

Cây chanh Volka sau 8 ngày trồng tiến hành chủng tuyến trùng Pratylenchus

spp như sau: đào 3 lỗ nhỏ sâu 3cm xung quanh gốc chanh Volka trong chậu, sau đó dùng Pipet hút huyền phù tuyến trùng tưới vào các lỗ đã đào và lấp đất lại Số lần chủng là 1

™ Phương pháp lấy chỉ tiêu

Thu mẫu và ghi nhận chỉ tiêu vào thời điểm 13 tuần sau chủng tuyến trùng:

o Tỷ lệ bệnh (%) trên lá và rễ chanh Volka được đánh giá theo triệu chứng bệnh thể hiện trên lá hoặc rễ

Tỷ lệ bệnh (%) = (Tổng số cây bị bệnh/ Tổng số cây quan sát) x 100

Chỉ số rễ thối (%) = {[ (n1 x 1) + (n2 x 2) + (n3 x 3) + (n4 x 4)]/(N x 4)}x100

Trong đó : n1, n2, n3, n4: lần lượt là số cây có rễ thối cấp 1, 2, 3,4

N: tổng số cây quan sát

Phân loại cấp bệnh trên rễ chanh Volka thể hiện triệu chứng vàng lá thối rễ do

Pratylenchus sp dựa vào vết thương theo Alston và ctv (2003) gồm có 5 cấp:

Cấp 0: rễ không bị thương tổn Cấp 1: rễ bị thương tổn với tỷ lệ 1% - 25%

Cấp 2: rễ bị thương tổn với tỷ lệ 26% - 50%

Cấp 3: rễ bị thương tổn với tỷ lệ 51% - 75%

Cấp 4: rễ bị thương tổn với tỷ lệ 76% - 100% với hầu hết những rễ bị thối rữa

o Sự sinh trưởng của chanh Volka: Chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng

tươi của thân và rễ

Õ Cách tính:

− Trọng lượng tươi của thân và rễ chanh volka: nhổ cây khỏi chậu, rửa sạch rễ,

để ráo nước, tiếp theo cắt thân và rễ để riêng sau đó tiến hành cân trọng lượng

− Chiều dài thân được đo từ cổ rễ lên đến đỉnh sinh trưởng ngọn

− Chiều dài rễ được đo từ cổ rễ đến chóp rễ dài nhất

− Mật số tuyến trùng Pratylenchus spp trong đất và rễ tại thời điểm lấy chỉ

tiêu Cách trích lọc giống như phương pháp đã được trình bày ở mục 3.1.4

3.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của mật số bào tử ở 2 dòng nấm Fusarium sp và

Phytophthora sp đến sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka

3.4.3.1 Nấm Fusarium sp

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố, 4 nghiệm

thức và mỗi nghiệm thức được lập lại 10 lần Mỗi lần lập lại là một chậu trồng một cây

chanh Volka

Bảng 3.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của mật số bào tử

nấm Fusarium sp đến sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka

Nghiệm thức Mật số nấm Fusarium sp Đơn vị tính

Ghi chú: Cơ sở chọn các mức mật số theo Nguyễn Ngọc Anh Thư và Nguyễn Văn Hòa (2006)

Phương pháp chuẩn bị đất và trồng chanh volka giống như phương pháp đã

trình bày ở mục 3.4.2

™ Phương pháp phân lập, định danh nấm Fusarium sp

Phần rễ cây bị nhiễm bệnh được quan sát và chọn cẩn thận, rửa sạch đất, cát hoặc côn trùng bám theo mô bệnh dưới vòi nước chảy để ráo nước Mẫu rễ được cắt tiếp giáp giữa phần mô bệnh và mô khoẻ dài 1 cm, khử trùng mặt ngoài bằng cồn 70% trong 1-1,5 phút, vớt ra rửa lại bằng nước cất vô trùng, thấm khô bằng giấy thấm, và đặt phần mô bệnh vào môi trường WA hoặc PDA đã đổ sẵn

Theo dõi đĩa cấy mỗi ngày, khi thấy có sợi nấm mọc khoảng 5 mm tiến hành cấy chuyền để làm thuần mẫu nấm bệnh

Giám định nấm được thực hiện theo Barnett & Hunter (1998) và Tsuneo Watanabe (2002) Các kỹ thuật sử dụng như quan sát sợi nấm, bào tử dưới kính hiển vi

™ Phương pháp nhân mật số nấm Fusarium sp và chủng nấm Fusarium sp

Nấm Fusarium sp được nhân mật số bào tử trên môi trường PDA, sau 8 ngày thì

tiến hành lấy bào tử của nấm

Ta tiến hành đếm số lượng bào tử nấm Fusarium sp bằng cách sử dụng buồng

đếm hồng cầu Thomas như sau: cho khoảng 1 ml nước cất đã hấp vô trùng vào đĩa nấm, dùng lame đã sấy vô trùng cạo nhẹ trên mặt thạch, rồi đổ phần nước lẫn bào tử nấm vào cốc thủy tinh có vạch định mức Sau đó dùng Pipet hút 1 ml nước lẫn bào tử

nấm Fusarium sp trong cốc nhỏ vào buồng đếm, đậy lamelle lại đặt lên kính hiển vi

và đếm số lượng bào tử Sau khi đếm xong thì sử dụng công thức sau đây để tính mật

số bào tử có trong 1 ml dịch bào tử:

D = (4000 * a * 103 ) / b

Trong đó:

D: Số bào tử có trong 1 ml dịch bào tử (bào tử/ml)

a: Số bào tử đếm trong 25 ô lớn (bào tử)

b: Số ô nhỏ trong 25 ô lớn (400 ô)

Chanh Volka được trồng sau 25 ngày thì tiến hành chủng bào tử nấm Fusarium

sp như sau: đào 3 lỗ nhỏ sâu 3cm xung quanh gốc Volka trong chậu, sau đó dùng

Pipet hút dịch bào tử nấm bào tử nấm Fusarium sp tưới vào các lỗ đã đào và lấp đất

lại Số lần chủng là 1

™ Phương pháp lấy chỉ tiêu

Thu mẫu và ghi nhận chỉ tiêu vào thời điểm 11 tuần sau chủng nấm Fusarium sp.:

o Tỷ lệ bệnh (%) dựa trên triệu chứng thể hiện trên lá hoặc rễ, chỉ số rễ thối (%), sự sinh trưởng của chanh Volka: chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng tươi của thân, rễ Với cách tính như đã trình bày ở mục 3.4.2

Với phân loại cấp bệnh trên rễ chanh Volka thể hiện triệu chứng vàng lá thối rễ

do Fusarium sp dựa vào vết thối tím và thối đen Alston và ctv (2003) gồm có 5 cấp:

Cấp 0: rễ không có vết thối tím và thối đen

Cấp 1: rễ bị thối tím và thối đen với tỷ lệ 1% - 25%

Cấp 2: rễ bị thối tím và thối đen với tỷ lệ 26% - 50%

Cấp 3: rễ bị thối tím và thối đen với tỷ lệ 51% - 75%

Cấp 4: rễ bị thối tím và thối đen với tỷ lệ 76% - 100% với hầu hết những

rễ bị thối rữa

3.4.3.2 Nấm Phytophthora sp

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố, 4 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức lập lại 10 lần Mỗi lần lập lại là một chậu trồng một cây chanh Volka

Bảng 3.3 Các nghiệm thức sử dụng trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của mật số

bào tử nấm Phytophthora sp đến sự biểu hiện triệu chứng vàng lá thối rễ chanh Volka

Nghiệm thức Mật số nấm Phytophthora sp Đơn vị tính

Phương pháp chuẩn bị đất và trồng chanh volka giống như phương pháp đã trình bày ở mục 3.4.2

™ Phương pháp nhân mật số nấm Phytophthora sp và chủng nấm

Phytophthora sp

Mật số nấm Phytophthora sp được nhân lên trên môi trường V8, sau 14 ngày thì

tiến hành lấy túi bào tử của nấm

Tiến hành đếm số lượng túi bào tử nấm Phytophthora sp như sau: ta kẻ 5 ô

vuông trên đĩa Petri theo 5 điểm chéo gốc, mỗi ô có diện tích 1 cm2, đặt đĩa dưới kính hiển vi đếm số lượng túi bào tử ở 5 ô đó, tính số lượng túi bào tử trung bình ở mỗi ô (A)

¾ Diện tích đĩa Petri:

Sau khi đếm xong số lượng túi bào tử/đĩa thì ta cho nấm vào máy xay, thêm một

ít nước cất đã hấp vô trùng vào, xay cho đến khi nhuyễn Tiếp theo rót phần nấm

Phytophthora sp đã xay vào cốc thủy tinh có định mức, thêm nước cất đã hấp vô trùng

vào đến thể tích 100 ml (mỗi nghiệm thức chủng đều cho 10 lần lập lại)

Chanh Volka được trồng sau 25 ngày thì tiến hành chủng bào tử nấm

Phytophthora sp như sau: đào 3 lỗ nhỏ sâu 3cm xung quanh gốc Volka trong chậu, sau đó dùng Pipet hút dịch bào tử nấm bào tử nấm Phytophthora sp tưới vào các lỗ đã

đào và lấp đất lại Số lần chủng là 1