ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA, MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH TRÊN CÁ ĐIÊU HỒNG Oreochromis sp. CỦA HAI CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus agalactiae CÓ DẠNG KHUẨN LẠC KHÁC NHAU

của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae có dạng khu ẩn lạc khác nhau” được tiến hành từ ngày 14/02/2011 đến ngày 11/07/2011 tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và Phòng Thí Nghiệ

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA, MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG GÂY

CH ỦNG VI KHUẨN Streptococcus agalactiae CÓ DẠNG

Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG NGỌC ANH

TRẦN NGUYỄN KIM TUYẾN Ngành: NUÔI TR ỒNG THỦY SẢN

Chuyên ngành: NGƯ Y Niên khóa: 2007 – 2011

Tháng 07/2011

ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA, MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH

TRÊN CÁ ĐIÊU HỒNG Oreochromis sp CỦA HAI CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus agalactiae CÓ DẠNG KHUẨN LẠC KHÁC NHAU

Tác giả

TRƯƠNG NGỌC ANH

TR ẦN NGUYỄN KIM TUYẾN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng

Kỹ sư ngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn

TS NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 07 năm 2011

C ẢM TẠ

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản và tất cả các thầy cô đã dùng hết tâm huyết của mình để truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo điều kiện học tập tốt nhất cho chúng tôi

Xin gửi lời cảm ơn vô cùng sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình hướng dẫn và hỗ trợ chúng tôi hoàn thành tốt khóa luận này

Cảm ơn các thầy và các bạn, các em phụ trách trại thực nghiệm Nuôi Trồng

Thủy Sản, chị Vũ Thị Ngọc, anh Đỗ Viết Phương, chị Truyện Nhã Định Huệ đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm để khóa luận có thể thực hiện thuận lợi

Cha mẹ và gia đình đã động viên, giúp đỡ và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho con trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, tập thể lớp DH07NY luôn khuyến khích, động viên và chia sẻ với chúng tôi trong suốt thời gian qua

Do kiến thức và kinh nghiệm hạn hẹp nên đề tài này sẽ không tránh khỏi sai sót, rất mong nhận được sự góp ý và thông cảm của quý thầy cô và các bạn

TÓM T ẮT

Đề tài “Đặc điểm sinh hóa, miễn dịch và khả năng gây bệnh trên cá điêu hồng Oreochromis sp của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae có dạng khu ẩn lạc khác nhau” được tiến hành từ ngày 14/02/2011 đến ngày 11/07/2011 tại

trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa

Thủy Sản, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Đề tài được thực hiện với mục đích:

- Tìm hiểu khả năng gây bệnh của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae

có dạng khuẩn lạc khác nhau trên cá điêu hồng Oreochromis sp

- Mô tả và so sánh các triệu chứng, bệnh tích, những biến đổi mô bệnh học trên

cá rô phi đỏ gây ra bởi hai chủng vi khuẩn

- Khả năng dung huyết và khả năng hình thành miễn dịch của hai chủng vi khuẩn trên

Thí nghiệm được bố trí gồm 3 nghiệm thức, gây nhiễm bằng phương pháp tiêm vào xoang bụng:

• Nghiệm thức A: Sử dụng chủng vi khuẩn Streptoccocus agalactiae dạng 1

(chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc lớn)

• Nghiệm thức B: Sử dụng chủng vi khuẩn Streptoccocus agalactiae dạng 2

(chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc dạng pinpoint)

• Nghiệm thức C (nghiệm thức đối chứng): Không sử dụng vi khuẩn

Trong 2 tuần tiến hành thí nghiệm, số lượng cá chết ở nghiệm thức A rất thấp trong khi ở nghiệm thức B lại rất cao Điều này khẳng định đôc lực của S agalactiae

dạng 2 cao hơn S agalactiae dạng 1

Cá bệnh do vi khuẩn S agalactiae có các triệu chứng bệnh tích gần giống nhau

như lờ đờ, kém linh hoạt; gan sung huyết, gan, thận, lách sưng, hoại tử, hoặc xuất huyết, não xuất huyết, Mô ở gan, thận, lách có nhiều khác biệt so với mô cá khỏe ở nghiệm thức đối chứng như cấu trúc mô hư hại, các tế bào máu tập trung thành từng vùng, xuất hiện trung tâm đại thực bào sắc tố,…

S agalactiae d ạng 1 có khả năng dung huyết nhưng rất yếu, còn S agalactiae

dạng 2 không có khả năng dung huyết

bệnh bằng S agalactiae dạng 1 Tương tự đối với S agalactiae dạng 2 Hiện tượng

ngưng kết chéo giữa hai chủng vi khuẩn với hai dạng huyết thanh và với huyết thanh

của cá ở nghiệm thức đối chứng đều không xảy ra

M ỤC LỤC

TRANG TỰA i

CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về bệnh do Streptococcus agalactiae 3

2.1.1 Lịch sử và một số nghiên cứu về bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra 3

2.1.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae 4

2.2 Phản ứng ngưng kết huyết thanh 11

2.3 Mô bệnh học 11

2.3.1 Khái niệm 11

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 12

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm 13

3.2 Vật liệu và dụng cụ 13

3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị 13

3.2.2 Hóa chất và môi trường 13

3.2.3 Đối tượng nghiên cứu 14

3.2.4 Hệ thống bể thí nghiệm 14

3.3 Phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 15

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu chung 16

3.3.3 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng 17

3.3.4 Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn 17

3.3.5 Phương pháp pha loãng huyền phù vi khuẩn 17

3.3.6 Xác định mật độ vi khuẩn 18

3.3.7 Gây bệnh bằng phương pháp tiêm 19

3.3.8 Phương pháp giải phẫu cá 19

3.3.9 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn 21

3.3.10 Phương pháp cấy thuần 21

3.3.11 Phương pháp định danh vi khuẩn 21

3.3.12 Thử nghiệm ngưng kết huyết thanh 23

3.3.13 Mô học 23

3.3.14 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm 24

3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 24

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Một số chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thí nghiệm 25

4.2 Kết quả thí nghiệm 26

4.2.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá trước khi thí nghiệm 26

4.2.2 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm 27

4.2.3 Triệu chứng và bệnh tích 28

4.2.4 Kết quả phân lập vi khuẩn trên cá chết 33

4.2.5 Phân lập vi khuẩn từ cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm 34

4.2.6 Kết quả định danh 34

4.2.7 Số lượng và tỷ lệ cá chết theo ngày 41

4.2.8 Thử nghiệm khả năng ngưng kết huyết thanh 46

4.2.9 Mô bệnh học 47

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Đề nghị 55

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 59

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Bảng 2.1: Các đặc điểm sinh hóa của S agalactiae phân lập bởi nhiều tác giả

Bảng 2.2: Các đặc điểm sinh hóa thông thường của S agalactiae từ một số tác giả

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên cá rô phi đỏ

Bảng 4.1: Một số chỉ tiêu chất lượng nước trước thí nghiệm

Bảng 4.2: Một số chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thí nghiệm

Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm ở các nghiệm thức

Bảng 4.4: Kết quả cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách, não của cá sau thí nghiệm ở các nghiệm thức

Bảng 4.5: Kết quả định danh sơ bộ

Bảng 4.6: Kết quả test kit API 20 Strep

Bảng 4.7: Tỷ lệ cá chết ở mỗi mật độ của nghiệm thức A sau 14 ngày thí nghiệm Bảng 4.8: Tỷ lệ cá chết ở mỗi mật độ của nghiệm thức B sau 14 ngày thí nghiệm

Bảng 4.9: Kết quả thử nghiệm ngưng kết huyết thanh

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ cá chết tích lũy của nghiệm thức A so với nghiệm thức đối chứng Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ cá chết tích lũy của nghiệm thức B so với nghiệm thức đối chứng

Hình 3.1: Phương pháp pha loãng

Hình 3.2: Cân cá trước khi tiêm

Hình 3.3: Thao tác tiêm vi khuẩn vào xoang bụng cá

Hình 3.4: Ba đường cắt mổ xoang bụng

Hình 3.5: Bốn đường cắt mổ sọ não cá

Hình 3.6: Kết quả phản ứng ngưng kết huyết thanh

Hình 4.1: Cá bệnh ở nghiệm thức A bị xuất huyết toàn thân và xơ vây

Hình 4.2: Cá bệnh ở nghiệm thức A có lách sưng to và gan sung huyết

Hình 4.3: Cá bệnh ở nghiệm thức A bị sưng hậu môn

Hình 4.4: Cá bệnh ở nghiệm thức A bị xuất huyết não

Hình 4.5: Cá bệnh ở nghiệm thức B bơi nghiêng

Hình 4.6: Cá bệnh ở nghiệm thức B bơi sát nền đáy và thân cong hình chữ C

Hình 4.7: Cá bệnh ở nghiệm thức B bị lồi và xuất huyết cả hai mắt

Hình 4.8: Cá bệnh ở nghiệm thức B bị lồi và đục một hoặc cả hai mắt

Hình 4.9: Cá bệnh ở nghiệm thức B bị xuất huyết não rất nặng

Hình 4.10: Cá bệnh ở nghiệm thức B có gan sưng to và sung huyết, lách sưng to

Hình 4.11: Khuẩn lạc của S agalactiae dạng 1 và dạng 2 sau 48 giờ

Hình 4.12: Hình dạng vi khuẩn của S agalactiae dạng 1 và S agalactiae dạng 2

Hình 4.13: Hai chủng vi khuẩn không phát triển lan rộng khỏi vết cấy

Hình 4.14: Phản ứng catalase và oxidase âm tính của vi khuẩn S agalactiae dạng 1

Hình 4.15: Phản ứng catalase và oxidase âm tính của vi khuẩn S agalactiae dạng 2

Hình 4.16: Khuẩn lạc S agalactiae dạng 1 dung huyết rất yếu trên môi trường thạch máu cừu

Hình 4.17: Khuẩn lạc S agalactiae dạng 2 không dung huyết trên môi trường thạch

máu cừu

Hình 4.18: Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep của vi khuẩn S agalactiae dạng 1 Hình 4.19: Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep của vi khuẩn S agalactiae dạng 2

Hình 4.20: Mô gan cá khỏe ở nghiệm thức đối chứng

Hình 4.21: Mô gan cá bệnh ở nghiệm thức A

Hình 4.22: Mô gan cá bệnh ở nghiệm thức B

Hình 4.23: Mô thận cá khỏe ở nghiệm thức đối chứng

DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT

ctv Cộng tác viên

BHIA Brain Heart Infusion Agar

BHIB Brain Heart Infusion Broth

SBA Sheep Blood Agar

OD Optical density

pd Proportionate distance

CFU Conoly forming unit

bệnh trên cá rô phi vẫn xuất hiện thường xuyên trong vụ nuôi Bệnh do Streptococcus

là nguyên nhân gây nên thiệt hại rất lớn, làm ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản thế giới Ước tính thiệt hại do Streptococcus hằng năm

khoảng 150 triệu USD (Shoemaker và Klesius, 1997) Từ năm 2000 đến năm 2009, Brian và ctv đã định danh hơn 1.000 chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô phi thu được ở

74 vùng và 14 nước và thấy rằng hơn ½ số vi khuẩn đó thuộc giống Streptococcus

quan trọng trong các bệnh do Streptococcus gây ra trên cá nuôi Trong khi bệnh trên cá gây ra bởi S iniae được báo cáo trên nhiều loài cá biển nuôi thì bệnh do S agalactiae

lại phổ biến hơn trên cá rô phi, là một loài cá nước ngọt

Bệnh do S agalactiae đã được báo cáo trên cá rô phi nuôi ở Việt Nam Đối với

cá rô phi đỏ nuôi bè ở đồng bằng Sông Cửu Long, thiệt hại cho nghề nuôi chủ yếu là

do S agalactiae Trong một đợt kiểm tra mẫu bệnh cá rô phi đỏ ở Đồng Tháp vào

tháng 05/2011, phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản – Khoa thủy sản trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được hai chủng S agalactiae Hai

chủng này tạo khuẩn lạc có sự phát triển và hình dạng khác nhau trên môi trường nuôi

cấy Kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và khả năng gây bệnh trên cá rô phi đỏ của các

chủng vi khuẩn khác nhau này là công việc rất cần thiết Công việc này nhằm tìm hiểu

sự khác biệt về đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của vi khuẩn S agalactiae

Từ nhận định trên và được sự phân công, cho phép của khoa Thủy Sản – trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Đặc điểm sinh hóa, miễn dịch và khả năng gây bệnh trên cá điêu hồng Oreochromis

sp của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae có dạng khuẩn lạc khác nhau”

1.2 Mục tiêu đề tài

- Tìm hiểu khả năng gây bệnh của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae

có dạng khuẩn lạc khác nhau trên cá điêu hồng Oreochromis sp

- Mô tả các triệu chứng, bệnh tích, biến đổi mô bệnh học của cá bệnh sau thí nghiệm

- Tìm hiểu khả năng dung huyết và khả năng hình thành miễn dịch của cá rô phi

đỏ đối với hai chủng vi khuẩn trên

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về bệnh do Streptococcus agalactiae

2.1.1 Lịch sử và một số nghiên cứu về bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra

Bệnh do liên cầu khuẩn được báo cáo lần đầu tiên năm 1966 bởi Robinson và

Mayer trên cá nước ngọt Notemignus crysoleucas Sau đó, Eldar và ctv (1995) xác định được hai loài S shiloi (S iniae) và S diffiicile (S agalactiae) là tác nhân gây

bệnh trên cá rô phi lai và cá hồi vân ở Israel năm 1984 Đến năm 1997, Vandamme và ctv đã chứng minh được S difficile thuộc nhóm B, type Ib Streptococcus, rất khó phân

biệt với S agalactiae, do hai loài có trình tự đoạn gen 16S - 23S giống nhau đến 97,7% và trình tự 16S giống nhau 100% Vì vậy, trong hai nghiên cứu của Brain với

ctv năm 2001 và Yoshiaki với ctv năm 2005 đã định danh lại S difficile chính là S

agalactiae

chúng còn ảnh hưởng đến các loài động vật khác, chẳng hạn như chó, mèo, cá sấu, ếch, hải cẩu hoặc cá heo.(Theo www.moredun.org.uk)

Hầu hết các chủng GBS đều dung huyết beta (β – haemolysis) trên môi trường thạch máu nhưng một số chủng phân lập trên người, cừu và cá không dung huyết (Kawamura và ctv., 2005; Sheehan và ctv., 2009) Tỷ lệ các dạng mầm bệnh streptoccocal chính ở vùng Châu Á – Thái Bình Dương là: S agalactiae dung huyết

beta chiếm 26%, S agalactiae không dung huyết chiếm 56%, còn lại là S iniae chiếm 18% Các chủng S agalactiae hiện diện theo từng vùng địa lý riêng biệt Ở Châu Á, S

Philippin Ở Châu Mỹ Latin, chúng được tìm thấy ở Ecuador, Honduras, Mexico và

gần đây nhất là ở Brazil (năm 2001); S agalactiae dung huyết beta chiếm ưu thế ở Thái Lan, Malaysia và Singapore; S iniae thường được tìm thấy cùng với S

Ecuador, Honduras, Indonesia, Philippin và Thái Lan Chỉ riêng ở Philippin và Việt Nam, cả S agalactiae dung huyết beta, S agalactiae không dung huyết và S iniae

hiện diện trong cùng một quốc gia

Vaccine từ S agalactiae không dung huyết chỉ có khả năng bảo hộ miễn dịch cho cá đối với S agalactiae không dung huyết , nhưng không thể bảo vệ cá khỏi S

Trên cá rô phi, S agalactiaae không dung huyết gây bệnh ở mọi giai đoạn,

trong khi S agalactiae dung huyết beta chủ yếu gây bệnh ở cá cỡ lớn S agalactiae đã

trở thành một tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá rô phi ở Châu Á và Châu Mỹ (Klesius và ctv, 2005) Đó là tác nhân gây bệnh cho tỷ lệ chết cao trên cá rô phi của Thái Lan trong những năm gần đây (Tân và ctv, 2007 Trích bởi Hồ Thành Tâm, 2010) Theo Maisak và ctv (2008), trên 60 cá rô phi mắc bệnh từ các vùng khác nhau

của Thái Lan, có đến 53 cá bị nhiễm S agalactiae (88%) và chỉ có 7 cá bị nhiễm S

2.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

bào hình cầu hoặc hình trứng, tồn tại độc lập, kết cặp hoặc dạng chuỗi, không di động, không sinh bào tử, cho kết quả phản ứng oxidase và catalase âm tính Đường kính khuẩn cầu từ 0,6 - 1,0 micromet (Duremdez và ctv., 2004; Yuasa và ctv., 2008)

BHIA (Ali và ctv, 2010) Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25 – 28o

C vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, tròn, ít hoặc không có lớp màng nhầy

và hơi lồi, một số chủng tạo khuẩn lạc lớn, màu trắng trong, hơi lồi, nhầy Lớp màng

nhầy đó là mucopolysaccharide Lớp màng nhầy càng dày thì độc lực của vi khuẩn

càng cao Tuy nhiên, rất khó duy trì chủng có độc lực cao được lâu, vì qua nhiều lần cấy chuyền độc lực sẽ giảm dần, thu được khuẩn lạc màu trắng đục, nhỏ, không có tính

nhầy như những chủng thông thường Vì vậy muốn giữ độc lực của nó ta cấy một lần

rồi bảo quản lạnh để phục hồi (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010)

Hình 2.1: Khuẩn lạc dạng pinpoint không dung huyết của S agalactiae trên môi

trường thạch máu (Nguồn: http://www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi)

Hình 2.2: Khuẩn lạc dạng pinpoint, dung huyết beta của S agalactiae trên môi trường

thạch máu (Nguồn: http://www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi)

S agalactiae dung huyết beta phát triển tốt ở 37o

C và chủ yếu gây bệnh trên cá giống

37oC và đa phần gây bệnh trên cá thương phẩm (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010)

Vi khuẩn S agalactiae dung huyết beta khi lấy làm vaccine ngừa bệnh cho cá

rô phi thì cá chỉ miễn dịch và không mắc bệnh trở lại với S agalactiae dung huyết beta nhưng đáng chú ý là nó lại không tạo ra miễn dịch để chống lại S agalactiae không

dung huyết và ngược lại (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010)

Kết quả một số phản ứng sinh hóa của vi khuẩn S agalactiae:

Bảng 2.1: Các đặc điểm sinh hóa của S agalactiae phân lập bởi nhiều tác giả

Eldar

và ctv (1994)

Baya

và ctv (1990)

Wikinson

và ctv (1973)

Robinson

và Meyer (1966)

Duremdez, và ctv (2004) Kuwait

Salvador và ctv (2005) Brazil

Yuasa và ctv(2008) Thái Lan

Nhuộm gram +, hình cầu +, hình cầu +, hình cầu +, hình cầu

Ghi chú: (+): Dương tính, (-): Âm tính; β: Dung huyết β; γ: Không dung huyết

2.1.2.3 Triệu chứng, bệnh tích của cá bị bệnh Streptococcus agalactiae

Ali và ctv (2011) đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho cá giống cá rô phi đỏ

bằng S agalactiae và kết luận rằng: S agalactiae phân lập từ cá rô phi nhiễm bệnh tự

nhiên có thể gây bệnh lại trên cá giống của cá rô phi đỏ thí nghiệm thông qua phương pháp tiêm vào xoang bụng và phương pháp ngâm Dấu hiệu bệnh tích, các biểu hiện chung và dấu hiệu mô học tương tự như mô tả từ cá bệnh tự nhiên

2.1.2.4 Tri ệu chứng

Cá bệnh có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài với những biểu hiện

bất thường như lờ đờ, hoạt động bơi lội bất thường và mất định hướng, xoay tròn, cong thân, cá bệnh tập trung thành từng cụm ở nền đáy, thường kém ăn hay bỏ ăn (Ali và ctv, 2011)

2.1.2.5 Bệnh tích

2.1.2.5.1 Bệnh tích bên ngoài

Một số biểu hiện tương đối đặc trưng là mắt mờ đục, lồi một bên, hai bên hoặc lõm vào, có thể thấy ổ mủ ở hàm dưới, gốc vây, ổ mủ vỡ ra thành loét, xuất huyết điểm

ở da, da vùng miệng, gốc vây

Một số còn bị đỏ, lồi lỗ hậu môn và lỗ sinh dục

2.1.2.5.2 B ệnh tích bên trong

Tương tự như bệnh nhiễm trùng do Aeromonas spp di động, Edwarsiella spp.,

bệnh thường gây xuất huyết, hoại tử gan, lách, thận thành những đốm màu nhạt ở cá rô phi (Bùi Quang Tề, 2006)

Gan sưng, thận và lách có hiện tượng sung huyết, tích dịch xoang bụng (Duremdez và ctv., 2004; trích bởi Springer, 2007)

Lách sưng, mô lách mềm nhũn, sung huyết, bóng hơi phình to, não mềm, thận sung huyết, tắc mạch máu (Ali và ctv, 2011)

Trướng bụng, dạ dày và ruột trống rỗng hoặc tích dịch hơi vàng (Springer, 2007)

Viêm phúc mạc nên viêm dính nội quan với nhau và viêm dính thành bụng, có

hiện tượng xuất huyết não (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010)

2.1.2.6 Dịch tễ của bệnh

Bệnh thường xảy ra trên cá cỡ lớn

Tỷ lệ cá chết rất cao ở những thời gian nhiệt độ nước cao trong năm, tập trung vào các tháng cuối mùa hè và đầu mùa thu Ở những thời điểm khác trong năm cá chết

rải rác Khi nhiệt độ nước xuống thấp vào những tháng mùa đông ở các nước ôn đới thì không thấy xuất hiện bệnh

Bệnh xảy ra do cá bị stress trong thời gian dài, bởi một số nguyên nhân do nhiệt

độ nước tăng cao (30,5 – 32o

C), DO thấp, mật độ nuôi dày

Bệnh lây lan theo chiều ngang do hiện tượng ăn nhau, khi cá bị trầy xướt trên

da tạo điều kiện cho vi khuẩn từ môi trường nước xâm nhập trực tiếp vào cơ thể cá, hay vi khuẩn xâm nhập qua niêm mạc (khứu giác) Bệnh truyền từ cá thể này sang cá

thể khác, từ cá chết sang cá hấp hối và cá khỏe Bệnh xảy ra cấp tính tỷ lệ chết cao, lên đến trên 50% trong 2 – 3 tuần Bệnh bộc phát vài lần, sau đó trở nên mãn tính, cá chết kéo dài trong nhiều tuần

2.1.2 7 Phương pháp chẩn đoán bệnh

Tại ao nuôi: Dựa vào các triệu chứng, bệnh tích để chẩn đoán sơ bộ

Trong phòng thí nghiệm: Tiến hành làm mẫu soi tươi, phết kính gan, thận, lách não Phân lập vi khuẩn bằng một số môi trường cơ bản như TSA, NA, BHIA Sử dụng môi trường thạch máu kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn Định danh vi khuẩn

bằng các phản ứng sinh hóa (phương pháp truyền thống), dùng bộ kit API 20 Strep, sử dụng kỹ thuật PCR,…Tuy nhiên trong thực tế, các kết quả thu được từ các phản ứng sinh hóa cũng như các test kit đôi lúc không trùng lắp với nhau do nhiều nguyên nhân

Vì vậy, cần kết hợp các phương pháp để có kết quả định danh chính xác nhất

2.1.2.8 Phương pháp phòng và trị bệnh

2.1.2.8.1 Phương pháp phòng bệnh

Áp dụng phương pháp phòng bệnh chung cho cá, đặc biệt là trước và trong mùa dịch Nên giảm mật độ nuôi, tránh cho ăn thừa, bổ sung các chất tăng cường miễn dịch vào thức ăn, thường xuyên vệ sinh bể nuôi, hạn chế đến mức tối đa các hoạt động phân

cỡ, chuyển đàn trong thời gian dịch bệnh thường xảy ra, vớt cá có dấu hiệu bệnh, cá chết ra khỏi ao nhằm tránh lây lan bệnh…

Sử dụng vaccine là biện pháp phòng bệnh tốt nhất hiện nay Evans và ctv

(2004) đã phát triển vaccine bất hoạt của S agalactiae có bổ sung sản phẩm ngoại bào

ECPs (Extracellular products) cho hiệu quả bảo hộ tốt với phương pháp tiêm qua xoang bụng một lần và phương pháp ngâm Trọng lượng cá rô phi thích hợp cho cấp vaccine theo cả hai phương pháp trên là 30g Phương pháp tiêm cho hiệu quả bảo hộ

tốt hơn so với phương pháp ngâm, việc hình thành miễn dịch khi đưa vaccine vào cơ

thể cá bằng phương pháp tiêm cho hiệu quả cao gấp 2 lần so với phương pháp ngâm Đồng thời, nhóm nghiên cứu còn cho rằng, không có sự bảo hộ miễn dịch chéo của vaccine có nguồn gốc từ S iniae chống lại S agalactiae và ngược lại Theo Sheehan

và cộng tác viên (2009), vaccine cho cá rô phi với chủng S agalactiae không dung

huyết không thể bảo vệ cá khi gây nhiễm với chủng S agalactiae dung huyết beta và ngược lại

2.1.2.8.2 Tr ị bệnh

Sử dụng các dạng kháng sinh phổ rộng hay kháng sinh diệt khuẩn gram dương như erythromycin, oxytetracyclin, doxycyclin,… để trị bệnh Dùng phương pháp trộn kháng sinh vào thức ăn như dùng erythromycin, ciprofloxacin, enrofloxacin liều 25 –

50 mg/kg cá/ngày, sử dụng liên tục trong 4 – 7 ngày

Tuy nhiên việc dùng kháng sinh cần thận trọng và tuân theo các nguyên tắc sử

dụng kháng sinh Nhiều người nuôi cho biết, kháng sinh chỉ có tác dụng trong thời gian dùng thuốc, khi ngưng kháng sinh, tỉ lệ chết tăng cao trở lại, buộc người nuôi phải dùng trong thời gian dài làm tăng nguy cơ kháng kháng sinh, giảm giá trị thịt cá và tăng chi phí sản xuất Vì vậy nếu đã quyết định dùng kháng sinh, chỉ nên dùng trong giai đoạn sớm của bệnh khi cá còn ăn

2.2 Ph ản ứng ngưng kết huyết thanh

Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi đã có sẵn kháng nguyên hòa tan đặc hiệu

Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên sẽ xuất hiện hiện tượng ngưng kết có thể nhìn thấy bằng mắt thường dùng để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh

Đầu tiên cho kháng nguyên hữu hình vào dãy ống nghiệm có độ pha loãng kháng thể tăng dần (Ví dụ: Ống 1: 1/2, ống 2: 1/4, ống 3: 1/8,…) Hiệu giá kháng thể

là độ pha loãng cao nhất mà vẫn xảy ra ngưng kết Chẳng hạn ở ống thứ 3 có độ pha loãng lớn nhất mà vẫn quan sát thấy ngưng kết thì ta nói hiệu giá của kháng huyết thanh là 1/8

2.3 Mô bệnh học

2.3.1 Khái ni ệm

Mô bệnh học là khoa học nghiên cứu các tổn thương ở các tế bào và mô Ngoài

ra còn so sánh đối chiếu các tổn thương với những biểu hiện lâm sàng

Qua đó, tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn chức năng để chẩn đoán nguyên nhân

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Cố định mẫu  Xử lý mẫu  Đúc khối  Cắt lát  Nhuộm màu Đọc kết quả  Hiểu được sự thay đổi bất thường của các tổ chức mô bệnh trên động vật thủy

sản do các tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn và virus (ThS Lưu Thị Thanh Trúc, 2009)

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Th ời gian và địa điểm

Khóa luận được thực hiện từ tháng 02/2011 đến tháng 07/2011 tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản và trại Thực Nghiệm Thủy Sản trường đại học Nông Lâm

cụ giải phẫu (bao gồm dao mổ, kéo, kẹp), ống tiêm

Hệ thống bể composite 70 L, vợt, máy sục khí, dây sục khí và đá bọt sục khí, nhiệt kế, xô, ống siphon

3.2.2 Hóa chất và môi trường

+ Nước muối sinh lý tiệt trùng, cồn 70o

, cồn 90o, nước cất, thuốc mê ethylen glycol monophenyl ether, dầu soi kính

Môi trường:

+ Môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHIA) dùng để nuôi cấy vi khuẩn

+ Môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHIB) dùng để tăng sinh vi khuẩn + Môi trường thạch máu cừu Sheep Blood Agar (SBA) gồm 95% BHIA và 5% máu cừu, dùng để kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn

3.2.3 Đối tượng nghiên cứu

3.2.3.1 Cá thí nghiệm

Đối tượng dùng trong thí nghiệm là cá rô phi đỏ Oreochromis sp.cỡ cá 25 – 30

g/con

Cá hương (cỡ 1000 con/kg) được chuyển từ trại cá giống ở Vĩnh Long về ương

ở trại thực nghiệm Thủy Sản trường đại học Nông Lâm TP.HCM Cá sau khi mang về được ương trong bể xi măng thể tích 4 m3 trong 2 tháng trước khi bố trí thí nghiệm Mỗi ngày cho cá ăn 2 lần vào lúc 8 giờ và 14 giờ bằng thức ăn của công ty Cargill

Cá được chọn để bố trí thí nghiệm phải đạt kích cỡ yêu cầu, đồng đều, chất lượng tốt, màu sắc tươi sáng Trước khi bố trí thí nghiệm, cá được kiểm tra tình trạng

kí sinh trùng và tình trạng nhiễm khuẩn trong gan, thận, lách, não

Hai ngày trước khi tiến hành gây nhiễm, cá sẽ được chuyển sang bể composite cho quen với môi trường bể thí nghiệm

3.2.3.2 Vi khuẩn thí nghiệm

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae sử dụng trong thí nghiệm được phân lập từ

cá rô phi đỏ bệnh ở Đồng Tháp vào tháng 05/2011 Sau đó được làm thuần cũng như định danh tại phòng thí nghiệm Bệnh học Thủy sản, khoa Thủy sản trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2.4 Hệ thống bể thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trong bể composite thể tích 70 lít/bể

Các bể được vệ sinh và khử trùng sạch bằng chlorine 500 ppm trước khi cấp nước

Nước sử dụng trong thí nghiệm là nước máy được bơm vào bể trữ 1m3

có sục khí Nước được sục khí trong 2 ngày cho bay hết chlorine sau đó mới cho vào bể thí nghiệm

Nước trong bể gây bệnh được sục khí liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

dạng 2 ở 5 nồng độ vi khuẩn 104

, 105, 106, 107, 108 + Nghiệm thức C: Nghiệm thức đối chứng Huyền dịch vi khuẩn được thay bằng nước muối sinh lý vô trùng

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên cá rô phi đỏ

Nghi ệm thức Vi khu ẩn M ật độ vi khuẩn (CFU/mL)

10 4 10 5 10 6 10 7 10 8

Thí nghiệm được theo dõi trong 14 ngày kể từ ngày gây bệnh

Không cho cá ăn trong thời gian thí nghiệm

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu chung

Vi khuẩn

Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn

Xác định mật độ bằng máy đo quang phổ

Pha loãng

Gây bệnh thực nghiệm Xác định mật độ vi khuẩn

trong bình gốc bằng phương pháp cấy trang Ghi nhận tỷ lệ chết, bệnh tích

Mổ, khám nội tạng

Phân lập vi khuẩn Cắt mẫu mô

Làm thuần vi khuẩn Quan sát, ghi nhận

Định danh

3.3.3 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng

Mục đích kiểm tra để đánh giá tình trạng sức khỏe tổng quát ban đầu của cá Cách tiến hành:

- Cá được làm chết bằng cách hủy não và đặt trong khay mổ sạch

- Quan sát hình dạng ngoài của cá ở da, mang, gốc vây

- Kiểm tra ngoại kí sinh: Dùng dao cạo lấy nhớt ở da, vây và dùng lamelle gạt

nhẹ nhớt cạo được lên lame, nhỏ lên đó 1 - 2 giọt nước sạch rồi dùng lamelle dàn mỏng Đặt lamelle lên và quan sát dưới kính hiển vi

- Kiểm tra kí sinh trùng ở cung mang: Dùng kéo cắt bỏ nắp mang rồi quan sát

bằng mắt thường Cắt cung mang, nhúng qua một đĩa nước đã chuẩn bị trước để rửa bớt máu, dùng kẹp lấy ra quan sát bằng mắt thường, sau đó quan sát dưới kính hiển vi

từ độ phóng đại nhỏ đến lớn

3.3.4 Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn

Vi khuẩn S agalactiae được cấy thuần trên môi trường BHIA, ủ ở 30o

C Sau 24

giờ, chọn một số khuẩn lạc đặc trưng, mọc riêng lẻ trên đường cấy hòa đều trong nước muối sinh lý vô trùng bằng máy vortex

3.3.5 Phương pháp pha loãng huyền phù vi khuẩn

Xác định mật độ vi khuẩn bằng máy đo quang phổ với bước sóng 550 nm Sau khi tiến hành đo huyền phù vi khuẩn gốc, điều chỉnh huyền phù vi khuẩn gốc bằng nước muối sinh lý vô trùng về giá trị OD (Optical density) = 0,125, lúc đó mật độ khuẩn trong huyền phù vi khuẩn gốc sẽ có giá trị tương đương 1,5 x 108

CFU/mL Tiếp tục pha loãng huyền phù vi khuẩn theo hệ số 10 để có các nồng độ gây bệnh tiếp theo

Mật độ vi khuẩn trong bình gốc ban đầu được quy định có độ pha loãng là 100

Dùng pipet lấy 1 mL huyền phù vi khuẩn trong bình gốc, cho vào ống nghiệm

có chứa sẵn 9 mL nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều bằng tay hoặc bằng máy vortex được huyền dịch có độ pha loãng 10-1

Dùng pipet lấy 1 mL huyền dịch có độ pha loãng 10-1

từ ống nghiệm trên cho vào ống nghiệm thứ hai chứa sẵn 9 mL nuớc muối sinh lý để có độ pha loãng 10-2

Tiếp tục làm như trên, lần lượt đạt được độ pha loãng 10-3

, 10-4…10-8

- Từ mỗi độ pha loãng, lấy 0,1 mL huyền dịch cho lên mặt thạch

- Dùng que trang tam giác vô trùng trang đều huyền phù lên mặt thạch cho đến khi mặt thạch vừa khô, mang đĩa đã trang ủ ở 30o

C trong 24 – 48 giờ

Ủ các đĩa trang ở nhiệt độ 300

C trong 24 giờ sau đó tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa (chỉ đếm số khuẩn lạc ở các đĩa nằm trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc) Dựa vào công thức để tính mật độ vi khuẩn

Công thức tính mật độ vi khuẩn trong dung dịch gốc:

N (CFU/mL) = M/(V x F i )

Trong đó:

- CFU (conoly forming unit): Đơn vị khuẩn lạc

- N: Mật độ vi khuẩn trong dung dịch gốc

- M: Số khuẩn lạc trung bình đếm ở mật độ thứ i

- V: Thể tích huyền phù đem trang (mL)

- F: Hệ số pha loãng

3.3.7 Gây b ệnh bằng phương pháp tiêm

Cá được gây mê bằng ethylen glycol monophenyl ether trước khi tiêm để hạn

chế cá bị sốc và thao tác dễ dàng trong quá trình tiêm

Cá được cân trước khi tiêm để điều chỉnh thể tích huyền dịch vi khuẩn tiêm tùy theo trọng lượng của cá

Hình 3.2: Cân cá trước khi tiêm Tiêm vào xoang bụng cá thí nghiệm với liều lượng 0,1 mL huyền dịch vi khuẩn/ 10g cá Cá ở nghiệm thức đối chứng được tiêm nước muối sinh lý thay cho huyền dịch vi khuẩn

Hình 3.3: Thao tác tiêm vi khuẩn vào xoang bụng cá

Cá sau khi tiêm được cho vào xô nước có sục khí mạnh để hồi phục rồi mới đưa trở lại bể thí nghiệm

3.3.8 Phương pháp giải phẫu cá

Đặt cá lên khay mổ Dùng cồn sát trùng mặt ngoài cơ thể cá tại những vị trí giải

phẫu để tránh sự nhiễm tạp các vi khuẩn bên ngoài

Mổ sọ não: Sát trùng vùng da xung quanh vùng sọ não cá, sau đó cắt 4 đường

cắt nối lại với nhau

Hình 3.5: Bốn đường cắt mổ sọ não cá

Dụng cụ giải phẫu phải được vô trùng trước và sau khi tiến hành thao tác trên từng cơ quan

3.3.9 Ph ương pháp cấy phân lập vi khuẩn

Tách lấy gan, thận, lách, đặt lên một miếng bông gòn đã tẩm cồn, sau đó sát trùng mặt ngoài của cơ quan này

Dùng kéo cắt ngang cơ quan này và chấm lên đĩa thạch

Dùng que cấy vòng ria 3 - 4 lần trên mặt thạch BHIA ở một góc Quay đĩa

thạch sang hướng khác và cấy ria từ 1 vạch thành 3 - 4 đường sao cho đường cấy sau không trùng lên đường cấy trước Lặp lại 2, 3 lần

Ủ các đĩa trong vòng 48 giờ ở 30o

C

3.3.10 Phương pháp cấy thuần

Mục đích của việc cấy thuần là để định danh vi khuẩn nhằm xác định chính xác tác nhân gây bệnh

Chọn những khuẩn lạc đặc trưng, riêng lẻ từ các đĩa phân lập và tiến hành cấy ria vào một đĩa BHIA khác Đặt các đĩa thạch đã cấy xong vào tủ ủ ở 30o

Các bước nhuộm gram:

- Nhỏ crystal violet lên vết bôi trong 30 giây

- Đổ bỏ crystal violet, rửa với nước cất

- Cho dung dịch lugol cố định màu crystal violet trong 1 phút

- Đổ bỏ lugol, rửa với nước cất

- Nghiêng lame, nhỏ dung dịch tẩy (cồn 95%) đến khi mất màu hoàn toàn, rửa lại bằng nước

- Cho dung dịch Safranin lên vết bôi trong 60 – 80 giây

- Đổ bỏ dung dịch, rửa nước để khô lame

- Quan sát trên kính hiển vi

Quan sát trên kính hiển vi:

- Quan sát màu vi khuẩn sau khi nhuộm: G

-: Vi khuẩn bắt màu hồng; G+

: Vi khuẩn bắt màu tím

- Quan sát hình dạng vi khuẩn: Trực khuẩn, cầu khuẩn, phẩy khuẩn

- Quan sát dạng tồn tại: Đơn, đôi, chuỗi…

3.3.11.2 Thử nghiệm catalase

Phương pháp tiến hành:

- Nhỏ 1 giọt thuốc thử catalase lên lame

- Lấy 1 khuẩn lạc cần thử nghiệm từ môi trường nuôi cấy bằng pipet Pasteur

- Trộn đều khuẩn lạc với thuốc thử

Đọc kết quả: Kết quả được đọc ngay sau 1 – 2 giây

- Phản ứng dương tính: Có bọt khí xuất hiện

- Phản ứng âm tính: Không có bọt khí

3.3.11.3 Thử nghiệm oxidase

Phương pháp tiến hành:

- Đặt đĩa giấy tẩm hóa chất lên lame sạch

- Làm ẩm đĩa giấy bằng nước muối sinh lý tiệt trùng, không làm quá ướt

- Dùng pipet Pasteur lấy 1 khuẩn lạc riêng lẽ bôi lên đĩa giấy

Các tiến hành thử nghiệm trên môi trường thạch bán lỏng: Cấy đâm sâu vi sinh

vật vào môi trường thạch

+ Vi sinh vật di động sẽ phát triển lan ra khỏi vết cấy, làm nhòe đường cấy

+ Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy

3.3.11 5 Định danh bằng bộ kit API 20 Strep

Dùng kit API 20 Strep của công ty Biomérieux để định danh vi khuẩn gây bệnh

Bộ kit gồm 20 giếng:

- 9 giếng nhỏ gồm các phản ứng: VP, HIP, ESC, PYRA, αGUR, βGAL, PAL, LAP

- 11 giếng lớn gồm các phản ứng: ADH, RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD, GLYG

Thực hiện thao tác nhỏ huyền phù vi khuẩn và các hóa chất, thuốc thử như hướng dẫn đi kèm với bộ kit

Thực hiện so màu sau 4 giờ đối với các giếng nhỏ và 24 giờ đối với các giếng lớn

Cuối cùng, dùng phần mềm Apiweb để xác định tên vi khuẩn đã dùng để định danh

3.3.12 Th ử nghiệm ngưng kết huyết thanh

- Tại vị trí vừa thực hiện một màu đục đồng nhất là kết quả âm tính

Thực hiện phản ứng ngưng kết chéo giữa huyết thanh của cá được gây bệnh bởi chủng vi khuẩn này với kháng nguyên là chủng vi khuẩn khác

Hình 3.6: Kết quả phản ứng ngưng kết huyết thanh 3.3.13 Mô học

Các cơ quan như gan, thận và lách của cá hấp hối và mới chết ở các nghiệm

thức được cố định trong dung dịch phosphate buffered formalin, sau đó được gửi cắt mẫu mô và nhuộm Hematoxylin – Eosin tại khoa Giải phẫu bệnh – bệnh viện Từ Dũ

Mẫu mô sau khi cắt được quan sát dưới kính hiển vi ở các vật kính khác nhau

để ghi nhận những biến đổi mô bệnh học của cá bệnh so với cá không bệnh

3.3.14 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm

Cá sau khi gây nhiễm được theo dõi trong 14 ngày

Hàng ngày, tiến hành đo nhiệt độ 2 lần/ngày (lúc 7 giờ 30 phút và 15 giờ), kiểm tra DO, pH, NH3 đo 2 ngày/1 lần

Nhiệt kế, máy đo OD, ống đong của test Sera phải được xịt cồn, lau chùi sau khi tiến hành đo ở mỗi nghiệm thức

Quan sát biểu hiện của cá, ghi nhận các biểu hiện bất thường, số liệu cá chết ở

mỗi bể Khi cá chết, ghi nhận biểu hiện bên ngoài, giải phẫu ghi nhận các biểu hiện bên trong Đối với cá mới chết, cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách

Số cá còn sống sau 14 ngày gây bệnh thực nghiệm được ghi nhận biểu hiện bên ngoài, bên trong và cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách

3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Các số liệu thu được trong quá trình thí nghiệm được xử lí bằng phần mềm Minitab 15 và Excel 2007

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Một số chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thí nghiệm

Chất lượng nước là một yếu tố quan trọng trong nuôi trồng thủy sản, có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và phát triển của thủy sinh vật nói chung và cá nói riêng Vì vậy, việc kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng nước là rất cần thiết để có thể kịp thời điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện sống của cá

Trước khi tiến hành thí nghiệm chúng tôi kiểm tra một số chỉ tiêu chất lượng nước như nhiệt độ, pH, DO…

Bảng 4.1: Một số chỉ tiêu chất lượng nước trước thí nghiệm

Bảng 4.2: Một số chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thí nghiệm

Dựa vào bảng 4.1 và bảng 4.2 chúng tôi rút ra nhận xét sau:

+ Nhiệt độ: Nhiệt độ nước dao động từ 29 – 31,50

C ở các nghiệm thức Kết quả này cho thấy nhiệt độ nước trong các bể thí nghiệm là khoảng nhiệt độ thích hợp nằm

trong giới hạn chịu đựng của cá rô phi (Ngô Văn Ngọc, 2008) Đồng thời đây cũng là khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và gây bệnh của vi khuẩn Steptococcus trên cá thí nghiệm

+ pH: Chúng tôi nhận thấy rằng pH ở các nghiệm thức dao động trong khoảng 7 – 7,5 Như vậy pH nằm trong khoảng giới hạn chịu đựng của cá

+ Hàm lượng ôxy hòa tan (DO): Do các bể được sục khí liên tục nên hàm lượng ôxy hòa tan trong suốt thời gian thí nghiệm ở các nghiệm thức được duy trì ở mức cao, dao động từ 4 – 6 mg/L Hàm lượng ôxy hòa tan này tốt cho sự sống bình thường của

cá

+ NH3: Theo Meade (1989; trích dẫn bởi Nguyễn Phú Hòa, 2000), nồng độ NH3

thích hợp trong môi trường nuôi cá nước ngọt là nhỏ hơn 0,1 ppm Hàm lượng NH3

mà chúng tôi kiểm tra được trong thời gian thí nghiệm dao động trong khoảng 0,06 – 0,09 ppm Như vậy hàm lượng NH3 này thấp hơn so với chỉ tiêu NH3 trong môi trường nuôi cá nước ngọt của Meade, nghĩa là giá trị này rất thích hợp cho sự phát triển của cá Sở dĩ hàm lượng NH3 trong quá trình thí nghiệm dao động tương đối thấp

là vì trong suốt quá trình thí nghiệm chúng tôi không cho cá ăn

Như vậy các chỉ tiêu chất lượng nước đều dao động trong khoảng thích hợp, không ảnh hưởng đến sức khỏe của cá thí nghiệm

4.2 Kết quả thí nghiệm

4.2.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá trước khi thí nghiệm

Trước khi bắt đầu thí nghiệm, chúng tôi theo dõi và tiến hành kiểm tra tình trạng sức khỏe chung của cá

Cá chuẩn bị dùng trong thí nghiệm bơi lội theo đàn, hoạt động nhanh nhẹn, linh hoạt, phản ứng mạnh với tiếng động và bóng người Màu sắc tươi sáng, không bị xuất huyết trên da và vây

Chúng tôi kiểm tra ngẫu nhiên 11 cá thể trong đàn cá chuẩn bị thí nghiệm để tiến hành kiểm tra thì thu được kết quả như sau:

- Kết quả kiểm tra ký sinh trùng ở da, mang, ruột, dạ dày cho thấy ở da, dạ dày,

ruột cá không có sự hiện diện của ký sinh trùng, riêng ở mang xuất hiện một vài cá thể trùng bánh xe và sán lá đơn chủ Tuy nhiên, số lượng ký sinh trùng chiếm tỷ lệ rất

thấp, nằm trong giới hạn cho phép dành cho cá nuôi

- Nội tạng có màu sắc bình thường, sáng, không có dấu hiệu sưng, xuất huyết, sung huyết, tích dịch, hoại tử…Sau khi quan sát thực hiện cấy phân lập vi khuẩn ở gan, thận, lách, não trên môi trường BHIA, ủ đĩa đã cấy ở 300

C sau 24 giờ trong tủ cho

kết quả không có khuẩn lạc hiện diện

Từ các kết quả trên chúng tôi có thể kết luận cá thí nghiệm hoàn toàn khỏe

mạnh, đáp ứng được yêu cầu thí nghiệm

4.2.2 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm

Khi pha loãng vi khuẩn ở các mật độ khác nhau để chuẩn bị tiêm cho cá, chúng tôi trích ra 0,1mL huyền phù để trang trên đĩa BHIA Sau 24 giờ ủ đĩa đã trang, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa, chúng tôi tính được mật độ vi khuẩn trong bình gốc của S agalactiae ở nghiệm thức A và B lần lượt là 4,7 x 108

CFU/mL và 1,1

x 108 CFU/mL

Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm ở các nghiệm thức

Nghiệm thức Mật độ vi khuẩn tiêm cho cá (CFU/mL)