TÌM HIỂU KỸ THUẬT NUÔI THÂM CANH CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN THỦY SẢN KIÊN GIANG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TỔNG HỢP HỢP CHẤT CHITIN TỪ SINH KHỐI NẤM SỢI Thực hiện bởi Nguyễn Thị Cẩm Luận văn được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Chế Biến Thủy Sản Giáo viên hướng d

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA TH ỦY SẢN

ĐỀ TÀI

SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ CẨM

NGÀNH: CH Ế BIẾN THỦY SẢN

KHÓA: 2007 – 2011

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁNG 07/ 2011

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TỔNG HỢP HỢP CHẤT CHITIN TỪ SINH KHỐI

NẤM SỢI

Thực hiện bởi

Nguyễn Thị Cẩm

Luận văn được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Chế Biến Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn: Th.s Nguyễn Thị Thanh Trúc

Th.s Trương Phước Thiên Hoàng

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 07/2011

C ẢM TẠ

Con cảm ơn ba mẹ, các em cùng những người thân luôn tạo mọi điều kiện thuận

lợi và động viên con trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Ban chủ nhiệm khoa Thủy Sản cùng các

thầy cô khoa Thủy Sản đã tận tình dạy dỗ tôi

- Ths Nguyễn Thị Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp tại trường

- Ths Trương Phước Thiên Hoàng đã luôn bên cạnh, quan tâm, hướng dẫn tận tình trong suốt tiến trình tiến hành đề tài

- Các anh, chị cùng cán bộ nhân viên ở viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

- Các bạn cùng lớp DH07CT luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

- Các bạn Nông Học và Công Nghệ Sinh làm cùng phòng 202, 203

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Cẩm

trường tăng sinh được sử dụng trong thí nghiệm này Kết quả đã chọn được môi

trường tăng sinh số 3 thích hợp cho 3 chủng nấm Aspergillus niger, Mucor sp.,

Trichoderma sp., riêng ch ủng nấm Penicillum sp lại thích hợp nhất với môi trường

tăng sinh thứ nhất và lượng sinh khối khô thu được của 4 chủng nấm lần lượt là 18,2 g/l, 1,4 g/l, 6,3 g/l và 2,2 g/l

Thí nghiệm 2: Tìm ra chủng nấm sợi có hàm lượng chitin cao nhất Sau quá trình khảo sát giữa bốn chủng nấm sợi Aspergillus niger, Mucor sp.,

Trichoderma sp và Penicillum sp Sau cùng chúng tôi đã chọn ra được chủng

Trichoderma sp là chủng có hàm lượng chitin trong vách tế bào nhiều nhất chiếm 23,8% trọng lượng khô so với 3 chủng còn lại lần lượt là Aspergillus niger 7,14%,

hợp cả 3 điều kiện trên trong cùng một thí nghiệm thì hàm lượng sinh khối khô đạt

được là 8,4 g/l

M ỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các hình viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các đồ thị x

Danh sách các biểu đồ x

Chương 1.MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Chitin 3

2.1.1 Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên 3

2.1.2 Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của chitin 4

2.1.2.1 Cấu trúc hóa học của chitin 4

2.1.2.2 Tính chất lý hóa của chitin 5

2.2 Chitosan 5

2.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của chitosan 5

2.2.1.1 Cấu trúc hóa học 5

2.3 Nấm sợi 6

2.3.1 Hình thái và kích thước 6

2.3.2 Cấu tạo tế bào 7

2.3.3 Sinh sản 8

2.3.4 Ý nghĩa thực tiễn của nấm sợi 8

2.4 Nấm Trichoderma sp 9

2.4.1 Đặc điểm hình thái (Gary J Samuels, 2004) 9

2.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh học, sinh hóa 11

2.4.3 Cấu tạo tế bào Trichoderma 12

2.5 Aspergillus niger 12

2.6 Mucor sp 12

2.7 Penicillum sp 13

2.8 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin-chitosan trong thực tế trên thế giới và ở Việt Nam 14

2.9 Một số quy trình sản xuất chitin – chitosan thế giới và Việt Nam 17

2.9.1 Trên thế giới 17

2.9.2 Ở Việt Nam 20

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu 24

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.1.2 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 24

3.1.2.1 Nguồn nấm 24

3.1.2.2 Thiết bị và dụng cụ 24

3.1.2.3 Hóa chất 24

3.1.2.4 Môi trường 25

3.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.2.1 Phương pháp cấy truyền các chủng nấm 26

3.2.2 Phương pháp lắc lên men 26

3.2.3 Phương pháp thu nhận sinh khối nấm sợi và tách chiết chitin 26

3.2.4 Bố trí thí nghiệm 27

3.2.4.1 Khảo sát và lựa chọn môi trường tăng sinh 27

3.2.4.2 Khảo sát và lựa chọn chủng nấm 27

3.2.4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp sinh khối tế bào và hợp chất chitin của chủng Trichoderma sp 27

3.2.4.3.1 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tổng hợp sinh khối và hợp chất chitin 27

3.2.4.3.2 Khảo sát thời gian lên men 28

3.2.4.3 3.Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến quá trình thu nhận sinh khối 28

3.2.5 Hiệu suất thu hồi sản phẩm 28

3.2.6 Phương pháp bố trí và xử lý số liệu thí nghiệm 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Khảo sát sự phát triển hệ sợi và bào tử của các chủng nấm sợi trên môi trường thạch PGA 30

4.2 Khảo sát và lựa chọn môi trường tăng sinh 32

4.3 Khảo sát và lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng tổng hợp sinh khối tế bào và các hợp chất chitin cao 35

4.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp sinh khối tế bào và hợp chất chitin của chủng Trichoderma sp 37

4.4.1 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tổng hợp sinh khối và hợp chất chitin 37

4.4.2 Khảo sát thời gian lên men 40

4.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến quá trình thu nhận sinh khối 41

4.5 Hiệu suất thu hồi sản phẩm 42

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Tài liệu tiếng Việt 45

Tài liệu tiếng Anh 46

PHỤ LỤC 48

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.6.1 Khuẩn ty Trichoderma sp (vùng màu trắng) phát triển trên môi trường agar

sau 2-3 ngày nuôi cấy (A) và trong tự nhiên (B) ( vùng màu xanh) 10

Hình 2.6.2 Hình dạng sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma sp 10

Hình 4.1.: Hình thái đại thể và vi thể của 4 chủng nấm trên thạch PGA 31

Hình 4.4.1: Hình dạng chủng nấm Trichoderma sp theo thời gian nuôi cấy 48

Hình 4.4.2 Hình sinh khối tế bào khi lắc tăng sinh của chủng nấm Trichoderma sp 48

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng chitin 4 Bảng 4.1 Sự phát triển hệ sợi và bào tử các chủng nấm trên môi trường thạch PGA 30

Bảng 4.2 Hiệu suất tổng hợp sinh khối tế bào của các chủng nấm sợi 35 Bảng 4.3.Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hiệu suất tổng hợp sinh khối và hàm

lượng chitin của chủng nấm sợi Trichoderma sp 37

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian lắc tăng sinh đến việc tổng hợp sinh khối tế bào của chủng nấm Trichoderma sp 40

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của pH đến quá trình tổng hợp sinh khối tế bào của chủng nấm

Trichoderma sp 41

Bảng 4.6 Hiệu suất thu hồi chitin của chủng nấm Trichoderma sp 43

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Sự biến thiên của hàm lượng sinh khối khô của Trichoderma sp theo thời

gian nuôi cấy 38

Đồ thị 4.2: Sự biến thiên của hàm lượng chitin của Trichoderma theo thời gian nuôi

cấy 38

Đồ thị 4.3: Sự biến thiên % hàm lượng chitin của Trichoderma sp theo thời gian nuôi

cấy 39

Đồ thị 4.4: Sự biến thiên của hàm lượng sinh khối khô của Trichoderma sp theo thời

gian lắc tăng sinh 40

Đồ thị 4.5: Sự biến thiên sinh khối tế bào của chủng Trichoderma sp theo pH 42

Biểu đồ 4.1: Hàm lượng sinh khối khô sau khi lắc tăng sinh của Trichoderma sp 32

Biểu đồ 4.2: Hàm lượng sinh khối khô sau khi lắc tăng sinh của Aspergillus niger 33

Biểu đồ 4.3: Hàm lượng sinh khối khô sau khi lắc tăng sinh của Pennicillum sp 33

Biểu đồ 4.4: Hàm lượng sinh khối khô sau khi lắc tăng sinh của Mucor sp 34

Biểu đồ 4.5: Hàm lượng chitin của chủng nấm 36

C hương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chitin là một polymer sinh học có nhiều trong cấu trúc khớp, sụn của các động

vật bậc thấp, trong thành phần tế bào một số vi sinh vật như: nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, Quá trình chiết tách, thu nhận chitin và các dẫn xuất của nó, đặc biệt là chitosan có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y

học và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường,… Ngoài những ứng dụng trên, chitin còn có ứng dụng cũng không kém phần quan trọng trong lĩnh vực thủy sản nhằm bổ sung vào

thức ăn cho tôm nhằm kích thích quá trình lột xác của tôm, mục đích rút ngắn thời gian thu hoạch, tiết kiệm chi phí và nâng cao hiệu quả kinh tế đồng thời hạn chế nguy

cơ miễn dịch bệnh so với thời gian nuôi khá dài trước kia

Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin - chitosan mà nhiều nước khác nhau trên thế giới trong đó có cả nước ta đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm sản xuất ra các

sản phẩm này như: tách chiết thành công chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học

hoặc thời gian gần đây có kết hợp thêm phương pháp sinh học hay công nghệ phân lập chitin bền vững của viện AIT

Tuy nhiên, hiện nay các quy trình sản xuất chitin - chitosan quy mô lớn tại Việt Nam chủ yếu là sử dụng phương pháp hóa học và nguyên liệu chủ yếu là từ vỏ tôm, nên phải sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến lượng chitin - chitosan thu được chưa cao và nhiều tạp chất Song chitin không chỉ có nhiều trong vỏ tôm mà còn có trong vi khuẩn, sinh khối nấm sợi,… với hàm lượng cũng đáng kể Đặc biệt từ trước đến nay có rất nhiều nghiên cứu về quy trình sản xuất chitin nhưng nguyên liệu chủ

yếu lại chỉ là vỏ tôm mà chưa chú trọng đến những nguyên liệu khác cũng có khả năng thu hồi chitin không thấp hoặc nếu có những nghiên cứu khác về nguyên liệu sản xuất chitin thì rất ít

Xuất phát từ thực tiễn trên, được sự hướng dẫn của Th.s Nguyễn Thị Thanh Trúc cùng với sự chấp thuận của Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, tôi thực hiện đề tài

“ Khảo sát khả năng tổng hợp hợp chất chitin từ sinh khối nấm sợi”

C hương 2

2.1 Chitin

2.1.1 S ự tồn tại của chitin trong tự nhiên

Theo Braconout (1821), chitin được phát hiện trong cặn dịch chiết từ một loại

nấm được gọi là “Fungine” Odier (1823) phân lập được một chất từ bọ cánh cứng gọi

là chitin hay “chiton”, nhưng không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó Tuy nhiên, Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống cellulose

Chitin - chitosan là một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose

và chúng được tạo ra trung bình 20g trong năm/1m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao, monome của chitin là thành phần chủ yếu trong mô da giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm sợi, một số loại tảo…

Chitin - chitosan là một polysacharite có đạm không độc, có khối lượng phân tử

lớn Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharite (N-acetyl 𝛽𝛽-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở dạng tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ lượng chitin chiếm khá cao dao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô (Trần Thị Luyến, 2000) Vì vậy

vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan và các dẫn

xuất của chúng

Nấm Tôm Cua

2.1.2 Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của chitin

2.1.2.1 C ấu trúc hóa học của chitin

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl- 𝛽𝛽-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết 𝛽𝛽-1-4 glucozit

Công thức cấu tạo của chitin:

Tên gọi khoa học: poly (1-4)-2-acetamido-2-deoxy- 𝛽𝛽-D-glucose; acetamido-2-deoxy- 𝛽𝛽-D-glucopyranose

poly(1-4)-2-Công thức phân tử: [ C8H13O5N]n

Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n

2.1.2.2 Tính chất lý hóa của chitin

Chitin là chất có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hay dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu… Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan trong hệ dimetylacetamid – LiCl 8%, tan trong hexafluoro – isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihyđrate (CF3COCF3.H2O) Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 nm

Chitin ổn định với các chất oxy hóa mạnh như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javen (NaOCl – NaCl)…, lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các

chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin

Chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schwcizci Sapranora Điều này có thể do nhóm acetamit (-NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết

Khi đun nóng trong acid HCl đậm đặc thì chitin sẽ bị phân hủy hoàn toàn thành 85,5% D-glucosamine và 12,5% acid acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở cầu

nối glucozit, tiếp theo là sự loại bỏ nhóm acetyl

Khi đun nóng chitin trong NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan

𝛽𝛽-D-Công thức cấu tạo:

Tên gọi khoa học: poly (1-4)-2-amino-2-deoxy- 𝛽𝛽-D-glucose; deoxy- 𝛽𝛽-D-glucopyranose

Chitosan kết hợp với aldehyde trong điều kiện thích hợp để tạo thành gel, đây là

cơ sở để bẫy tế bào, enzyme

Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo ra muối khó tan Chitosan tác dụng với iot trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím

trường, từ đây sinh ra những cơ quan sinh sản Khuẩn ti cơ chất mọc sâu vào môi trường

Khuẩn lạc của nấm sợi cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc xạ khuẩn Khuẩn lạc nấm sợi khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn, thường to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần Dạng xốp hơn do kích thước khuẩn ti to hơn Thường thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích thước 5 - 10 mm, trong khi đó khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5 - 2 mm

2.3.2 Cấu tạo tế bào

Cũng như nấm men, nấm sợi có cấu tạo tế bào điển hình như ở sinh vật bậc cao Thành phần hoá học và chức năng của các cấu trúc này cũng tương tự như ở nấm men Điều sai khác cơ bản giữa nấm sợi và nấm men là ở tổ chức tế bào

Nấm men chỉ là những tế bào riêng rẽ hoặc xếp với nhau theo kiểu cây xương rồng Nấm sợi có tổ chức tế bào phức tạp hơn, trừ một số nấm sợi bậc thấp có cấu tạo đơn bào phân nhánh Ở những nấm sợi bậc thấp này, cơ thể là một hệ sợi nhiều nhân không có vách ngăn

Đa số nấm sợi có cấu tạo đa bào, tạo thành những tổ chức khác nhau như sợi khí sinh, sợi cơ chất Sợi cơ chất của nấm sợi không đơn giản như ở xạ khuẩn mà phức tạp hơn Có những loài có sợi cơ chất giống như rễ chùm ở thực vật gọi là rễ giả, ví dụ

như ở Aspergillus niger Ở những loài nấm sợi ký sinh trên thực vật, sợi cơ chất tạo

thành những cấu trúc đặc biệt gọi là vòi hút

Ở một số loài nấm sợi, các sợi nấm nối với nhau thông qua các cầu nối, các cầu nối hình thành giữa các sợi nằm gần nhau gọi là sự hợp nối do có hiện tượng 2 khối nguyên sinh chất trộn lẫn với nhau Đó có thể là một hình thức lai dinh dưỡng

Một số loài nấm sợi có cấu tạo gần giống mô thực vật gọi là mô giả Đó là các

tổ chức sợi xốp gồm các sợi nấm xếp song song với nhau tạo thành một tổ chức sợi xốp Ngoài tổ chức sợi xốp còn có tổ chức màng mỏng giả gần giống như màng mỏng

ở thực vật bậc cao Chúng gồm những tế bào có kích thước xấp xỉ nhau hình bầu dục, xếp lại với nhau Hai tổ chức trên có ở thể đệm và hạch nấm Thể đệm cấu tạo bởi nhiều khuẩn ti kết lại với nhau, từ đó sinh ra các cơ quan sinh sản của nấm sợi Hạch

nấm thường có hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, kích thước tuỳ theo loài, từ dưới 1 mm đến vài cm Đặc biệt có loài có kích thước hạch nấm tới vài chục cm Hạch nấm là một tổ chức giúp cho nấm sống qua những điều kiện ngoại cảnh bất lợi Sợi nấm tồn tại trong hạch không phát triển Khi gặp điều kiện thuận lợi hạch sẽ nảy mầm

và phát triển bình thường

2.3.3 Sinh sản

Nấm mốc có 3 hình thức sinh sản chính: sinh sản dinh dưỡng, sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính

2.3.4 Ý nghĩa thực tiễn của nấm sợi

Nấm sợi là một nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong thiên nhiên Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá vật chất, khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Khả năng chuyển hoá vật chất của chúng được ứng dụng trong nhiều ngành, đặc biệt là chế biến thực phẩm (làm rượu, làm tương, nước chấm v.v ) Mặt khác, có nhiều loại nấm sợi mọc trên các nguyên, vật liệu, đồ dùng, thực phẩm phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng Một số loài còn gây bệnh cho người, động vật thực vật (bệnh lang ben, vẩy nến ở người, nấm rỉ sắt ở thực vật v.v )

Ngoài các nhóm vi sinh vật chính đã mô tả ở trên, thuộc về các vi sinh vật có kích thước hiển vi có thể xếp vào đối tượng của vi sinh vật học còn có các nhóm tảo đơn bào gọi là vi tảo, các nhóm nguyên sinh động vật như trùng roi, amip v.v

Tất cả những sinh vật nhỏ bé nói trên tạo thành thế giới vi sinh vật vô cùng phong phú, chúng phân bố ở khắp mọi nơi trên hành tinh chúng ta Chúng tham gia vào các quá trình chuyển hoá vật chất, khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong thiên nhiên, làm cho sự cân bằng vật chất được ổn định và từ đó bảo vệ sự cân bằng sinh thái Người ta có thể sử dụng nhiều nhóm vi sinh vật vào mục đích bảo vệ môi trường Ví dụ như nhóm vi sinh vật phân huỷ chất hữu cơ trong rác thải, nhóm vi sinh vật phân huỷ các chất độc hại thành chất không độc Trong công nghệ xử lý chất thải bằng phương pháp sinh học có sử dụng rất nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau Vi sinh vật còn được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất như chế tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật sinh học nhằm mục đích thay thế các chất hoá học độc hại với

môi trường Sự phân bố rộng rãi của vi sinh vật trong các môi trường tự nhiên đóng vai trò quyết định vào khả năng tự làm sạch môi trường đó, cùng với những yếu tố lý học, hoá học và sinh học khác Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc làm nên khả năng chịu tải của môi trường, đó chính là khả năng tự làm sạch môi trường, giữ cho môi trường tự nhiên không bị ô nhiễm

Tuy nhiên, bên cạnh những nhóm vi sinh vật có khả năng làm sạch môi trường, lại có những nhóm gây ô nhiễm môi trường Đó chính là nhóm các vi sinh vật gây các bệnh vô cùng nguy hiểm cho người, động vật và thực vật

2.4 Nấm Trichoderma sp

2.4.1 Đặc điểm hình thái (Gary J Samuels, 2004)

Khuẩn ty của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trường PGA hóa vàng

Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định Cuống bào tử là

một nhóm sợi nấm bện vào nhau Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những

cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc

(T.koningii), có kích thước từ 1-7µm, có hình đệm rất chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng

hoạt động như chồi mầm

Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống

sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy Đặc điểm nổi bật của nấm

Trichoderma là bào t ử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (như T.virens),

vàng hay xanh xám Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài: rộng từ 1-1.1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài: rộng hơn là 1,4µm), đa số các bào tử trơn láng Kích thước không quá 5µm

Hình 2.4.1 Khuẩn ty Trichoderma sp (vùng màu trắng) phát triển trên môi trường

agar sau 2-3 ngày nuôi cấy (A) và trong tự nhiên (B) ( vùng màu xanh)

(http://en.wikipedia.org/wiki/Trichoderma reesei

http://www.isth.info/img/T koningii GJS.jpg)

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà

T.harzianum có thể tồn tại 110 - 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của

Trichoderma trong môi trường không cung cấp chất dinh dưỡng nên chlamydospores

có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học

Hình 2.4.2 Hình dạng sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma sp

(http://en.wikipedia.org/wiki/Trichoderma reesei

http://www.isth.info/img/T koningii GJS.jpg)

2.4 2 Đặc điểm sinh lý, sinh học, sinh hóa

Môi trường sống: Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp,

đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất sa mạc Hầu hết chúng là những vi sinh vật hoại sinh,

nhưng chúng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác Trichoderma rất ít tìm

thấy trên thực vật sống, chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực

Bắc đến những vùng núi cao cũng như miền nhiệt đới Tuy nhiên có một sự tương quan giữa sự phân bố các loại nấm và điều kiện môi trường Loài Trichoderma

harizianum có ở các vùng khí hậu nóng Điều này tương quan với nhu cầu nhiệt độ tối

đa cho từng loài

Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid, theo Gochenaur (1970) cho rằng có thể có tương quan giữa sự hiện diện cuả T.viride với đất acid trong vùng khí

hậu rất lạnh ở Peru Trichoderma phát triển tốt nhất ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và

chúng cũng có thể phát triển tốt trên đất kiềm nếu như ở đó có một lượng CO2 và

bicarbonat Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbohydrate, amino acid ammonia

Trichoderma vì ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt,

những khu rừng khác nhau Trichoderma hamatum và Trichoderma pseudokoninggii

có thể chịu điều kiện độ ẩm cao hơn các loài khác Tuy nhiên, Trichoderma sp thường

không chịu được độ ẩm thấp và điều này là một trong những yếu tố làm cho số lượng

Trichoderma giảm rõ rệt trong những nơi có độ ẩm thấp, song các loài khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau

Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển trong đất có pH từ 2,5 – 9,5 Phát

triển tốt ở pH 4,5 – 6,5 Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 250

C

-300C Một vài dòng phát triển tốt ở 350C Một số ít phát triển được ở 400

C (Gary J Samuels, 2004) Theo Prasun K M và Kanthadai R (1997) hình thái khuẩn lạc và bào

tử của Trichoderma khác nhau khi ở nhiệt độ khác nhau Ở 350

C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ ở mép bất thường, ở 370

C không

tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

2.4.3 Cấu tạo tế bào Trichoderma

Nấm sợi nói chung thành tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, chitosan và các thành

phần khác gồm β-glucan,α-glucan, mannoprotein (Siu-Wai Chiu và David Moore, 2001), chất màu, lipid (8-33%) (Lâm Thanh Hiền, 1999) Màng tế bào dầy khoảng 7µm thành phần chủ yếu là lipid (40%) và protein (38%) Nhân phân hóa, thường hình tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 - 3µm Ty thể hình elip, luôn di động để tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào (Lâm Thanh Hiền, 1999)

2.5 Nấm Aspergillus niger

Khuẩn ty phát triển, phân nhánh và có vách ngăn ngang hoàn chỉnh, đặc biệt ở vách ngăn ngang có một lỗ nhỏ để cho tế bào chất thông thương qua lại giữa hai tế bào Khuẩn ty đứt thành khúc và mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra khuẩn ty

mới Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng Bào tử bụi có màu đen

Mỗi tế bào chứa chitin trong các vi sợi, ngoài ra còn có manose, glucose, amino, đường và protein cùng với một hệ enzyme trong thành phần vỏ tế bào

Mỗi bào tử có đường kính khoảng 5µm, vỏ bào tử có một đai mỏng bên ngoài

và mỗi bào tử nang nảy mầm cho một khuẩn ty mới

Nấm xuất hiện ở hầu hết các vùng có khí hậu khác nhau và phát triển phổ biến trong đất, trong vùng nước mặn hay nước ngọt, hoại sinh trên xác bã động thực vật và

chitin syntaze Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội mạc (endoplasmic reticulum), không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực

vật Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribô thể (ribosomes) và những thể khác chưa rõ chức năng

2.7 Penicillum sp

Penicillium đặc trưng cho giống mốc xanh, chúng thường ở trên vỏ cây có múi, phô mai và nhiều loại trái cây khác, da và nhiều loại thức ăn khác Penicillium

notatum là loài t ổng hợp penicillin giúp ích cho con nguời, Penicillium griseofulvum

tổng hợp griseofulvin là một loại thuốc trị nấm; nhiều loại phô-mai lên men từ

Penicillium camenberi và Penicillium requeforti nhưng cũng có những loài làm hư

hỏng trái cây như Penicillium digitatum, P italicum và P expansum Trái cây có múi

và phô-mai là 2 sản phẩm rất thu hút bào tử Penicillium trong không khí

Đa số hình sợi, hiếu khí bắt buộc Sợi có vách ngăn, sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài Đường kính sợi nấm thường từ 3 – 5 µm, có khi đến 10 µm Chiều dài của sợi nấm có khi tới vài chục cm Vách tế bào

nấm được cấu tạo bởi vi sợi chitin

Tế bào chất chứa nội mạc endoplasmic reticulum, không bào (vacuoles) ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào thực

vật Ngoài ra tế bào nấm còn có ribosomes và những thể khác chưa rõ chức năng

Không có diệp lục tố nên chúng được cung cấp chất dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng)

Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân Nhân tế bào có hình cầu hay hình bầu dục với lớp màng kép bên trong màng nhân chứa ARN, phospholipid và protein

Là bào tử nấm hở, giá bào tử trần nhẫn, phát triển hệ sợi từ nền, phần lớn từ 3 – 3,5 µm x 150 – 350 µm mang 1 – 2 nhánh, nhánh cùng với các vòng cuốn thể bình tạo thành chuỗi 3 vòng , nhánh nhẵn từ 3 – 3,5 x 15 – 15 µm, cuống bình từ 2 – 5 cái Thể

bình xếp vòng từ 4 – 6 cái Bào tử trần hình trứng, elip có đường kính trục lớn từ 3 – 3.2 µm tạo thành chuỗi song song hay chồng chéo nhau

2.8 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin-chitosan trong thực tế trên

th ế giới và Việt Nam

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và các ứng dụng chitin – chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX

Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu quá ít không đủ để đáp ứng nhu cầu về sản xuất trong thời kỳ bấy giờ Đồng thời trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm và cua Trong một thời gian dài, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải trực tiếp ra môi trường dẫn đến việc ô nhiễm môi trường quanh khu vực đó nghiêm trọng Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp

Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp

Hiện nay, đi đầu trong lĩnh vực này là Nhật và Mỹ đã sản xuất theo thứ tự là

600 tấn/năm và 400 tấn/năm, chitosan với giá từ 200 – 300 USD/kg Ngoài ra còn có các nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp cũng sản xuất sản phẩm này nhưng với số lượng thấp (khoảng 2 tấn/năm)

Năm 1999, Viện AIT nghiên cứu “công nghệ phân lập bền vững chitin – chitosan, bằng phương pháp lên men bằng cách dùng các loại khuẩn lactobacillus

Việc nghiên cứu chitin và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta Vào những năm 1978 đến

1980, Trường đại học Thủy Sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin – chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị trường

của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn

thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp

Thực tế ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, trung tâm nghiên cứu polymer – Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Hóa thuộc phân Viện Khoa Học Việt Nam tại Thành Phố Hồ Chí Minh, Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản – Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2

Ở miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp thủy sản Hà

Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình

và đã đạt được một số kết quả đáng khích lệ

Ở miền Nam, Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản phối hợp với một số

cơ quan khác: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh, phân Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Khoa Học nông nghiệp miền Nam,… đang nghiên cứu sản xuất và ứng

dụng chitin – chitosan trong lĩnh vực nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm

Hiện nay các nhà nghiên cứu đã ứng dụng việc sản xuất chitin có kết hợp cả biện pháp sinh học nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi và thu thêm một vài chất từ nguyên liệu ban đầu so với trước đây

Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt

Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hóa của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ, đồng thời hàm lượng các enzyme như amylaza, catalaza hay peroxidaza cũng tăng lên

Hiện nay chitin - chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng

Những ứng dụng của chitin và các dẫn xuất của chúng ngày càng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau Một số đã đưa vào ứng dụng như: chỉ khâu tự hủy, da nhân

ạo, thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác còn đang nghiên cứu như: tác động

kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu, trị bỏng nhiệt,…

Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi Da nhân tạo bị phân hủy sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới Nó có tác dụng giảm đau, giúp các vết sẹo bỏng

phục hồi biểu bì nhanh chóng Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia cũng đã chế tạo thành công loại

da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng có hiệu quả

Chitin và các oligome của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào

giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh

Những nghiên cứu gần đây hướng vảo các oligome, N-acetyl-glucosamine và glucosamine, các chất này có một số tính chất của các polyme tương ứng nhưng lại có

ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ

Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang để cố định enzyme tế bào Enzyme cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích Enzyme cố định được sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác Nhất là trong công nghiệp làm sạch nước, làm trong nước hoa quả, sử dụng enzyme cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao Chitosan thỏa mãn yêu cầu đối với một chất mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tố hóa học

Do có cấu trúc tương tự như cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời

việc in trên giấy cũng tốt hơn Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu người ta cho thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in

Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợi bền,

mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được acid và kiềm nhẹ

Chitosan kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải

chống thấm, sản xuất vải,

Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của chitosan

là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH4+ Các nhóm này liên

kết với các tế bào sừng hóa của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử

dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lững giàu protien và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm

Chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước

Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau:

Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin-chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinh vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu2+ Như vậy vi sinh vật sẽ bị chết do mất sự cân bẳng liên quan đến các ion thiết yếu (Muzzarclli 1977)

Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào

Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào

Ngoài ra từ chitin làm ra vải chống nước, chống lửa và chịu nắng Vải dùng để

sản xuất vải bao dây điện và dụng cụ bảo hộ lao động

Chitin – 6 – sunfate và disulfate chitin tạo chất chống đông máu, chống acid và bảo vệ màng nhày dạ dày Chitin bị sunfate hóa hoàn toàn được dùng làm chất kết dính trong kem đánh răng, keo

2.9 Một số quy trình sản xuất chitin – chitosan thế giới và Việt Nam

2.9.1 Trên thế giới

a Phương pháp của Whistler và Miller

Vỏ tôm được cạo rửa sạch dưới vòi nước chảy Sấy khô ở 500C Ngâm 500g vỏ trong NaOH 10%, thời gian 3 ngày ở nhiệt độ phòng Dung dịch kiềm được thay hằng ngày Phần bã đem rửa với nước cho đến khi trung tính, sau đó nghiền với ethanol 95% rồi lọc sạch cho đến khi phần nước lọc không màu (thao tác này dùng khoảng 6 lít ethanol 95%)

Phần rắn đem nghiền với acetone (1:1), ethanol (2,5:1) và eter (0,5:1) Bã đem lọc cho đến khi dung dịch lọc không màu Sấy khô dưới áp suất thấp và ngâm với HCl 37% ở 200

C trong 4 giờ Những hạt bị trương phồng được ly tâm tách ra ở 00

C và rửa

với nước ở 00C cho đến khi hết acid Hiệu suất thu hồi là 20% (100g) Hàm lượng N ở sản phẩm là 7,1%

Ưu điểm: chitin trắng sạch mặc dù không qua công đoạn tẩy màu nhưng hiệu

suất thu hồi sản phẩm thấp, thời gian thực hiện các công đoạn kéo dài, tiêu tốn nhiều năng lượng, nồng độ hóa chất sử dụng cao

b Phương pháp của Roseman

Vỏ tôm được khử Ca theo phương pháp Hackman (vỏ tôm cạo rửa sạch và làm khô ở 1000C Ngâm 220g vỏ tôm trong HCl 2N (2:1) trong 5 giờ ở nhiệt độ phòng

Rửa sạch và làm khô Trọng lượng còn lại là 91.3g đem nghiền thành bột mịn, ly trích với 500ml HCl 2N, lắc nhẹ trong 48 giờ, rửa sạch bã với nhớt

Lấy 10g đã khử Ca đem khuấy trong 28 giờ ở nhiệt độ phòng với 100ml acid formic 90% Lọc lấy bã, rửa kỹ với nước và xử lý trong 2,5 giờ với 500ml dung dịch NaOH 10% Đem lọc, phần bã thu được màu trắng được rửa dưới với nước đến trung tính Rửa bã vài lần với ethanol và eter rồi sấy khô dưới áp suất thấp Hiệu suất thu hồi

sản phẩm khoảng 60 - 70% Hàm lượng N của sản phẩm là 6,85%

Phương pháp này đem lại hiệu suất thu hồi sản phẩm tương đối cao nhưng lại

có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, thời gian thực hiện công đoạn lại kéo

lại

c Quy trình thủy nhiệt Yamasaki và Nacamichi

Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N trong

thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được 100%)

Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô Tiếp theo là tiến hành kết hợp hai công đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt độ 1500

C trong 1 giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ deacetyl đạt trên 70% Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu được chitosan thành phẩm

Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao Tuy nhiên cũng có nhược điểm là sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt cao, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất

d Quy trình sản xuất chitin của Hackman

Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1000

C, tiếp theo được khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 1000C và đem xay nhỏ

Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v = 1/2,5 ở nhiệt độ phòng Sau

48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v = 1/2,5 ở nhiệt độ 1000C, sau 42 giờ đem ly tâm thu phần

bã Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem

ly tâm thu phần bã Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, ethanol và ete Sau đó làm khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem

Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng Khử protein song cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ ni và vỏ cua, thời gian thực hiện các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ mang tính chất nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình

chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin

e.Quy trình sản xuất chitosan của Pháp

Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay nhỏ

Khử protein bằng NaOH 3.5% với tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ 650

C, sau 2 giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng sau 2

giờ vớt ra tiến hành tẩy màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ w/v = 1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen (NaOCl + NaCl) 0.135%,

tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút vớt ra rửa trung tính, thu được chitin

sạch đẹp Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt

độ 850

C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính, thu được chitosan

Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch

do có hai bước khử sắc tố Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polymer, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác aceton có giá trị đắt

tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao Chưa kể các yếu tố an toàn trong sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện nay

f Phương pháp điều chế chitin của Capozza

Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy khuấy, thêm từ từ 825 ml acid HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 400C trong thời gian 48

giờ Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH = 7 Xác định hàm lượng tro 0,4 – 0,5% Sau đó sản phẩm được khuấy ở nhiệt độ phòng với

1500 ml acid formic HCOOH 90% để qua đêm Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã

và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7, sau đó sản phẩm được tráng rửa lại trong ethanol 960 và eter Sấy khô ở 400C dưới áp suất giảm Khối lượng chitin khô

sạch thu được là 66g Hiệu suất 44,3%

2.9.2 Ở Việt Nam

a Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng (1980)

Nguyên liệu là vỏ tôm được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/v = 1/2,5 ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong NaOH 8% với tỷ lệ w/v = 1/1,5 ở nhiệt độ 1000C, sau 2 giờ khử protein rồi đem rửa trung tính

Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10%, sau 1 giờ đem rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1,5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu chitin

Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v = 1/1 ở nhiệt độ 800

C sau 24 giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan

Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm

b Quy trình s ản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử Viện Khoa Học Việt Nam

Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng một lần bằng HCl 4%

ở nhiệt độ phòng sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để lảm giảm lượng NaOH tiêu hao ở công đoạn sau

Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 – 95o

C sau 3 giờ đem rửa trung tính, tiếp tục

khử khoáng bằng HCl ở nhiệt độ phòng, sau 24 giở đem rửa trung tính và đem nấu lần

2 trong NaOH ở nhiệt độ 90 – 95oC sau 3 giờ đem rửa trung tính Cuối cùng nấu trong NaOH 40% rửa trung tính và sấy khô thu được chitosan

Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công đoạn

c Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp thủy sản Hà Nội

Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1 trong HCl 4% tỷ lệ w/v = 1/2 ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ vớt ra rửa trung tính Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v = 1/2,8 ở nhiệt

độ phòng 90 – 95o

C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl 4%

tỷ lệ w/v = 1/2 ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ vớt ra rửa trung tính Để tách protein lần 2 cũng dùng NaOH 2% với tỷ lệ w/v = 1/2,8 ở nhiệt độ phòng 90 – 95oC, sau 3 giờ rửa

và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên Sản phẩm đem

làm khô thu được chitin

Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình dài, nồng độ hóa chất xử lý cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm

d Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học

Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũng thực

hiện theo các bước: khử khoáng, khử protein và deacetyl

Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng phương pháp hóa học

Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinh học,

đó là khử protein bằng enzyme proteaza và deacetyl bằng enzyme deacetylaza

Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v = 1/10 để ở nhiệt độ phòng trong

thời gian 5 giờ Rửa sạch đến pH = 7 Sau đó khử protein bằng papain 13% tỷ lệ w/v = 1/5, pH = 5 – 5,5 ở nhiệt độ 70 – 80o

C trong thời gian 4 giờ Rửa sạch, tẩy màu và sấy khô ở 600C thu được chitin khô, trắng Deacetyl chitin bằng NaOH 35% tỷ lệ w/v = 1/10 ở 90o

C trong thời gian 5,5 giở Rửa sạch và sấy khô thu được chitosan sạch

Chitosan thu được có màu trắng, đẹp, trong và mềm mại Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác Tuy nhiên điều kiện khó khăn do

việc tìm mua hoặc sản xuất enzyme deacetylaza nên công đoạn deacetyl được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc

Như chúng ta đã biết, nguyên liệu sản xuất cũng như những nghiên cứu về chitin từ xưa chủ yếu là vỏ tôm Riêng đối với việc thu nhận chitin từ sinh khối nấm sợi thì trên thế giới và trong nước cũng có một số nghiên cứu nhưng không đi sâu và cũng chưa được hoàn thiện như đối với vỏ tôm Dưới đây là một số nghiên cứu về việc thu nhận chitin từ sinh khối nấm sợi

• Th ế giới

Hiện nay trên thế giới cũng có những đề tài nghiên cứu về khả năng thu nhận chitin từ nấm sợi như:

Đề tài “Prodution and isolation of chitosan from Mucor rouxii” của Stephen

A.White (1979) , với nguyên liệu chính là nấm Mucor rouxii được nuôi cấy trong môi trường lỏng, sau đó đem đi lắc tăng sinh từ 40 – 80 giờ, thu sinh khối đem sấy khô và

xử lý sinh khối khô đó bằng dung dịch NaOH thu được lượng chitin Sau quá trình

thực hiện đã thu được 16 – 22% sinh khối khô và hàm lượng chitosan chiếm từ 4 – 8% sinh khối tế bào

• Trong nước

Hiện nay ở nước ta cũng đã có đề tài nghiên cứu về khả năng chiết tách chitin

từ nấm sợi của tiến sĩ Hoàng Đình Hòa (2007), với nguyên liệu chủ yếu là 4 chủng nấm: Aspergillus niger, Blakeslea trispora, Aspergillus oryzae và Rhizopus sp, sau quá trình thực hiện kết quả thu được như sau: sinh khối khô hệ sợi của các chủng nấm lần lượt là: 7,1 g/l, 5,7 g/l, 8,3 g/l và 4,5 g/l Các hợp chất chitin của bốn chủng nấm thu được sau khi xử lý kiềm đạt từ 14 – 26,3% so với sinh khối khô hệ sợi

C hương 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Th ời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Khóa luận này được thực hiện từ 3/2011 đến 6/2011 tại viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.1.2 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

3.1.2.1 Ngu ồn nấm

Aspergillus niger được phân lập từ nước thải của nhà máy chế biến thủy sản

Mucor sp được phân lập từ tiêu

Trichoderma sp, Pennicillum sp từ Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3 2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp cấy chuyền các chủng nấm

Giống sau khi thu nhận từ phòng thí nghiệm được cấy chuyền qua môi trường PGA để giữ giống và sử dụng lâu dài Dùng que cấy lấy những bào tử từ ống lưu trữ, cấy chấm lên trên bề mặt thạch PGA, sau 2 - 3 ngày khuẩn ty sẽ mọc bên trên bề mặt

thạch

Giống sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ trong phòng thí nghiệm trong thời gian 7 ngày, sau đó bảo quản ở 40C Sau 2 tháng cấy chuyền giữ giống một lần để đảm bảo nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật

3.2.2 Phương pháp lắc lên men

Sau khi các chủng nấm được cấy từ 3 - 4 ngày ta tiến hành cho nước cất vô trùng vào đĩa thạch, sau đó tiến hành đánh tơi bào tử, dùng pipepman hút 1ml dịch bào

tử trên cho vào 100ml môi trường tăng sinh được chứa trong erlen, đem erlen trên để vào máy lắc tròn ở 280C, 200 vòng/phút trong 48 giờ

3.2.3 Phương pháp thu nhận sinh khối nấm sợi và tách chiết chitin

Sinh khối sợi nấm sau khi lên men được thu nhận bằng cách li tâm hoặc lọc, sau

đó được rửa, làm khô và giữ ở nhiệt độ 40C đến khi sử dụng Thành tế bào hệ sợi được phá vỡ bằng dung dịch NaOH 1N đun trong vòng 2 giờ để loại bỏ protein, lipid và các polysaccarite Sản phẩm sau khi đun được đem rửa, sau đó đem sấy khô ở 600

C