KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG Bacillus subtilis B20.1 LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC SẢN XUẤT PROBIOTIC PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

Hơn thế nữa, phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi probiotic được mong đợi và trở thành công cụ phòng ngừa , điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN NỮ TRANG THÙY Ngành : NUÔI TR ỒNG THỦY SẢN

Niên khóa : 2007-2011

Tháng 8 năm 2011

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG Bacillus subtilis B20.1

LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC SẢN XUẤT PROBIOTIC PHÒNG BỆNH GAN

TH ẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

Tác giả

NGUYỄN NỮ TRANG THÙY

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Nuôi trồng thủy sản

( chuyên ngành ngư y)

Giáo viên hướng dẫn Ths HỒ THỊ TRƯỜNG THY Ths VÕ MINH SƠN

Tháng 8-2011

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành tốt khóa luận , tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, Ban chù nhiệm khoa Thủy

sản, cùng tất cả các quý thầy cô giáo đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khoảng thời gian học tại trường

Viện Nuôi Trồng Thủy Sản II đã tạo mọi điều kiện cho tôi và tất cả các bạn sinh viên có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận của mình

Đặc biệt, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Võ Minh Sơn, cùng cô Hồ Thị Trường Thy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực

hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn chị Thúy, và các bạn học ngành công nghệ sinh học ở các trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, Đại Học Công Nghệ TPHCM, Đại Học Mở TPHCM đã đồng hành cùng tôi và giúp đỡ tôi trong khoảng thời gian qua

Và xin gởi lời tri ân chân thành đến ba mẹ , người đã nuôi nấng dạy dỗ tôi, tạo cho tôi sức mạnh để có thể phấn đấu trên con đường học tập, cảm ơn anh chị em cùng

tất cả những bạn bè quanh tôi, cùng các bạn lớp DH07NY đã cổ vũ, động viên những lúc tôi phải gặp khó khăn

Sinh viên th ực hiện

NGUYỄN NỮ TRANG THÙY

TÓM T ẮT

NGUYỄN NỮ TRANG THÙY, Đại Học Nông Lâm TPHCM, tháng 8-2011.”

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG Bacillus subtilis B20.1 LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC SẢN XUẤT PROBIOTIC PHÒNG BỆNH GAN

TH ẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

Giáo viên hướng dẫn : Th.s Hồ Thị Trường Thy và Ths Võ Minh Sơn

Nhằm tạo ra sản phẩm probiotic tốt nhất có thể ứng dụng rộng rãi trên thị trường,

và khắc phục được hậu quả của bệnh gan thận mủ trên cá Tra,chúng tôi đã tiến hành chọn vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 để tiến hành các thí nghiệm: khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, lipase, protease, cellulase), khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp pH trên các nồng độ pH (4,5,6,7,8,9,10), nhiệt độ (25o

C, 30oC, 35oC,

40oC ), muối(0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% , 6%), khảo sát khả năng chịu đựng pH thấp (pH=2,3), muối mật (0.5%, 1%, 2%), khảo sát khả năng phân hủy phân tử tín hiệu HHL, và khả năng ức chế E.ictaluri của Bacillus subtilis B20.1 trong điều kiện nuôi chung Kết quả chúng tôi đạt được:

Xác định được vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 có khả năng sinh ra các loại

enzyme như cellulase, amylase và caseinlase

Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp, vi khuẩn có thể phát triển tốt nhất và đối kháng mạnh nhất trong khoảng pH=6, nồng độ muối 3% và nhiệt độ 35o

C

Vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 có thể chịu đựng tốt với pH thấp 2-3 ở dạ dày và

chịu được muối mật ở nồng độ cao 2%

Có khả năng phân hủy HHL, bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Xác

định được bản chất đối kháng của Bacillus subtilis B20.1 đối với E.ictaluri chỉ là cạnh tranh sinh dưỡng, mà không tiết chất đối kháng Bacillus subtilis B20.1 có khả năng ức

chế mạnh mẽ sự phát triển của E ictaluri

M ỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Hiện trạng nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long 3

2.2.Bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi 4

2.2.1 Tác nhân gây bệnh 4

2.2.2 Lịch sử bệnh 5

2.2.3 Triệu chứng 6

2.2.4 Phòng trị 7

2.3 Tổng quan về probiotic 8

2.3.1 Định nghĩa probiotic 8

2.3.2 Đặc điểm probiotic 10

2.3.3 Cơ chế tác động của probiotic 10

2.3.3.1 Sản sinh ra các hợp chất ức chế 10

2.3.3.2 Cạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng sẵn có 11

2.3.3.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại 12

2.3.3.4 Đóng góp về mặt dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa 13

2.3.3.5 Cải thiện chất lượng nước 13

2.3.3.6 Tăng cường đáp ứng miễn dịch 14

2.3.4 Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản 15

2.3.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic ở Việt Nam và trên thế giới 16

2.4 Quá trình quorum sensing – cách tiếp cận mới trong việc kiểm sóat hệ vi sinh trong nuôi trồng thủy sản 18

2.4.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing 18

2.4.2 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh 19

2.4.3 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp mới trong việc kiểm soát bệnh 20

2.4.4 Những triển vọng của việc bẻ gãy quá trình quorum sensing 20

2.4.5 Hệ thống quorumsensing của vi khuẩn Edwardsiella spp 21

2.5 Tổng quan về Bacilus subtilis 21

2.5.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus subtilis 21

2.5.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis 24 2.6 Tổng quan về enzyme ngoại bào của Bacillus 25

2.6.1 Các enzyme thường gặp ở Bacillus 25

2.6.2 Ứng dụng của các enzyme amylase và protease ngoại bào 25

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

3.2 Vật liệu nghiên cứu 28

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

3.2.2 Môi trường và hóa chất 28

3.2.3 Thiết bị, dụng cụ 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 29

3.3.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 29

3.3.2 Khảo sát các điều kiện nuôi thích hợp pH, nhiệt độ, NaCl lên khả năng đối kháng với E ictaluri 32

3.3.3 Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật 33

3.3.4 Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone 35

3.3.5 Kh ảo sát khả năng ức chế của Bacillus B20.1 lên sự phát triển của E ictaluri bằng phương pháp nuôi chung (co-culture) và xác định bản chất đối kháng giữa chúng 38

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Kết quả khảo sát enzyme ngoại bào 39

4.2 Kết quả khảo sát các điều kiện nuôi thích hợp pH, nhiệt độ, NaCl lên khả năng đối kháng với E ictaluri 43

4.2.1 Phương trình đường chuẩn của Bacillus subtilis B20.1 43

4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn lên tăng trưởng và khả năng đối kháng của Bacillus subtilis B20.1 v ới E ictaluri 43

4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng và khả năng đối kháng của Bacillus B20.1 với E Ictaluri 46

4.2.4 Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng và khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 v ới E ictaluri 48

4.3 Kết quả khảo sát khả năng chịu đựng pH thấp 50

4.4 Kết quả khảo sát khả năng chịu đựng muối mật 52

4 5.Kết quả khảo sát khả năng phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing 54

4.5.1 Xây dựng đường chuẩn mối tương quan giữa nồng độ C6-HHL và đường kính vòng sắc tố violacein 54

4.5.2 Kết quả quá trình phân hủy HHL 54

4.7 Kết quả khảo sát khả năng ức chế của Bacillus subtilis B20.1 lên sự phát triển của E ictaluri bằng phương pháp nuôi chung (co-culture) và xác định bản chất đối kháng giữa chúng 56

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 60

DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT

AHL N-acyl homoserine lactone

C6-HHL N-Hexanoyl homoserine lactone

CMC Carbonyl methyl cellulose

CV026 Chromobacterium violaceum

TCA Tricloric acetic acid

DSM Difco Sporulation Medium

BHIA Brain Heart Infusion Agar

BHIB Brain Heart Infusion Broth ,

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Bảng 4.1 : Kết quả khảo sát enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis B20.1 41

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của độ mặn lên tăng trưởng và khả năng đối kháng của 44 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với E

ictaluri c ủa vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 46

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với E ictaluri

của Bacillus subtilis B20.1 49

Bảng 4.5 Tỉ lệ sống của Bacillus B20.1 khi nuôi trong môi trường có pH thấp- số liệu

biểu thị giá trị trung bình của 3 lần lập lại với sai số chuẩn (SE) 51

Bảng 4.6 Tỉ lệ sống của Bacillus subtilis B20.1 khi nuôi trong môi trường muối

mật-Số liệu biểu thị giá trị trung bình của 3 lần lập lại với sai số chuẩn (SE) 52 Bảng 4.7 Khảo sát khả năng ức chế của Bacillus subtilis B20.1 đối với sự phát triển

của E.ictaluri bằng phương pháp nuôi chung 56

Bảng 4.8 Khảo sát tính chất đối kháng của Bacillus subtilis B20.1 đối với E ictaluri

57

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Biểu đồ 3.1 : Sơ đồ tiến hành phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method)

(Chythanya et al., 2002; Hai et al., 2007) 33

Biểu đồ 3 2 Thử khả năng chịu đựng acid dạ dày 34

Biểu đồ 3 3: Thử khả năng chịu đựng muối mật 35

Biểu đồ 3.4: Sơ đồ khảo sát khả năng phân hủy phân tử tín hiệu HHL 37

Biểu đồ 4.1 : Phương trình đường chuẩn của Bacillus subtilis B20.1 43

Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của độ mặn lên tăng trưởng và khả năng đối kháng của Bacillus subtilis B20.1 với E ictaluri 44

Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với E ictaluri của vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 47

Biểu đồ 4 4: Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với 48

Biểu đồ 4.5: Khả năng chịu đựng pH thấp của vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 50

Biểu đồ 4 6: Khả năng chịu đựng muối mật 53

Biểu đồ 4.7 Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ phân tử HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein 54

Biểu đồ 4.8 : Khả năng phân hủy HHL của Bacillus subtilis B20.1 55

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Nhuộm Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5

Hình 2.2 Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A), bị bệnh mủ ở gan thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan ( B-mẫu thu từ ao cá bị bệnh), cá tra cảm nhiễm nhân tạo với vi khuẩn xuất hiện bệnh tích giống với cá bị cảm nhiễm tự nhiên 7

Hình 2.5 : Vi khuẩn Bacillus subtilis 22

Hình 3.1: Các vòng tròn sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện của phân tử AHL 36

Hình 4.1 : Hoạt tính enzyme amylase 39

Hình 4.2 Khả năng tiệt ra enzyme lipase (A), lipase dương tính (B) có kết quả Cacium xung quanh khuẩn lạc 40

Hình 4.3 : Hoạt tính enzyme gelatinase 40

Hình 4.4 : Hoạt tính enzyme caseinnase 41

Hình 4.5 : Hoạt tính enzyme cellulase 41

Hình 4.6 : Khảo sát khả năng đối kháng tạo vòng vô khuẩn của Bacillus subtilis B20.1 với E.ictaluri 46

Hình 4.6 : Sự phân hủy HHL khi nồng độ HHL cao và thấp 56

dẫn đến tình trạng môi trường ngày càng suy thoái do nguồn nước thải và bùn đáy ao gây ô nhiễm môi trường, kéo theo đó là tình hình dịch bệnh bùng phát một cách nhanh chóng, nhất là bệnh gan thận mủ đã gây thiệt hại rất lớn Các phương pháp trị liệu truyền thống đã sử dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn để điều trị, tuy cũng có kết quả đáng kể nhưng lại tạo ra những chủng vi khuẩn kháng thuốc và tăng độc lực, đồng

thời sự tồn tại dư lượng kháng sinh trong cơ thịt của cá đã làm giảm giá trị và gây hại cho con người Do đó ngày nay, các phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học đã được chú trọng hơn như vaccin, chất tăng cường hệ thống miễn dịch,

probiotic đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Vaccin là phương pháp hiệu quả nhất trong việc phòng ngừa và chữa trị một số bệnh do vi khuẩn và virut, tuy nhiên

việc sử dụng vaccin vẫn còn nhiều hạn chế, do giá thành vaccin quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc cho cá Hơn thế nữa, phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) được mong đợi và trở thành công cụ phòng ngừa , điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua k hả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh Đặc biệt là các vi sinh vật có lợi có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu (Quorum sensing) của các vi khuẩn gây bệnh nhằm làm giảm độc và đồng thời ức chế sự phát triển của chúng

Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số đặc tính loài

Baccillus subtilis B20.1 làm cơ sở cho việc sản xuất probiotic khả năng đối kháng với

Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

1.2 M ục tiêu đề tài

Khảo sát một số đặc tính của chủng Bacillus subtilis B20.1 có khả năng đối kháng với Edwardsiella ictaluri để có thể ứng dụng trong việc sản xuất probiotic

1.3 Nội dung đề tài

- Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

- Khảo sát các điều kiện nuôi thích hợp pH, nhiệt độ, NaCl lên khả năng đối kháng với E ictaluri

- Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật

- Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-hexanoyl homoserine lactone

- Khảo sát khả năng ức chế giữa Bacillus subtilis B20.1 với E.ictaluri bằng phương pháp nuôi chung và bản chất đối kháng giữa chúng

CHƯƠNG 2

2.1 Hi ện trạng nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long

Trên thực tế, trong những năm gần đây cá Tra đã trở thành một nghề nuôi truyền

thống của vùng đồng bằng sông Cửu Long với sản lượng ngày càng tăng, sản phẩm cá tra-ba sa xuất khẩu của Việt Nam đã được xuất sang nhiều quốc gia trên thế giới Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, gọi tắt là VASEP, đưa ra thống kê nói

sản phẩm cá tra xuất khẩu của Việt Nam đang chiếm lĩnh gần như toàn phần thị trường

thế giới Đến hết tháng 11/2010 tổng sản lượng sản xuất cá tra toàn vùng đạt gần 2,4 tỉ con cá giống, diện tích thả nuôi 5.420 ha, đạt 90,3% kế hoạch năm; nhờ nâng cao năng

suất (trung bình đạt 261,2 tấn/ha/vụ) nên sản lượng cá thu hoạch 1.141.000 tấn, đạt 95,1%/năm Sản lượng cá xuất khẩu đạt 600.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,3

tỉ USD, giảm 2,8% về lượng, 7,8% về kim ngạch xuất khẩu so cùng kỳ năm 2009.(

http://pangasius-vietnam.com)

So với hai năm trước 2008, 2009, năm qua không còn hiện tượng tồn đọng cá tra Tuy vậy, diễn biến không ổn định Vào những tháng đầu năm nguồn cung khá dồi dào nên dẫn tới giá cá nguyên liệu thấp 14.500-16.200 đ/kg Tình hình này khiến cho một

số hộ nuôi cá nhỏ lẻ không có lãi nên đã bỏ ao không nuôi tiếp hoặc nuôi cầm chừng

Do vậy cuối năm xảy ra tình trạng thiếu cá nguyên liệu Trong 6 tháng cuối năm sản lượng cá thu hoạch đạt 400.000 tấn, giá cá tăng lên 21.000- 23.500 đ/kg

Giá cá lên xuống không ổn định, người nuôi khó có lãi cao Bởi giá thành nuôi cá quí 1/2010 đã lên đến 14.000-16.000đ/kg, tính ra người nuôi lãi may mắn lãi 1.000-2.000đ/kg Sang quí 2, giá cá tra giảm 500-1.000 đ/kg cùng với giá thức ăn thủy sản tăng lên nên người nuôi lãi ít, thậm chí hòa vốn hoặc lỗ nên dẫn tới diện tích thả nuôi sụt giảm Tới quí 3, giá cá tra dao động tăng trở lại 16.000-16.500đ/kg, người nuôi lãi 1.000đ/kg và quí 4 giá cá nguyên liệu tăng lên 19.000đ/kg và trong 2 tháng 11 và

12/2010 tăng lên 23.000-23.500 đ/kg Thế nhưng tới lúc này người nuôi nhỏ lẻ đã

bỏ ao vãn nên thiếu nguyên liệu

Mặt khác trên thị trường xuất khẩu vẫn còn tồn tại một số vấn đề đáng lo Hầu hết các doanh nghiệp tự xây dựng cho mình một thị trường, thương hiệu riêng mà chưa quan tâm đến thương hiệu chung cá tra của Việt Nam Một số doanh nghiệp tranh giành thị trường bằng cách tự hạ giá sản phẩm Mặt khác, cá tra Việt Nam liên lục gặp phải nhiều rào cản từ các thị trường tiêu thụ như Hoa Kỳ, duy trì thuế chống phá giá; Ukraina cảnh báo sản phẩm; Braxin dự kiến thắt chặt kiểm soát và tăng thuế và WWF ( Word Wide Fund for Nature) đưa cá tra vào sách đỏ về khuyến nghị tiêu dùng tại 6 nước EU Hơn nữa, viễn cảnh cạnh tranh phía trước với một số nước lân cận như Thái Lan, Philippin, Malaixia, Inđônêxia cũng đang triển khai nuôi cá tra.( http://pangasius-vietnam.com)

Bên cạnh những khó khăn về thị trường và giá thành sản xuất cá thương phẩm không ổn định, tình hình dịch bệnh bùng phát ở cá tra nuôi thương phẩm và sản xuất giống đã và đang gây ra cho người nuôi nhiều tổn thất về kinh tế Trong đó bệnh gan thận mủ gây thiệt hại kinh tế nhiều nhất cho người nuôi (Loan và ctv., 2007)

2.2.Bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi

Hiện nay bệnh này gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra thâm canh ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Tỷ lệ cá chết khi bị nhiễm bệnh gan thận mủ có thể lên đến 90% Cá Tra thường bị nhiễm bệnh vào những tháng cuối năm khi nhiệt độ nước hạ

thấp( khoảng tháng 9 đến tháng 1 năm sau) Tuy nhiên ngày nay bệnh còn xuất hiện ở những thời điểm khác trong năm do việc tăng diện tich và tăng mức độ thâm canh, cũng như việc không sát trùng nguồn nước của những ao nuôi nhiễm bệnh trước khi

thải ra môi trường

2.2.1 Tác nhân gây bệnh

Bệnh gan thận mủ cá tra (còn gọi là bệnh mủ gan) là bệnh do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây ra

Đặc điểm sinh hóa: Edwardsiella ictaluri là loài thuộc Enterobacteriacea, gram

âm, hình que ngắn kích thước 0.75x1.5-2.5μm Di động yếu ở 25-300C , không di động khi nhiệt độ cao hơn, Catalase dương tính, cytochrome oxidase âm tính và lên men glucose (Shott, 1989) Không sinh ra H2S và Indole âm tính Vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI (36-48 giờ tại 28-300

C) (Bùi Quang Tề,2006)

Sau đó, nhiều báo cáo mô tả về bệnh xuất hiện ở Mississippi, Arkansas, Idaho,Colorado, Indiana, và Maryland Khi cá mắc bệnh, Tỉ lệ chết lên đến 50% Ngoài ra, Bệnh này còn gọi là bệnh “lỗ trong đầu” do sự hiện diện của 1 số tổn thương xuất hiện trong hộp sọ của 1 số cá bệnh kinh niên Tuy nhiên, tên gọi này không phổ

biến bởi vì một số tác nhân gây bệnh khác có thể gây ra tổn thương tương tự

Nguyên nhân quan trọng nhất gây ra bệnh nhiễm trùng huyết ở ruột do bởi

E.ictaluri ( Hawke, 1979) đã được xác định lần đầu tiên ở cá da trơn, và nó ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ thống nuôi cá da trơn công nghiệp , gây ra thiệt hại hàng triệu đô

mỗi năm tại Hoa Kỳ

Bệnh nhiễm trùng huyết đường ruột gọi tắt là BNP (Bacillary Necrosis of Pangasius) đã được báo cáo đầu tiên trong cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 Theo Dũng (2005), bệnh bắt đầu xảy ra và bùng phát nghiêm trọng

nhất trong tháng 7 và giảm thời gian khác Nam (2002) báo cáo rằng BNP xảy ra chủ

yếu trong mùa lũ hàng năm vì lượng phù sa trong nước, biến động tình trạng nước, và tốc độ dòng nước, gây ra căng thẳng cho cá, làm miễn dịch yếu dần dẫn đến cá dễ mắc

bệnh

Khi ESC được mô tả đầu tiên năm 1977, người ta nghĩ rằng E.ictaluri là một tác

nhân gây bệnh bắt buộc sẽ không thể tồn tại lâu bên ngoài vật chủ (Hawke, 1979) ESC được xem là một căn bệnh theo mùa, xảy ra chủ yếu vào cuối mùa xuân đến đầu màu hè và một lần nữa vào mùa thu Bệnh thích hợp với nhiệt độ không khí 20-27o

C Tuy nhiên, bệnh đã được phát hiện ở hầu hết các tháng trong năm Francis-Floyd et al (1987) chứng minh rằng tỉ lệ chết trong giống cá Tra bằng thực nghiệm bị nhiễm bệnh cao nhất 25o

chết thì thấy túi mật bị vỡ , dịch mật lan tràn khắp nội tạng do ống dẫn mật và túi mật

bị hoại tử Một số cá có biểu hiện màu sắc nhợt nhạt, có nhiều đốm lớn nhỏ trên da Số lượng cá chết hằng ngày tăng cao và tỷ lệ tăng dần Tốc độ lây lan bệnh rất nhanh, trong điều kiện thí nghiệm, trong khoảng trong vòng từ 3-4 ngày thì toàn bộ cá trong

bể đều bị nhiễm bệnh, vì vậy việc điều trị phải triệt để và đồng bộ

Hình 2.2 Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A), bị bệnh mủ ở gan thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan ( B-mẫu thu từ ao cá

bị bệnh), cá tra cảm nhiễm nhân tạo với vi khuẩn xuất hiện bệnh tích giống với cá bị

cảm nhiễm tự nhiên

2.2.4 Phòng trị

Phương pháp cũ:

Đầu năm 2006, Khoa Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ đã nghiên cứu và công

bố chất kháng sinh Florfenicol là kháng sinh đặc trị bệnh này ( thay thế cho các loại kháng sinh khác bị cấm), khi sử dụng thuốc từ 7-10 ngày cho hiêu quả tốt, cá phục hồi nhanh khi kết hợp vệ sinh diệt mầm bệnh trại nuôi và trong môi trường nước nuôi Chú ý: Thuốc phải trộn với thức ăn, áo bên ngoài bằng Lecithin, sau đó phơi khô ráo nhằm tăng khả năng dung nạp thuốc Phải sử dụng liên tục từ 7-10 ngày và kết hợp

vệ sinh môi trường để tránh tái nhiễm Tuy nhiên, hiện nay các loại kháng sinh đang

sử dụng để điều trị bệnh gan thận mủ trên cá Tra và cá Basa đều đã bị vi khuẩn đề kháng nên hiệu quả không cao

Phương pháp mới nghiên cứu:

Giữa năm 2009, tiến sĩ Nguyễn Hữu Thịnh (Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM) cùng các đồng sự của trường Đại Học Đài Loan và Nauy đã tổ chức nghiên

cứu và thực nghiệm một phương pháp mới “ kết hợp phương pháp chủng ngừa vaccine

bằng cách ngâm và cấp qua đường tiêu hóa để hạn chế tỷ lệ chết do vi khuẩn trên cá Tra” Trước đây, việc sử dụng vaccine bất hoạt để phòng ngừa bênh nhiễm khuẩn do

Edwardsiella ictaluri đã được thử nghiệm trên nhiều loài cá da trơn khác nhau, đặc

biệt là ở Mỹ Các loại vaccine bất hoạt có thời gian miễn dịch không dài và loại vaccine sống sử dụng E ictaluri chủng RE-33 được làm giảm độc lực cũng chỉ có tác

dụng bảo vệ trong khoảng một thời gian ngắn sau khi tiêm vaccine Ngoài ra, những phương pháp khác sử dụng các loại vaccine bất hoạt để phòng ngừa bệnh nhiễm khuẩn

E.italuri trên cá Tra ở Việt Nam cũng đã được thử nghiệm nhiều nhưng không có kết

quả lâu dài Phương pháp này sử dụng vaccine được lấy từ vi khuẩn E.ictaluri được

bất hoạt bằng Formalin với nồng độ 0.5% ủ trong thời gian tối thiểu là 24 giờ ở nhiệt

độ mát Đồng thời dịch huyền phù vi khuẩn cũng được bảo quản ở nhiệt độ 4oC Sau

đó phải được kiểm tra kĩ lưỡng Chủng ngừa bằng phương pháp ngâm được thực hiện bằng cách ngâm 1200 cá trong dung dịch pha loãng 2 lít vaccine ( gồm nước cất và vi khuẩn bất hoạt ở nồng độ 5x109

cfu/ml) trong 18 lít nước sạch có nồng độ vi khuẩn

cuối cùng 5.56 x 108

cfu/ml trong thời gian 1 phút , sục khí mạnh Vaccine cấp qua đường tiêu hóa được chuẩn bị bằng cách phun kháng nguyên dạng nhũ tương bên ngoài viên thức ăn với tỷ lệ 2% Viên thức ăn sau đó được phun áo bên ngoài bằng dầu gan mực với tỷ lệ 0.1% (v/w) Thức ăn này được chuẩn bị hằng ngày và được sử dụng

từ 1-2 ngày sau khi chuẩn bị Cho cá ăn đến no và kéo dài đến 2 tuần Sau khi cá nuôi được 101-107 ngày thì cho ăn tăng cường thức ăn trộn vaccine liên tục 1 tuần rồi ngưng Kết quả cho thấy khi ao cá được cho lây nhiễm bệnh mạnh thì tỷ lệ cá chết rất

ít so với các ao không được ngâm và cho ăn bằng vaccine Tóm lại, chủng ngứa bằng cách kết hợp phương pháp ngâm /cho ăn để gây miễn dịch ban đầu và cho ăn tăng

cường cho kết quả bảo hộ tương đối tốt khi cá bị nhiễm vi khuẩn E.ictaluri Lặp lại

việc cho ăn tăng cường có thể sẽ là một phương pháp thay thế để duy trì hiệu quả miễn

dịch cho cá Tra đối với việc phoi nhiễm các tác nhân gây bệnh có độc lực cao

2.3 Tổng quan về probiotic

2.3.1 Định nghĩa probiotic

Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy lạp “probios” có nghĩa là “cho sự

sống” Thông qua thời gian cùng với sự phát triển của khoa học và sự hiểu biết của nhân loại thuật ngữ này được định nghĩa nhiều lần

Vào năm 1965, Lilly và Still đã định nghĩa probiotic là những nhân tố thúc đẩy phát triển được sản xuất bởi vi sinh vật Vào năm 1974 Parker đã định nghĩa probiotic

dựa trên mối quan hệ giữa vi sinh với vật chủ “probiotic là những sinh vật và những cơ chất có lợi cho động vật có khả năng cải thiện hệ vi sinh đường ruột” Đến năm 1989, Fuller mở rộng định nghĩa “probiotic là sinh vật sống được cung cấp dưới dạng thức

ăn cho động vật nhằm cải thiện cân bằng hệ sinh vật đường ruột” Havenaar và Huis Int Veld (1992) định nghĩa “probiotic là một chủng hay một hỗn hợp vi sinh vật sống, cung cấp cho người hoặc động vật, có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện đặc tính hệ

vi sinh bản địa” Gatesoup (1999) định nghĩa “probiotic là những sinh vật sống cung cấp dưới dạng thức ăn nhằm cải thiện sức khỏe cho vật chủ”

FAO/WHO (2002), Reid và cộng sự (2003) định nghĩa “probiotic là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ”

Vào năm 2003, Jean Fioramonti và cs đã định nghĩa probiotic một cách ngắn gọn nhưng đầy xúc tích: “probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật ảnh hưởng có lợi lên sức khỏe và tốt cho vật chủ”

Trước đây, probiotic thường được ứng dụng cho con người và động vật trên cạn,vì vậy thuật ngữ probiotic thường được ngụ ý là những vi khuẩn gram dương chủ

yếu là Lactobacillus và dần dần các sinh vật được áp dụng làm probiotic ngày càng

nhiều gồm cả vi khuẩn gram âm, gram dương, bacteriophage, nấm men và tảo đơn bào, phạm vi sử dụng rộng hơn, ngoài con người và động vật trên cạn, probiotic ngày nay được ứng dụng trên cả đối tượng động vật thủy sản

Khác với người và động vật trên cạn, động vật thủy sản được bao bọc bởi môi trường nước và ở đó các tác nhân gây bệnh tồn tại một cách độc lập với vật chủ

Những vi sinh vật gây bệnh được hấp thụ liên tục bởi vật chủ thông qua quá trình tiêu

thụ thức ăn, động vật thủy sản tiêu hóa một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường nước, kết quả của mối tương tác tự nhiên giữa khu hệ vi sinh trong môi trường và đối tượng

thủy sản Trong nuôi trồng thủy sản mối tương tác giữa probiotic và vật chủ không chỉ giới hạn trong đường ruột của vật chủ, probiotic còn có thể hoạt động trên mang, da và

cả môi trường nước xung quanh vật chủ Do vậy, Verschuere và cs (2000) đã đề xuất

một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ probiotic trong nuôi trồng thủy sản “probiotic là hỗn hợp vi sinh vật sống được thêm vào có lợi cho vật chủ

bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hoặc quần xã vi sinh vật xung quanh, cải thiện khả năng sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường chống chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống của vật chủ”

Probiotic sử dụng không gây hại cho vật chủ

Probiotic phải tới đúng vị trí cần tác động trong cơ thể vật chủ

Sử dụng probiotic phải có biểu hiện có lợi đối với vật chủ (cạnh tranh đối kháng

với các sinh vật gây bệnh, sinh các enzyme hoặc các chế phẩm cuối cùng mà vật chủ

có thể sử dụng được)

Bản thân probiotic không chứa gen gây độc hoặc gen kháng kháng sinh làm gây

hại cho vật chủ và làm giảm tác dụng của các kháng sinh sử dụng

2.3.3 Cơ chế tác động của probiotic

Gia tăng khả năng bám hoặc đối kháng trực tiếp những ảnh hưởng có hại của tác nhân gây bệnh là những yếu tố quan trọng của probiotic để làm giảm tính gây độc trong suốt quá trình nhiễm bệnh Các chủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi khuẩn gây bệnh ở điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau Đa

số các nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong thập niên qua, trong đó có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic Nhìn chung, probiotic có các cơ

chế tác động sau:

2.3.3.1 Sản sinh ra các hợp chất ức chế

Kháng khuẩn là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên Vì vậy, sự tương tác

giữa các vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đảm bảo trạng thái cân bằng giữa vi sinh

vật hữu ích và những vi sinh vật gây bệnh

Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học có

khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy năng lượng hay các chất hóa học (Fredrickson và Stephanopoulos, 1981) Những hợp chất này bao

gồm: bacteriocin, siderphore, lysozyme, protease, hydrogen peroxide và các acid hữu

cơ Vi khuẩn sinh acid lactic tạo hợp chất bacteriocin giúp ức chế các vi khuẩn khác

Có rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh

của một số chủng vi khuẩn được chọn lựa bổ sung vào môi trường ương nuôi ấu trùng

Gaixa (1889) đã có báo cáo đầu tiên về sự tồn tại của vi khuẩn trong nước biển có khả năng ức chế Vibrio sp Sau đó, Rosenfeld và Zobell (1947) mô tả một nghiên cứu

việc sản sinh chất ức chế vi sinh vật biển và kể từ đó nhiều nghiên cứu tiếp theo, theo hướng sử dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát sinh học Nogami và Maeda (1992), Nogami và cs (1997) đã chứng minh vi khuẩn Thalasobacter utilis ức chế vi khuẩn Vibrio anguillarum, do đó làm gia tăng khả năng sống sót của ấu trùng cua xanh

Portunus trituberculatus , đồng thời cũng làm giảm số lượng Vibrio trong nước ương

ấu trùng Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng này ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn V angillarum trên cá bơn trưởng thành Scophthalmus maximus và Limanda

limanda S ử dụng V alginolyticus như một probiotic đã được đề cập để tăng cường

khả năng sống sót và phát triển của ấu trùng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei ở các trại nuôi ở Ecuador Gần đây một chủng vi khuẩn nước mặn, Pseudomonas I2 được phân lập từ cửa sông, có khả năng sinh hợp chất ức chế lại Vibrio gây bệnh trên

tôm Hợp chất kháng khuẩn này được chứng minh có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt, tan trong chloroform, và kháng được sự thủy giải của các ezyme (Chythanya và

cs, 2002)

2.3.3.2 C ạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng sẵn có

Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay trong môi trường nuôi thủy sản

siderophore Tất cả vi khuẩn đều cần sắt để tăng trưởng, siderophore là chất có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng gắn với ion sắt Siderophore có thể hòa tan sắt kết tủa thành dạng dễ sử dụng, do đó nó là một công cụ thu lượm sắt hiệu quả

probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính gây bệnh có liên quan đến việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy phân tử sắt trong môi trường thiếu sắt

năng đề kháng đối với vi khuẩn gây bệnh Vibrio P, Vibrio splendidus ở ấu trùng cá bơn Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng, Vibrio E có thể phát triển trong môi trường đã

bị tách hết sắt trong khi Vibrio P thì không Hơn nữa, cá bơn bột được cho ăn rotifer

được làm giàu chất siderophore deferoxamine của Vibrio E đã đạt được tỉ lệ sống cao hơn sau khi gây nhiễm với Vibrio P, so với lô đối chứng (Gatesoupe, 1997) Từ những

kết quả có liên quan trong các thí nghiệm in vitro và in vivo, các nhà khoa học đã kết

luận rằng hiệu quả probiotic của Vibrio E có thể một phần là do sự đấu tranh giành lấy

phân tử sắt với tác nhân gây bệnh

2.3.3.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại

Khả năng hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic trong biểu

mô ruột và trong lớp nhầy đường ruột vật chủ là cơ chế bảo vệ vật chủ chống lại tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh các thụ quan bám dính, dinh dưỡng và không gian, oxy và sự sản sinh các cơ chất kháng khuẩn Một số cơ chế liên quan đến sự bám dính của vi sinh vật lên tế bào biểu mô ruột bao gồm: Liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, vị trí gắn dựa trên các cấu trúc chuyên biệt Những đặc tính này là một thế mạnh cạnh tranh quan trọng giúp duy trì vi khuẩn trong đường ruột động vật

Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành khuẩn lạc của vi sinh vật có thể phụ thuộc vào:

Mối quan hệ với vật chủ như: nhiệt độ cơ thể, enzyme, đặc tính do kháng di truyền Ví dụ, vi khuẩn có thể theo nguồn nước và thực phẩm đến miệng và đóng góp vào quá trình dinh dưỡng, ở đó một số chủng được giữ lại trở thành quần cư của vi khuẩn đường ruột Những chủng còn lại bị tiêu diệt thông qua quá trình tiêu hoá và bị

loại thải thông qua quá trình bài tiết Ngoài ra, sự sinh trưởng của vi khuẩn trong đường ruột còn có thể bị ức chế do hợp chất kháng khuẩn tiết ra từ vật chủ

Các yếu tố có mối quan hệ với vi sinh vật như: ảnh hưởng của các hợp chất kháng khuẩn, protease, bacteriocin, hydrogen peroxide, sự hình thành NH3, diacetyl,

và sự biến đổi pH do sản sinh các acid hữu cơ

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chủng Lactobacillus plantarum có khả

năng bám dính và hình thành màng nhầy bên trong đường ruột, chủng này sử dụng vị trí gắn chuyên biệt là manose để cạnh tranh vị trí gắn với các chủng gram âm gây bệnh trên lớp nhầy đường ruột của cá

Ngoài ra, sự hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic đóng vai trò quan trọng trong điều hòa và kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào chủ

2.3 3.4 Đóng góp về mặt dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vi sinh vật ảnh hưởng có lợi cho quá trình tiêu hóa

của động vật thủy sản: khử độc các hợp chất độc hại trong thức ăn, phân hủy các hợp

chất khó tiêu như chitin, cellulose…trong thức ăn nhờ các enzyme thủy giải (cellulase, amylase…) Ngoài ra probiotic còn cung cấp vitamin (biotin và vitamin B12), carotenoid, protein, acid béo chuỗi ngắn và chuỗi acid béo không bão hòa (PUFAs - polyunsaturated fatty acids) như eicosapentaenoic acid (EPA) và docosahexaenoic acid (DHA) cần thiết cho sự sinh trưởng của cá

Ở mức độ in vivo, có nhiều báo cáo cho rằng khi cho cá ăn probiotic ở nồng độ từ

103-1012 cfu/g trong thời gian từ 30-90 ngày có thể gia tăng tỷ lệ sống sót, tăng trọng, giảm hệ số chuyển đổi thức ăn

Ở cá, có báo cáo cho rằng Bacteroides và Clostridium đã đóng góp về mặt dinh dưỡng cho vật chủ đặc biệt là cung cấp acid béo và vitamin Một số vi sinh vật như

Agrobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp., và Staphylococcus sp có thể đóng góp vào quá trình tiêu hóa ở cá hồi chấm hồng Bắc cực

(Salvelinus alpinus L.) Một số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B subtilis, B

polymixa, B laterosporus và B circulans) thúc đẩy tăng trưởng của ấu trùng cá tầm

Acipenser nudiventris: tăng chiều dài và khối lượng, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn, tăng hệ số tăng trưởng đặc hiệu (Specific Growth Rate) Ngoài ra một số vi khuẩn còn tham gia vào quá trình tiêu hóa của những loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng cách sản sinh các enzyme ngoại bào như protease, lipase, đồng thời cung cấp các nhân tố dinh dưỡng cần thiết Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú ở tôm

Penaeus chinensis bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa và các hợp chất đồng hóa tương tự như ở động vật

2.3.3.5 Cải thiện chất lượng nước

Chất lượng nước đã được cải thiện nhờ bổ sung các chủng probiotic đặc biệt là các chủng Bacillus spp Các chủng gram dương chuyển đổi các hợp chất hữu cơ thành

CO2 tốt hơn các chủng gram âm Có báo cáo cho rằng việc sử dụng các chủng Bacillus

sp cải thiện chất lượng nước, tăng khả năng sống và tăng tốc độ phát triển của

Penaeus monodon và làm gi ảm tác nhân gây bệnh Vibrio

Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được chất hữu cơ trong nước ao nuôi thủy sản, giảm hàm lượng BOD (nhu cầu oxy sinh

học) và giảm độc tố do amoni, nitrite và hydro sulfua, khống chế được vi khuẩn gây

bệnh, tăng năng suất tôm cá

2.3.3.6 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi probiotic, quá trình hình thành khuẩn lạc và sự bám dính của probiotic trong ruột cá là điều kiện cần thiết để tăng cường đáp ứng miễn dịch thông quan liên kết giữa các kiểu phân tử liên quan đến vi khuẩn- BAMPs (bacteria associated molecular patterns) có tính bảo tồn cao và các thụ thể chyên biệt trên bề mặt của tế bào biểu mô ruột

Một số nghiên cứu đã chứng minh Clostridium butyricum giúp gia tăng khả năng

kháng Vibrio của cá hồi và gia tăng hoạt tính thực bào của bạch cầu Rengpipat và cs (2000) cho rằng sử dụng Bacillus sp (chủng S11) đã bảo vệ tôm sú Penaeus monodon

khỏi tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ thống miễn dịch dịch thể ở tôm Balca´zar (2003) chứng minh sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp và Vibrio sp ảnh

hưởng tốt tới sự phát triển và khả năng sống sót của ấu trùng tôm thẻ chân trắng đồng

thời bảo vệ chống lại Vibrio harveyi và virus gây hội chứng đốm trắng Sự bảo vệ này

xuất phát từ sự kích thích hệ thống miễn dịch bằng việc gia tăng thực bào và hoạt động kháng khuẩn Ngoài ra, nhiều tác giả chứng minh sử dụng vi khuẩn lactic

Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) ở hàm lượng 105

cfu/g, Lactococcus

lactis, Leuconostoc mesenteroides, L sakei kích thích miễn dịch ở cá hồi

Oncorhynchus mykiss bằng cách thúc đẩy hoạt tính thực bào, sản sinh superoxide, lyzozyme, tăng cường hoạt tính bổ trợ (ACH50)

2.3.3.7 Tác động kháng virut

Một số vi khuẩn được sử dụng như probiotic có tác dụng kháng virut, mặc dù cơ

chế này vẫn chưa được hiểu chính xác Việc kiểm tra trong phòng thí nghiệm chỉ ra có

sự bất hoạt virut nhờ các hợp chất hóa học và hợp chất sinh học như là dịch chiết từ

tảo biển và dịch chiết ngoại bào từ vi khuẩn

Kamei và cs (1988) báo cáo cho rằng các chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp,

Aeromonas sp và nhóm Coryneform phân lập từ các trại ấp trứng cá hồi có hoạt tính kháng virus IHHNV (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)

Direkbusarakom và cs (1998) phân lập được hai chủng Vibrio spp NICA 1030 và

NICA 1031 có hoạt tính kháng IHHNV và Oncorhynchus masou virus (OMV) với tỷ

lệ giảm hai virus trên lần lượt từ 62% và 99% [12]

2.3.4 Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, các vi sinh vật sẽ sinh sôi và phát triển rất nhanh trong môi trường nước Sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi sẽ có các tác dụng sau đây trong các ao hồ nuôi thủy sản:

-Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy

-Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước

-Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí thay nước

-Nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (do kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu ở tôm, cá)

-Ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật

có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại) Trong môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được sự phát triển của mầm bệnh

Ngoài ra, một số probiotic còn được sử dụng bằng cách trộn vào thức ăn để nâng cao khả năng hấp thu tôm cá, làm giảm hệ số thức ăn và phòng chống các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cho tôm cá

Do đó, sử dụng probiotic sẽ có ý nghĩa nhiều mặt trong việc nâng cao hiệu quả kinh tế cho các mô hình nuôi thủy sản như:

Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn (giảm hệ số thức ăn)

Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi

Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt

Giảm chi phí thay nước

Giảm chi phí sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong việc điều trị bệnh

2.3.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic ở Việt Nam và trên thế giới 2.3.5.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trên thế giới

Có nhiều nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong nhiều thập niên qua

Khởi đầu các nghiên cứu đầu thập niên 80 tập trung vào các nghiên cứu sử dụng probiotic cho đối tượng con giống và cá thương phẩm trong khi các nghiên cứu ứng dụng cho đối tượng ấu trùng bắt đầu trễ hơn vào khoảng thập niên 90 Tuy nhiên đa số các nghiên cứu ở giai đoạn này tập trung vào ảnh hưởng về mặt dinh dưỡng của probiotic lên vật chủ như các nghiên cứu của Brown và cs (1996), Ringø và cs (1995), Sakata (1990)

Những năm gần đây các nhóm tác giả Gatesoupe (1994, 1997), Gildberg và cs (1997) đã chứng minh được ảnh hưởng của probiotic lên khả năng kháng bệnh của cá

bột và cá giống Austin (2006), Nikoskelainen và cs (2003), Sakai và cs (1995 chứng

minh kích thích miễn dịch của probiotic Các nghiên cứu của Gildberg và cs (1995); Kelly và cs (2007); Nikoskelainen (2006) đã chứng minh tăng cường khả năng bám dính và hình thành khuẩn lạc trong ruột

2.3.5.2 Tình hình nghiên c ứu và ứng dụng probiotic ở Việt Nam

Trong những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng bệnh

và cải thiện môi trường trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triển mạnh Theo Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng trên 200 thương hiệu chế phẩm sinh học và vitamin đang bán trên thị trường nước ta Đa số các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nhiều nước: Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc… được bán với giá cao Trong những năm gần đây, các nhà khoa học Việt Nam bắt đầu nghiên cứu “nội địa hóa” chế phẩm sinh học ứng dụng trong thủy sản nhằm hạ giá thành, giúp giảm chi phí sản xuất, nâng cao lợi nhuận cho người nông dân Có thể kể đến các nghiên cứu sau:

- Võ Thị Hạnh và cs thuộc Viện Sinh học nhiệt đới Tp HCM nghiên cứu và tạo

chế phẩm BIO II có tác dụng: phân hủy những thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao,

ổn định pH và màu nước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh cho

tôm, cá như các vi khuẩn Vibrio spp, tăng năng suất nuôi trồng

- Chế phẩm EM được giáo sư Teruo Higa-Nhật Bản phát minh năm 1980, được ứng dụng trong các lĩnh vực nông-ngư nghiệp trên thế giới Tuy nhiên, chế phẩm EM

ở dạng lỏng được nhân giống từ EM gốc của Nhật Bản với mật độ tế bào vi sinh vật có

lợi cho nuôi trồng thủy sản thấp (< 107

CFU/ml) nên hiệu qủa sử dụng không cao Để góp phần hoàn thiện và nâng cao hiệu quả chế phẩm EM, nhờ sự hỗ trợ kinh phí của

Sở Khoa học và Công nghệ Tp.HCM, phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm VEM sử dụng bổ sung với chế phẩm BioII Chế phẩm VEM (Vietnamese effective microorganisms) gồm tập hợp các vi sinh vật

hữu ích có trong chế phẩm EM Ngoài ra, còn có thêm một số loài vi khuẩn Bacillus

spp được chọn lọc và vi khuẩn quang dưỡng, không chỉ có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản mà còn cạnh tranh và đối kháng với các loài vi khuẩn gây bệnh tôm-cá Mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus spp và vi khuẩn quang dưỡng thêm

vào tương ứng là 1010

và 107 CFU/ml

- Các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện KH&CN

Việt Nam) đã nghiên cứu thành công quy trình sản xuất chế phẩm sinh học đa năng Hudavil - HUD 5 với thành phần Bacillus subtilis, Nitrosomonas sp, Nitrobacter sp,

Thiobacter thioparus với mật độ 108 cfu/ml để xử lý môi trường ở các hồ nuôi thủy

sản, đặc biệt là hồ nuôi tôm sú, cá tra

- Võ Thị Thứ và cs với chế phẩm sinh học Biochie bao gồm một số chủng thuộc

chi Bacillus (B.subtilis, B megaterium, B.licheniformis) và Lactobacillus (L

acidophilus) Chúng có chức năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và chất thải nhờ khả năng tổng hợp enzym phân hủy hữu cơ như protease, amylase Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas… do chất lượng nước nuôi bị giảm

Sử dụng chế phẩm sinh học Biochie để xử lý nước nuôi tôm cá có tác dụng làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay nước và cải thiện môi trường (tăng oxi hòa tan, giảm COD, BOD) Ngòai ra, còn có tác dụng giảm đáng kể tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng

- Ts Nguyễn Hữu Phúc, Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM đã nghiên cứu chế tạo thành công hai chế phẩm sinh học để nuôi tôm Hai chế phẩm này có tên là Probact dùng để trộn vào thức ăn của tôm, và Ecobact dùng để xử lý môi trường nước trong ao

nuôi tôm Hai chế phẩm sinh học này có tác dụng giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cải thiện chất lượng nước và bùn trong các ao nuôi tôm (góp phần tăng tính miễn

dịch cho tôm trong quá trình nuôi) Bước đầu hai chế phẩm này đã được sử dụng thử nghiệm tại một số hộ nông dân ở huyện Cần Giờ, Nhà Bè, các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, cho kết quả khá tốt Tôm ít bị bệnh, tăng trưởng tốt, năng suất thu hoạch tăng từ 30-45%

2.4 Quá trình quorum sensing – cách tiếp cận mới trong việc kiểm sóat hệ vi sinh trong nuôi trồng thủy sản

2.4 1 Định nghĩa quá trình quorum sensing

Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm sóat việc biểu thị gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào Quá trình này được gọi là quorum sensing Nhiều kiểu hình

ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học …

Trong thế giới vi sinh vật tồn tại cả hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn

ngữ phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài

và giữa các loài Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide có chiều dài 5 đến 17 amino acid

Quá trình giao tiếp thông qua hệ thống tín hiệu LuxI/LuxR được xem như là cơ chế chuẩn được các vi khuẩn Gram âm sử dụng để thông tin liên lạc với nhau Hệ

thống quorum sensing kiểu này được sử dụng để kiểm soát việc biểu hiện gen ở trên

25 loài vi khuẩn Gram âm Trong mọi trường hợp, AHL là một loại phân tử tín hiệu

mà việc tổng hợp phụ thuộc vào protein kiểu LuxI Một protein khác (protein kiểu LuxR) chịu trách nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL và sau đó là quá trình

hoạt hóa việc phiên mã của một số gen đích Phân tử tín hiệu AHL đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình quorum sensing ở nhiều tác nhân gây bệnh ở người

và thực vật, như Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh và cs, 2000), Erwinia

carotovora, Agrobacterium tumefaciens (Whitehead và cs, 2001), cũng như ở Vibrio

harveyi (Manefield và cs, 2000) và những loài vi khuẩn gây bệnh khác trong nuôi

trồng thủy sản (Bruhn và cs, 2005)

2.4 2 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh

Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong vi khuẩn Những enzyme có thể ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các lòai vi khuẩn thuộc nhóm ß-Proteobacteria (Zhang và cs, 2002), α-Proteobacteria và γ-Proteobacteria (Uroz và

cs, 2003) cũng như ở một số lòai thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (Dong và cs, 2002) Những lòai vi khuẩn này có thể khóa hệ thống quorum sensing của những lòai

vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc Quá trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL-acylase và AHL-lactonase

Enzyme AHL-acylase có khả năng bẻ gãy mạch cacbon của phân hủy AHL thành acid béo và homoserine lactone, tuy nhiên không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc của phân

tử AHL Trong khi đó enzyme AHL-lactonase, điều khiển bởi gen aiiA, có khả năng

phân hủy phân tử AHL bằng cách xúc tác phản ứng mở vòng lactone Điều này dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc hình thể tương đối của phân tử AHL, gây trở ngại cho việc

gắn kết của phân tử AHL với protein điều tiết việc phiên mã LuxR, vì vậy một số kiểu hình (trong đó có yếu tố độc lực ở vi khuẩn gây bệnh) không thể được biểu hiện Gen

aiiA đầu tiên được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus sp 240B1 Các

dạng tương đồng của gen aiiA sau đó được tìm thấy ở nhiều loài Bacillus khác, bao

gồm Bacillus thuringiensis, B cereus, B anthracis, B mycoides và B subtilis Các

gen này có độ tương đồng cao (89 – 96%) so với gen aiiA của chủng 240B1 Gần đây,

Yin và cs (2010) đã phân lập được gen aiiA từ ADN của Bacillus amyloliquefaciens,

một lòai tương đồng với B subtilis Gen này có độ tương đồng 87 – 99.3% so với các

dạng tương đồng ở các lòai Bacillus khác, trong khi trình tự acid amin của

AHL-lactonase có độ tương đồng 89.6 – 99.6%

2.4.3 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp mới trong việc kiểm soát bệnh

Có hai chiến lược chủ yếu trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn, hoặc giết chết

vi khuẩn gây bệnh, hoặc làm suy giảm độc lực của nó để sau đó mầm bệnh không thể thích nghi với môi trường bên trong vật chủ hoặc dễ dàng bị đào thải bởi hệ miễn dịch

tự nhiên của vật chủ Việc phát hiện ra hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn, có chức năng gắn liền với việc sản xuất ra các hợp chất trao đổi chất thứ cấp và những yếu tố liên quan đến độc lực, là tiền đề cho cách tiếp cận thứ hai

Việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh đã được đề nghị như

là cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn Một số phương pháp bẻ gãy hệ thống quorum sensing đã được nghiên cứu, bao gồm (Hình 1.6):

(1) Ức chế quá trình sinh tổng hợp phân tử tín hiệu quorum sensing;

(2) Ứng dụng các hợp chất đối kháng quorum sensing;

(3) Ức chế bằng hóa học đối với phân tử tín hiệu quorum sensing;

(4) Phân hủy sinh học bằng các enzyme của vi khuẩn

Một số báo cáo liên quan đến việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở các vi khuẩn gây bệnh trong nước, cùng với những kết quả đạt được đối với vi khuẩn gây bệnh ở người và thực vật, chỉ ra rằng phương pháp tiếp cận mới này có nhiều tiềm năng trong việc kiểm soát bệnh trong thủy sản

Hình 2.4 Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn

2.4.4 Những triển vọng của việc bẻ gãy quá trình quorum sensing

Những kết quả đạt được bằng cách sử dụng những kỹ thuật bẻ gãy hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh cho thấy rằng đây là một biện pháp đầy hứa

hẹn thay thế cho việc sử dụng kháng sinh trong việc chống lại sự nhiễm khuẩn Cách tiếp cận mới này cũng có thể có giá trị trong nuôi trồng thủy sản, khi mà mối liên hệ

giữa quorum sensing và sự thể hiện yếu tố độc lực ở một số vi khuẩn gây bệnh ở động

vật thủy sản đã được chứng minh Tuy nhiên, vẫn còn thiếu những số liệu về ảnh hưởng của quorum sensing đến độc lực của các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản Nghiên cứu cơ bản trong lĩnh vực quorum sensing chắc chắn sẽ cung cấp những sự

hiểu biết chính xác hơn về cơ chế mà sự biểu hiện của các gen điều khiển bởi quorum sensing được kích họat hay bị ức chế Cho đến hiện nay, đa số các nghiên cứu đã được

tiến hành đối với hệ thống quorum sensing do AHL làm trung gian của các vi khuẩn gây bệnh gram âm trên người và thực vật Tuy vậy, có thể mong đợi những kỹ thuật bẻ gãy hệ thống quorum sensing của những vi khuẩn gây bệnh khác sẽ được phát triển trong tương lai

2.4.5 Hệ thống quorumsensing của vi khuẩn Edwardsiella spp

Hệ thống quorum sensing gần đây cũng được phát hiện ở nhóm vi khuẩn gây

bệnh quan trọng trên cá, Edwardsiella spp Han và ctv (2009) xác định có bốn loại

phân tử tín hiệu AHL (BHL,HHL, 3-oxo-HHL và một phân tử AHL chưa xác định

được) liên quan đến độc lực của Edwardsiella tarda, tác nhân gây bệnh trên các loài cá

nước ngọt và nước mặn như lươn, cá nheo Mỹ, cá đối, cá tráp, cá rô phi, ca bơn Gần đây, nhóm nghiên cứu trên lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói trên cũng

tồn tại ở Edwardsiella ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính

trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam

2.5 Tổng quan về Bacilus subtilis

2.5.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus subtilis

2.5.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis lần đầu tiên được phát hiện trong phân ngựa năm 1941 bởi chức

y học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến năm 1949-1957 khi Henry và các cộng

sự đã tách được chủng thuần khiết Bacillus subtilis Từ đó“ subtilis therapy“ có nghĩa

là thuốc subtilis ra đời trị chứng viêm ruột , viêm đại tràng, chóng tiêu chảy trong rối

loạn tiêu hóa Ngày nay vi khuẩn này được sử dụng rộng rãi , phổ biến trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005)

2.5.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis

2.5.1.2.1 Đặc điểm phân loại

Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc :

Vi khuẩn Bacilllus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc , chúng được phân bố

hầu hết trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trú trong đất , thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10-100 triệu cfu/g Đất nghèo dinh dưỡng vùng sa mạc hoặc vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước

biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ thị Thứ , 1996)

2.5.1.3 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn , G+

, kích thước 0.5-0.8 µm x 1.5-3 µm , đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8-12 lông sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào Kích thước 0.8-1.8µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử , không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt , chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ ( Tô Minh Châu, 2000)

2.5.1.4 Đặc điểm sinh hóa

Lên men không sinh hơi các loại đường glucose, maltose, mannitol, saccharose, xyrose, arabinose

Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+) , di động (+), hiếu khí (+)

2.5.1.5 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

2.5.1.5.1 Cấu tạo bào tử

Ngoài cùng bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ Vỏ bào tử có nhiều

lớp, đây là những lớp các tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng chất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, do vậy có

thể tồn tại trong trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004)

Tế bào khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hóa học và tính chất sinh

lí

2.5.1.5.2 Khả năng tạo bào tử

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo

chu trình phát triển tự nhiên, hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) ( Tô Minh Châu, 2000)

Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng Tế bào chất và nhân tập trung tại

một vị trí nhất định trong tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore) Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng Tiền bào tử phát triển và tạo thành bào tử Khi bào tử trường thành, tế bào sinh dưỡng tự phân giải, và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước

và bị trương ra Sau đó vỏ của chúng bị phá hủy, và bào tử nảy mầm và phát triển thành tế bào mới Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004)

2.5.1.6 Tính chất đối kháng

Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp với những môi trường khác nhau , sinh khuẩn lạc khác nhau Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi, là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật Thực tế, khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với số lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh sinh dưỡng Cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn ( trong 24 giờ) sẽ

sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường , đồng thời tạo ra một số loại

kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế ( Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976)

2.5.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis

Trong nông nghiệp, theo tài liệu Lê Minh Cẩm Ngọc (2005) ứng dụng của Bacillus subtilis trong nông nghiệp được tiến hành như sau:

- Chăn nuôi :

Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm Biousubtyl để điều trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con

Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccine cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biousubtyl

dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng

Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc , nấm

men và một số chủng vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic

-Trồng trọt:

Bacillus subtilis được ừng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh nấm Rhizoctonia

solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch

Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm

sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hóa chất , Bộ Nông Nghiệp tại thành phố Hồ Chí Minh trừ các loại nấm bệnh trên rau cải

Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã

sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) trong phòng chống nấm bệnh Ostrinia

furnacalis trên bắp

Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm kumura từ

Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc

Aspergillus flavus , Aspergillus paraciticus

-Kháng sinh:

Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng

ức chế vi khuẩn G

-, G+ ( Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Trong thủy sản:

Các chủng B subtilis sản xuất enzyme ngoại bào như protease và một số enzyme khác đã đóng góp vào hoạt tính enzyme tự nhiên của chủng chủ (Ziaei Nejad và cs,

2006), đóng góp nguồn vi lượng và đa lượng bổ sung thức ăn (Verschuere và cs,

2000) Hơn nữa, B subtilis sản sinh các hợp chất kháng khuẩn, cạnh tranh dinh dưỡng

và không gian sống góp phần ức chế vi khuẩn gây bệnh (Vaseeharan và cs, 2003)

2.6 Tổng quan về enzyme ngoại bào của Bacillus

2.6.1 Các enzyme thường gặp ở Bacillus

Bacillus là loài rất đa dạng về sinh thái do đó hệ enzyme của chúng cũng vô cùng phong phú Ở các loài Bacillus khác nhau đã tìm thấy enzyme thuộc các nhóm carbonhydrase (amylase, cellulase, chitinase ), protease, pennicillinase, nuclese, phossphatase, lipase, thiaminase, enzyme phan giải vi khuẩn

-Amylase

Trong nhóm enzyme này thường gặp nhất là α-amylase , chúng thủy phân liên kết α-1,4 glucosidic của tinh bột để tạo thành các polysacharide Có 2 loại α-amylase

chính được tạo thành từ Bacillus là :

Enzyme dịch hóa tinh bột (liquefying enzyme)

Enzyme đường hóa (Sacharifying enzyme)

Hai enzyme này có thề phân biệt với nhau dựa trên sự tác động của chúng đối với tinh bột Trước kia người ta cho rằng α-amylase và cyclodextrin glucosyltranferase của

B maceransualaf là những enzyme duy nhất phân giải tinh bột của chi Bacillus, nhưng gần đây người ta cũng tìm thấy những enzyme khác cũng thủy phân tinh bột như β-amylase, α-1,6 amylase và các enzyme cắt nhánh

-Protease

Phần lớn trong số 34 loài Bacillus có tên trong Bergey’s manual of Systematic Bacteriology (1986) đều có khả năng sinh tổng hợp protease Trong số đó những loài quan trọng nhất là: B subtilis, B megaterium, B polymyxa (và gần đây được gọi là Paenibacillus polymyxa) , B alcalophilus, và B Themoproteolyticus Protease của vi

khuẩn được chia làm 4 nhóm dựa trên cơ chế hoạt động của chúng: protease chứa serine, protease chứa kim loại, protease chứa lưu huỳnh, protease acid Các protease ngoại bào Bacillus thường thuộc nhóm protease kim loại và protease serine

2.6.2 Ứng dụng của các enzyme amylase và protease ngoại bào

2.6.2.1 Ứng dụng amylase ngoại bào

Các amylase ngoại bào được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm dại mạch) , công nghiệp nước

chấm, công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hóa tinh bột, công nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh ), công nghệ chế biến rau quả, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi

2.6.2.2 Ứng dụng protease ngoại bào

Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như ngành chế biến cá, thịt , sữa, bánh mì, nước giải khát, thuộc da, dệt, phim ảnh Ngoài ra, protease còn được sử dụng

bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt có tác dụng loại bỏ tế bào biểu bì da đã chết làm cho da láng mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người bị bệnh tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh

mạch Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương , các ổ viêm làm thông đường hô hấp và thủy phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Trong chăn nuôi, sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn làm tăng khả năng hấp thu của động vật , dùng sản xuất các dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

Ngoài ra, các enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus còn có tác dụng xử lí

ô nhiễm môi trường

CHƯƠNG 3

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Từ 3/20115/2011

Phòng thí nghiệm Vi Sinh- Phòng Sinh học Thực Nghiệm- Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

-Chủng vi khuẩn nghiên cứu Bacillus subtilis B20.1 được phân lập từ mẫu nước

và bùn của ao nuôi cá tra thịt và giống thu tại tỉnh: Đồng Tháp, Vĩnh Long, An Giang -Chủng vi khuẩn gây bệnh để thử nghiệm khả năng kháng khuẩn: Chủng

Edwardsiella ictaluri Gly 09M nhận từ Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ

-Chủng CV026, thể đột biến từ chủng vi khuẩn Chromobacterium violaceum, được

sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị để phát hiện nồng độ dư lượng AHL còn lại trong môi trường Chủng này có khả năng tạo sắc tố màu tím violacein khi có sự hiện diện của các phân tử AHL mạch ngắn (từ 4-8 cacbon) trong môi trường

3.2.2 Môi trường và hóa chất

-Môi trường dinh dưỡng thông thường:Brain Heart Infusion Agar (BHIA), Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Blood agar (BA)

-Môi trường tạo bào tử Bacillus: Difco Sporulation Medium (DSM)

-Môi trường thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào: enzyme cellulase, amylase, protease, gelatinase và lipase

-Nước muối sinh lý 0.9%

-Thuốc thử cho các phản ứng khả năng sinh enzyme ngoại bào: Lugol, TCA 25% (tricloric acetic acid 25%)

-H2O2 3%, đĩa giấy oxidase, glycerol 40%

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA

- Cân điện tử 4 số lẻ AY220

- Máy đo pH để bàn Thermo Orion

- Tủ mát Sanyo

- Tủ lạnh sâu Sanyo

- Nồi hấp vô trùng Hirayama

- Các loại đầu típ và micropipet

- Eppendorf

- Erlen các loại

- Ống nghiệm

- Đĩa petri

Một số thiết bị và dụng cụ khác như que cấy các loại, đèn cồn, nhíp, dụng cụ đục

lỗ, bông thấm, bông không thấm…

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

Đối với các chủng vi sinh vật dùng làm probiotic trong thủy sản, khả năng sinh các enzyme ngoại bào là một tiêu chí chọn lọc quan trọng giúp hỗ trợ tiêu hóa cho vật

chủ và cải thiện môi trường sống của động vật nước ngọt bằng cách phân hủy nhanh chóng thức ăn dư thừa Các enzyme thử nghiệm là: amylase, protease, cellulase, lipase

3.3.1.1 Th ử nghiệm amylase

Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào có tác dụng phân hủy tinh bột thành các đường đơn Phản ứng này nhận biết được khi ta nhỏ dung dịch lugol vào trong môi trường thạch nuôi cấy, nếu trong môi trường có tinh bột thì môi trường chuyển sang màu xanh đậm, ngược lại thì lugol sẽ không làm chuyển màu môi trường Thí nghiệm 1 :