KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CHIẾT TÁCH CHLOROPHYLL CỦA DUNG MÔI LÊN RONG MỨT KHÔ (Porphyra sp.)

Một số yếu tố được kiểm tra, phân tích để đem lại hiệu quả chiết tách cao như: thời gian, nhiệt độ, điều kiện môi trường, tác dụng của MgCO3 khi bổ sung vào quá trình chiết tách, phương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

KHOA THỦY SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CHIẾT TÁCH CHLOROPHYLL CỦA

DUNG MÔI LÊN RONG MỨT KHÔ (Porphyra sp.)

Họ và tên sinh viên: LÊ PHẠM CÔNG HOANG Ngành: CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Niên khóa: 2007 – 2011

Tháng 7/2011

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CHIẾT TÁCH CHLOROPHYLL CỦA DUNG

MÔI LÊN RONG MỨT KHÔ (Porphyra sp.)

Thực hiện bởi

LÊ PHẠM CÔNG HOANG

Khóa luận được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành

Chế Biến Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn:

TH.S NGUYỄN THÙY LINH

LỜI CẢM ƠN

Thế là 4 năm học đại học đã sắp trôi qua Tôi sắp phải chia tay ngôi trường thân yêu, nơi đã cho tôi biết bao nhiêu kỷ niệm vui, buồn cùng bạn bè, thầy cô; Cho tôi những kiến thức quý giá để bước vào đời Đây là khoảng thời gian khá khó khăn, tôi phải hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, đây là công việc đầy thử thách và thú vị Nếu không có sự giúp đỡ của nhiều người tôi khó có thể hoàn thành tốt khóa luận này

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM cùng quý thầy cô trong Khoa Thủy Sản đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, truyền đạt những kiến thức quý báu để cho tôi bước vào đời

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Thùy Linh đã giành rất nhiều tâm huyết giúp đỡ tôi hoàn thành tốt bài luận văn này

Đồng thời tôi cũng cảm ơn các anh, chị đã chỉ bảo trong quá trình học tâp, cảm

ơn các bạn trong và ngoài lớp đã cùng tôi đi hết quãng đời sinh viên đầy thách thức và thú vị Nếu có cơ hội, tôi mong muốn mình là cậu sinh viên năm nhất như ngày nào

Cuối cùng, tôi xin gửi những lời thân thương và trìu mến nhất đến bố, mẹ tôi những người nông dân một nắng hai sương đã vất vả cho tôi ăn học nên người

Tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này với lòng hăng say nghiên cứu, sự nhiệt tình cùng với những kiến thức mà tôi có được Tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót rất mong quý thầy cô và các bạn đóng góp thêm

TÓM TẮT

Trong những năm gần đây ngày càng có nhiều nghiên cứu, báo cáo về tác dụng của chlorophyll đối với sức khỏe cũng như phương pháp chiết tách chlorophyll từ các loại

thực vật khác nhau Chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát hiệu quả chiết

tách chlorophyll của dung môi lên rong mứt khô (Porphyra sp.)” trong thời gian

01/03/2011 – 15/06/2011, tại phòng thí nghiệm 305, 307 khoa Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Trong đề tài chúng tôi có đưa ra một vài phương pháp để xác định hàm lượng chlorophyll, một trong những phương pháp cơ bản mang lại kết quả tốt đó là: phương pháp quang phổ kế Thí nghiệm so sánh khả năng chiết tách của một số dung môi khác nhau như: acetone, methanol, ethanol Một số yếu tố được kiểm tra, phân tích để đem lại hiệu quả chiết tách cao như: thời gian, nhiệt độ, điều kiện môi trường, tác dụng của MgCO3 khi bổ sung vào quá trình chiết tách, phương pháp phá vách tế bào, điều kiện ủ…

Qua kết quả nghiên cứu cho thấy:

Acetone là dung dịch thích hợp để chiết tách chlorophyll từ rong Porphyra sp so với

hai dung dịch khác là methanol và ethanol Rong biển được ủ với acetone nồng độ 80% trong vòng 24 giờ, ở 40C, với điều kiện ánh sáng mờ cho hiệu quả chiết tách chlorophyll tốt nhất 28,9 µg / l Khi bổ sung MgCO3 vào quá trình chiết tách với một lượng là 500 mg, kết quả lượng chlorophyll thu được tăng lên đáng kể 37 µg / l

MỤC LỤC

Trang tựa i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH BIỂU ĐỒ viii

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Chlorophyll 3

2.1.1 Giới thiệu về chlorophyll 3

2.1.2 Cấu tạo hóa học 3

2.1.3 Vị trí và chức năng của chlorophyll 6

2.1.3.1 Vị trí của chlorophyll trong lục lạp 6

2.1.3.2 Chức năng 7

a Chức năng kiến tạo máu 8

b Khả năng chống ung thư 9

2.2 Rong biển 10

2.2.1 Giới thiệu về rong biển 10

2.2.2 Tỷ lệ chlorophyll trong một số loại rong biển 11

2.2.2.1 Rong mơ (Sargassum polycystum) 11

2.2.2.2 Rong sụn (Kappaphycus alvarezii) 12

2.2.2.3 Rong mứt (Porphyra sp.) 12

2.2.2.4 Rong câu (Gracilaria) 12

2.3 Rong mứt (Porphyra sp.) 12

2.3.1 Phân loại 13

2.3.2 Hình thái cấu tạo 13

2.3.3 Phân bố 14

2.4 Một số loại rong thường gặp ở nước ta có chứa nhiều chlorophyll 14

2.4.1 Ngành tảo lục 14

2.4.1.1 Rong cải biển (Ulva Lactuca) 15

2.4.1.2 Rong bún (Enteromorpha Flexuosa) 15

2.5 Một số phương pháp ly trích chlorophyll 16

2.5.1 Phương pháp của Rhena Schumann, Norbert Haubner, Steffi Klausch, Ulf Karsten 16

2.5.2 Phương pháp của R Ronen and Margalith Galun 16

2.5.3 Phương pháp của Keiji Iriyama 17

2.6 Phương pháp đo độ hấp thu 17

2.6.1 Phương pháp quang phổ kế 17

2.6.1.1 Phương pháp của Daniel I Arnon, 1948 18

2.6.1.2 Phương pháp của Porra, 2002 19

2.6.1.3 Phương pháp chuẩn độ 19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian và địa điểm 21

3.1.1 Thời gian 21

3.1.2 Địa điểm 21

3.2 Vật liệu khảo sát 21

3.2.1 Nguyên liệu 21

3.2.2 Thiết bị 21

3.2.3 Dụng cụ 21

3.3 Hóa chất sử dụng 21

3.4 Phương pháp nghiên cứu 21

3.4.1 Công đoạn chuẩn bị 22

3.4.2 Bố trí thí nghiệm 22

3.4.2.1 Thí nghiệm khảo sát nồng độ và dung môi thích hợp trong chiết tách chlorophyll 23

3.4.2.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết tách chlorophyll 25

3.4.2.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ lên quá trình chiết tách

chlorophyll 25

3.4.2.4 Thí nghiệm bổ sung CaCO3 26

3.4.3 Phương pháp tính toán 26

3.4.3.1 Xác định độ hấp thu cực đại 26

3.4.3.2 Phương pháp xác định nồng độ chlorophyll 27

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 28

4.1 Thí nghiệm khảo sát nồng độ và dung môi sử dụng trong quá trình chiết tách chlorophyll 28

4.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh huởng của nhiệt độ lên quá trình chiết tách chlorophyll 36

4.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ lên quá trình chiết tách chlorophyll 38

4.4 Thí nghiệm bổ sung MgCO3 41

4.5 Quy trình chiết tách chlorophyll từ rong porphyra sp 45

4.5.1 Nguyên liệu 45

4.5.2 Nghiền, ủ rong 46

4.5.3 Ly tâm và đo độ hấp thu 47

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết quả 48

5.2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 52

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP Adenosine triphosphate

ADP Adenosine diphosphate

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Hệ số hấp thụ riêng ε của chlorophyll trong một số dung môi 18

Bảng 4.1 Hàm lượng (µg / l) chlorophyll thu được ở các nồng độ khác nhau của dung môi acetone 28

Bảng 4.2 Hàm lượng chlorophyll a, b thu được khi ly trích bằng acetone 29

Bảng 4.3 Hàm lượng (µg / l) chlorophyll thu được ở các nồng độ khác nhau của dung môi methanol 31

Bảng 4.4 Hàm lượng chlorophyll a, b thu được khi chiết tách bằng methanol 31

Bảng 4.5 Hàm lượng (µg / l) chlorophyll thu được ở các nồng độ khác nhau của dung môi ethanol 33

Bảng 4.6 Hàm lượng chlorophyll a, b thu được khi chiết tách bằng ethanol 33

Bảng 4.7 Hàm lượng chlorophyll thu được ở các nồng độ khác nhau của các dung môi acetone, methanol, ethanol 35

Bảng 4.8 So sánh hàm lượng chlorophyll cao nhất của các dung môi 36

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình chiết tách chlorophyll 38

Bảng 4.10 Hàm lượng chlorophyll a và b thu được khi khảo sát theo thời gian ủ 39

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của MgCO3 lên quá trình chiết tách 41

Bảng 4.12 Hàm lượng chlorophyll a và b thu được khi bổ sung MgCO3 vào quá trình chiết tách 42

DANH SÁCH CÁC HÌNH – ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Cấu tạo của chlorophyll 3

Hình 2.2 Porphyrin 5

Hình 2.3 Chlorophyll a 5

Hình 2.4 Chlorophyll b 5

Hình 2.5 Dẫn xuất của chlorophyll 5

Hình 2.6 Cấu tạo lục lạp 6

Hình 2.7 Sơ đồ phản ứng quang hợp 8

Hình 2.8 Trisodium copper chlorin 10

Hình 2.9 Rong mứt 12

Hình 2.10 Rong cải biển 15

Hình 2.11 Rong bún 15

Hình 2.12 Ethylenediamine tetraacetic acid 20

Hình 3.1 Acetone 23

Hình 3.2 Methanol 24

Hình 3.3 Ethanol 24

Hình 4.1 Chlorophyll ly trích bằng acetone ở các nồng độ 70%, 80%, 90% 29

Hình 4.2 Chlorophyll chiết tách bằng methanol ở nồng độ 70%, 80%, 90% 31

Hình 4.3 Chlorophyll chiết tách bằng ethanol nồng độ 70%, 80%, 90% 33

Hình 4.4 Chlorophyll chiết tách ở nhiệt độ 40 C và 310C 37

Hình 4.5 Chlorophyll chiết tách được khi ủ ở các mức thời gian 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ 38

Hình 4.6 Chlorophyll thu được khi bổ sung MgCO3 vào quá trình chiết tách 41

Hình 4.7 Ứng dụng của chlorophyll làm chất màu 44

Hình 4.8 Chlorophyll mới chiết tách 44

Hình 4.9 Chlorophyll sau hai tuần 44

Hình 4.10 Rong porphyra khô 45

Hình 4.11 Rong porphyra sau khi ngâm nước 45

Hình 4.12 Rong sau khi xay 46

Hình 4.13 Rong sau khi xay 46

Hình 4.14 Mẫu rong với dung môi chuẩn bị ủ 47

Đồ thị 4.1 Độ hấp thu chlorophyll theo bước sóng khi chiết tách bằng acetone 30

Đồ thị 4.2 Độ hấp thu chlorophyll theo bước sóng khi chiết tách bằng methanol 32

Đồ thị 4.3 Độ hấp thu của chlorophyll theo bước sóng khi chiết tách bằng ethanol 34

Đồ thị 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên quá trình chiết tách chlorophyll 38

Đồ thị 4.5 Độ hấp thu của chlorophyll theo bước sóng khi ủ theo thời gian 40

Đồ thị 4.6 Độ hấp thu của chlorophyll theo bước sóng khi bổ sung MgCO3 43

Bên cạnh những chức năng sinh học trên thì chlorophyll cũng có ảnh hưởng rất tốt đối với sức khỏe con người Ngày nay, thói quen ăn uống của chúng ta ngày càng ít rau xanh, mà đây là loại thực phẩm rất giàu chlorophyll và có lợi cho sức khỏe Hiện nay có nhiều nghiên cứu về việc ly trích và lợi ích của chlorophyll

− Lợi ích đáng kể nhất của chlorophyll đã được thể hiện qua cấu trúc phân tử của

nó Chlorophyll có cấu tạo khá giống với hồng cầu ngoại trừ nhân của chlorophyll là ion Mg2+ còn nhân của hồng cầu là Fe2+ Vì vậy, chlorophyll có khả năng phục hồi và tái tạo máu rất tốt, nhất là đối với những người thiếu máu

− Chlorophyll cũng có khả năng chống ung thư, chúng ngăn chặn những hợp chất gây ung thư và gây đột biến như độc tố nấm mốc trong quả và hạt, những độc tố xuất hiện trong quá trình chế biến thực phẩm từ thịt, cá… như xông khói, nướng…và những chất gây ung thư tồn tại trong không khí bị ô nhiễm Vì vậy ngày càng có nhiều những nghiên cứu về khả năng chống ung thư của chlorophyll (Roderick H Dashwood, 1997)

Chlorophyll cũng được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như là chất màu

tự nhiên Khi chế biến thực phẩm thì hầu hết các chất màu tự nhiên của thực phẩm bị giảm hay bị mất đi làm cho thực phẩm không còn bắt mắt và giảm đi giá trị sử dụng

của nó Chính vì vậy mà dùng những chất màu được ly trích bổ sung vào thực phẩm giúp ta cải thiện được giá trị và tăng thêm tính hấp dẫn của sản phẩm

Chính vì những lợi ích trên của chlorophyll nên việc khảo sát và đánh giá các phương pháp ly trích chlorophyll là rất cần thiết Vì lý‎ do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát hiệu quả chiết tách chlorophyll của dung môi lên rong mứt khô

(Porphyra sp.)” với sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Thùy Linh và sự chấp thuận của khoa Thủy Sản trường ĐH Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát các phương pháp chiết tách và những điều kiện thích hợp để thu nhận chlorophyll với hiệu suất cao

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Chlorophyll

2.1.1 Giới thiệu về chlorophyll

Chlorophyll là chất màu xanh có trong hầu hết tất cả các loại thực vật, tảo, và khuẩn lục thuộc họ Cyanophyta Tên của nó bắt nguồn từ Hy Lạp “Chloros” có nghĩa

là màu xanh “Phyllon” có nghĩa là lá Chlorophyll là một phân tử sinh học rất quan trọng, quyết định đến quá trình quang hợp của cây Giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh dương nhưng lại hấp thụ kém

ánh sáng màu lục trong dải quang phổ của ánh sáng (wikipedia.org )

2.1.2 Cấu tạo hóa học

Hình 2.1 Cấu tạo của chlorophyll

Theo Winstater (1913) đã xác định được cấu tạo của phân tử chlorophyll Cấu trúc cơ bản của chlorophyll là nhân porphyrin Nhân porphyrin do 4 vòng pyrol nối với nhau bằng các cầu metyl tạo thành vòng khép kín Giữa nhân có nguyên tử Mg tạo nên cấu trúc dạng haem Điều đặc biệt quan trọng là trên nhân porphyrin hình thành 10

nối đôi cách là cơ sở của hoạt tính quang hoá của chlorophyll Có nhiều loại phân tử chloropyll như chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c1, c2, c3, các loại chlorophyll đều có phần cấu trúc giống nhau, đó là nhân porphyrin và 2 gốc rượu Mỗi loại chloropyll được đặc trưng riêng bởi các nhóm bên khác nhau tạo nên một số tính chất khác nhau Chlorophyll là chất có hoạt tính hoá học cao, vừa có tính acid, vừa có tính base Đặc biệt chloropyll có những tính chất lý học quan trọng giúp cho chúng thực hiện chức năng trong quang hợp

Tính chất lý học quan trọng nhất của chlorophyll là khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng chọn lọc Quang phổ hấp thụ cực đại của chlorophyll vùng ánh sáng xanh (430-460 nm) và vùng ánh sáng đỏ ( 620-700 nm) Nhờ khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nên chloropyll có hoạt tính quang hoá Khi hấp thụ năng lượng từ các lượng tử ánh sáng, năng lượng của các lượng tử đã làm biến đổi cấu trúc của chlorophyll làm cho phân tử chlorophyll trở thành trạng thái giàu năng lượng – trạng thái kích động điện tử Ở trạng thái đó phân tử chlorophyll thực hiện các phản ứng quang hoá tiếp theo

Một tính chất quan trọng khác của chlorophyll là có khả năng huỳnh quang Nhờ khả năng huỳnh quang mà năng lượng được truyền qua các hệ sắc tố để tập trung vào hai tâm quang hợp Nhờ những tính chất trên nên chlorophyll là sắc tố có vai trò quan trọng trong quang hợp Chlorophyll tiếp nhận năng lượng ánh sáng, truyền năng lượng ánh sáng thành năng lượng điện tử của chlorophyll để rồi biến đổi năng lượng điện tử thành năng lượng hoá học tích trữ trong ATP cung cấp cho quá trình tổng hợp chất hữu cơ (Đỗ Ngọc Liên, 2007) Sự khác nhau giữa chlorophyll a và

chlorophyll b là tại vị trí C7 ở chlorophyll a là nhóm CH3 còn ở chlorophyll b là nhóm CHO (tailieu.vn)

- Mg - CO2CH3

Chlorophyll Pheophytin pyropheophytin

- phytol - phytol - phytol Chlorophyllase

- Mg - CO2CH3Chlorophyllide Pheophorbide Pyropheophorbide

Hình 2.5 Dẫn xuất của chlorophyll (Schwartz, 1998)

2.1.3 Vị trí và chức năng của Chlorophyll

2.1.3.1 Vị trí của chlorophyll trong lục lạp

và các khoang rỗng (thylakiod lumen) Có hai kiểu màng trong của lạp thể: lớp màng xếp chồng lên nhau (grana) và các màng trong không xếp chồng lên nhau được gọi là các màng đệm (stromat membrane) của chất nền (stroma) Đặc điểm tổ chức quan trọng của các thylakiod là các hệ thống quang hợp I (PSI) và hệ quang hợp II (PSII)

Hệ thống quang hợp I cần ánh sáng ở bước sóng ≤ 700 nm, và chủ yếu nằm trong màng thylakiod không gắn với grana Hệ thống quang hợp I có trung tâm phản ứng là một phức hợp protein – diệp lục tố hấp thu bước sóng 700 nm Hệ thống quang hợp II cần ánh sáng ở bước sóng ≤680 nm và có nhiều trong màng thylakoid có grana Hệ thống quang hợp II có trung tâm phản ứng hấp thụ bước sóng 680 nm (Lê Ngọc Thông

và Huỳnh Tiến Dũng, 2006)

Hệ thống quang hợp chứa đựng một trung tâm phản ứng quang hoá và nhiều anten là các phức hệ sắc tố thu nhận ánh sáng kết hợp với protein chức năng thực hiện chức năng quang hợp Chức năng của những anten sắc tố này là hấp thụ năng lượng ánh sáng chuyển chúng vào trung tâm phản ứng, ở đó năng lượng sẽ làm biến đổi các sản phẩm hoá học bền vững Việc phân tích kích thước của hệ thống quang hợp I và hệ thống quang hợp II chỉ ra rằng ở tất cả thực vật, mỗi trung tâm phản ứng có xấp xỉ 250

phân tử chlorophyll bao gồm chlorophyll a và chlorophyll b, chlorophyll nằm trên màng thylakoid của lục lạp Có hai loại chlorophyll là chlorophyll a và chlorophyll b, trong đó tỷ lệ chlorophyll a có mặt trong thực vật cao hơn (Đỗ Ngọc Liên, 2007)

2.1.3.2 Chức năng

Diệp lục là sắc tố rất quan trọng trong quá trình quang hợp, giúp thực vật tổng hợp được năng lượng từ ánh sáng mặt trời, hấp thụ ánh sáng để thực hiện phản ứng phân giải nước:

Ánh sáng

H2O ½ O2 + H2 (tạo thành NADPH)

(Lê Ngọc Thông và Huỳnh Tiến Dũng, 2006)

Có nhiều dạng diệp lục tố khác nhau như chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c, trong đó các sắc tố chlorophyll a và chlorophyll b đóng vai trò quan trọng Quang hợp là một quá trình tổng hợp các hợp chất hữu cơ trong đó có các hợp chất năng lượng cao như ATP, và các coenzym khử NADPH thông qua con đường phosphoryl hóa nhờ năng lượng của ánh sáng mặt trời dưới dạng hạt photon Quá trình này được gọi là quang - phosphoryl hóa tổng hợp chỉ được thực hiện trong bào quan lục lạp của thực vật (Đỗ Ngọc Liên, 2007)

Phương trình phản ứng tổng quát của sự quang hợp là:

AS 6CO2 + 12H20 C6H12O6 + 6O2 + 6H2O

Lục lạp

Quang hợp gồm hai giai đoạn xảy ra liên tục:

Pha tối của quá trình quang hợp bao gồm sự cố định CO2 vào chu trình Calvin

để tạo ra đường, là một chuỗi phản ứng xảy ra trong stroma và do emzym Rubisco xúc tác Những phản ứng này cần năng lượng từ ATP và NADPH, được tổng hợp từ pha sáng của quá trình quang hợp (Lê Ngọc Thông và Huỳnh Tiến Dũng, 2006)

Hình 2.7 Sơ đồ phản ứng quang hợp

a Chức năng kiến tạo máu

Điểm khác biệt chính giữa cấu tạo chlorophyll và haemoglobin là nguyên tử trung tâm của chlorophyll là Mg2+

, trong khi haemoglobin là Fe2+, vì thế chlorophyll đóng một vai trò quan trọng trong việc tái tạo máu, những nghiên cứu được thực hiện trên những loài động vật khác nhau đã cho thấy chlorophyll có thể giúp hồng huyết cầu trở lại bình thường trong vòng 4-5 ngày điều trị bằng chlorophyll, dù rằng những động vật này đã được xác định là thiếu máu nghiêm trọng hoặc số lượng hồng cầu thấp Chlorophyll còn làm tăng chức năng của tim, hệ huyết quản, phổi và các chức năng của phụ nữ Chlorophyll được dùng tốt trong các trường hợp thiếu máu, huyết áp không bình thường có nguy cơ dẫn đến xơ vữa động mạch Nó kích thích các trạng

thái nhu động: hoàn thiện hệ thống ruột non, giảm hàm lượng Ure – như là một thuốc lợi tiểu (Trần Đình Toại và Châu Văn Minh, 2005)

b Khả năng chống ung thư

Chlorophyllin là dẫn xuất kim loại của chlorophyll, ion Mg2+

trong chlorophyll được thay thế bởi ion Cu2+, có tiềm năng phòng chống các chất gây ung thư từ thức ăn

bị thiu, mốc như hydrocarbon mạch vòng, aflatoxin, stress, nhiễm độc thuốc trừ sâu, hút thuốc lá, khẩu phần ăn có nhiều chất béo Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất cảm thụ ánh sáng để diệt các tế bào ung thư và chống virus, bản chất

là chất chống oxy hóa nên chúng có khả năng khử các gốc tự do trong cơ thể, làm các gốc tự do trong cơ thể trở nên vô hại Do đó chúng có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã bị

hư hại và bảo vệ con người khỏi các chất gây ung thư Chlorophyll còn giúp cho tiêu hóa tốt và làm cho da thêm đẹp Theo Roderick H Dashwood (1997) chlorophyllin là

dẫn xuất tan trong nước của chlorophyll được sử dụng từ nhiều thập kỷ gần đây để điều trị bệnh ở người Thuật ngữ chlorophyllin được sử dụng ngày càng nhiều trong các tài liệu về đột biến gen, ảnh hưởng của chlorophyllin lên những gen có hại trong một thời gian ngắn Gần đây cũng có nhiều nghiên cứu về chlorophyllin trong việc chống ung thư trên chuột đồng, chuột nhà, cá hồi Những chế phẩm sinh học của chlorophyllin trong thực tế bao gồm hỗn hợp một, hai hay ba acid carboxylic gắn trong vòng chlorin Những hỗn hợp này hiện diện trong các muối như muối K, hay Na trong vòng chlorins Vòng chlorin nhân Cu2+có gắn 3 muối Na+

(trisodium copper chlorin) chiếm tỷ lệ lớn trong chlorophyllin thương mại Tuy nhiên dẫn xuất chlorin nhân Cu2+

có gắn hai muối Na+ cũng chiếm một số lượng lớn, phụ thuộc vào loài thực vật mà ta

sử dụng làm nguyên liệu

Hình 2.8 Trisodium copper chlorin

Một trong những cơ chế giải thích khả năng chống lại ung thư của chlorophyllin

là dẫn xuất của chlorophyll có thể chống lại những hợp chất gây ung thư và gây đột biến như các hydrocarbon thơm mạch vòng, độc tố nấm mốc và những amine dị vòng Một thí nghiệm trên chuột cho thấy khi dùng 200 mg chlorophyllin/kg trọng lượng có tác dụng chống lại sự thay đổi của những nhiễm sắc thể giống nhau gây ra bởi tia gama trong tủy xương, tuy nhiên nó lại không chống lại sự thay đổi trong nhân của tế bào hồng cầu

Thực phẩm, nước uống có sự hiện diện của chloropohyll được biết đến với khả năng chống đột biến gen và chống lại các chất gây ung thư ở nhân tế bào Tác dụng của chlorophyllin là tạo phức hợp với các tác nhân gây ung thư và làm giảm khả năng sinh học của nó, giới hạn sự hoạt động của các enzym sinh học, kích thích enzym khử độc tố, kết hợp với những phần mang ái lực điện tử của tác nhân gây ung thư để loại

bỏ chúng Chlorophyll còn có khả năng chống oxy hóa trực tiếp Simonich đã sử dụng

100 mg chlorophyllin ba lần mỗi ngày có ý nghĩa rất lớn, làm giảm 50% độc tố nấm mốc thải ra ngoài theo nước tiểu của những người tham gia thử nghiệm (Michael T Simonich, 2008)

2.2 Rong biển

2.2.1 Giới thiệu về rong biển

Rong biển là loài tảo lớn, chúng tạo thành một thành phần quan trọng trong nguồn tài nguyên sinh vật biển của thế giới Chúng có mặt ở phần lớn các vùng nước

nông ven biển, cửa sông, và vùng nước lợ Rong biển là loại thực vật nước mặn không

có hoa, có hệ thống cành, rễ, thân, và lá thật Rong biển thường phát triển thẳng đứng

từ nền đáy mà nó bám vào, điều này giúp nó vươn tới gần ánh sáng mặt trời Những nhân tố môi trường chính như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, dòng chảy, và dinh dưỡng đều có ảnh hưởng đến sự phát triển của rong biển Sự hấp thụ dinh dưỡng và quang hợp diễn ra trên toàn bộ bề mặt của rong, điều này trái ngược hoàn toàn với những loài

thực vật bậc cao Rong biển được chia làm ba nhóm là: Xanh lá cây (Chlorophyceae), Nâu (Phaeophyceae), Đỏ (Rhodophyceae) dựa trên những màu sắc căn bản của chúng

như chlorophylls, carotenoids và phycobiliproteins (Erulan V và ctv 2009)

Rong biển là loại thực phẩm rất giàu dinh dưỡng và tốt cho sức khỏe Ở nước ta

có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng biển miền bắc 310 loài, miền nam 484 loài, 156 loài tìm thấy ở cả hai miền nam và bắc Trong đó có các đối tượng quan trọng là: rong câu (Gracilaria), rong mơ (Sargassum), rong đông (Hypnea), rong mứt (Porphyra), và rong bún (Enteromorpha) ( Trần Thị Luyến và ctv 2004) Rong biển có chứa rất nhiều khoáng chất chiếm 15% - 57% với hàm lượng muối thấp và canxi cao Hàm lượng dinh dưỡng cao, hàm lượng protein ở Mostoc commune flagelliform

20,9%, rong Ulva lactuca 14,9%, rong Porphyra tenera 25 – 30%, chứa nhiều các nguyên tố như Iod, Co, K, P, Ca, N… Rong còn là món ăn dễ tiêu, chữa được các bệnh sưng tuyến giáp trạng Chính vì vậy mà ngày nay thế giới đã dùng Hydrohysat (hợp chất do sự thủy giải của rong biển) dùng làm thuốc bổ, có tác dụng làm cơ thể mau tăng cân, cải thiện sức khỏe (Nguyễn Xuân Lý, 1979)

2.2.2 Tỷ lệ chlorophyll trong một số loại rong

2.2.2.1 Rong mơ (Sargassum polycystum)

- Chlorophyll a: tối đa 0,615 ± 0,032 mg/g fr.wt

2.2.2.2 Rong sụn (Kappaphycus alvarezii)

- Chlorophyll a: 0,62 ± 0,043 mg/g fr.wt

- Chlorophyll b : 0,378 ± 0,029 mg/g fr.wt

- Total chlorophyll : 0,998 ± 0,073 mg/g fr.wt

0,941 ± 0,086 mg/g fr.wt (G Thirumaran và ctv 2009)

được quyết định bởi sự phối hợp của các thành phần sắc tố trên Rong mứt đã được con người sử dụng từ rất lâu, phổ biến là dùng làm thức ăn

Rong mứt là loại rong có giá trị kinh tế cao, chứa nhiều chất dinh dưỡng có ảnh hưởng tốt đến hoạt động sinh lý của con người Rong mứt có mùi vị thơm ngon, hợp khẩu vị và được người dân ưa thích, được xếp vào loại món ăn cao cấp và đặc sản đang chiếm vị trí quan trọng trên thị trường quốc tế Nhiều nước ven biển đã tiến hành khai thác tự nhiên và nuôi trồng để tăng sản lượng và đáp ứng nhu cầu trong nước và

xuất khẩu (Ngô Văn Hiến, 1978) Tại Đông Nam Á, Porphyra sp (Nori, rong mứt) là

sản phẩm rất được ưa chuộng nhờ chúng có hàm lượng protein, các loại vitamin và khoáng chất cần thiết rất cao (Trần Thị Luyến và ctv, 2004 )

2.3 2 Hình thái, cấu tạo

Theo Ngô Văn Hiến (1978) rong mứt là loại rong có dạng lá mỏng, do một lớp

tế bào tạo thành Phần gốc có cơ quan bám hình đĩa rất nhỏ do tế bào kéo dài tạo thành Phần trên là cuống lá bé và phần hình lá, là phần chủ yếu của cơ thể Hình dạng

lá tùy theo vùng biển, môi trường sống mà khác nhau Một vài loài cơ thể gồm hai hàng tế bào nên cơ thể dày 100µ, loài mỏng chỉ 20 – 40 µ, trung bình 50 – 60 µ Khi rong còn non cơ thể màu hồng nhạt, khi già đặc biệt ở những vùng nhiều chất dinh dưỡng thì rong có màu tím đậm Rong dạng phiến tròn hay bầu dục, ít khi xẻ thùy, nhiều phiến xếp chồng lên nhau thành dạng đóa hoa hồng Rong có màu tím thẫm hay tím lục đậm, cao 3 – 4 cm, phiến rộng 2 - 4 cm

2.3 3 Phân bố

Porphyra sp là loài phân bố rộng, ở nhiều vĩ độ khác nhau từ vùng ôn đới tới vùng nhiệt đới và một số ít sống ở vùng hàn đới Rong thích ánh sáng mạnh, rong trưởng thành thường bám trên các nền đáy cứng như san hô, vỏ động vật nhuyễn thể Các giai đoạn phát triển của rong thường thích nghi với những nơi có sóng mạnh Một

số nơi thường gặp là: Hải Phòng, Thanh Hóa, Quảng Bình, Hà Tĩnh, Nghệ An, Quy Nhơn, Nha Trang

Theo Trần Thị Luyến và ctv (2004), ở Việt Nam thường gặp 2 loài Porphyra:

rong mứt hoa (P.crisnata Kzelim) và rong mứt Việt Nam (P.Việt namensis tanaka), khi

non có màu hồng nhạt, cơ thể mỏng, nhất là ở vùng cằn cỗi, khi già ở vùng đất tốt cây cao, dày, tím thẫm

Ở miền bắc Việt Nam chỉ có rong mức hoa tập trung ở Đồ Sơn - Hải Phòng, Sầm Sơn - Thanh Hóa, Cửa Gianh - Quảng Bình, Cửa Sót - Hà Tĩnh Ở các tỉnh Miền nam có cả rong mức hoa lẫn rong mức Việt Nam: Qui Nhơn, Nghĩa Bình, Nha Trang – Khánh Hòa, Vũng Tàu, Đồng Nai, Cà Ná - Thuận Hải cũ Rong miền Bắc xuất hiện vào tháng 12 tháng 4 lụi tàn Rong miền nam – tháng 12 và tháng 3 lụi tàn Rong Porphyra ở Việt Nam chủ yếu mọc tự nhiên, chưa có rong nuôi trồng nhân tạo

2.4 Một số loại rong thường gặp ở nước ta có chứa nhiều chlorophyll

2.4.1 Ngành Tảo Lục

Tảo lục gồm những loại tảo có màu xanh lá cây, màu lục nhạt, lục vàng Sắc tố của nó là diệp lục giống như sắc tố của thực vật bậc cao, chủ yếu là chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid Cho đến nay người ta đã tìm thấy trong tảo lục có khoảng

360 giống, 5700 loài như: Monostroma, Ulva, Valonia, Enteromorpha…Tảo lục thường dùng làm thức ăn rất tốt, ngoài ra còn có thể dùng làm thức ăn cho gia súc, làm phân bón

2.4.1.1 Rong cải biển (Ulva Lactuca)

Hình 2.10 Rong cải biển

Rong dạng phiến rộng, mềm mại, mọc xòe, xẻ thùy, mép nhăn gấp, màu lục thẫm hay lục nhạt kích thước trưởng thành cao 10 – 25 cm, rộng 4 – 10 cm

Rong thường bám trên đá, vỏ động vật thân mềm, gỗ mục, trong các ruộng muối, vào mùa xuân và đầu hè tìm thấy ở Nam Hà (hiện nay chia thành Hà Nam và Nam Định), ngoài ra còn phân bố ven biển từ Quảng Ninh đến Nghệ An, Hải Phòng, Vũng tàu Phân bố: biển Đen, bắc Đại Tây Dương, Thải Bình Dương, Ấn Độ Dương…

2.4.1.2 Rong bún (Enteromorpha Flexuosa)

Hình 2.11 Rong bún

Dạng ống rỗng trụ tròn, cao 20 – 30 cm màu lục, lục vàng, chia nhiều nhánh chủ yếu là ở phần gốc Các nhánh có kích thước gần như nhau, trên thân và nhánh có chồi nhỏ dạng gai Rong sống bám hay sống trôi nổi thành bè, quấn vào nhau, phát triển tốt vào mùa đông xuân Tìm thấy trong các đầm nước lệ Hải Phòng, Thái Bình, vùng biển miền nam Việt Nam Phân bố: Liên Xô, Rumani, Bungari, Thổ Nhĩ Kỳ, rong này phân bố ở các vùng biển ấm trên thế giới

2.5 Một số phương pháp ly trích chlorophyll

2.5.1 Phương pháp của Rhena Schumann, Norbert Haubner, Steffi Klausch, Ulf Karsten

Theo Rhena Schumann và ctv (2004) nguyên cứu trên tảo đã dùng acetone 90%

để ly trích chlorophyll, công đoạn phá vách tế bào dùng những hạt micro-beads trong qua trình đồng hóa để tăng khả năng phá vách tế bào lên gấp 3 lần các phương pháp khác Nhưng hiệu suất thu hồi chlorophyll chỉ từ 39 – 85%

Trong một nghiên cứu khác ly trích chlorophyll từ dung môi là Dimethyl formamide Đạt hiệu quả khá cao tuy nhiên Dimethyl formamide là hóa chất độc không được sử dụng trong thực phẩm Theo nghiên cứu trên hạt micro-beads được đưa vào nguyên liệu và đồng hóa trong 3 phút; Sau đó thêm 4,5 ml acetone 90% vào khuấy đều; Rồi ly tâm 3 phút Phần nổi trên được thu lấy cho vào ống nghiệm 10ml sẫm màu; Phần lắng ở đáy được ly tâm 2 lần nữa sau khi khuấy trộn cặn lắng với 2,5 ml và 2 ml acetone; Phần nổi trên được thu lấy và cho vào ống nghiệm 10 ml trên Sau đó tiến hành đo độ hấp thu

Để cải thiện chất lượng chiết tách chlorophyll sau khi nghiền rồi ủ với acetone 90% trong 9 giờ, sau đó tiến hành các công đoạn tiếp theo Tuy nhiên nếu không giữ lạnh vàthí nghiệm tiến hành ở ánh sáng mờ thì chlorophyll bị biến đổi thành các dạng đồng phân của nó như pheophyltin, chlorophyllin

2.5.2 Phương pháp của R Ronen and Margalith Galun

Một nghiên cứu khác sử dụng nguyên liệu là địa y (Ramalina duriaei) để thu

hồi chlorophyll của R Ronen và Margalith Galun (1983), tác giả đã sử dụng Dimethyl sulfoxideđể chiết tách chlorophyll bằng cách ngâm 20 mg Ramalina duriaei

trong 5 ml dung dịch Dimethyl sulfoxide trong bóng tối, 40 phút ở 650C Dịch thu được pha loãng với Dimethyl sulfoxide theo tỷ lệ 1:1 đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ Tuy nhiên Dimethyl sulfoxide là hóa chất độc hại có hại cho người làm thí nghiệm và không thể sử dụng trong thực phẩm Trong bài viết tác giả cũng đề cập đến một phương pháp chiết tách khác, sản phẩm thu được có độ hấp thụ cao hơn

Tác giả sử dụng 4 g Ramalina duriaei tươi nghiền với acetone 90% trong cối

giữ ở nhiệt độ lạnh, ánh sáng mờ và có sự hiện diện của MgCO3 Giữ trong ngăn mát

tủ lạnh 3 giờ sau đó lấy ra ly tâm 2000 vòng/phút; Phần nổi lên trên được thu lấy đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ

2.5.3 Phương pháp của Keiji Iriyama

Keiji Iriyama (1978) chiết tách chlorophyll từ rau Chân Vịt Tất cả các bước của thí nghiệm đều được tiến hành trong bóng tối và nhiệt độ lạnh Bước phá vách tế bào được tiến hành bằng cách nghiền rau spinach trong 3 phút với acetone Sau đó ly tâm dung dịch thu được, được chia làm 3 phần xử lý khác nhau Việc chiết tách chlorophyll xử dụng methanol 90% thì cho kết quả tốt tuy nhiên các hình thức khác của chlorophyll a đã được hình thành với khác biệt nhỏ về cấu tạo, hình thành pheophytin a, pheophytin b có cấu tạo giống như chlorophyll tuy nhiên nhân Mg2+

bị thiếu, chlorophyllin nhân Mg2+ bị thay thế bởi Cu2+

Nếu sử dụng acetone chiết tách

và để sản phẩm quá lâu sau 2 giờ thì sản phẩm chuyển sang các dạng đồng phân của chlorophyll như pheophytin, chlorophyllide…

Như vậy đã có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu về vấn đề chiết tách chlorophyll mỗi phương pháp đều có điểm mạnh, điểm yếu Tuy nhiên ta có thể tham khảo để có thể hoàn thiện quy trình chiết tách trên rong bằng cách tiếp thu điểm mạnh từ các quy trình như:

- Giữ các bước thí nghiệm dưới điều kiện ánh sáng mờ và nhiệt độ lạnh

- Làm lạnh nguyên liệu trước khi đồng hóa

- Xác định phương pháp đồng hóa cho phù hợp

- Xác định dung dịch chiết tách cho phù hợp

- Ủ dung dịch sau khi đồng hóa 9 giờ ở nhiệt độ lạnh 40C, ánh sáng mờ

- Thêm MgCO3 trong quá trình đồng hóa

2.6 Phương pháp đo độ hấp thu

2.6.1 Phương pháp quang phổ kế

Độ hấp thu cực đại A

A = ε.L.C Với:

- A: độ hấp thu cực đại

- ε: hệ số hấp thu riêng (

cm mg ml

)

- L: độ dài đường đi xuyên qua dung dịch cần đo

- C: nồng độ dung dịch đo độ hấp thu

Bảng 2.1 Hệ số hấp thụ riêng ε của chlorophyll trong một số dung môi

Dung môi Chiều dài sóng

(Nguyễn Thị Hoàng Yến, 2009)

2.6.1.1 Phương pháp của Daniel I Arnon, 1948

Chlorophyll a và chlorophyll b tinh sạch được xác định bởi đo mật độ tế bào chlorophyll chiết tách được trong acetone 80% trong ống Cuvet của máy quang phổ

6,45

D −

thay vào (i) ta có:

(iv) Cb = 0,0229D645 – 0,00468D663 Thay kết quả trên vào (iii)

2.6.1.2 Phương pháp của Porra, 2002

Dung môi là acetone

60,45

Dung môi là Methanol

Đối với dung môi là methanol thì dùng hai bước sóng là 652 nm, và 665,2 nm

để đo độ hấp thu theo Robert J Porra, 2002

[Chloa]= 16,29E665,2 – 8,54E652

[Chlob]= 30,66E652 – 13,58E665,2

[Chloa+b]= 22,12E652 + 2,71E665,2

2.6.1.3 Phương pháp chuẩn độ

Theo Vernon, 1960, trích bởi Nguyễn Hoàng Yến (2009), chlorophyll có thể được xác định bằng việc chuẩn độ thông qua sự liên kết Magnesium (Mg) với Ethylenediamine tetraacetic acid C10H6N2O8 Phương pháp này không phân biệt được

phổ kế Phương pháp này chỉ phù hợp với những loại vật liệu không có pheophytin hiện diện

Hình 2.12 Ethylenediamine tetraacetic acid

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

3.1.1 Thời gian

Đề tài “Khảo sát hiệu quả tách chiết chlorophyll của dung môi lên rong mứt khô

Porphyra sp.” đã được thực hiện từ ngày 01/03/2011 đến ngày 15/06/2011

3.1.2 Địa điểm

Đề tài ” Khảo sát hiệu quả tách chiết chlorophyll của dung môi lên rong mứt

khô Porphyra sp.” được thực hiện tại phòng thí nghiệm 305, 307 khoa Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu khảo sát

3.2.1 Nguyên liệu:

Ly trích chlorophyll được tiến hành trên rong Porphyra sp khô Nguồn rong

được mua từ chợ Bình Tây

3 4 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình chiết tách chlorophyll cơ bản:

3.4.1 Công đoạn chuẩn bị

Tiến hành rửa sạch các dụng cụ trước khi thí nghiệm như máy xay sinh tố, ống nghiệm, đũa khuấy, cốc đong, bình đo thể tích, ống cuvet, để khô

3 gram Porphyra sp khô ngâm nước cho nở ra, ngâm 2 – 3 lần để loại bỏ sắc tố

đỏ phycoerythrin vì sắc tố phycoerythin tan trong dung môi không phân cực Sau khi ngâm xong để ráo, chuẩn bị nghiền trong máy xay sinh tố

3 4.2 Bố trí thí nghiệm

Để chiết tách chlorophyll hiệu quả chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm để xác định một vài thông số kỹ thuật trong quy trình như sau:

3.4.2.1 Thí nghiệm khảo sát nồng độ và dung môi thích hợp trong chiết tách chlorophyll

a Thí nghiệm 1 Thí nghiệm khảo sát nồng độ acetone sử dụng trong chiết tách chlorophyll

Hình 3.1 Acetone

Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên ở ba nồng độ acetone là: 70%, 80%, 90%, và tiến hành lặp lại 3 lần Khi ta thay đổi nồng độ acetone thì các bước khác của quy trình cần giữ nguyên

3 gam rong khô ngâm trong nước, nhiệt độ phòng, 1 phút, giữ trong điều kiện ánh sáng mờ Sau đó cho vào máy xay sinh tố (bao đá lạnh xung quanh để giữ nhiệt độ mát, dùng vải bọc xung quanh tạo điều kiện ánh sáng mờ), nghiền trong 5 phút với lần lượt 30%, 20%, 10% nước, nhiệt độ mát Cho hỗn hợp vào cốc đựng acetone 100%, đảm bảo nồng độ acetone sau cùng đạt 70%, 80%, 90%, lắc nhẹ cốc sau đó bọc cốc bằng giấy bạc rồi cho vào ngăn mát tủ lạnh ủ ở 40C, 24h; Sau đó lấy mẫu ra, ly tâm

6000 vòng/phút trong 10 phút; Pha loãng mẫu, rồi đo độ hấp thu của chlorophyll bằng máy quang phổ ở bước sóng 664 nm, 646 nm Mẫu blank là dung dịch acetone: 14%, 16%, 18% tùy theo nồng độ acetone mà ta dùng để chiết tách chlorophyll

Ở mỗi lần lặp lại thí nghiệm tiến hành đo độ hấp thu và hàm lượng chlorophyll Dùng phương pháp thống kê (phần mềm thống kê MINITAB 15) để phân tích kết quả

và chọn thông số về nồng độ acetone phù hợp để đưa vào quy trình

b Thí nghiệm 2 Khảo sát nồng độ methanol trong quá trình chiết tách chlorophyll

Hình 3.2 Methanol

Thí nghiệm một yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên ở ba nồng độ methanol 70%, 80%, 90% Thí nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần Khi ta thay đổi nồng độ methanol thì các bước khác của quy trình cần giữ nguyên

Tiến hành thí nghiệm tương tự như thí nghiệm 1 thay dung môi acetone bằng dung môi methanol

c Thí nghiệm 3 Khảo sát nồng độ của ethanol trong quá trình chiết tách chlorophyll

Hình 3.3 Ethanol

Thí nghiệm một yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên ở 3 nồng độ ethanol 70%, 80%, 90% Thí nghiệm lặp lại 3 lần Khi ta thay đổi nồng độ ethanol thì các bước khác của quy trình cần giữ nguyên

Tiến hành làm tương tự thí nghiệm 1 chỉ thay dung môi là acetone bằng dung môi là ethanol

d So sánh kết quả giữa ba quy trình chiết tách chlorophyll từ rong Porphyra sp khô

sử dụng acetone, methanol, ethanol

Quy trình chiết tách chlorophyll từ rong Porphyra sp khô sử dụng acetone, methanol, ethanol, ta so sánh kết quả tốt nhất của 3 dung môi ở 3 nồng độ với nhau, sau đó lựa chọn loại hóa chất và nồng độ phù hợp để sử dụng trong quy trình chiết tách, để đạt được hàm lượng chiết tách chlorophyll cao nhất

3.4.2.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết tách chlorophyll

Thí nghiệm một yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên ở 2 mức nhiệt độ là: nhiệt độ phòng, 40C Thí nghiệm lặp lại 3 lần Khi yếu tố nhiệt độ thay đổi thì các yếu

tố khác của quy trình như nồng độ dung môi, loại dung môi và các điều kiện thí nghiệm được giữ nguyên

Sau khi xác định được loại dung môi và nồng độ dung môi thích hợp từ thí nghiệm 1, ta tiến hành thay đổi nhiệt độ trong quá trình ủ hỗn hợp rong với loại dung môi thích hợp Thí nghiệm tiến hành tương tự như thí nghiệm 1, nhưng yếu tố nhiệt độ

ủ thay đổi Chúng tôi tiến hành ủ mẫu ở 2 mức nhiệt độ là: nhiệt độ phòng và 40

C; Theo dõi hàm lượng chlorophyll trong dung dịch

3.4.2.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ lên quá trình chiết tách chlorophyll

Thí nghiệm một yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên ở 3 mức thời gian ủ là:

16 giờ, 20 giờ, 24 giờ Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Khi yếu tố thời gian ủ thay đổi thì các yếu tố khác của quy trình như nồng độ dung môi, loại dung môi và các điều kiện thí nghiệm được giữ nguyên

Sau khi xác định được loại dung môi, nồng độ dung môi thích hợp và nhiệt độ ủ thích hợp từ thí nghiệm 1, thí nghiệm 2, ta tiến hành thay đổi thời gian trong quá trình

ủ hỗn hợp rong với loại dung môi thích hợp Thí nghiệm được tiến hành tương tự như

thí nghiệm 1 nhưng yếu tố thời gian được thay đổi Chúng tôi tiến hành thay đổi thời gian ủ hỗn hợp, sau đó đo độ hấp thu của dung dịch ở hai bước sóng thích hợp

3.4.2.4 Thí nghiệm bổ sung MgCO 3

Thí nghiệm cải thiện quy trình chiết tách chlorophyll được tiến hành sau khi đã xác định được một vài hệ số kỹ thuật phù hợp Dùng 250 mg, 500 mg, 750 mg MgCO3

cho vào hỗn hợp lúc đồng nhất mẫu Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần Khi tiến hành thí nghiệm thì các yếu tố như: nhiệt độ ủ, thời gian ủ, nồng độ, dung môi và các điều kiện khác của thí nghiệm không đổi

Thí nghiệm cải thiện quá trình chiết tách chlorophyll bằng cách bổ sung MgCO3 vào công đoạn nghiền của quá trình chiết tách Ta lần lượt thêm 250 mg, 500

mg, 750 mg MgCO3 khi tiến hành nghiền rong, sau khi nghiền ta ủ rong với dung môi thích hợp rồi tiến hành đo độ hấp thu của chlorophyll thu được, đánh giá kết quả thu được để xác định lượng MgCO3 cần thiết và hiệu quả chiết tách khi bổ sung thêm MgCO3

3 4.3 Phương pháp tính toán

3.4.3.1 Xác định độ hấp thu cực đại

Xác định độ hấp thu cực đại của chlorophyll bằng máy quang phổ kế

a Xác định bước sóng để đo độ hấp thu:

Trong trường hợp dung môi là acetone Theo như một số tài liệu tham khảo thì:

bước sóng 664 nm, và 646 nm là hai bước sóng thích hợp để đo độ hấp thu (Nguyễn Hoàng Yến, 2009) Theo Robert J Porra (2001) thì bước sóng dùng để đo độ hấp thu của chlorophyll là 663,6 nm và 646,6 nm

Bước sóng được chọn trong thí nghiệm của chúng tôi là 664 nm, và 646 nm để

đo độ hấp thu của chlorophyll khi sử dụng hai dung môi là acetone và ethanol

Trong trường hợp dung môi là methanol Theo Robert J Porra (2002) đã dùng hai bước sóng là 665,2 nm và 652 nm để đo độ hấp thu của chlorophyll

Bước sóng được chọn trong thí nghiệm của chúng tôi là 665 nm và 652 nm để

đo độ hấp thu của chlorophyll

b Xác định độ hấp thu

Lấy 3 ml chlorophyll mẫu pha loãng 5 lần, lấy 3,5 ml dung dịch pha loãng cho vào ống Cuvet đo độ hấp thu bằng máy quang phổ Đối với dung môi là acetone thì

tiến hành đo độ hấp thu ở hai bước sóng là 664 nm, 646 nm Quá trình lặp lại 3 lần Đối với dung môi là methanol và ethanol thì tiến hành đo độ hấp thu ở hai bước sóng

là 665 nm, và 652 nm Quá trình lặp lại 3 lần

3.4.3.2 Phương pháp xác định nồng độ chlorophyll

a Dung môi là acetone

Bước sóng dùng để xác định độ hấp thu của chlorophyll là : 664 nm và 646 nm Công thức tính hàm lượng chlorophyll được xác định theo phương pháp của Nguyễn Hoàng Yến (2009) và Robert J Porra (2002), ở mục 2.7.1.2

b Dung môi là methanol

Đối với dung môi là methanol thì hai bước sóng dùng đo độ hấp thu là 652 nm

và 665 nm Công thức tính hàm lượng chlorophyll được xác định theo phương pháp của Robert J Porra (2002), ở mục 2.7.1.2

c Dung môi là ethanol

Theo M Henriques và ctv (2007) thì hàm lượng chlorophyll được tính giống nhau bởi cùng công thức của Kaczmar (2004), đối với hai dung môi là acetone và ethanol

[Chloa+b]= (11,64 A663 – 2,16 A645 – 0,10 A630)v/(lV) µg / ml

Với:

- v: Lượng dung dịch trong mỗi lần đo độ hấp thu, ml

- l: Độ dài ánh sáng quang phổ xuyên qua, cm

- V: Lượng dung dịch mẫu

Trong nghiên cứu này tôi dùng phương pháp của Robert J Porra (2002), mục 2.7.1.2

để tính hàm lượng chlorophyll Hai bước sóng mà chúng tôi dùng khảo sát là 664 nm

và 646 nm

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm khảo sát nồng độ và dung môi sử dụng trong quá trình chiết tách chlorophyll

Hàm lượng chlorophyll chiết tách được phụ thuộc vào quá trình phá vách tế bào của nguyên liệu, tiêu chuẩn của hóa chất, độ chính xác của máy dùng trong quá trình chiết tách, và tính chất của nguyên liệu như nguyên liệu khô hay tươi, làm lạnh hay không làm lạnh…theo tất cả sự tương quan trên thì hàm lượng chlorophyll tăng lên trong quá trình ly trích khi các thiết bị, tính chất vật lý của nguyên liệu, phương pháp nghiền hỗ trợ cho việc phá vách tế bào đạt hiệu quả, nguyên liệu được ủ lạnh và giữ lạnh trong lúc nghiền bằng máy nghiền

Trong mỗi loại rong, tảo khác nhau thì hàm lượng chlorophyll trong chúng cũng khác nhau Đối với những loài khác nhau thì việc ly trích chlorophyll phải dùng những loại dung môi thích hợp để mang lại hiệu quả cao hơn Trong cùng một loại rong thì việc sử dụng các loại dung môi khác nhau thì ta thu được hàm lượng chlorophyll cũng khác nhau Qua thí nghiệm chúng tôi sử dụng rong Porphyra sp để ly trích

chlorophyll bằng 3 loại dung môi khác nhau là acetone, methanol, ethanol

a Dung môi acetone

Bảng 4.1 Hàm lượng (µg / l) chlorophyll thu được ở các nồng độ khác nhau của dung môi acetone

Nồng độ dung môi n Hàm lượng chlorophyll (µg / l)

(Ghi chú: các ký h iệu giống nhau trên cùng một cột biểu thị sai khác không có ý nghĩa

về mặt thống kê, ở độ tin cậy 95%)

Bảng 4.1 cho thấy nồng độ acetone 80% cho kết quả trích ly tốt hơn so với 70%

và 90% Hàm lượng chlorophyll thu được ở nồng độ acetone 80% là 28,9 µg / l, kết quả là khá thấp Chlorophyll là hợp chất không tan trong nước vì vậy trong quá trình chiết tách nếu sử dụng càng nhiều nước thì lượng chlorophyll hòa tan trong dung dịch càng thấp, điều này có thể giải thích tại sao khi dùng dung môi là acetone ở nồng độ 70% thì hàm lượng chlorophyll lại thấp hơn acetone ở nồng độ 80%, mặc khác theo J Barrett và S W Jeffrey (1964) thì enzym chlorophyllase trong dung dịch acetone ở nồng độ 70% hoạt động mạnh hơn ở nồng độ 80% và 90%, vì vậy việc chlorophyll chuyển sang các dạng đồng phân của nó ở nồng độ acetone 70% diễn ra mạnh mẽ hơn dẫn đến hàm lượng chlorophyll chiết tách được ít hơn hai nồng độ acetone 80% và 90%

Ở nồng độ acetone 90% enzym chlorophyllase vẫn hoạt động do đó một lượng chlorophyll cũng bị biến đổi sang dạng khác và bị mất đi (Barrett và Jeffrey, 1964), hơn nữa hiệu quả phá vỡ màng tế bào không tốt nên hàm lượng chlorophyll chiết tách được không cao Do đó hàm lượng chlorophyll thu được không cao (27,6 µg / l) khi sử

dụng acetone ở nồng độ 90% để ly trích từ rong porphyra sp

Hình 4.1 Chlorophyll ly trích bằng acetone ở các nồng độ 70%, 80%, 90%