QUY TRÌNH CHẨN đoán BỆNH PHÙ ở lợn DO VI KHUẨN ECOLI

Khi có stress đặc biệt là khi thay đổi chế độ dinh dưỡng, những chủng E.coli chủng có nhân tố bám dính Fimbriae 18 F18 nhân lên trong ruột non và bám vào thành ruột... - Trên môi

10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 729-2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH PHÙ Ở LỢN

DO VI KHUẨN E COLI

H N i - 2006à Nội - 2006 ội - 2006

TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 729 – 2006

QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH PHÙ Ở LỢN

DO VI KHUẨN E COLI

(Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN ngày tháng 5 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)

1 Phạm vi áp dụng:

Áp dụng cho các cán bộ thú y để chẩn đoán bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli gây ra

2 Khái niệm bệnh

Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E coli có yếu tố bám dính F18 và có khả năng sản sinh độc

tố verotoxin 2e gây ra Khi có stress đặc biệt là khi thay đổi chế độ dinh dưỡng, những chủng

E.coli chủng có nhân tố bám dính Fimbriae 18 (F18) nhân lên trong ruột non và bám vào

thành ruột Các vi khuẩn này sản sinh độc tố Verotoxin (VT2e), độc tố này được hấp phụ vào

máu và đến các tế bào biểu mô của các vi mạch quản làm cường thẩm thấu qua mạch quản gây

ra phù và các triệu chứng thần kinh điển hình như: Đi lại loạng choạng, xiêu vẹo hay ngã, có khi co giật

3 Máy móc - dụng cụ - môi trường - hoá chất - nguyên liệu

3.1 Máy móc và dụng cụ

- Tủ lạnh

- Tủ ấm 370C

- Tủ sấy

- Lò vi sóng

- Nồi hấp ướt

- Cân điện

- Kính hiển vi phóng đại 1000 lần

nghiệm, pipet, lam kính.

- Các dụng cụ khác: Panh, kéo, dao cắt, que cấy, đèn cồn, bút viết kính, bông thấm nước, bông không thấm nước, khăn bông hoặc giấy thấm mềm

- Dụng cụ đo pH

3.2 Hoá chất

- Cồn Ethylic

- Cồn Methylic – cồn isomylic

- Xylen

- Natri hydroxyt

- Natribicarbonat

- Nước cất

- Dầu soi kính

- Bộ thuốc nhuộm Gram (xem phụ lục 1)

- Thuốc thử Kovacs (xem phụ lục 1)

- Thuốc thử Voges-Prskauer (xem phụ lục 1)

- Methyl red

3.3 Môi trường và nguyên liệu

- Thạch máu cơ bản (Blood agar base)

- Thạch MacConkey (hoặc thạch Brilliant green)

- Môi trường VP-MR

- Nước peptone

- Môi trường Cimon Citrate

- Máu bò, bê hoặc cừu

- Bộ kháng huyết thanh E.coli chuẩn của lợn

- Kháng nguyên F18

- Cặp mồi (primer) phát hiện yếu tố bám dính F18

- Cặp mồi (primer) phát hiện gene vt2e (yếu tố độc lực VT2e)

- Các nguyên liệu cần thiết cho PCR

4 Phương pháp chẩn đoán

Sơ đồ chẩn đoán bệnh phù do vi khuẩn E coli

Sơ đồ chẩn đoán bệnh phù do vi khuẩn E coli

Mæ kh¸m KiÓm tra bÖnh tÝch

BÖnh phÈm

4.1.Đặc điểm dịch tẽ

- Bệnh thường xuṍt hiện trước và sau khi cai sữa

- Bệnh xuṍt hiện lẻ tẻ, ít lõy lan từ đàn này sang đàn khỏc và thường trong điờ̀u kiện nuụi dưỡng tốt

- Lợn bị bệnh thường là những con phỏt triển nhanh nhṍt trong đàn

- Tỉ lệ chết khoảng 65%

4.2 Triệu chứng lõm sàng

- Một hoặc nhiờ̀u lợn bị chết đột ngột mà khụng biểu hiện triệu chứng lõm sàng

- Thõ̀n kinh rối loạn bao gụ̀m: đi lại loạng choạng, xiờu vẹo hay ngã, có khi co giọ̃t

- Phù ở mí mắt, ở mặt, phõ̀n bụng phù và sưng to

- Thở khó, kờu khàn khàn do thanh quản bị phù

- Lợn có biểu hiện bỏ ăn, bỏ bú Hiện tượng này có thẻ kéo dài trong nhiờ̀u ngày

- ỉa chảy, phõn lỏng có khi toàn nước hoặc lõ̃n cục mỏu tươi

- Lợn thường chết trong vòng từ 4 giờ đến 48 giờ sau khi có triệu chứng lõm sàng

4.3 Bệnh tích

- Phù dưới da toàn thõn

- Phù ở mí mắt, kết mạc, đường cong lớn dạ dày

- Có dịch nhõ̀y ở dưới niờm mạc dạ dày

- Tràn dịch màng tim, màng phụ̉i, xoang bụng tích nước

- Mỏu đặc sõ̃m, phụ̉i viờm, gan sưng , tim nhão, hạch ruột viờm toàn bộ

4.4.Phương phỏp chõ̉n đoỏn trong phòng thí nghiệm

4.4.1 Lṍy mõ̃u

- Dụng cụ lṍy mõ̃u: lọ thuỷ tinh, bình tam giỏc hoặc túi nilụng vụ trùng

- Bệnh phõ̉m: Lṍy vụ trùng phủ tạng, hạch màng treo ruột, ruột non mụ̃i loại cho vào từng lọ riờng biệt đọ̃y kín và đưa ngay vào phòng xét nghiệm càng nhanh càng tốt Nếu phòng thí nghiệm ở xa, bệnh phõ̉m phải được bảo quản trong đIờ̀u kiện lạnh từ 20C đến 80C và gửi vờ̀ phòng xét nghiệm chọ̃m nhṍt 48h sau khi lṍy mõ̃u

4.4.2 Nuụi cṍy, phõn lọ̃p giỏm định vi khuõ̉n

4.4.2.1 Nuụi cṍy, phõn lọ̃p

Phân lập, giám định sinh

hoá, KHV

Kết luận

Định týp huyết thanh Xác định yếu tố độc lực

F18 và VT2

4.4.2.2 Giám định đặc tính sinh hoá

Một số đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn E.coli

- Trên môi trường thạch MacConkey khuẩn lạc E.coli có màu hồng đậm, nhám, đường

kính 2-4 mm

- Trên môi trường thạch Brilliant green khuẩn lạc E.coli màu vàng và môi trường trở nên

vàng chanh

- Thạch máu: E coli gây bệnh phù thường gây dung huyết thạch máu Khuẩn lạc màu

trắng xám, tròn, bóng

- Kiểm tra hình thái vi khuẩn trên kính hiển vi:

Lấy que cấy chấm vào khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch máu, hòa vào gịot nước sinh lý trên phiến kính hoặc lấy một vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn giàn mỏng trên phiến kính, để khô, rồi cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn

Tiêu bản sau khi đã được cố định, nhuộm bằng phương pháp Gram (Phụ lục 4) Xem tiêu bản bằng vật kính dầu 100X

Vi khuẩn bắt mầu đỏ (màu Gram âm), dạng trực khuẩn ngắn, cầu khuẩn hoặc hình bầu dục, đứng rải rác, không thành chuỗi

- Sau khi kiểm tra hình thái trên kính hiển vi, cấy khuẩn lạc vào môi trường thạch McConkey

- Chọn khuẩn lạc có mầu hồng đậm trên thạch McConkey cấy vào môi trường nước thịt hay nước peptone để tiếp tục kiểm tra các đặc tính sinh hóa

- Phản ứng IMViC

IMViC = sinh Indol, methyl red (MR), Voges-Proskauer (VP) và citrate)

Từ những khuẩn lạc có màu hồng đậm trên thạch MacConkey và gây dung huyết trên

thạch máu, tiến hành làm phản ứng IMViC

Vi khuẩn E coli có IMViC= +/ + /

-/-+ Sinh Indol: cấy khuẩn lạc vào môi trường nước peptone hay môi trường có chứa

tryptophan, nuôi ở 370C từ 18 giờ đến 24 giờ Nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs vào

môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn, nếu trên bề mặt môi trường có vòng màu đỏ ở là phản ứng dương tính

+ VP: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 370C sau 24 giờ nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt thuốc thử VP (xem phần phụ lục), đọc kết quả sau 2 giờ phút, nếu có màu đỏ hồng là dương tính, không biến màu hoặc màu vàng là âm tính

+ MR: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 370C sau 24 giờ nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch đỏ methyl trong cồn 950 (xem phần phụ lục), đọc kết quả sau 5 phút, nếu có màu đỏ là phản ứng dương tính, có màu vàng là âm tính

+ Citrate: kiểm tra sự sử dụng citrate của vi khuẩn Cấy khuẩn lạc vào thạch simon citrate

nuôi ở 370C từ 18 giờ đến 24 giờ Vi khuẩn sử dụng citrate (dương tính) làm môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển Âm tính khi môi trường giữ nguyên màu xanh lá cây

4.4.2.3 Kiểm tra khả năng sản sinh độc tố F18 và VT2e

huyết

Kiểm tra yếu tố bám dính F18 bằng phản ứng Polymerase chain reaction (PCR) hay ngưng

kết nhanh trên phiến kính

- Kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với kháng nguyên F18

+ Để tìm yếu tố bám dính F18, nuôi cấy vi khuẩn E coli trên môi trường Minca hoặc

+ Lấy khuẩn lạc, hoặc vi khuẩn trong các canh trùng nuôi cấy làm phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với kháng nguyên F18 theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- PCR để phát hiện gene f18 sản sinh yếu tố bám dính F18

4.4.2.4 Kiểm tra khả năng sản sinh độc tố Verotxin

- Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng

+ Tiêm 2 chuột nhắt trắng mỗi con 0,2 ml canh trùng nuôi cấy tĩnh (không lắc) Nếu có độc lực chuột chết sau 24 giờ

- Dùng phản ứng PCR phát hiện gene vt2e (yếu tố độc lực VT2e - Nếu có điều kiện)

5 Kết luận

Dựa trên đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và kết quả chẩn đoán trong phòng thí nghiệm:

- Phân lập, giám định đặc tính sinh hoá

- Kiểm tra yếu tố độc lực F18 và VT2e

KT BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG

Bùi Bá Bổng

Phụ lục Phụ lục 1: Nhuộm gram

1 Thuốc nhuộm

a Dung dịch kết tinh tím

b Dung dịch fuscin mẹ

Pha loãng dung dịch mẹ theo tỉ lệ 1/10 với nước cất khi nhuộm

c Dung dịch lugol

d Cồn axeton

2 Cách nhuộm

- Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: 1 phút đến 2 phút

- Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

- Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút

- Rửa nước nhanh, vẩy khô

- Nhỏ cồn Axeton

- Rửa nước thật nhanh

- Nhỏ dung dịch fucsin loãng: Để 1 phút

- Rửa nước

- Thấm khô Sấy khô

3 Xem kính bằng vật kính dầu

- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím

- Vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ

Phụ lục 2: Thuốc thử Kovacs

a- Paradimetylaminobenzaldehyte 2,5 g

Cách pha: Hoà dung dịch a vào b cho tan hết và để trong tử lạnh âm 40C Thêm 5ml đến

10 ml HCL từ từ hoà đều rồi để tủ lạnh cho lạnh lại tiếp tục đổ HCL cho đủ lượng

* Thuốc thử không được để quá nóng trong lúc pha chế Bảo quản trong lọ màu, lạnh

Dương tính: Vòng thuốc thử có màu đỏ

Âm tính: Vòng thuốc thử có màu vàng

Phụ lục 3: Thuốc thử phản ứng VP

Chế thuốc thử

- Dung dịch 1: Alpha-naphthol 5g

Cồn 96 100 ml

- Dung dịch 1: NaOH 40g

Nước cất 100 ml

Tiến hành phản ứng: cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP – MR, nuôi cấy ở

370C từ 24 giờ đến 48 giờ, sau đó nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch 1 và 2 Sau 5 phút có màu đỏ hồng là phản ứng dương tính Không biến màu hoặc màu vàng là phản ứng âm tính

Phụ lục 3: Thuốc thử phản ứng MR

Đỏ methyl 0,04g

Cồn 95 60 ml