Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng trọng xử lyus nước thải hữu cơ

vnVIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG S

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d vn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYM NHẰM ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngư ời hư ớng dẫn k hoa h ọc: TS Ng u yễ n Th ế Trang

Hà Nội, tháng 12 năm

2014

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Đà, Phạm Thị Thu Phương, Lê

Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thúy Nga, Lê Quang Sáng, Phạm Văn Duy (2014).Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại một số chủng vi khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp xenlulaza phân lập từ nước thải sau hầm biogas Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30,6S.

2 Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thúy Nga, Phạm Văn Duy (2014) Ứng

dụng một số chủng vi khuẩn xử lý nước thải giàu hữu cơ sau hầm biogas, Tuyển tập báo cáo khoa học, Hội thảo khoa học quốc tế “Năng lượng và tăng trưởng xanh khu vực ASEAN”, Hà

Nội 2014 Nhà xuất bản Khoa học tư nhiên và Công nghệ.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

MỞ ĐẦU

Cùng với sư phát triển của các nhà máy chế biến nông sản (đồ hộp từ dứa, dưa chuột bao tử, cà chua, ngô ngọt ) một vấn đề đang làm bức xúc các nhà sản xuất đó là: nước thải, phế thải từ các quá trình chế biến Chất thải của các nhà máy chế biến đồ hộp rau quả có hàm lượng các chất hữu cơ rất cao (các loại đường đơn, axit hữu cơ, protein, xenluloza …), đây là nguồn dinh dưỡng thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật sinhtrưởng Sư sinh trưởng của các vi sinh vật trong môi trường nước thải giàu hữu cơ từ nông sản khi không có sư kiểm soát của con người thường tạo ra các sản phẩm có mùi hôithối tác động xấu tới môi trường sinh thái Do vậy, các chất thải cần phải được xử lý trước khi thải ra môi trường tư nhiên Có nhiều phương pháp xử lý nước thải hữu cơ khác nhau như: Phương pháp cơ học, hóa học, hóa lý và sinh học Đối v ới nước thải hữu

cơ thì phương pháp xử lý sinh học sẽ có hiệu quả hơn, thân thiện với môi trường hơn, cónhiều ưu điểm cả về hiệu quả kinh tê và ky thuật Trong các nghiên cứu xử lý nước thải thì việc dùng biện pháp sinh học đang là ưu tiên hàng đầu Viêc phân huy chât hưu cơ dưa trên cac vi sinh vât tư nhiên co săn trong nươc thai con găp nhiêu han ch ế như thời gian phân hủy lâu, quá trình phân huy chưa triêt đê Do đo, cân tuyên chon nhưng chung

vi sinh vật (VSV) thích hợp bổ sung vào bên cạnh những VSV có sẵn để có thế giúp cho quátrình xử

lý đạt kết quả tốt hơn [1] Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số

chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng trong

xử lý nước thải hữu cơ” được thưc hiện là cần thiết.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ TRÊN THẾ

GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.1.1 Tình hình nghiên cứu xử lý nước thải hữu cơ trên thế giới

Sư phát triển của phương pháp thứ cấp để xử lý nước thải trong những năm đầuthế kỷ XX được cho là cải tiến đáng kể nhất đối với y t ế cô n g c ộng và môi tr ư ờng trongsuốt thời gian này, đó là việc phát minh ra "bùn hoạt tính" cho quy trình xử lý nướcthải Gilbert Fowler và cộng sư tại Đại học Man c hester được tiến hành tại Trạm Thínghiệm Lawrence ở s sachusettsMa liên quan đến việc sục khí vào nước thải trong bình

đã được phủ một lớp tảo Các đồng nghiệp của Fowler, Edward Ardern và William Lockett,những người đã triển khai nghiên cứu cùng với Văn phòng công ty đường sôngManchester ở công trình xử lý nước thải Da v y hu l m e Thí nghiệm trên được thưc hiệntrong một lò phản ứng bằng cách hút ra và thu vào, việc xử lý cho hiệu quả cao hơn Họsục khí liên tục cho nước thải trong khoảng một tháng và kết quả đạt được là nitrat hóa

h oàn toàn các nguyên liệu mẫu Điều đó chỉ ra rằng bùn đã hoạt hóa các chất (một cáchtương tư như than hoạt tính) quá trình được đặt tên là h o ạtbùn tín h Kết quả đã đượccông bố trong công trình tại Hội thảo 1914, và lần đầu tiên một hệ thống quy mô đầy đủvới dòng chảy liên tục được lắp đặt tại Worcester hai năm sau đó Do hậu quả của chiếntranh thế giới thứ nhất phương pháp xử lý mới được truyền bá nhanh chóng, đặc biệt làHoa Kỳ, Đan Mạch, Đức và Canada [26] Vào cuối những năm 1930, việc xử lý nước thảibằng bùn hoạt tính là quá trình chủ yếu được sử dụng trên toàn thế giới Trong bùn hoạt

tính có nhiều chi vi sinh vật khác nhau : Actinomyces, Arthrobacer, Bacillus, Bacterium, Corynebacterium, Desulfotomacillium, Micrococcus,

Pseudomonas, Sarcina … Chúng oxy hóa rượu , axit beo , paraffin, hydrocacbon va các

hợp chất khác

Ở Mỹ, hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 ÷

85 mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 ÷ 35 mg/l, hàm lượng NH3

từ 12 ÷ 50 mg/l Hàm lượng photphat trong nguồn nước không ô nhiễm nhỏ hơn 0,01mg/l Theo quy định của Hà Lan, tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

photphate trong nước uống không được vượt quá 6 mg/l Theo tiêu chuẩn của cộng đồngchung châu Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphat không được vượt quá 2,18mg/l [4].

Xử lý nước thải của quá trình chế biến rau quả các nhà khoa học Thái Lan đã sử

dụng chủng nấm men Candida utlis CBS1517 có khả năng đồng hóa tốt các loại đường và

axit hữu cơ có nhiều trong thành phần nước thải, kết quả thu được cho thấy sau 96 giờ

xử lý trong điều kiện phòng thí nghiệm là COD giảm 89,9 % và pH tăng từ 3,5 lên 8,5 [36].Môt sô kêt qua nghiên cưu xư ly nươc thai chăn nuôi lơn băng qua trinh SBR hoăc tương

tư đươc tông hơp : Trong nghiên cứu của Bortone G (1992) hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR cấp nước một lần đạt khá cao, tương ứng là khoảng 93 % và 88 ÷ 93 % Tải trọng COD và T-N cũng đạt cao

lần lượt là 0,37 kg/(m3.ngày) và 0,13 kg/(m3.ngày) [28] Nghiên cứu của Chang

Won Kim (2000) hiệu quả xử lý COD ở chế độ cấp nước một lần đạt 57 ÷ 87 % Tải trọngCOD và T-N lần lượt là 1,0 kg/(m3.ngày) và 0,2 kg/(m3.ngày) [29] Quá trình sục khí luânphiên cấp nước liên tục trong nghiên c ứu của Jiang Cheng (2011) cho hiệu quả xử lý khácao, của COD là 57 %, T-N là 91 % [31] Nghiên cứu của Mohammad N (2011) với quátrình SBR cấp nước một lần cho hiệu quả xử lý COD và T-N lần lượt là 80,3 % và 61 % [34].Trong nghiên cứu của Zang và đồng tác giả (2006) cho hiệu quả xử lý cao hơn cả, đối với

cả COD và T-N tương ứng là 96,3 % và 97,5 %; tải trọng COD và T-N cũng đạt rất cao lầnlượt là 2,1 kg/(m3.ngày) và

0,28 kg/(m3.ngày), nước thải trong nghiên cứu này có COD và tỉ lệ COD/T-N rất

cao và các tác giả đã đưa thêm các giai đoạn kỵ khí vào trước và giữa các giai đoạn thiếukhí/hiếu khí, do đó đã nâng cao được tải trọng xử lý COD Mặt khác, các tác giả đã thưcnghiệm ở thời gian lưu tương đối lớn, tỉ lệ COD/T-N và tỉ lệ lưu nước (n=9) rất cao, vì vậycũng đã nâng cao được hiệu suất xử lý T-N [38]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu xử lý nước thải hữu cơ ở Việt Nam

Xử lý nước thải hiện nay luôn là vấn đề thời sư nóng bỏng và nổi cộm ở Việt Namhiện nay, theo dư báo của Tổ chức Kinh tế thế giới thì Việt Nam sẽ là một trong nhữngnước có tốc độ phát triển kinh tế vào loại nhanh trên thế giới với tốc độ

tăng trưởng được dư báo là 7 % trong thập kỷ tới Tuy nhiên, việc tăng trưởng kinh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

tế một cách nhanh chóng và mạnh mẽ cũng đồng thời tạo nên những thách thức áp lưctác động về mặt môi trường, trong đó, tác động của chất thải rắn và nước thải đang là vấn

đề nổi cộm ở Việt Nam

Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ở ViệtNam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới Theo báo cáo môi trường Quốc gia năm 2010của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm môi trường nướcmặt ở tất cả các chỉ số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theo QCVN 40:2011/BTNMT.Các chỉ số COD, BOD đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 ÷ 10 lần Hàm lượng NH4+ trong môitrường nước mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông Cầu đều vượt quy chuẩn cho phépQCVN 40:2011/BTNMT cho nước mặt phù hợp với việc bảo tồn động thưc vật thủy sinh là

Với xu hướng hội nhập nền kinh tế quốc tế, đặc biệt từ khi Việt Nam gia nhậpWTO, cùng với sư phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghiệp hoá đất nước, chấtthải công nghiệp cũng đang ngày một gia tăng về khối lượng, đa dạng về chủng loại vàđang là vấn đề cấp bách của xã hội, đòi hỏi phải có nhận thức đúng đắn và đầu tư thíchđáng cho vấn đề xử lý nước thải Hiện nay công nghệ xử lý nước thải bị ô nhiễm cáchợp chất hữu cơ trên thế giới và Việt Nam chủ yếu là sử dụng các biện pháp sinh học,trong đó phương pháp xử lý hiếu khí và xử lý kị khí là phổ biến nhất, với nguồn nước thải

có mức độ ô nhiễm cao thông thường người ta xử lý kết hợp kị khí và hiếu khí Kết quảnghiên cứu của Vũ Thúy Nga và các cộng

sư cho thấy có thể cải thiện chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

phẩm vi sinh vật Để nhằm khắc phục tình trạng ô nhiễm do nước thải chế biến tinh bộtsắn, công trình nghiên cứu tập trung tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có hoạt tính sinhhọc cao, sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để nâng cao hiệu quả xử lý nước thảisau biogas của nhà máy chế biến tinh bột sắn Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được 3

chủng vi sinh vật gồm Bacillus velezensis, Streptomyces fradiae và Nitromonas sp có khả

năng chuyển hóa tốt hợp chất hữu cơ trong nước thải chế biến tinh bột sắn [15] Nghiêncứu về ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly- photphat trong xử lý nước thải của Lê QuangKhôi và các cộng sư cho thấy các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được tuyển chọn có hiệu

suất loại bỏ photphat hòa tan cao Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia

sp.TGT025L có hiệu quả loại bỏ PO43- cao nhất trong môi trường tổng hợp sau 25

giờ thí nghiệm Sư loại bỏ PO43- được thưc hiện bởi hoạt động của gen ppk 1 dạng IIA

trong quá trình chuyển hóa photphat thành dạng poly-P tích lũy trong tế bào Kết quảnghiên cứu mang lại nhiều triển vọng ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P trên để xử

lý photpho hòa tan trong nước thải chăn nuôi [14]

Với mục đích nghiên cứu phát triển công nghệ xử lý hiệu quả đồng thời hữu cơ vàchất dinh dưỡng trong nước thải ngành chăn nuôi lợn, trong nghiên cứu của Phạm ThịHải Thịnh và đồng tác giả, đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện vận hànhnhư tỷ lệ COD/T-N (tỉ lệ giữa nhu cầu oxy hóa học và tổng nitơ) và chế độ sục khí đếnhiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR đối với nước thải chăn nuôi đã qua xử lý

kị khí Với chế độ hai chu trình thiếu - hiếu khí thích hợp, hiệu quả xử lý COD và T-N đạtkhá cao, tương ứng là khoảng 90 % và 80 ÷

85 % [12] Tuy nhiên nồng độ T-N trong nước thải chăn nuôi lợn là rất cao và thay đổitrong khoảng khá rộng, vì vậy nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lý nitơ của quá trìnhnhằm đáp ứng một cách ổn định các quy chuẩn xả thải là rất cần thiết Theo Phan ĐỗHùng và cộng sư cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cấp nước thải đến hiệu quả xử lý của quátrình SBR hai chu trình thiếu - hiếu khí cấp nước hai lần và so sánh với chế độ cấp nướcmột lần Với quá trình SBR hai chu trình thiếu-hiếu khí, cấp nước hai lần là một giải pháp

để nâng cao hiệu quả xử lý T-N của quá trình Thưc

nghiệm cho thấy, khi tăng tỉ lệ cấp nước (tỉ lệ giữa lượng nước thải cấp lần thứ nhất

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

và tổng lượng nước thải xử lý trong một mẻ), lúc đầu hiệu suất xử lý T-N sẽ tăng, tuynhiên đến một giới hạn nhất định hiệu suất xử lý T-N sẽ giảm trở lại Hiệu suất xử lý T-N ở

cả ba tỉ lệ cấp nước nghiên cứu đều khá cao, trong đó ở tỉ lệ 2/3 đạt cao nhất, trongkhoảng 85 ÷ 90 % Hiệu suất xử lý T-N thưc nghiệm ở các tỉ lệ cấp nước thấp 1/2 và2/3 khá phù hợp với hiệu suất lý thuyết Hiệu suất xử lý COD ở chế độ cấp nước hai lầncũng khá cao, 85 ÷ 90 % ở tỉ lệ cấp nước 2/3, xấp xỉ với trường hợp cấp nước một lần [5]

1.2 THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA NƯỚC THẢI HỮU CƠ

1.2.1 Xenluloza trong nước thải

Trong nước thải hữu cơ hàm lượng chiếm xenluloza là thành phần chủ yếu của các

tổ chức thưc vật Trong xác thưc vật (nhất là trong thân và rễ) thành phần hữu cơ chiếm

tỷ lệ cao nhất bao giờ cũng là xenluloza Hàm lượng xenluloza trong thưc vật thường thayđổi trong khoảng 30 ÷ 80 % (tính theo trọng lượng khô), trong sợi bông hàm lượng nàythường vượt trên 90 % [30]

Xenluloza là polysaccarit rất bền vững, được cấu tạo bởi rất nhiều gốcanhydroglucoza, liên kết với nhau nhờ dây nối β-1,4-glucozit Mỗi phân tửxenluloza thường chứa từ 1.400 đến 10.000 gốc glucoza Khối lượng phân tử xenlulozarất khác nhau phụ thuộc vào từng loại thưc vật (ở bông 150.000 ÷

1.000.000, ở sợi gai lên tới 1.840.000) Trên mỗi chuỗi glucan đơn vị lặp lại không phải là

glucoza mà là xenlobioza Mỗi phân tử glucoza có dạng “ghế bành”, phân tử này quay

180o so với phân tử và vị trí β của các nhóm hydroxyl đều ở mặt phẳng nằm ngang củaphân tử

Xenluloza có cấu trúc lớp sợi song song, các phân tử và các chuỗi xenluloza gắn vớinhau nhờ mạng lưới liên kết hydro, còn các lớp gắn với nhau nhờ lưc Van- der-Van Trong

tư nhiên, các chuỗi glucan của xenluloza có cấu trúc dạng sợi, đơn vị sợi nhỏ nhất cóđường kính khoảng 3 nm Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có đường kính từ 10 ÷ 40

nm, những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học.Toàn bộ lớp sợi này có một lớp vỏ hemixenluloza và

lignin rắn chắc bao bọc bên ngoài Phân tử xenluloza có cấu trúc không đồng nhất

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

gồm hai vùng: Vùng kết tinh có trật tư cao, rất bền vững và vùng vô định hình kém trật tư

và bền vững hơn Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn vùng kết tinhmạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sư trương này Xenluloza có cấu trúc đặc, bềnchắc cùng với sư có mặt của lớp vỏ hemixenlulo-lignin khiến cho sư xâm nhập của enzymvào cấu trúc hết sức khó khăn và làm tăng tính kỵ nước của chuỗi β-1-4-glucan, làm cảntrở tốc độ của phản ứng thủy phân

Xenluloza là hợp chất cacbon chiếm tỷ lệ trọng lớn nhất (50 %) trong tổng sốhydratcacbon tư nhiên và là thành phần hữu cơ chủ yếu của rác, trong giấy, gỗ, thân cây,cành cây, lá cây, rơm rạ, sợi đay, vải bông, vv…

Hình 1.1 Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza [30]

Mầu nâu - cacbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro

Xenluloza có cấu trúc rất bền vững Không tan trong nước, không bị tiêu hóa trongđường tiêu hóa của người và động vật Trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất cónhiều vi sinh vật có khả năng phân giải được xenluloza

1.2.2 Hemixenluloza trong nước thải

Trong tế bào thưc vật hemixenluloza đứng thứ hai về khối lượng Trong thànhphần của hemixenluloza có nhiều loại đường khác nhau, chính vì vậy tên của chúngthường được gọi theo tên của một loại đường chủ yếu nào đó có trong thành phần củachúng Khối lượng phân tử của hemixenluloza nhỏ hơn rất nhiều so với xenluloza, thườngchúng chỉ có khoảng 150 gốc đường Các gốc đường đơn này được nối với nhau bằng cácliên kết β-1-4, β-1-3, β-1-6 glucozit Các hemixenluloza thường tạo mạch ngắn và phânnhánh, so với xenlulo thì hemixenluloza có cấu trúc không chặt chẽ dễ bị phân giải bởiaxit yếu và kiềm yếu, đôi khi còn bị phân giải

trong nước nóng [30]

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

1.2.3 Protein trong nước thải

Protein là hợp chất cao phân tử chứa nitơ (15 ÷ 17 % tính theo trọng lượng khô).Protein là thành phần quan trọng của cơ thể động, thưc vật Sư phân giải protein trải quacác quá trình thuỷ phân protein thành các polypeptit, sau đó là các axit amin, tiếp theo làcác quá trình amon hoá, nitrat hoá và phản nitrat hoá Quá trình amon hoá là quá trìnhchuyển hoá các hợp chất nitơ hữu cơ thành nitơ dạng khoáng Quá trình nitrat hoá là quátrình chuyển hoá các chất ammoniac ban đầu thành axit nitơ sau đó thành axit nitric Quátrình khử nitrat thành nitơ gọi là phản nitrat hoá[ 16]

1.2.4 Tinh bột trong nước thải

Tinh bột là một cacbonhyđrat cao phân tử bao gồm các đơn vị D-glucoza nối vớinhau bởi liên kết α-glucozit Công thức phân tử gần đúng là (C6H10O5)n trong đó n cógiá trị từ vài trăm đến khoảng mười nghìn Tinh bột có dạng hạt màu trắng tạo bởi hai loạipolyme là amiloza và amilopectin Amiloza là polime mạch thẳng gồm các đơn vị D-glucoza liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucozit Amilopectin là polime mạch nhánh,ngoài chuỗi glucoza thông thường còn có những chuỗi nhánh liên kết với chuỗi chínhbằng liên kết α-1,6-glucozit

Trong tư nhiên, tinh bột là thành phần chủ yếu của các loại ngũ cốc, củ, quả.Hàm lượng tinh bột có trong hạt và củ là 40  70 %, trong các phần khác của cây là

4  25 % Chúng đóng vai trò là nguồn dư trữ năng lượng cho quá trình nảy mầm củahạt, và là nguồn lương thưc chủ yếu của con người Enzym thủy phân tinh bột phân hủychủ yếu liên kết α-glucozit Nhóm enzym này gồm các enzym: α-amylaza, β-amylaza,glucoamylaza, dextrinaza [16]

1.2.5 Một số vi sinh vật gây bệnh khác trong nước thải

Các

vi sinh v ật g â y b ệ nh chủ y ếu tro n g n ư ớc thải: Salmonella spp., một vài loài Salmonella có thể hiện hiện trong nước thải đô thị, kể cả S typhi (gây bệnh thương hàn) Doran và cộng sư cho rằng số lượng 700 Salmonella/l; khoảng chừng đó Shigellae

và khoảng 1.000 Vibrio cholera/l thường phát hiện trong nước thải đô

thị của khu vưc nhiệt đới Shigellae và Vibrio cholera nhanh chóng chết đi khi thải

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

ra môi trường Do đó nếu chúng ta sử dụng một biện pháp xử lý nào đó để loại được

Salmonella thì cũng có thể bảo đảm là phần lớn các vi khuẩn kia đã bị tiêu diệt Enteroviruses: Có thể gây các bệnh nguy hiểm như sởi, viêm màng não Số lượng của

chúng tương đối thấp hơn enteroviruses Người ta đã chứng minh được rằng việc loại bỏcác loài vi rút có quan hệ mật thiết với việc loại bỏ các chất rắn lơ lửng Ngoài vi sinh vậtgây bệnh còn có một số ký sinh trùng: thường thì các bệnh ký sinh trùng chủ yếu là do

Ascaris lumbricoides, trứng của loài ký sinh trùng này có kích thước lớn (45  70 m  35

 50 m)

1.3 VI SINH VẬT PHÂN GIẢI NƯỚC THẢI HỮU CƠ

1.3.1 Vi sinh vật phân giải xenluloza

Xenlulaza đươc thu tư nhiêu nguôn nguyên liêu khac nhau như đông vât (các nhóm thân mềm, lơn, bò, gà); thưc vât (trong hat ngu côc nay mâm la đai mach , yên mạch, lúa mì, mạch đen ) và vi sinh vật (nâm sơi , nâm men , xạ khuẩn và vi khuẩn ) Tuy nhiên, vi sinh vât la nguôn thu enzym chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đươc nhiêu lân trong năm va chu đông sư dung nguôn nguyên liêu re tiên đê nuôi cũng như dễ dàng điều khiể n co đinh hương nguôn enzym hoăc gia tăng lương enzym Có rất nhiềuchủng vi khuẩn , xạ khuẩn , nâm môc va môt sô loai nâm men có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza

Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lân ki khi đêu co kha năng sinh xenlulaza như Bacillus subtlis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis, Acidothermus cellulobutcus Ngoài

ra còn có các loài ưa kiềm như Cephalosporium sp.RYM-202 [9].

1.3.2 Vi sinh vật phân giải hemixenluloza

Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza Các vi sinh vật cókhả năng phân giải xenluloza khi sản sinh ra xenlulaza thường sinh ra hemixenlulaza Một

số loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza như: Bacillus, Aspergillus, Clostridium, Streptomyces

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

1.3.3 Vi sinh vật phân giải protein

Dưới tác dụng của các vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành các axitamin Các axit amin này lại được một số nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3 hoặc NH4+gọi là nhóm vi khuẩn amin hóa Quá trình này gọi là sư khoáng hóa chất

hữu cơ vì qua đó, nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng Dạng NH4+ sẽ đượcchuyển hóa thành dạng NO3-nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa

Nhóm vi khuẩn nitrat hóa bao gồm bốn chi khác nhau: Nitrosomonas, Nitrozocystc, Nitrozolobus và Nitrosospira, chúng đều thuộc loại dị dưỡng bắt buộc

[3]

1.3.4 Vi sinh vật phân giải tnh bột

Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột, đó là vi khuẩn Bacillus, Pseudomonas, Athrobacter, Achromobacter, Agrobacterium … Một số vi sinh vật có khả

năng tiết ra các loại enzym trong hệ enzym amylaza Ví dụ như một số vi nấm bao gồm

một số loại trong các chi Aspergillus, Fusarium Xạ khuẩn cũng có một số chỉ có khả

năng phân hủy tinh bột Đa số các vi sinh vật đều không có khả năng tiết ra một hoặc vàienzym trong hệ đó, chúng chỉ có khả năng tiết ra môi trường [3]

1.4 THÔNG SỐ CƠ BẢN ĐÁNH GIÁ NƯỚC BỊ Ô NHIỄM

Để đánh giá chất lượng nước cũng như mức độ ô nhiễm của nước nói chung thì córất nhiều các thông số Tuy nhiên, mỗi loại nước với thành phần các chất có trong đó mà

ta chọn những thông số thích hợp nhất rồi so sánh với tiêu chuẩn cho phép về thànhphần hóa học và sinh học đối với từng loại nước sử dụng cho các mục đích khác nhau.Các thông số cơ bản để đánh giá chất lượng nước thải hữu cơ là: pH, độ đục, các chấtrắn lơ lửng, oxy hòa tan … Đặc biệt hai chỉ số BOD và COD có ý nghĩa rất quan trọng.Theo QCVN 40:2011/BTNMT - Quy chuẩn ky thuật quốc gia về nước thải công nghiệp, một

số thông số ô nhiễm trong nước thải công

nghiệp (bảng 1.1)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

Bảng 1.1 Một số thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp [9]

Màu của nước là do:

+ Các chất hữu cơ và phần chết của thưc vật gọi là màu thưc vật, màu này rấtkhó xử lý được bằng phương pháp đơn giản Ví dụ rong tảo làm nước có màu xanh.+ Các chất vô cơ là những hạt rắn có màu gây ra, màu này có thể xử lý

Có nhiều phương pháp xác định màu của nước, nhưng thường dùng ở đây làphương pháp so màu với các dung dịch chuẩn là Chlophantinat coban Cường độ màucủa nước xác định theo phương pháp so màu khi lọc bỏ các chất vẩn đục [16]

 Mùi của nước

Nước tư nhiên sạch không mùi, nước thải và nước ô nhiễm thường có mùi khóchịu từ nhẹ đến hôi thối

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

Có thể xác định mùi của nước theo phương pháp đơn giản sau: Mẫu nước chứatrong bình có nắp đậy kín, lắc trong khoảng 10 ÷ 20 giây, sau đó mở nắp, ngửi mùi và đánhgiá: không mùi, mùi nhẹ, trung bình, nặng và rất nặng [16]

 Độ pH

pH cua nươ c thai có một ý nghĩa quan trọng trong quá trình xử lý Các công trình

xử lý nước thải áp dụng các quá trình sinh học làm việc tốt khi pH nằm trong giơi han tư 7

÷ 7,6 Môi trương thuân lơi nhât đê vi khuân phat triên l à môi trường có pH từ 7 ÷ 8 Cácnhóm vi khuẩn khác nhau có giới hạn pH hoạt động khác nhau Ví dụ vi khuẩn nitrit phát triển thuận lợi nhất với pH từ 4,8 ÷ 8; còn vi khuẩn nitrat vơi pH tư 6,5 ÷ 9,3 Vi khuân lưu huynh co th ể tồn tại trong môi trường có pH từ 1

÷ 4 Ngoài ra pH còn ảnh hưởng đến quá trình tạo bông cặn của các bể lắng bằng cách tạo bông cặn bằng phèn nhôm [21]

Nươc thai sinh hoat co pH tư 7,2 ÷ 7,6

 Nhu cầu oxy sinh hóa - BOD

BOD là nhu cầu oxy sinh hóa hay nhu cầu oxy sinh học, là lượng oxy cần thiết đểoxy hóa các chất hữu cơ dễ phân hủy có trong nước bằng VSV (chủ yếu là vi khuẩn) hoạisinh, hiếu khí [19]

Chỉ tiêu BOD là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất để xác định mức ô

nhiễm của nước Nó chỉ biểu thị lượng chất hữu cơ có thể bị phân hủy bởi VSV

Trong thưc tế không thể xác định lượng oxy cần thiết để VSV oxy hóa hoàn toànchất hữu cơ có trong nước, mà chỉ cần xác định lượng oxy cần thiết khi ủ ở nhiệt độ 20

oC trong 5 ngày ở phòng tối để tránh quá trình quang hợp, khi đó có khoảng 70 ÷ 80 % nhucầu oxy được sử dụng và kết quả được biểu thị là BOD5 [19]

 Nhu cầu oxy hóa học - COD

COD là nhu cầu oxy cần thiết để oxy hóa toàn bộ chất hữu cơ và các chất khử

có trong nước thành CO2 và H2O [19]

 Hàm lượng các chất rắn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

Các chất rắn có trong nước là: Các chất vô cơ là dạng các muối hòa tan hoặc khôngtan như đất đá ở dạng huyền phù lơ lửng Các chất hữu cơ như xác các vi sinh vật, tảo,động vật nguyên sinh, động vật phù du …, các chất hữu cơ tổng hợp như phân bón, cácchất thải công nghiệp.

Chất rắn ở trong nước gồm có: Tổng chất rắn (TS) được xác định bằng trọng

lượng khô phần còn lại sau khi cho bay hơi nước trên bếp cách thủy rồi sấy khô ở

105 oC cho đến khi trọng lượng không đổi Đơn vị tính bằng mg (hoặc g/l) Chất rắn lơlửng ở dạng huyền phù (SS) Hàm lượng các chất huyền phù là trọng lượng khô của chấtrắn còn lại trên giấy lọc sợi thủy tinh Chất rắn hòa tan (DS) Hàm lượng chất rắn hòa tanchính là hiệu số của tổng chất rắn với huyền phù: DS = TS – SS Đơn vị tính bằng g (hoặcmg) [22]

 Hàm luợng nitơ

Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni (NH4+), nitrat(NO3-), ít hơn ở dạng nitrit (NO2-) và trong một số hợp chất hữu cơ khác Thành phầnđược xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu cho môi

khuẩn nitrit hóa; NO2- sinh ra được nhóm sinh vật nitrat hóa chuyển hóa thành NO3;cuối cùng nitrat được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ quá trìnhkhử nitrat

Hiện nay, kết hợp phương pháp sinh học trong xử lý đối với cả nitơ, photpho trongnước ô nhiễm đang là một hướng nghiên cứu mới Trong nghiên cứu của Jorgensen vàPauli, một số chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho cũng có khả năng khử nitrat[18]

 Hàm lượng photpho

Các hợp chất chứa photpho trong tư nhiên thường khó phân giải [7] Các nguồnnước thải chăn nuôi, biogas thường có hàm lượng photpho cao Theo tiêu chuẩn ViệtNam về nước thải, hàm lượng photpho trong nước thải vượt quá 6 mg/l có thể dẫn đếnhiện tượng phú dưỡng (dư thừa các chất dinh dưỡng), gây tác động trưc tiếp đến độngvật, thưc vật và gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái Việc xử lý nước thải giàuphotpho thường khó thưc hiện bằng còn đường sinh học do trong tư nhiên số lượng loài

vi sinh vật phân giải chuyển hóa photpho không nhiều Một số chủng vi sinh vật phân lập

trong tư nhiên có khả năng tích lũy photphat cao thuộc các chi: Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, … [8,9] Kết quả nghiên cứu của Bao và

cộng sư về khả năng thu nhận tích lũy photpho của các chi vi khuẩn cho thấy sau 20 giờ vi

khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng thu nhận 14,34 mg/l khi tiến hành ở điều kiện yếm khí, chi Enterobacteriaceae có khả năng thu nhận 8,91 mg/l, chi Alcaligenes là 6,43 mg/l, Staphylococcus là 6,23 mg/l, Bacillus là 4,41 mg/l ở điều kiện hiếu khí [8] Sư

tích lũy photphat cung cấp nguồn năng lượng cho vi sinh vật phát triển Trong cơ thể visinh vật, photpho tích lũy ở dạng chủ yếu là photphat Photphat chiếm đến 12 % trọnglượng tế bào đối với vi khuẩn có hoạt tính tích lũy photphat, trong khi ở vi khuẩn khôngtích lũy photphat chỉ có khoảng 1 ÷ 3 % Xử lý nước thải có chứa các hợp chấtphotpho bằng phương pháp sinh học dưa trên khả năng của một số nhóm vi sinh vật tíchlũy lượng photpho nhiều hơn mức cơ thể chúng cần trong điều kiện hiếu khí Thôngthường hàm lượng photpho trong vi sinh vật chiếm từ 1,5 ÷ 2,5 % khối lượng tế bào khô,một số loài có khả năng hấp thu cao hơn, từ 6 ÷ 8 % [3], [14]

Nghiên cứu Van Bethum và cộng sư, cho thấy photpho trong cơ thể vi sinh vật đượctích lũy dưới dạng chủ yếu là photphat Trong cơ thể của chúng, photphat có thể chiếmđến 12 % trọng lượng tế bào đối với vi khuẩn có tích lũy polyphotphat, và với vi khuẩnkhông tích lũy polyphotphat, chỉ chiếm khoảng 1÷ 3 % trọng lượng tế bào [3]

 Chỉ số vệ sinh (E coli)

Nước làm lan truyền các nguồn bệnh và trong thưc tế các bệnh lây lan qua môitrường nước là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh có thể dẫn đến tử

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

vong, nhất là ở các nước đang phát triển Các tác nhân gây bệnh thường được bài tiết

ra trong phân của người và động vật bị bệnh, bao gồm các nhóm chính sau: Các vi khuẩn,virus, động vật đơn bào, giun kí sinh Chất lượng về mặt vi sinh của nước thường được sử

dụng rộng rãi nhất là chỉ số E coli [20].

1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SƯ SINH TRƯƠNG CUA VI SINH VÂT TRONG QUA TRINH XƯ LY NƯƠC THAI

1.5.1 Ảnh hương cua nươc va nông đô cac chât dinh dương

Nươc đong vai tro rât quan trong trong hoat đông sông cua vi sinh vât Nươc hòa tan các chất dinh dưỡng nhờ đó mà chất dinh dưỡng dễ dàng thâm thâu qua màng tế bào để cho vi sinh vật sử dụng Nông đô cac chât dinh dương trong nươc thải phải phù hợp với đặc điểm sinh lý của tế bào Nông đô cac chât dinh dương cao quá mức giới hạn

tế bào sẽ mất nước, nguyên sinh chât trong tê bao bi keo tu lai lam hoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ Ngươc lai, trong nươc cât tê bao bi trương lên do xay ra hiên tương thâm thâu cua nươc qua mang tê bao lam cho tê bao bi vơ Tỉ lê cac chât dinh dương coanh hương lơn đên hoat đông sông cua vi sinh vât Môi loài vi sinh vật cũng có nhu cầu khác nhau về tỷ lệ các chất dinh dưỡ ng Tỷ lệ C : N

: P phô biên cho nhiêu loai la 100 : 10 : 1

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiêt đô

Môi loai vi sinh vât co đô giơi han nhiêt đô sinh trưởng thích hợp khác nhau Đốivới mỗi loại vi sinh vật có các giới hạn nhiệt độ sinh trưởng tôi thiêu, nhiêt đô phát triểntối đa và nhiệt độ sinh trưởng thích hợ p Phân lơn vi khuân co nhiệt độ sinh trưởngthích hợp 30 ÷ 37 oC, có nhiều loài vi khuẩn có nhiệt độ sinh trưởng thâp 10 ÷ 20 oC(vi sinh vât ưa lanh ) và có nhiều loài nhiệt độ sinh trưởng khá cao

50 ÷ 60 oC (vi sinh vât ưa nhiêt ) Trong xư ly nươc thai hâu như viêc điêu chinh

nhiêt đô không thê thưc hiên đươc ma thương xư ly ơ nhiêt đô tư nhiên cua môi

trương Vì vậy, ngươi ta thương chon cac loai vi sinh vât co săn trong tư nhiên cua

khu vưc đê chung co kha năng thich nghi vơi nhiêt đô môi trương tư nhiên [27]

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

1.5.3 Ảnh hưởng của pH môi trường

Cũng tương tư như nhiệt độ , pH môi trường ban đầu cũng là yếu tố ảnh hương lơn đên tôc đô sinh trương cua vi sinh vât Phân lơn ca c vi sinh vât co pH sinh trưởng tôi ưu tư 5,5 ÷ 7,5 có một số loài sinh trưởng tôi ưu ơ pH thâp (< 4,5) và môt sô loai sinh trưởng tôi ưu ơ pH kiêm Ở pH không thich hơp hê enzym của vi sinh vât hoat đông yêu hoăc bi bât hoa t do đo anh hương trưc tiêp đên qua trinh trao đôi chât cua vi sinh vât Đê vi sinh vât sinh trương tôt cân duy tri pH thich hơp trong suôt thơi gian nuôi cây

1.5.4 Ảnh hưởng của oxy hòa tan

Môi quan hê cua vi sinh vât đôi vơi o xy rât khac nhau Vi sinh vât hiêu khi cân oxy

đê sinh trương Vi sinh vât yêm khi oxy lai la tac nhân gây đôc Nhóm vi sinh vât trunggian giưa hai nhom nay la nhom hiêu khi tuy tiên

Trong xư ly nươc thai ơ cac bê a eroten cân cung câp đu oxy đê vi sinh vât hiêu khi oxy hoa cac chât hưu cơ co trong nươc thai Còn xử lý yếm khí thì tiến hành trong các bể kín để oxy không tan được vào trong nước thải gây ức ch ế các vi sinh vât yêm khi [23]

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU HỮU CƠ

Có nhiều biện pháp xử lý nước thải: Xử lý cơ học, xử lý hóa học, xử lý sinh

học, xử lý cơ-lý-hóa, và xử lý nhờ kết hợp các biện pháp sinh học và cơ-lý-hóa

Trong các phương pháp trên thì phương pháp xử lý sinh học được sử dụng nhiềuvới hiệu quả cao, đặc biệt là đối với nước thải chứa nhiều chất hữu cơ dễ bị phân hủy,nhưng không mang hiệu quả đối với nước thải công nghiệp có chứa các chất vô cơ độc hại(kim loại nặng, axit, kiềm) hoặc các chất hữu cơ bền vững (các clobenzen, phenol …) và íthiệu quả đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh Trong các trường hợp này phải kết hợpphương pháp xử lý sinh học với các phương pháp

xử lý cơ-lý-hóa [29]

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

1.6.1 Phương pháp xử lý cơ học

Phương pháp cơ học thường sử dụng ở giai đoạn xử lý sơ bộ, dùng để loại cácvật rắn có kích thước lớn và các tạp chất rắn không tan trong nước Các chất này có thể ởdạng vô cơ hoặc hữu cơ Các phương pháp xử lý cơ học thường dùng: lọc qua song chắnhoặc lưới, lắng, lọc qua lớp cát và quay ly tâm

1.6.2 Phương pháp xử lý hóa học

Phương pháp hóa học dưa trên cơ sở là các phản ứng hóa học, các quá trình hóa lýdiễn ra giữa chất ô nhiễm với các hóa chất bổ sung vào Các phản ứng xảy ra có thể làphản ứng oxy hóa khử, các phản ứng tạo chất kết tủa hoặc các phản ứng phân hủy Dovậy, có 3 phương pháp xử lý hóa học thường được sử dụng đó là: Phương pháp trunghòa, phương pháp oxy hóa-khử, phương pháp điện hóa học

1.6.3 Phương pháp xử lý sinh học

Phương pháp phổ biến và kinh tế nhất để xử lý nước thải giàu chất hữu cơ làphương pháp sinh học Phương pháp này dưa trên cơ sở sử dụng hoạt động của các visinh vật để phân hủy các chất hữu cơ gây ô nhiễm trong nước thải

Các vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ và một số khoáng chất làm nguồn dinhdưỡng và tạo năng lượng Trong quá trình phát triển, chúng nhận các chất dinh dưỡng đểxây dưng tế bào, sinh trưởng và sinh sản nên sinh khối của chúng được tăng lên Quátrình phân hủy các chất hữu cơ nhờ vi sinh vật gọi là quá trình oxy hóa sinh hóa [8]

Nước thải có thể xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bởi chỉ tiêuCOD hoặc BOD Để có thể xử lý bằng phương pháp này, nước thải cần không chứa cácchất độc và tạp chất, các muối kim loại nặng hoặc nồng độ của chúng không được vượtquá nồng độ cưc đại cho phép, đồng thời thỏa mãn: BOD/COD ≥

0,5

1.7 TIÊU CHÍ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ

Xư ly nươc thai băng phương phap sinh hoc chu yêu dưa vao hoat đông sông củacác vi sinh vật dị dưỡng có khả năng phâ n giai chât hưu cơ Các vi sinh vật dị

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

dương co t hê chia thanh ba nhom nho : Vi sinh vât hiêu khi , vi sinh vât yêm khi va vi sinhvât tuy nghi Khu hê vi sinh vât sư dung trong qua trinh xư ly nươc thai gôm vi khuân ,nâm me n, nâm môc , xạ khuẩn Trong đo , vi khuân chiêm sô lương lơn nhât Trong cac

bê xư ly sinh hoc , vi khuân đong vai tro quan trong hang đâu vi no chịu trách nhiệm phânhủy các thành phần hữu cơ trong nước thải Do vây, bên cạnh viêc lơi dụng nhưng tínhnăng ưu viêt của các loài vi sinh vât thì chúng ta cân phải lưa chọn nhưng chủng vi sinhvât thích hơp vưa có khả năng làm sạch, vưa tạo đô kêt lăng tôt vưa không gây đôc hạicho môi trương Các tiêu chí đươc xét: Có hoạt tính sinh học cao: Có phức hệ enzym phângiải hữu cơ cao, ổn định Sinh trưởng tốt trong điều kiện thưc tế của nước thải hữu cơ,cạnh tranh được với vi sinh vật có sẵn trong nước thải Nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng tốttrong môi trường tư nhiên, thuận

lợi cho quá trình nhân giống thu sinh khối

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng được tuyển chọn: Vi khuẩn NT01, NT03 và NT05 được lưu giữ trong Bộsưu tập giống Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc ViệnHàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nước thải sau hầm biogas tại hộ gia đình ông Bùi Vinh Nghê, xóm Văn

Miếu, thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng, huyện Đan Phượng, thành phố Hà Nội

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị chính

Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD (Nhật Bản); máy đo pH, MetterToledo (Thụy Sỹ); cân điện tử AB 204, Metter Toledo (Thụy Sỹ); máy lắc ổn nhiệt (HànQuốc); các loại pipetman Gilson, Biohit; nồi khử trùng ướt (Trung Quốc); tủ sấy khô(Sellab - Mỹ); tủ lạnh, Hàn Quốc; máy đo OD; lò vi sóng; ống đong: 100 ml, 500 ml, 1.000ml; cốc đong: 100 ml, 200 ml, 1.000 ml, 2.000 ml; máy sục khí; các dụng cụ khác …

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

Cao thịt (Merck- Đức); cao nấm men (Merck - Đức); pepton (Merck - Đức); thạch(Merck- Đức); bột xenlulo (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại đường: D- glucoza,saccaroza, D-fructoza, …(Merck- Đức); các hóa chất vô cơ khác: NaCl, KH2PO4,MgSO4.7H2O, KNO3 …

+ Bộ Kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB

+ Bộ kit TOPO TA Cloningđ bao gồm các thành phần cần thiết cho quá trình táchdòng: Vectơ pCRđ2.1-TOPOđ, enzym, tế bào khả biến chủng TOP 10, và dung dịch đệmcho từng loại enzym

+ Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tư, sử dụng bộsinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit [2]

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

+ Cặp mồi cho phân loại vi khuẩn:

Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Pr16R:

TACGGTTACCTTGTTACCGACTT

- Cặp mồi tổng hợp gene 16S rARN được đặt tổng hợp tại hãng GENSET

(Singapore BioTech pte, Ltd)

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất 1.000 ml; pH7

Môi trường Winogradsky (g/l): NaNO21; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,3;Na2CO3 1; NaCl 0,5; FeSO4 0,1; nước cất 1.000 ml

Môi trường Pikoskaya (g/l): Glucoza 10; Ca3(PO4)2 5; (NH4)2SO4 0,5; NaCl0,2; MgSO4.7H2O 0,1; KCl 0,2; Cao nấm men 0,5; MnSO4 vết ; FeSO4 7H2O vết;

nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2

Môi trường xenlulo (g/l): NH4NO3 0,2; ure 0,1; cazein 0,2; KH2PO4 0,2;MgSO4.7H2O 0,3; CaCO3 0,2; FeSO4.7H2O 0,05; bột giấy 20; cao nấm men 0,1;cazamino axit 0,1; agar 20; nước cất 1.000; pH 7

Môi trường xenlulo Glovina (g/l): CMC1,5; KNO3 0,5; KH2PO4 0,85; MgSO4.7H2O0,0625; cao nấm men 0,025; nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2

Môi trường Gelatin: Môi trường MPA + 0,4 % gelatin; khử trùng ở 121 oC

trong 20 phút

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương phap nghiên cưu vi sinh vât

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chun̉g vi khuẩn

 Nhuộm Gram vi khuẩn [3]

Xác định các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ vào màu thuốcnhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn Nếu vi khuẩn bắt màu hồng là Gr (-), màu tím là Gr(+)

 Đặc điểm sinh lý, sinh hoa

 Khả năng sinh tổng hợp enzym

Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung thêm

1 % tinh bột Nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol Nếu vikhuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vikhuẩn sinh trưởng [3]

Thủy phân xenlulo: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1 % bột giấy.Nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol Nếu vi khuẩn cókhả năng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vi khuẩnsinh trưởng

Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng, nuôi ở nhiệt

độ 30 oC, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4 oC để trong 2 giờ Sau 2 giờ môi trườngtrong ống nghiệm không bị đông thì chủng đó có khả năng làm loãng gelatin

 Khả năng sư dung cac nguôn cacbon

Nuôi vi sinh vât trên môi trương co bô sung 1 % nguôn đương, cacbon Xác đinhkha năng phat triên cua chung

 Khả năng chịu NaCl, chịu nhiệt, pH

Thay đôi nông đô NaCl và nuôi ở các thang nhiệt độ , pH khac nhau Theo

dõi khả năng sinh trưởng của chúng

* Phương pháp phân tích nitơ tổng số

Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng

vô cơ và hữu cơ về dạng nitrat nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ở bướcsóng 220 nm [9]

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

* Phương pháp phân tích hàm lượng amoni NH4+

Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn được phân tích dưa trên nồng

độ amoni trong môi trường theo các khoảng thời gian nuôi Phản ứng của NH4+ vàhypochlorit với sư có mặt của xúc tác phenol tạo thành hợp chất indophenol blue

So màu ở bước sóng 640 nm [9]

* Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrit

Khả năng chuyển hóa nitrit (NO2-) thành nitrat (NO3-) của các chủng được đánhgiá thông qua sư giảm nồng độ nitrit trong môi trường nuôi cấy Phản ứng giữa nitrit

và hỗn hợp sulfanylamit với naphtylendiamin tạo phức màu hồng ở pH 2 So màu ở bướcsóng 540 nm [9]

* Đánh giá khả năng tch lũy photpho

Đánh giá khả năng tích lũy photpho của vi sinh vật thông qua hàm lượng photphatcòn lại trong môi trường Hàm lượng photphat được đánh giá dưa trên nguyên tắc tạophức giữa gốc phosphat, amonium molypdat và kali antimon tatrat thành một phức chấtmàu xanh đậm và được đo ở bước sóng 710 nm [11]

2.2.1.2 Phương pháp đánh giá tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn

Đối kháng giữa các chủng vi khuẩn: Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy giaonhau trên môi trường MPA, nuôi ở 37 oC sau 24 giờ quan sát sinh trưởng của các chủng ởcác đường giao nhau [3]

2.2.1.3 Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn

+ Ảnh hưởng của thời gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay đổi môi

trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sư thay đổi của các tế bào vi sinh vật Vì vậy,sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng thời điểm lượng enzymsinh ra cũng khác nhau Tiến hành thí nghiệm bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môitrường MPA, nuôi ở 37 oC, điều kiện lắc 200 vòng/phút trong 60

giờ Cứ sau 6 giờ lấy mẫu một lần, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm) [4]

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

+ Ảnh hưởng của nhi ệt độ: Để nghiên cứu sư sinh trưởng của các chủng vi khuân

ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể Sau đó, cấy các chủng vi sinhvật trong các ống nghiệm chứa môi trường đã vô trùng và để ở các thang nhiệt độ: 25;30; 35; 45 và 55 Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm)

+ Ảnh hưởng của pH : Sử dụng môi trường MPA có pH ban đầu là: 3; 4; 5;

6; 7; 8; và 9 Cấy vi sinh vật, nuôi ở 37 oC, sau 48 giờ xác định khả năng sinh trưởngbằng cách đo OD620 nm

+ Ảnh hưởng của nồng độ NaCl: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường MPA sau đó

bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1; 3; 5; 7 và 9 và 11 nuôi ở 37

oC trong 48 giờ Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số (OD620nm)

+ Ảnh hưởng của ngu ồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh

trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn trên cácnguồn cơ chất khác nhau Trên môi trường cơ sở có bổ sung tinh bột, CMC-Na, glucoza,saccaroza, lactoza, rỉ đường Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ.Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sư sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm)

+ Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi trường cơ sở

có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao thịt, KNO3 và (NH4)2SO4

Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra

sư sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm)

2.2.1.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzym

Phương pháp đường khử : Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ: 0.5; 1;1.5; 2 và 3 (mg/ml) Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ đến khi xấp xỉnồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng bằng 1 ml) Bổ sung 1 ml cơchất, mix đều và ủ ở 37 oC trong 10 phút, sau đó thêm 3 ml DNSA, mix đều rồi đun sôi cácmẫu enzym, đường chuẩn, EB và S cùng nhau (khoảng 30 phút) Sau đó làm lạnh bằngcách ủ vào đá rồi đo OD (540 nm) Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫu

tiếp

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

quả thu được áp vào đường chuẩn hình 2.1 tính hoạt độ xenlulaza.

7

6 y = 2.8096x + 0.1064

R2 = 0.99825

43210

0 0.5 11.5 2 2.5

Đồ thị đườngchuẩn glucose(mg/ml)

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld [26]

2.2.2 Phương pháp phân loại

2.2.2.1 Phân loại theo Bergey’s

Dưa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa đối chiếu với chủng chuẩn

đã được nghiên cứu theo khóa phân loại Bergey’s [32]

2.2.2.2 Phân loại vi khuẩn theo kit chuẩn API 50 CHB

Chủng vi khuẩn cấy sau 24 giờ trên thạch nghiêng, lấy 2 ÷ 3 vòng que cấy hoà tanvào nước muối sinh lý, dùng pipet vô trùng hút 2 ml từ nước muối sinh lý đã có vi sinhvật vào môi trường API 50 CHB, lắc đều Dùng pipet hút dịch từ môi trường API 50 CHBcho vào các chíp (vạch 1), tiếp theo nhỏ parafin khoảng 5 ÷ 6 giọt cho đầy Nuôi 37 oC,sau 24 giờ và 48 giờ ghi kết quả Trong suốt quá trình nuôi cấy, các đường lên men tạothành axit làm giảm pH, được nhận biết bằng sư

đổi màu chất chỉ thị [8].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

2.2.2.3 Phân loại theo sinh học phân tử dựa trên trình tự gene 16S rRNA

a Tách chiết ADN tổng số

Quy trình tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn được tiến hành theo phươngpháp CTAB/NaCl của Ausubel, 1994

(1) Vi khuẩn nuôi trong 24 giờ trên môi trường thạch thu sinh khối hòa trong

1,5 ml nước khử trùng (2) Cặn tế bào được thu bằng cách ly tâm lạnh ở tốc độ 5000vòng/5 phút để thu sinh khối (3) Cặn tế bào hòa trong 567 µl TE, 5 µl lyzozym mix đều ủ

37 oC trong 20 phút (4) Bổ sung 3 µl proteaza K, 30 µl SDS 10 % vào dung dịch trên mixđều ủ 37 oC trong 30 phút (5) Sau đó bổ sung 100 µl NaCl 5 M, mix đều, bổ sung tiếp 80

µl dung dịch CTAB/NaCl (10 % cetyltrimethylammoium bromit, 0.7 M NaCl) mix đều ủ 65oC/10 phút (6) Chiết 1 V hỗn hợp chloroform : isoamyl (24 : 1), vortex (7) Ly tâm 12000vòng/phút thu dịch nổi (lặp lại chiết dung môi hai lần) (8) Bổ sung 10 µl Na - acetat 3 M,mix đều, bổ sung tiếp 2 V cồn 100

% (lạnh) hoặc 0,7 V isopropanol (lạnh), mix đều (9) Để lạnh ở -20 oC ít nhất 4 giờ

(10) Ly tâm 12000 vòng/ 20 phút thu cặn (11) Rửa tủa bằng 500 µl cồn 70o, ly tâm

12000 vòng/ 10 phút, thu cặn (12) Làm khô (13) Hòa cặn trong 40 ÷ 60 µl TE - ARNaza, ủ

ở 37 oC/ 1 giờ (14) Kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng máy đo quang phổ ở bước sóng

260 nm và 280 nm CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độ pha loãng mẫu Tỉ lệADN/protein > 1,8 là mẫu sạch (15) Điện di kiểm tra trên gel agaroza

0,8 %, điện thế 100 V Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromit 1 %/ 10 phút

Nhân bản đoạn ADN thuộc gen 16S rARN bằng PCR

Thu nhận đoạn gen 16S ARN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi:

Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Pr16R:

TACGGTTACCTTGTTACCGACTT

PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µl/ mẫu: ADN tổng số (1 µl), 16F (1

µl), 16R (1 µl), dNTPs 10 mM (2 µl), Taq polymeraza (0,25 µl), đệm Taqpolymeraza 10 X (5 µl), nước khử ion (bổ sung cho đủ 25 µl)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

Chu trình nhiệt: (1) 94 oC - 3 phút, (2) 94 oC - 1 phút, (3) 55 oC - 1 phút, (4) 72

oC - 2 phút Lặp lại 30 chu kỳ từ bước 2 ÷ 4; 72 oC - 7 phút Giữ ở 4 oC

b Thu nhận ADN thuộc gen 16S rARN bằng cách thôi gel

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza 0,8 %, phân đoạn ADN có độ dài

~ 1500 bp được thu nhận, tiến hành thôi gel và tinh sạch sản phẩm bằng kitQiaQuick PCR Purification (Qiagen, Hilden, Đức)

(1) Thêm 3 lần thể tích của dung dịch đệm ADB (Agarose Dissolving Buffer) vào mỗithể tích gel Ủ trong bể ổn nhiệt 55 oC trong 5 ÷ 10 phút, đến khi tan hết gel (2)Chuyển dung dịch gel đã hoà tan vào cột Zymo-Spin, sau đó ly tâm 12.000 vòng/ phúttrong 5 ÷ 10 giây (3) Thêm 200 µl dung dịch đệm rửa (Wash Bufer) vào cột, ly tâm12.000 vòng/ phút trong 5 ÷ 10 giây, lặp lại bước này hai lần (4) Thêm trưc tiếp 6 ÷ 8 µlnước khử ion vào màng của cột, đặt cột vào trong ống 1,5 ml và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút Thu sản phẩm ADN tinh sạch

2.2.3 Phương pháp lên men, xử lý nước thải hữu cơ sau hầm biogas

2.2.3.1 Phương pháp lên men vi khuẩn

Nhân giống cấp 1: Nhân giống trong môi trường MPA cho vi khuẩn, nuôi lắc trongbình tam giác, nhiệt độ và thời gian nuôi thích hợp cho từng chủng, số lượng tế bào đạtkhoảng 109/ml dịch nuôi

Nhân giống cấp 2: Tiếp tục nhân giống lớn trong thiết bị lên men trên môi trườngMPA cho vi khuẩn, số lượng tế bào đạt 109/ml dịch nuôi

2.2.3.2 Thiết kế thí nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas

Thí nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas quy mô phòng thí nghiệm được thưchiện quy mô 2,5 m3/mẻ sục khí liên tục, tại thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng, huyện ĐanPhượng, thành phố Hà Nội

2.2.3.3 Phương pháp đánh giá mức độ ô nhiễm

+ Phương pháp xác định pH theo TCVN 6492 - 1999 (ISO 10523 - 1994) [21]

+ Xác định BOD theo TCVN 6001 - 1995 (ISO 5815 - 1989) [19]

Thử nghiệm BOD được thưc hiện bằng cách hòa loãng mẫu nước thử với nước đãkhử ion và bão hòa về oxy, thêm một lượng cố định vi sinh vật mầm giống, đo lượng oxyhòa tan và đậy chặt nắp mẫu thử để ngăn ngừa oxy không cho hòa tan thêm (từ ngoàikhông khí) Mẫu thử được giữ ở nhiệt độ 20 °C trong bóng tối để ngăn chặn quang hợp(nguồn bổ sung thêm ôxy ngoài dư kiến) trong vòng 5 ngày và sau đó đo lại lượng ôxyhòa tan Khác biệt giữa lượng DO (oxy hòa tan) cuối và lượng DO ban đầu chính là giá trịcủa BOD Giá trị BOD của mẫu đối chứng được trừ đi từ giá trị BOD của mẫu thử đểchỉnh sai số nhằm đưa ra giá trị BOD chính xác của mẫu thử [2]

+ Xác định COD theo TCVN 6491 - 1999 (ISO 6060 - 1989) Xác định nhu cầu oxy

T1 – T2 1000

SS (mg/l) =

-VTrong đó: T1: Khối lượng cặn và giấy lọc T2:

Khối lượng giấy lọc (mg) V: Thể tích mẫu nước

+ Xác định N tổng theo TCVN 5988-1995 (ISO 5664-1984)

Nguyên tắc chung của phương pháp này là dùng axit sunfuric đậm đặc oxy hóatoàn bộ các hợp chất hữu cơ có nitơ về amoniac (NH3) Do vậy, không để lẫn với lượngamoni mới được hình thành phải phân tích xác định NH3 tư do có sẵn trong mẫu nướcthải trước để hiệu chỉnh về sau NH3 mới sinh ra và NH3 tư do đều kết hợp với axitsunfuric đậm đặc để chuyển thành muối amoni sunfat Sau đó lại tách toàn bộ NH3 từamoni sunfat (vừa hình thành) bay ra khỏi dung dịch bằng cách đun nóng dung dịch vớiNaOH

+ Phương pháp xác định gia tri SV30 (solid value)

Đây la phương phap xac đinh kha năng tao bun lăng cua dich xư ly Dịch nươcthai đa đươc xư l ý lắc đều rót vào ống đong 500 ml Đê lăng tư nhiên , sau 30

phút ghi lại thể tích bùn lắng (Vtb) Giá tri SV30 đươc tinh như sau: SV30

= (Vtb/500)×100

+ Xác định Coliforms theo TCVN 6187 - 2 : 1996 (ISO 9308 - 2:1990) [20]

Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần (3 ÷ 10 lần) Các độ pha loãngđược lưa chọn sao cho trong các lần lặp lại có số lần dương tính và có số lần âm tính Sốlần dương tính được ghi nhận và so với bảng thống kê Mac Crady

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình IRISTAT 5.0 và EXCEL

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

PHẦN III KÊT QUA VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Khả năng phân giải cơ chất của các chủng nghiên cứu

Ba chủng vi khuẩn được ký hiệu NT01, NT03 và NT05 được phân lập từ nguồnnước thải giàu hữu cơ tại Công ty Cổ phần thưc phẩm xuất khẩu Đồng Giao - Ninh Bình,các chủng được xác định khả năng phân giải cơ chất là CMC và tinh bột: Môi trườngMPA có bổ sung CMC và tinh bột 1 % khử trùng ở 0,8 atm trong 30 phút, sau đó đổ ra đĩaPetri Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa, ủ ở nhiệt độ

37 oC trong 48 giờ Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol Nếu vi khuẩn có khảnăng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vi khuẩn sinhtrưởng Kết quả được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1

NT01

NT05 NT03

Hình 3.1 Vòng phân giải CMC của 3 chủng vi khuẩn

Tư hinh 3.1 cho thây 3 chủng vi khuẩn NT 01, vi khuân NT 03, vi khuân

NT05 đều có hoạt tính và được đo vòng phân giải tại bảng 3.1

Bảng 3.1 Khả năng phân giải CMC và tinh bột của các chủng

Từ hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy chủng vi khuẩn NT01 có vòng phân giải xenlulo

là 21,0 mm, chủng NT03 có vòng phân giải xenlulo 19,0 mm, chủng NT05

có vòng phân giải 17,0 mm Các chủng này đều có khả năng sinh tổng hợp

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

xenlulaza cao, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.

+ Khả năng tch lũy phân giải photphat của các chủng có hoạt tnh xenlulaza: Khả năng sử dụng photpho của các chủng có hoạt tính xenlulaza được đánh giá

thông qua hàm lượng photphat được tích lũy trong vi sinh vật dẫn đến việc giảm hàmlượng của hợp chất này trong môi trường nuôi cấy

Bảng 3.2 Hàm lượng photpho còn trong môi trường sau 7 ngày nuôi cấy

STT Ký hiệu chủng Hàm lượng photpho còn trong môi trường (%)

7 ngày nuôi cấy đã không còn phát hiện được photphat còn trong môi trường, tiếp tục bổsung và tăng hàm lượng photpho trong môi trường nuôi cấy lên gấp 3 lần ở mức 18 mg/l.Tại nồng độ này kết quả nghiên cứu cho thấy chủng NT01 có khả năng sử dụng photphattốt nhất so với các chủng còn lại Lượng photphat trong dịch nuôi của chủng NT01 giảm đi29,12 % sau 7 ngày trong khi với các chủng NT03 và NT05 lượng giảm tương ứng là 25,77

% và 22,94 %

+ Đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ: Các chủng NT01, NT03 và NT05

được nuôi lắc ở 37 °C trong các khoảng thời gian từ 0, 5, 10, 15 và 20 ngày Môitrường nuôi lắc là dung dịch môi trường Winogradsky có bổ sung 1 % pepton và kết quảthu đươc như sau

Bảng 3.3 Hàm lượng nitơ còn trong môi trường sau thời gian nuôi cấy

Ký hiệu chủng Hàm lượng nitơ còn trong môi trường (%), ngày

Kết quả cho thấy, sau 5 ngày, ba chủng NT01, NT03 và NT05 làm nồng độ NH4+giảm nhiều Sau 15 ngày, chủng NT01 có hàm lượng NH4+ có trong mẫu đã giảm xuống66,66 % và 2 chủng còn lại hàm lượng NH4+ trong dung dịch giảm xuống 69,03 % sovới mẫu ban đầu với chủng NT03 và 71,28 % với chủng NT05

nhưng sau 20 ngày các chủng đều chuyển hóa nitơ chậm Từ kết quả trên cho thấy cả 3chủng đều có khả năng chuyển hóa nitơ nhưng chủng NT01 có khả năng chuyển hóatốt nhất và thời gian tối ưu là khoảng 15 ngày

+ Khả năng làm loãng gelatn của các chủng phân lập: Các chủng vi khuẩn nghiên

cứu được cấy trong môi trường MPA lỏng bổ sung 10 % gelatin, nuôi ở nhiệt độ 37 oC.Sau 2 ngày, trước khi quan sát giữ mẫu ở 20 oC trong khoảng 4 giờ, kiểm tra kết quả với

vi khuẩn Dịch môi trường loãng chứng tỏ chủng có khả năng làm loãng gelatin

NT01 NT03 NT05

ĐC

Hình 3.2 Khả năng làm loãng gelatin của các chủng nghiên cứu

Kết quả được trình bày ở hình 3.2 cho thấy các chủng nghiên cứu đều có khả nănglàm loãng gelatin rất tốt so với đối chứng không cấy vi sinh vật

3.1.2 Khả năng đối kháng của các chủng nghiên cứu

Để xử lý nước thải hữu cơ một cách tốt nhất thì hệ vi sinh vật tuyển chọn cần phải

có sư tương trợ lẫn nhau, nếu chúng đối kháng với nhau thì việc cùng bổ sung chủng vàonước thải là vô nghĩa Vì vậy, cần kiểm tra khả năng đối kháng của các

chủng nghiên cứu với nhau Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy giao nhau trên

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

môi trường MPA, nuôi ở 37 oC sau 48 giờ quan sát sinh trưởng của các chủng ở các

đường giao nhau

NT01 NT0

NT0 1 NT03

NT0 5

Hình 3.3 Khả năng đối kháng của các chủng nghiên cứu

Kết quả hình 3.3 cho thấy các chủng nghiên cứu không đối kháng nhau Cả ba vikhuân đê u phát triển bình thường tại các điêm giao nhau , không co sư ưc chê giưa cacchung Như vậy, chúng hoàn toàn có thể sinh trưởng trong cùng một môi trường cũngnhư phối hợp chúng trong xử lý nước thải hữu cơ

3.1.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu được xácđịnh khi nuôi cấy trên môi trường MPA, ở nhiệt độ 37 oC, sau 48 giờ quan sát hình tháikhuẩn lạc và hình ảnh tế bào được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh LăngChủ tịch Hồ Chí Minh Kết quả hình 3.4 cho thấy 2 chủng vi khuẩn NT01 và chủng vikhuẩn NT03 đều có tế bào hình que dài, kích thước từ 1

÷ 3 µm Hình thái tế bào của 2 chủng tương tư nhau nhưng hình thái khuẩn lạc thì khácnhau hoàn toàn, chủng NT01 khuẩn lạc lồi, không bóng, nhầy, hơi nhăn, chủng vikhuẩn NT03 khuẩn lạc màu trắng sữa, hơi lồi, mép răng cưa Chủng vi khuẩn NT05 có tếbào hình que ngắn hơn, kích thước 1 ÷ 2 µm Hình thái khuẩn lạc

tròn, màu trắng kem

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

3.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

3.1.4.1 Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi khuẩn nghiên cứu

+ Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn: Thời gian là

yếu tố cần thiết cho sư sinh trưởng của bất cứ loài nào, thời gian nào là thời điểm vi sinhvật sinh trưởng mạnh nhất tùy thuộc vào mỗi loài Ba chủng vi khuẩn lưa chọn được nuôicấy trên môi trường MPA, nhiệt độ 37 oC, điều kiện lắc 200 vòng/phút Sau khi cấy giốngthu mẫu 6 giờ một lần, tiến hành xác định khả năng sinh trưởng bằng cách đo OD vớibước sóng 600 nm Kết quả được trình bày ở hình

3.5

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn

0

6 12 18 24 30 36

42 48 54 60

Thời gian, h Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn

Kết quả hình 3.5 cho thấy thời gian tối ưu cho sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn

là 42 giờ, OD chủng NT01 đạt 2,155, chủng NT03 đạt 2,89, chủng NT05 đạt

2,715 Từ 6 ÷ 42 giờ các chủng sinh trưởng rất nhanh Từ 42 giờ trở đi sinh trưởng của các chủng nghiên cứu giảm dần

+ Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi khuẩn: Các

chủng vi khuẩn lưa chọn được nuôi trong môi trường MPA lỏng có bổ sung 0,1 % CMC,nuôi 37 oC, lắc 200 vòng/phút Lấy mẫu dịch nuôi cấy cứ sau 6 giờ một lần, bảo quảndưới 0 oC để vi khuẩn không tiếp tục sinh trưởng Sau khi kết thúc tiến hành làm đườngkhử xác định hoạt tính xenlulaza của các chủng nghiên

cứu Kết quả được trình bày ở hình 3.6

2.521.51

NT01NT03NT050.5

0

6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

Thời gian, h

chủng vi khuẩnKết quả hình 3.6 cho thấy 3 chủng vi khuẩn sau 6 giờ nuôi cấy, lượng enzymsinh ra tăng liên tục nhưng tương đối khác nhau Chủng NT01 sau 6 ÷ 24 giờ khả năng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN h t t p : / /ww w l r c t n u e d u vn