Nghiên cứu sự biến đổi thành phần gen nhân ITS 2, 28s rRNA và gen ty thể COX1 của loài sán lá gan lớn fasciola sp dạng thuần và dạng lai gây bệnh trên động vật tại việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---NGUYỄN THỊ HOA ÁNH NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI THÀNH PHẦN GEN NHÂN ITS-2, 28S rRNA VÀ GEN TY THỂ COX1 CỦA LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN FASCIOLA SSP DẠNG TH

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-NGUYỄN THỊ HOA ÁNH

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI THÀNH PHẦN GEN NHÂN ITS-2, 28S rRNA VÀ GEN TY THỂ COX1

CỦA LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN FASCIOLA SSP DẠNG THUẦN VÀ DẠNG LAI GÂY BỆNH

TRÊN ĐỘNG VẬT TẠI VIỆT NAM

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên

ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ BÍCH NGA

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi trực tiếp thực hiện và một số kết quảcùng cộng tác với các cộng sự khác Các số liệu trình bày trong luận văn là hoàn toàn trungthực và chính xác

Ngày…… tháng … năm 201…

Học viên

Nguyễn Thị Hoa Ánh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến:

- TS Nguyễn Thị Bích Nga là người đã trực tiếp hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợicho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận văn

- Cảm ơn các cán bộ của Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học nơi

tôi thực tập đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến:

- Ban Giám đốc Đại học Thái Nguyên, Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học, PhòngĐào tạo và Quan hệ Quốc tế, Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại họcThái Nguyên

- Sự tài trợ kinh phí của Quỹ phát triển Khoa học và công nghệ quốc gia (Nafosted) cho

đề tài mã số 106-YS.02-2013.06 do TS Nguyễn Thị Bích Nga làm chủ nhiệm

- Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân đã luônkhuyến khích,động viên cũng như chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt quá trình họctập và hoàn thành nghiên cứu của mình

Học viên

Nguyễn Thị Hoa Ánh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về loài sán lá gan lớn 3

1.1.1.Vị trí phân loại sán lá gan lớn trong hệ thống phân loại động vật 3

1.1.2.Đặc điểm hình thái học của sán lá gan lớn Fasciola sp 3

1.1.3.Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của sán lá 5

1.1.4.Trứng sán lá gan lớn 8

1.1.5.Sán trưởng thành 9

1.2.Đặc điểm của bệnh do sán lá gan lớn 10

1.2.1.Cơ chế sinh bệnh 10

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá Fasciola ở trâu, bò ở Việt Nam 12

1.3 Tầm quan trọng của nghiên cứu giám định loài bằng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự 17

1.3.1 Giới thiệu sơ bộ hệ gen nhân ribosomal DNA (rDNA) 18

1.3.2 Hệ gen DNA ty thể 19

CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.3 Dụng cụ và thiết bị và hóa chất 22

2.3.1 Dụng cụ, trang thiết bị 22

2.3.2 Hóa chất 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu Fasciola sp 24

2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 24

2.4.3 Thiết kế mồi, thực hiện PCR gen ITS2, 28S và gen cox1 25

2.4.4 Phương pháp giải trình tự 27

2.4.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 Thu nhận gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt 30

3.1.1 Thu thập mẫu sán lá gan lớn và phân loại hình thái 30

3.1.2 Sử dụng gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt 30

3.2 Kết quả thu nhận gen 28s và xây dựng cây phả hệ 35

3.3 Kết quả thu nhận chuỗi gen ty thể COX1 39

3.3.1 Kết quả giải trình tự gen cox1 của Fasciola sp Việt Nam và so sánh với các loài thuộc lớp sán lá Trematoda 41

3.3.2 Xây dựng mối quan hệ phả hệ giữa các loài thuộc lớp sán lá 47

KẾT LUẬN 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

Sán lá gan lớn Polymerase chain reaction dideoxyrinonucleotide triphosphate deoxyrinonucleotide triphosphate Cặp bazơ (base pair)

Tris base-Acetic-EDTA Điện

di gel polyacylamid Ethidium Bromide

Ethylene Diamine Tetraacemic Acid Mật độ quang học

Kilobase Kilodalton Microlitre

Micrometer Millimeter

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bang 2.1 Danh sách cac mồi dung trong phan ưng PCR thu nhận gen ITS-2, 28S

và COX1 25Bảng 3.1 So sánh các nucleotide ở các vị trí biến đổi của vùng giao gen ITS-2 của các mẫu

sán lá gan lớn ở các vùng địa lý và vật chủ khác nhau 33

Bảng 3.2 Các mẫu cung cấp chuỗi gen 28S trong nghiên cứu 36

Bảng 3.3 Các mẫu sán lá Trematoda trong Ngân hàng gen cung cấp chuỗi cox1

sử dụng so sánh đối chiếu trong nghiên cứu 40Bảng 3.4 Tỷ lệ tương đồng trình tự amino acid gen cox1 của các loài sán lá thuộc lớpTrematoda 46

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh mô tả hình thái của sán lá gan lớn Fasciola sp 4

Hình 1.2 Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của SLGL Fasciola sp ký sinh vật chủ ở động vật và người 5

Hình 1.3 Hình ảnh của trứng sán lá gan lớn Fasciola sp phóng đại 400 lần dưới kính hiển vi điện tử 8

Hình 1.4 Hình thể sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành 9

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc ribosome DNA của gen nhân và vùng gen cần nghiên cứu18 Hình 1.6 Mô hình cấu trúc DNA của hệ gen ty thể 20

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể Fasciola sp 23

Hình 3.1 Hình ảnh sán lá gan lớn FspNB-VN và FspCB-VN trong nghiên cứu 30

Hình 3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của vùng gen ITS-2 31

Hình 3.3 So sánh trình tự chuỗi nucleotide ITS-2của 16 mẫu Fasciola sp 32

Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR gen 28S với cặp mồi U28SF – U28SR 35

Hình 3.5 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa mẫu Fasciola sp xác trên lập dựa trên thành phần nucleotide gen 28S ribosome bằng chương trình MEGA6.06 38

Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của gen cox1 với cặp mồiFSP12F – FGHR2 40

Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn của FspNB-VN và FspCB-VN so sánh với các chuỗi gen cox1 thuộc lớp sán lá Trematoda 44

Hình 3.8 Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ về loài giữa các mẫu sán lá dựa trên thành phần amino acid của gen cox1 bằng chương trình MEGA6 48

gây bệnh trên người.

Trước đây, các đặc tính hình thái học (morphology), sinh thái học (ecology) và huyếtthanh học (serology) thường sử dụng trong chẩn đoán cũng đã đáp ứng được phần lớn yêucầu về phân loại sinh vật trong đó có ngành ký sinh trùng [5],[18]

Tuy nhiên nếu phân loại sán lá gan chỉ dựa vào hình thái thì rất khó phân định Đặcbiệt đã có hiện tượng lai và dạng trung gian (hybrid form) trong quần thể sán lá gan đã được

phát hiện, đó là hệ gen có sự trộn lẫn của F hepatica và F gigantica (Fh/Fg), trong đó hệ gen nhân tế bào mang gen từ dòng bố (F hepatica) và hệ gen ty thể (F gigantica) mang tính di

truyền theo dòng mẹ [7]

Bệnh sán lá gan lớn hiện nay được coi là bệnh ký sinh trùng mới nổi bị lãng quên(neglected emerging infectious disease) và đang được tổ chức y tế thế giới (WHO) quan tâm

Sán lá gan lớn gây bệnh ở người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, do chúng gây

ra các tổn thương bệnh lý ở hệ thống gan mật, gây can xi hóa đường mật, ký sinh lạc chỗhoặc di chuyển lạc lên não… gây tổn thương nặng ở nhu mô gan làm suy gan dẫn đến tửvong [4], [7], [17] Một số trường hợpdo bệnh sán lá gan lớn ở người gây phản ứng viêm, xơhóa gan, dẫn đến chẩn đoán bị nhầm là bệnh ung thư gan [2], [5]

Đối với động vật ăn cỏ (trâu, bò, dê, cừu…) khi nhiễm sán lá gan lớn làm giảm trọnglượng của con vật, ốm yếu, thiếu máu bệnh lý, con vật không sinh sản, gây thiệt hại lớn vềkinh tế [11]

Vì vậy việc phát hiện sớm và xác định chính xác loài Fasciola gây bệnh là rất cần thiết,

có ý nghĩa thực tiễn trong chẩn đoán và điều trị Chẩn đoán, giám định và phân biệt loài

Fasciola được thực hiện bằng các phương pháp sinh học phân tử dựa trên các chỉ thị gen

nhân và ty thể

Xuất phát từ yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự biến đổi thành phần gen nhân ITS-2, 28S rRNA và gen ty thể COX1 của loài sán lá gan lớn Fasciola

sp dạng thuần và dạng lai gây bệnh trên động vật tại Việt Nam” Mục tiêu của đề tài

- Giải trình tự và phân tích gen nhân ITS-2, gen 28S của sán lá gan lớn dạng

thuần và xác định dạng laigây bệnh trên động vậttại Việt Nam

- Giải mã gen COX1 của hệ gen ty thể F hepatica và F gigantica dạng thuần và dạng lai,

phân tích đặc điểm di truyền

- Xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự của gen ITS-2, 28S rRNA và COX1 trong phânloại

Nội dung nghiên cứu

- Thu nhận và sàng lọc các mẫu của Fasciola sp, giám định bằng hình thái học nhận

dạng dòng lai dựa vào vùng gen của hệ gen nhân ITS-2 để phân biệt Fasciolagigantica và Fasciola dạng lai (hybrid), so sánh phân tích dữ liệu trình tự của gen ITS-2 và gen 28S, xây

dựng cây phả hệ

- Thu nhận gen ty thể COX1 của gen ty thể, phân tích trình tự

nucleotide/amino acid, xem xét mối quan hệ tiến hóa di truyền phả hệ

- Phân tích biến đổi di truyền và dịch tễ học phân tử: xác định khác biệt của trình tự

hệ gen nhân vùng ITS-2, 28S và COX1 của F hepatica và F gigantica (thuần và lai).

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Góp phần cung cấp trình tự các chuỗi gen ITS-2, 28S và cox1 của sán lá gan lớn

Fasciola sp ở Việt Nam.

- Ngoài ra các kết quả chính xác của sinh học phân tử cho phép ứng dụng những hướngmới và rất có thể sẽ làm thay đổi một phần hệ thống phân loại về ký sinh trùng trong nghiêncứu dịch tễ học phân tử và phân loại loài

- Sử dụng các số liệu của hệ gen ty thể để ứng dụng phát triển các phương pháp chẩnđoán phân tử trong phòng và điều trị bệnh sán lá gan lớn ở người và động vật tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về loài sán lá gan lớn

1.1.1 Vị trí phân loại sán lá gan lớn trong hệ thống phân loại động vật

Theo Skarjabin cs (1997) [67], sán lá gan lớn kí sinh và gây bệnh cho trâu

bò được xếp trong hệ thống phân loại động vật như sau:

Ngành: Plathelminthes (Schneider, 1873) Phân

ngành: Platodes (Leuckart, 1854) Lớp:

Trematoda (Rudolphi, 1808)

Phân lớp: Prosostomadidea (Skrjabin và Guschanskaja, 1926) Bộ:

Fasciolida (Skrjabin et Schulz, 1937)

Phân bộ : Fasciolata (Skrjabn et Schulz, 1937) Họ :

Fasciotidae (Railliet, 1985)

Phân họ : Fasciolinae (Stiles et Hasall, 1898) Giống :

Fasciola (Linnaeus, 1758)

Loài : Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) Loài :

Fasciola gigantica (Cobbold, 1888).

1.1.2 Đặc điểm hình thái học của sán lá gan lớn Fasciola sp

Cũng như nhiều loài sán lá khác, sán lá gan lớn thuộc dạng sinh sản lưỡng tính có thểthụ tinh chéo hoặc tự thụ tinh Sán lá có giác miệng và giác bụng, giác bụng không nối với cơquan tiêu hóa Sán lá không có hệ hô hấp, tuần hoàn và cơ quan thị giác, ở giai đoạn mao ấu

có dấu vết sắc tố mắt Hệ sinh dục rất phát triển với cả hệ sinh dục đực và cái trong cùng một

cơ thể, tử cung sán lá chứa đầy trứng (Hình 1.1)

Có thể phân biệt 2 loài sán lá gan thuộc giống Fasciola như sau:

- Loài F.gigantica (Cobbold, 1885): Có chiều dài gấp 3 lần chiều rộng, vai không có hoặc không nhìn rõ rệt, nhánh ruột chia tỏa ra nhiều nhánh ngang F.gigantica (có nghĩa là

sán khổng lồ), có kích thước chiều dài 25 – 75mm, chiều rộng 3 – 12mm, u lồi hình nón củađầu là phần tiếp theo của thân, vì vậy nó không

có vai như loài khác của giống Fasciola, hai rìa bên thân sán lá song song với nhau, đầu cuối

của thân tù Giác bụng tròn lồi ra Ruột, tuyến noãn hoàng, buồng trứng và tinh trùng đềuphân nhánh Trứng hình bầu dục, màu vàng nâu, phôi bào to đều và xếp kín vỏ Kích thướctrứng 0,125 – 0,170 × 0,06 – 0,10mm (Hình

1.1A)

Hình 1.1 Hình ảnh mô tả hình thái của sán lá gan lớn Fasciola sp

A Fasciola gigantica ; B : Fasciola hepatica [71]

- Loài F hepatica (Linnaeus, 1758): loài này thân rộng, đầu lồi và nhô ra phía trước làm cho sán có vai, nhánh ruột chia ít nhánh ngang hơn F hepatica (nghĩa là sán ở gan) dài

18 – 51mm, rộng 4 - 13mm, phần trước thân nhô ra tạo cho sán có vai bè ra hai bên Hai rìathân sán không song song với nhau mà phình ra ở chỗ vai rồi thót lại ở đoạn cuối thân.Những ống dẫn tuyến noãn hoàng chạy ngang, chia vùng giữa của sán lá thành phần trước vàphần sau của thân Phần sau thân có tinh hoàn và bộ phận sinh dục đực Tinh hoàn phânnhiều nhánh xếp chỗ sau thân Tử cung ở phần giữa thân trước tạo nên một mạng lưới rốinhư tơ vò Buồng trứng phân nhánh nằm ở sau tử cung Trứng của sán lá

F hepatica có màu sắc, hình thái tương tự như trứng của loài F.gigantica, kích

thước 0,13 – 0, 145 × 0,07 – 0,09mm (Hình 1.1B)

1.1.3 Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của sán lá.

Chu kỳ sinh học của sán lá Fasciola đã được Leukart (1882) nghiên cứu ở Đức vàThomas (1882) nghiên cứu ở Anh Chu kỳ sinh trưởng và phát triển (vòng đời) của SLGL

Fasciola sp được trình bày ở Hình 1.2.

Người hoặc động vật ăn phải ấu trùng

Sán lá gan lớn ký sinh ở người hoặc động vật

Hình 1.2 Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của SLGL Fasciola sp ký sinh vật chủ ở động

vật và người [71]

Quá trình Fasciola sp trưởng thành sinh sống trong ống dẫn mật của trâu, bò, dê Sau

khi thụ tinh mỗi sán lá đẻ hàng chục vạn trứng Những trứng này cùng dịch mật vào ruột, sau

đó theo phân ra ngoài Nếu gặp được điều kiện thuận lợi như nước mưa cuốn trôi xuống cácvũng nước, ao, hồ, ruộng nước ở nhiệt độ 15 –

300C, pH = 5 - 7,7, có điều kiện ánh sáng thích hợp thì sau 10 – 25 ngày trứng nở

thành miracidium bơi tự do trong nước Nếu thiếu ánh sáng miracidium không có khả năngthoát vỏ nhưng vẫn có thể tồn tại 8 tháng trong vỏ Miracidium có hình tam giác, xung quanh

thân có lông và có thể di chuyển được trong nước Khi gặp vật chủ trung gian thích hợp (ốc Lymnaea sp) Miracidium xâm nhập vào tế bào ốc

và phát triển thành bào ấu (Sporocyst) Những miracidium không gặp vật chủ trung gian thì sẽrụng lông, rữa dần và chết.

Bào ấu (Sporocyst) hình túi, màu sán lá được bao bọc bởi lớp màng mỏng, các tế bàongọn lửa hoạt động thành hình hầu, ống ruột và các đám phôi Trong 1 ốc có thể có 1 - 2 ấutrùng Khoảng 3 – 7 ngày, bào ấu sinh sản vô tính cho ra nhiều redia (lôi ấu) Một bào ấu sinh

ra 5 – 15 lôi ấu

Redia hình suốt chỉ, ít hoạt động, có miệng, hầu, ruột, hình túi đơn giản Có

2 hệ: Redia thế hệ I và redia thế hệ II cùng phát triển trong ốc – vật chủ trung gian Ở nhiệt độ160C hoặc thấp hơn, lôi ấu chỉ sinh sản Redia I và dừng phát triển, ở nhiệt độ thích hợp (20 –300C), sau 29 – 35 ngày, lôi ấu biến thành vĩ ấu (cercaria) Một redia có thể sinh ra 12 – 20cercaria

Cercaria (vĩ ấu) là ấu trùng sống ở pha sống tự do của sán lá gan, có cấu tạo thân hìnhtròn lệch, đuôi dài hơn thân giúp vĩ ấu di chuyển dễ dàng trong nước Cấu tạo của vĩ ấu gồmgiác miệng, giác bụng, hầu, thực quản và ruột phân thành

2 nhánh

Theo Giniecisz – Kaija (1960), trong cơ thể cercaria có những dạng glycogencung cấp năng lượng cho hoạt động sống của ấu trùng, đặc biệt là cho sự vận động khôngngừng của đuôi Đuôi là cơ quan vận động của vĩ ấu Theo một số tác giả đuôi làm nhiệm vụthay đổi vị trí của ấu trùng tronh môi trường nước Nhờ sự hoạt động tích cực của đuôi mà

vĩ ấu tiếp cận để bám vào các cây thủy sinh, tạo thành kén (Adolescaria)

Từ khi miracidium chui vào ốc đến khi phát triển thành cercaria cần khoảng thời gian

50 – 80 ngày Sau khi phát triển thành thục, cercaria thoát khỏi vỏ ốc, ra môi trường bênngoài, bơi tự do trong nước, có kích thước 0,28 mm– 0,30 mm chiều dài và 0,23 mm chiềurộng Sau vài giờ bơi trong nước, cercaria rụng đuôi tiết chất nhầy xung quanh thân nếu gặpkhông khí khô rất nhanh, lúc này cercaria đã biến thành adolesscaria

Adolescaria hình khối tròn, bên trong chứa phôi hoạt động, phôi có giác miệng, giácbụng, ruột phân nhánh và túi bài tiết, adolescaria thường ở trong nước hoặc bám vào cây cỏthủy sinh Nếu trâu, bò, nuốt phải adolescaria vào đến dạ

dày và ruột, lớp vỏ ngoài được phân hủy, ấu trùng được giải phóng và di chuyển

đến ống mật bằng 3 con đường

- Một số ấu trùng dùng tuyến xuyên qua niêm mạc ruột, vào tĩnh mạch ruột,

qua tĩnh mạch vào gan, xuyên qua nhu mô vào ống mật

- Một số ấu trùng khác cũng dùng tuyến xuyên chui qua thành ruột vào xoang bụngđến gan, xuyên qua vỏ gan vào ống mật

- Một số ấu trùng từ tá tràng, ngược dòng dịch mật để lên ống dẫn mật

Sau khi vào ống dẫn mật, ấu trùng kí sinh ở đó và phát triển thành sán lá gan trưởngthành Theo Skerman (1966), thời gian hoàn thành vòng đời là 9 – 117 ngày Fasciola trưởngthành có thể kí sinh trong ống dẫn mật của trâu bò 3 – 5 năm, có khi tới 11 năm

Theo Phan Địch Lân [13], tác giả sách Bệnh ngã nước trâu bò, NXB Nông nghiệp Hà

Nội cho biết, khoa học thú y nước ta đã nghiên cứu thành công vòng đời của sán lá gan trong

điều kiện nhiệt độ thích hợp (28-300C) có ốc vật chủ trung gian là Lymnae swinhoei và Lymnae viridis, vật chủ cuối cùng (trâu, bò, dê, cừu) thì vòng đời sán lá gan ở nước ta được

xác định với các mức thời gian sau:

- Ở ngoài thiên nhiên:trứng sán lá gan phát triển thành mao ấu (Miracidium)

trong khoảng 14 -16 ngày

- Ở trong ốc vật chủ trung gian: mao ấu (Miracidum) phát triển thành lôi ấu

(Redia) cần 8 – 21 ngày Lôi ấu (Redia) phát triển thành vĩ ấu (cercaria) non cần

7 – 14 ngày, thành vĩ ấu trưởng thành 13 – 14 ngày

- Ở ngoài ốc vật chủ trung gian: vĩ ấu phát triển thành kén (Adolescaria)

sau 2 giờ

- Ở trâu, bò: Khi trâu, bò, bê nghé nuốt phải adolescaria, sau 79 – 88 ngày trong ốngdẫn mật của trâu bò đã có sẵn sán lá gan trưởng thành đẻ trứng theo phân ra ngoài

Điều kiện nhiệt độ và độ ẩm của nước ta rất thuận lợi cho sự nhiễm và gây bệnh sán

lá gan (kế cả gây nhiễm và nhiễm tự nhiên) Ở những vùng có mầm bệnh tồn tại, trung bình 3tháng sán lá gan lại hoàn thành vòng đời trong cơ thể trâu, bò, nghĩa là trâu cứ trong vòng 3tháng lại sản sinh ra một đời sán lá gan mới, gây

tình trạng bội nhiễm sán lá gan, vì vậy cường độ nhiễm tăng lên theo tuổi thọ trâu, bò.

1.1.4 Trứng sán lá gan lớn

Hình thái: trứng SLGL có kích thước lớn nhất trong các loài sán lá, trứng

có màu vàng, hình elip đối xứng qua trục dọc, vỏ có nắp ở một đầu (Hình 1.3)

Kích thước: trứng sán lá gan có kích thước trung bình (140-172,3 ×

80-89,6) µm, dao động (130-150 x 60-90) μm có khi tới 152-198 x 72-94 μm [Tomimura,Nishitani., 1976] Trứng SLGL có phổ dao động kích thước rộng là do chúng tồn tại dưới 2thể: nhị bội (diploid form) và tam bội (triloid form)

Sức đề kháng của trứng: Trứng sán lá gan được thải theo phân động vật mắc bệnh rangoài môi trường ngoại cảnh Trứng rất nhảy cảm với môi trường khô hạn và tác động trựctiếp của ánh sáng mặt trời Ở trong phân khô, phôi ngừng phát triển và trứng sẽ chết sau 8 –

50C → -150C) Nhiệt độ 10 - 200C trứng ngừng phát triển Nhiệt độ 40 – 500C,

phôi chết sau vài phút [8]

1.1.5 Sán trưởng thành

Sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành có dạng giống hình chiếc lá, thân dẹt và bờ

mỏng, kích thước 20-30 x10-12 mm, màu trắng hồng hoặc xám đỏ, giác miệng (oral sucker)nhỏ, kích thước 1 mm, giác bụng (ventral suckers) to hơn, kích thước 1,6 mm Cơ thể sánđược bao phủ bởi một lớp cutile mỏng và có nhiều chóp nhỏ Chúng thường “bám dính” vớinhiều cơ quan khác của vật chủ thông qua các giác hút (một giác hút ở phía trước gọi là giácmiệng và một cái còn lại ở giữa gọi là giác bụng) Miệng thường nằm ngay ở giác miệng vànối với manh tràng, chia hai nhánh và mỗi nhánh mở rộng về một phía của cơ thể Đặc điểmchính của sán lá gan lớn là sự có mặt của các tế bào hình ngọn lửa trong hệ bài tiết của sán(Hình 1.4)

Sán lá gan lớn sinh sản lưỡng tính, bộ phận sinh dục có lỗ nằm gần giác bụng Cũngnhư nhiều loài sán lá khác, sán lá gan lớn lưỡng tính, có thể thụ tinh chéo hoặc tự thụ tinh,trong cơ thể sán có cả cơ quan sinh dục đực và cái Hệ thống sinh dục rất phát triển, tử cungsán chứa đầy trứng Sán có giác bụng và giác miệng, giác miệng đóng kín và không nối với cơquan tiêu hóa Sán không có hệ thống tuần hoàn, hô hấp và cơ quan thị giác, hệ bài tiết ởcuối thân

Hình 1.4 Hình thể sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành [70]

Cơ quan sinh dục đực bao gồm một hay nhiều tinh hoàn kết nối với một

ống đơn thuần hoặc một ống dẫn tinh lớn, nhờ vào một ống ngắn hoặc ống dẫn

tinh Ống dẫn tinh sẽ kết thúc bằng một cơ quan sinh dục đực Cơ quan sinh dục cái bao gồmmột buồng trứng duy nhất kết nối với ống dẫn trứng Ống dẫn trứng nối với vài ống hoặc ốngnoãn hoàng Ống dẫn trứng nối tiếp với ootype rồi được bao quanh bởi một khối tuyến ngoạitiết (tuyến Mehlis) Tử cung nằm ở cuối của ootype Sự tự thụ tinh hiếm khi xảy ra trong cácloài sán lá.

SLGL có cả những loại sinh tinh bất thường (abnormal spermatogenic type (AST) baogồm nhiễm sắc thể nhị bội (diploid form), tam bội (triloid form) và đa bội mà không thụ tinh

và loại sinh tinh bình thường (normal spermatogenic type (NST) của Fasciola sp được tìm

thấy ở một số quốc gia châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Nepal, Philippines, Thái Lan

và Việt Nam AST xảy ra đặc biệt ở Nhật Bản và Hàn Quốc Tại vùng Đông Nam Á, loài sán có

loại AST cùng khu vực phân bố với NST của F hepatica và NST của F gigantica Tương tự, tại châu Phi, chủ yếu gặp chủng F gigantica Ngược lại, ở châu Âu, phần Nam và Bắc Mỹ, châu Đại Dương là các địa danh phân bố chủ yếu của loài sán lá gan lớn F hepatica.

1.2.Đặc điểm của bệnh do sán lá gan lớn

1.2.1 Cơ chế sinh bệnh

Theo các nhà ký sinh trùng học, sán lá gan gây bệnh ở vật chủ bằng tác động của độc

tố, sự chiếm đoạt dinh dưỡng và tác động mang trùng Khi trâu bò mới nhiễm bệnh, sán lánon di chuyển trong cơ thể làm tổn thương ở ruột, thành mạch máu, nhu mô gan Một số ấutrùng có thể di chuyển “lạc chỗ” đến phổi, lách, cơ hoành, tuyến tụy…gây tổn thương hoặcxuất huyết nặng hoặc nhẹ Sán lá non xuyên qua các nhu mô gan làm các tổ chức gan bị pháhoại tạo ra các đường di hành đầy máu và mảnh tổ chức gan bị phá hủy Gan bị viêm từ nhẹđến nặng tùy theo số lượng ấu trùng nhiễm vào cơ thể Trâu bò có thể thiếu máu do xuấthuyết, có thể chết do mất máu

Tác động ảnh hưởng của sán lá còn tiếp tục khi sán lá đã đi vào ống dẫn mật, tiếp tụctăng lên về kích thước và phát triển thành sán lá trưởng thành xuyên qua kích thích niêmmạc ống mật bằng các gai cutin trên cơ thể gây viêm ống mật

Số lượng sán lá nhiều có thể làm tắc ống mật, mật ứ không xuống ruột được sẽ

tràn vào máu gây hiện tượng hoàng đản

Trong quá trình ký sinh sán lá thường xuyên tiết độc tố Độc tố tác động vào thànhống mật và mô gan, gây biến đổi đại thể và vi thể làm tăng quá trình viêm Đồng thời độc tốcủa sán lá còn hấp thu vào máu gây hiện tượng trúng độc toàn thân, gây hủy hoại máu, làmbiến chất protein trong máu, làm Albumin giảm, Globumin tăng Độc tố của sán lá còn làmtăng nhiệt độ cơ thể, tăng bạch cầu (đặc biệt là bạch cầu ái toan) và tác động vào thần kinh,làm cho con vật có triệu chứng thần kinh (run rẩy, siêu vẹo…) Độc tố của sán lá gan tác độngvào thành mạch máu, làm tăng tính thẩm thấu của thành mạch, gây hiện tượng thủy thũng,làm cho máu đặc lại Cũng do tác động của độc tố nên giữa các tiểu thùy gan có hiện tượngthẫm nhiễm huyết thanh và tế bào, hình thành nên các mô liên kết mới dọc theo các váchngăn của tiểu thùy gan và quanh ống mật, vì vậy các ống mật này cũng dày lên Quá trìnhviêm kéo dài làm cho các tế bào yêu cầu tăng sinh, thay thế những tế bào nhu mô gan, gâyhiện tượng sơ gan và teo gan.Khi trâu bò nhiễm sán lá gan nặng, hiện tượng sơ gan chiếmdiện tích lớn của gan, làm cho chức năng gan bị phá hủy Từ đó dẫn đến hàng loạt các rốiloạn khác như: rối loạn cơ năng dạ dày – ruột, thiếu máu, suy nhược, gầy dần, cổ chướng,xoang phúc mạc tích nước

Một tác động quan trọng của Fasciola khi ký sinh ở vật chủ là chiếm đoạt dinh dưỡng.Dinh dưỡng của sán lá gan là máu trâu, bò mà nó ký sinh Bằng phương pháp phóng xạ,người ta đã thấy mỗi sán lá ký sinh ở ống dẫn mật lấy

0,2ml máu mỗi ngày Như vậy nếu trâu bò nhiễm ít sán là thì vai trò chiếm đoạt dinh dưỡngkhông rõ, Nhưng nếu trâu bò có hàng trăm, hàng nghìn sán lá ký sinh thì lượng máu mất đirất nhiều

Ngoài các tác động gây bệnh trên, trong khi di hành, sán lá non còn mang theo cácloại vi trùng từ bên ngoài vào máu, gan và những cơ quan khác, gây những bọc mủ hoặc gâybệnh truyền nhiễm ghép với bệnh sán lá gan

Tất cả những tác động kể trên của sán lá gan lớn làm cho sức đề kháng của trâu, bògiảm sút nghiêm trọng dễ mắc các bệnh khác hoặc làm cho các bệnh trong cơ thể trâu, bònặng thêm lên.

Daves (1958) nhận xét rằng, gia súc bị suy nhược và thiếu máu là do độc tố của

F.gigatica, độc tố của sán lá còn tác động gây hiện tượng protein trong huyết thanh biến

chất lượng Albumin giảm và Globumin tăng Davtjan (1962) đã chứng minh, quá trình dị ứngcủa cơ thể trâu bò và kết quả tác động của các kháng nguyên sinh ra từ sán lá với kháng thểxuất hiện trong tổ chức gan, và các chất sinh ra từ các tổ chức khác bị hủy hoại Quá trình dịứng dẫn đến những rối loạn đầu tiên, biểu hiện bằng hiện tượng suy dinh dưỡng, thiếuvitamin A, bằng sự tăng quá nhiều bạch cầu ái toan trong cơ thể

Sán lá gan thường gây tổn thương gan và có thể gây nên những biến chứng nặng nề ởvật chủ Trâu bò được xem là vật chủ chính của sán lá gan lớn và người là vật chủ tình cờ do

ăn phải rau sống hoặc uống nước bị nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn [68]

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá Fasciola ở trâu, bò tại Việt Nam

Tại Việt Nam bệnh phát hiện ở khắp các tỉnh trên cả nước Houmeder (1938) đã điều

tra và thấy, trâu, bò ở miền Bắc Việt Nam đều nhiễm sán lá F.gigantica với tỷ lệ là 64,7% ở

trâu, 23.5% ở bò và đặc biệt có 2% nhiễm sán lá gan ở người

Ở trâu trưởng thành mắc bệnh sán lá gan do F.gigantica với tỷ lệ nhiễm

50% - 70% Theo Phan Địch Lân (1980), mổ khám 1043 trâu ở Thái Nguyên, số trâu nhiễmsán là 57%, trong đó có nhiều gan phải hủy bởi do số lượng sán lá quá nhiều Kết quả điều tra

ở huyện Bình Lục – Hà Nam, tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu là 51,2 – 57,5% [21]

Theo tác giả Đoàn Văn Phúc đã kiểm tra 64 bò tại trại bò sữa Hà Nội, thấy tỷ lệ nhiễmsán lá Fasciola là 73,43% Tác giả còn cho biết, bệnh sán lá gan đã ảnh hưởng rõ rệt đến sứckhỏe và sản lượng sữa của đàn bò [14] Tỷ lệ trâu bò khu vực Hà Nội nhiễm sán lá gan tỷ lệ53,41% [15]

Kết quả kiểm tra trâu, bò ở một số địa phương xung quanh Hà Nội, Bắc Giang, TháiNguyên, Hòa Bình, tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 44,53% Trong đó, trâu nhiễm 33,92%, bò nhiễm54,21% [22].

Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan ở gia súc nhai lại phụ thuộc vào các yếu tố sau:

- Yếu tố thời tiết, khí hậu và mùa vụ

Thời tiết khí hậu của một vùng, một khu vực có liên quan trực tiếp đến sự tồn tại của

ốc – vật chủ trung gian của sán lá gan Điều kiện ẩm ướt, mưa nhiều tạo ra môi trước nước,giúp ốc nước ngọt sống và sinh sản thuận lợi

Trâu bò bị nhiễm sán lá gan đều tăng lên vào mùa vật chủ trung gian phát triển.Những năm mưa nhiều, tỷ lệ nhiễm sán lá gan tăng lên so với những năm nắng ráo và khôhạn Mùa vụ gắn liền với sự thay đổi thời tiết, khí hậu Mùa hè thu, số lượng gia súc bị nhiễmsán lá gan tăng cao hơn so với các mùa khác trong năm Cuối mùa thu và mùa đông bệnhthường phát ra [8], [10], [20], [21]

- Yếu tố vùng và địa hình

Vùng và địa hình là hai khái niệm khác nhau song có liên quan chặt chẽ với nhau Cácvùng khác nhau có địa hình không giống nhau Địa hình là yếu tố quan trọng quyết định sựkhác nhau giữa các vùng

Các vùng khác nhau trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đều thuộc bốnloại địa hình: Ven biển, đồng bằng, trung du và miền núi

Hầu hết các nhà ký sinh trùng học đều thống nhất rằng, gia súc nhai lại ở vùng đồngbằng nhiễm sán lá gan nhiều nhất, tỷ lệ và cường độ nhiễm giảm dần đối với đàn gia súc ởvùng ven biển, vùng trung du và vùng núi Về nguyên nhân dẫn đến quy luật này, một số tácgiả đều giải thích do vùng đồng bằng có nhiều ao, hồ, kênh, rạch, có điều kiện cho ốc – vậtchủ trung gian sống và sinh sản Các điều kiện địa hình khác thì vấn đề này hạn chế hơn ởvùng đồng bằng [8], [20], [41], [58]

Theo số liệu đã điều tra 7359 trâu, bò ở miền Bắc Việt Nam, kết quả cho thấy: Trâu,

bò ở vùng đồng bằng nhiễm sán lá gan cao nhất, sau đó đến vùng trung

du, vùng ven biển và vùng núi Bình quân tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở các vùng điều tra như sau:vùng đồng bằng từ 19,6% - 61,3%; vùng trung du 16,4% - 50,2%; vùng ven biển 13,7% - 39,6%;vùng núi 14,7% - 44%) Tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu bò qua mổ khám vùng đồng bằng là 88%,vùng trung du là 77,6% [13].

- Yếu tố loài và tuổi vật chủ cuối cùng

Các loài nhai lại đã được thuần hóa như trâu, bò, dê, cừu đều nhiễm sán láFasciola Ngoài ra các loài nhai lại hoang dã cũng nhiễm sán lá này (hươu, nai, hoẵng…),cũng có trường hợp thỏ, ngựa, lợn kểcả người cũng có thể nhiễm sán Fasciola

Ở nước ta, loài gia súc nhiễm sán lá Fasciolanhiều nhất là trâu (79,6%), bò ít hơn(36%), dê ít nhất (20%) Sở dĩ trâu nhiễm sán lá gan nhiều nhất là đặc tính ưa nước của chúng(thích ăn gần chỗ có nước, đằm, tắm trong nước và uống nước ở vũng, ao, kênh rạch) trongkhi bò và dê ít ưa nước hơn [8] , [21]

Về mối liên quan giữa tỷ lệ, cường độ nhiễm sán lá gan và tuổi vật chủ, các tác giả đềuthống nhất rằng, tuổi trâu, bò càng cao tỷ lệ và cường độ nhiễm càng tăng lên Một điều dễnhận thấy là trâu, bò tuổi càng tăng lên (thời gian sống càng dài) thì sự tiếp xúc với môitrường ngoại cảnh càng nhiều, cơ hội gặp và nuốt phải nang ấu (Adolescaria) càng cao Mặtkhác sán lá Fasciola trưởng thành có thời gian ký sinh ở trâu bò nhai lại tương đối dài (3 đến

5 năm, thậm chí lên tới 11 năm) Đó chính là cơ sở khoa học giải thích cho quy luật nhiễm

theo tuổi vật chủ của sán lá Fasciola sp.

Theo tác giả Phan Địch Lân cho biết, trâu dưới 3 năm tuổi chỉ nhiễm sán lá gan17,2 -22%; trâu 3 – 5 năm tuổi nhiễm sán lá gan 31,2% -40,2%; trâu 5 – 8 năm tuổinhiễm 42,4% - 57,5%; trâu 8 năm tuổi nhiễm56,8% -

66,3%; trâu ở độ tuổi phế canh (loại thải) khi mổ khám thấy tỷ lệ nhiễm cao tới 84,6%(những trâu này tỷ lệ nhiễm rất nặng, gan phải hủy bỏ toàn bộ do quá nhiều sán kýsinh) [13]

Nguồn gieo rắc bệnh chủ yếu là trâu, bò, dê, cừu… và những dã thú mang

Fasciola Trứng sán lá gan theo phân của trâu bò ra ngoài tự nhiên Hàng năm mỗi

sán lá gan đẻ ra hàng chục vạn trứng Vì vậy mỗi trâu, bò mang sán lá gan hàng năm thải khốilượng trứng khá lớn ra đồng cỏ và các bãi chăn thả Những đồng cỏ ẩm thấp lầy lội là nhữngnơi cần thiết để mầm bệnh phát triển và xâm nhập vào trâu bò, đồng thời cho trứng nởthành Miracidium và thuận lợi cho vật chủ trung gian tồn tại và phát triển.

- Vật chủ trung gian của Fasciola sp

Sự phân bố của các loài ốc – vật chủ trung gian của san lá gan phụ thuộc vào các vùng

địa lý khác nhau Vật chủ trung gian của sán lá Fasciola là các loài ốc nước ngọt Lymnaea: L auricularia, ở nhật Bản là L pervia, ở Indonesia, ở Philippine là L viridis, ở Hungari là G truncatula [8].

Ốc G truncatula là loài ốc nhỏ, dài 10mm, rộng 5mm, vỏ màu xám, đầu dài, có 4 - 5

gai thịt Nhiệt độ tốt nhất để loài ốc này phát triển là 20 – 220C, pH

Phan Địch Lân và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của ốc – vật chủ trung

gian của F gigantica ở miền Bắc Việt Nam Tác giả cho biết, vật chủ trung gian của sán lá Fasciola là hai loại ốc nước ngọt thuộc giống Lymnae với tên gọi là ốc vành tai (L.swinshoei)

và ốc chanh (L viridis) Loài L swinshoei cỏ vỏ mỏng, dễ vỡ, không có nắp miệng, kích thước 20mm, vòng xoắn cuối cùng rất lớn, chiếm gần hết phần thân, vỏ loe ra như vành tai Loài L viridis cũng có vỏ mỏng, không có nắp miệng, kích thước 10mm, vỏ dễ vỡ, có 4 – 5 vòng xoắn

cuối cùng lớn

Ốc L viridis thường sống ở những nơi có nước xâm nhập lớn, đẻ trứng thành

ổ 7 – 10 trứng, sau 7 ngày nở thành ốc con, ốc L swinshoei thường sống trôi nổi ở

cống, rãnh, ao, hồ, đẻ trứng quanh năm, mỗi ổ có 60 – 150 trứng Trong điều kiện nhiệt độ của nước ta ốc đẻ quanh năm và quanh năm có ốc con nở ra.

Loài ốc L swinshoei phân bố nhiều hơn ở đồng bằng, trong khi ốc L viridis phân bố

nhiều hơn ở vùng núi, trung du và ven biển Theo kết quả nghiên cứu của tác giả thì cà hailoài ốc này đều xuất hiện trong cả 12 tháng của năm, nhưng mật độ (tính trên 1m2) khác

nhau theo từng vùng: vùng đồng bằng, mật độ ốc L swinshoei cao hơn và phân bố đều hơn

trong năm Cụ thể ở Mỹ Hào (Hưng Yên) bình quân mật độ là 110,4 con/ m2, ở Bình Lục (Hà

Nam) 116,2 con/ m2, còn ốc L.viridis thì xuất hiện với mật độ cao hơn ở các vùng núi là 75%, trung du 66,5%, ven biển 42% Từ đó, tác giả nhận xét rằng, L swinshoei chịu nước hơn, L.viridis chịu cạn hơn [13].

Sự tồn tại và phát triển quanh năm, ở tất cả các vùng ốc – vật chủ trung gian là điềukiện quan trọng nhất làm cho tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu bò cao và phổ biến ở tất cả cácvùng Nước ta được xếp vào 1 trong 5 nước ở châu Á trồng lúa nước có đàn trâu, bò có tỷ lệbệnh nhiễm sán lá gan cao nhất Kết quả điều tra ở một số vùng cho thấy:

Ở 11 tỉnh miền núi, tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu, bò là 39%

Ở 4 tỉnh trung du, tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu, bò là 42,2 %

Ở 5 tỉnh thuộc vùng đồng bằng, tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 57,5%

Ở 6 tỉnh thuộc vùng ven biển, tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 36,7%

Kết quả điều tra giữa tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan của ốc – vật chủ trung gian với tỷ

lệ nhiễm sán lá gan của trâu, bò có mối tương quan thuận, nghĩa là nếu tỷ lệ nhiễm ấu trùngsán lá gan nước ngọt cao thì tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu, bò khu vực đó cũng cao [9]

Khi phát triển đến giai đoạn nang ấu (Adolescaria), sức đề kháng của chúng tăng lên

rõ rệt Adolescaria có khả năng tồn tại ở (-40C - 60C), ở điều kiện nhiệt độ bình thườngnhững Adolescaria có trong cỏ khô bị ẩm và trong môi trường nước có thể tồn tại đến trên 5tháng [41]

1.3 Tầm quan trọng của nghiên cứu giám định loài bằng phương pháp sinh

[65]

Hiện nay, sự phát triển của sinh học phân tử trong chẩn đoán đã giúp phân định đượcloài ký sinh trùng có liên quan mật thiết với nhau mà nếu chỉ dựa trên hình thái học đơn thuần

sẽ không thể phân tách ra được Đây là trường hợp phân loại ở SLGL của Nhật Bản và Hàn

Quốc, ở Ai Cập và cả ở Việt Nam - nơi mà giữa F hepatica và F gigantica thường khó

phân định chính xác loài [25], [53], [54]

Giải trình tự nucleotide rất có giá trị trong chẩn đoán khi phân biệt giữa các loài

Fasciola sp với nhau, chẳng hạn nucleotide của vùng giao gen trong hệ gen nhân (second internal transcribed spacer-ITS2), kết hợp trình tự nucleotide của nad1 (NADH dehydrogenase subunit1) và cox1 (cytochrome oxidase subunit 1) của gen ty thể [23], [33],

Tại Việt Nam, gần đây một số tác giả trong nước bắt đầu ứng dụng các kỹ

thuật sinh học phân tử, công nghệ gen trong lĩnh vực ký sinh trùng và đặc biệt nghiên

loài F gigantica [6], [3], [65], [46].

1.3.1 Giới thiệu sơ bộ hệ gen nhân ribosomal DNA (rDNA)

Vùng gen ribosome (rDNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có nhiều bản sao

và không mã hóa cho bất kỳ protein nào Đây là vùng gen bảo tồn nên được xem là cơ sởchính xác để tìm ra sự tương đồng và khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóngvai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh loài và phát hiện lai giữacác loài

Vùng gen rDNA chứa 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA, ITS1, 5.8S

rRNA, ITS2, 28S rRNA và 3' ETS Gen ITS-1 và ITS-2 (internal transcribed spacer 1 and 2) với

hai đầu biên là IGS (intergenic spacer là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA) (Hình 1.5)

Vùng 5,8S – rDNA là vùng có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi [60] Vùng ITS rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứutiến hóa của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định cácbiệt hóa trong cùng loài để xác lập phả hệ di

-truyền [32]

External transcribed spacer ( ETS)

Intergenicspacer

( IGS) Internal transcribed

spacer (ITS )

28S 18S

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc ribosome DNA của gen nhân và vùng gen nghiên

cứu (vùng gen ITS-2 và gen 28S được đánh dấu bằng khoanh vòng) [46]

Các cặp mồi (primer) thường được thiết kế trên những oligonucleotide có tínhbảo tồn cao được sử dụng cho tất các sinh vật cùng loài nhằm khuếch đại các vùng tươngđương dùng trong so sánh, t ạo phả hệ di truyền Ngoài ra nhiều primer và probe cũngđược thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh sinhvật [62].

Trong nghiên cứu, chúng tôi thiết kế các primer cũng dựa trên các vùng của hệgen nhân là ITS-2 và gen 28S của cấu trúc ribosome DNA (rDNA) (Hình 1.5)

Vùng gen ITS-2 và 28S thu nhận bằng phương pháp PCR, giải trình tự nuleotide và

so sánh với các cơ sở dữ liệu có trong Ngân hàng gen (GenBank) để xác định tên loài, tuynhiên nếu chỉ dựa vào vùng ITS-rDNA sẽ không hoàn toàn chính xác vì trong các loài vẫn

có sự tương đồng lớn về trình tự vùng này và đây là vùng rất bảo tồn Do vậy, cần kếthợp giải trình tự các vùng gen chuyên biệt của hệ gen nhân song song với hệ gen ty thể

chẳng hạn như gen atp6,cob, cox1, nad1 trong các nghiên cứu thẩm định và chẩn đoán.

1.3.2 Hệ gen DNA ty thể

DNA ty thể quy định tính di truyền theo dòng mẹ, có kích thước khoảng

16 - 30 kb, bao gồm 36 - 37 gen mã hóa cho sản phẩm protein và một số vùng không mã hóa cần thiết cho sự sao chép và phiên mã (Hình 1.6)

Ngoài các gen mã hóa protein, hệ gen ty thể ký sinh trùng và động vật còn có 2 gen

RNA ribosome (rRNA) là 12S rRNA (hay rrnS) và 16S rRNA (hay rrnL), 22 gen RNA vận chuyển

(tRNA) và một vùng không gen không mã hóa protein, có độ dài ngắn phụ thuộc vào từngloài động vật [28], [48], [34]

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc DNA của hệ gen ty thể Vùng gen COX1 trong

nghiên cứu được đánh dấu bằng vòng tròn [46]

Những ưu điểm của hệ gen ty thể:

- Kích thước hệ gen ty thể nhỏ hơn so với hệ gen nhân tế bào, ty thể chứa đầy đủ cácgen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên DNA ty thể được coi là đối tượng đểkhảo sát sự biến đổi trong hệ gen về chẩn đoán, giám định, phân loại, dịch tễ học và ditruyền quần thể [28], [48]

- Gen ty thể trong cùng loài hoặc có quan hệ cận loài sinh học có tính bảo tồn rất caonên bất kỳ sự thay đổi nhỏ nào cũng là giá trị được phản ánh trong giám định, phân loại vànghiên cứu di truyền học [31]

- Hệ gen ty thể cung cấp nguồn dữ liệu quý giá về chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vềmối quan hệ giữa loài và loài (nội loài và ngoại loài) trong giám định phả hệ và dịch tễ học[66] Ngoài ra, sự hiểu biết đây đủ về hệ gen ty thể của ký sinh trùng còn có giá trị lớn trongchẩn đoán và phòng chống bệnh nhằm tìm kiếm các loại hóa chất, hóa dược đặc hiệu trongphòng và điều trị bệnh hiệu quả [34], [48]

Đối với Fasciola sp và bệnh SLGL, việc chẩn đoán bằng chỉ thị ty thể (mitochondrial

marker) kết hợp với chỉ thị hệ gen nhân (nuclear marker) đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề về phânloại, phân bố, hiện tượng lai trong quần thể, di truyền phân tử và tiến hóa loài [24], [38], [39],[46], [47], [51], [52], [55]

Thông tin về dữ liệu gen học của toàn bộ hệ gen ty thể mới chỉ mang tính chất cục

bộ đối với mỗi quốc gia, đặc biệt là ở Việt Nam khi nổi cộm vẫn là đã phát hiện loài lai kísinh gây bệnh không những ở động vật mà còn trên người với số ca bệnh ngày càng tăng,thì những dữ liệu về toàn bộ một hệ gen ty thể và vùng giao gen IGS hoàn chỉnh không cónhiều để so sánh Trong tổng số hơn 30 hệ gen của các loài sán dẹt đã được giải mã toàn bộ

hệ gen ty thể mới chỉ có dữ liệu của một loài SLGL F hepatica của Úc (Australia) đã được

giải trình tự và công bố và số đăng ký trong Ngân hàng gen là AF216697 [45]

Hiện nay, sử dụng phương pháp sinh học phân tử PCR và giải trình tự không nhữnggiúp làm sáng tỏ mối quan hệ dịch tễ học của bệnh, mà còn cho phép chẩn đoán bệnh mộtcách chính xác với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp cung cấp thông tin về nguồn và đườnglan truyền của các tác nhân gây bệnh để có thể đề xuất biện pháp điều trị can thiệp phù hợp

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm sán lá gan lớn trưởng thành được phân lập từ trâu, bò tại một số địaphương của Việt Nam được thu tại vùng núi phía Bắc thuộc tỉnh Cao Bằng và vùng đồng bằngthuộc tỉnh Ninh Bình Chọn lọc sơ bộ hình thái để tiến hành tách DNA tổng số

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 10/2014 – 06/2015

Địa điểm nghiên cứu: tại phòng Miễn Dịch học, Viện Công nghệ sinh học thuộc

Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.3 Dụng cụ và thiết bị và hóa chất

2.3.1 Dụng cụ, trang thiết bị

- Máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc., Mỹ)

- Máy ly tâm eppendorf (Centrifuge 5415D)

- Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin- Wealtec (Mỹ)

- Bộ điện di ngang và nguồn điện di (Bio-Rad)

- Box cấy vô trùng

- Máy lắc có điều nhiệt để nuôi tế bào

- Máy hút chân không Speed-Vac

- Máy vortex,lò vi sóng,tủ lạnh -20oC, tủ lạnh-80oC(SANYO-Nhật Bản)…

- Các bộ pipetman (10µl, 20µl, 100µl, 1000µl) của hãng Gilson (Pháp), đầu côn cácloại, đĩa petri, chai pyrex các loại pha môi trường và ống nuôi vi khuẩn…

2.3.2 Hóa chất

+ Các loại hóa chất:

- Yeast extract (DIFCO-Mỹ); trypton (DIFCO-Mỹ); EDTA, SDS, tris (Sigma-Mỹ),acidacetic (Merk-Đức); kanamycin, ampicilin (Merk-Đức); x-gal (Sigma-Mỹ),agarose (Sigma-Mỹ),cồn tuyệt đối (Prolabo-Pháp)…

+ Các bộ kit sử dụng:

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Bioneer (Hàn Quốc)

- Kit tinh sạch elution “thôi gel” của Qiagen (Mỹ)

- Các loại enzym giới hạn EcoRI, BamHI, NotI, SmaI, DraI… của các hãng New

England - BioLabs (Mỹ), Fermentas (Lithuania)

Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ sinhhọc với các trang thiết bị của phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, kết hợp với một

số đơn vị trong và ngoài nước trong quá trình giải trình tự

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu được trình bày ở Hình 2.1

Mẫu SLGL Tách DNA tổng số Thực hiện PCR Giải trình tự (Sequencing)

Xử lý chuỗi nucleotide Truy cập ngân hàng gen

Phân tích đặc tính SHPT Xây dựng cây phả hệ

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể Fasciola sp.

2.4.1 Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu Fasciola sp

Mẫu bệnh phẩm được rửa sạch bằng nước muối sinh lý và cố định trong cồn 70% vàbảo quản lạnh ở -200C, cho đến khi sử dụng

Các mẫu sán được cắt lấy một phần nhỏ ở rìa để tách DNA tổng số Tách chiết bằng

bộ kit QIAampDNA Mini kit (QIAGEN Inc) Các DNA tổng số sẽ được dùng làm nguyên liệukhuôn, cho phản ứng PCR trong nghiên cứu

2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của từng mẫu riêng biệt được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN Inc (Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất DNA tổng số được kiểm tra nồng độbằng cách đo OD (Optical Density) trên máy đo quang phổ kế Nanodrop 1000spectrophotometer hoặc điện di trên thạch agarose 1%

Bước 2: Thêm 200µl dung dịch tissue lysis buffer (ATL) Bổ sung 20µl proteinase K(50mg/ml) + 4µl Rnase – A (100mg/ml), ủ trong bể điều nhiệt ở 550C trong 2 - 3 giờ, thỉnhthoảng vortex cho đến khi mô được phân hủy hoàn toàn

Bước 3: Bổ sung 200 µl dung dịch binding buffer (AL), lắc mạnh rồi ủ ở

700C trông 30 phút

Bước 4: Thêm 200µl dung dịch izopropanol – 2 , vortex khoảng 15 giây

Bước 5: chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm 10.000 vòng/phúttrong 1 phút, loại bỏ phần dung dịch phía dưới cột lọc

Bước 6: Thêm 500µl dung dịch washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa DNA đãbám vào màng của cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dướicột

Bước 7: Thêm 500µl dung dịch (Washinh buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa

DNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới Ly tâm lại

13.000 vòng/ phút trong 1 phút (để làm khô màng)

Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 60 µl dung dịch elutionbuffer (EL), để ở nhiệt độ phòng trong 2 – 5 phút Sau đó ly tâm

13000 vòng/phút trong 2 phút Bỏ cột, giữ lại dịch bên dưới

Ghi ký hiệu mẫu DNA tổng số và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng

2.4.3 Thiết kế mồi, thực hiện PCR gen ITS2, 28S và gen cox1

2.4.3.1 Thiết kế mồi

Đoạn gen cox1 của hệ gen ty thể sán lá gan Fasciola chứa gen mã hóa protein cox1;

gen ITS-2 và gen 28S là đoạn gen không mã hóa trong hệ gen nhân được lựa chọn để thunhận gen bằng phương pháp PCR và giải trình tự, phân tích và so sánh với các loài sán lá gan

và sán lá khác

Các mồi được thiết kế dựa trên trình tự các gen có trong ngân hàng gen Mồi

đặc hiệu được sử dụng 3SF-BD2R, U28SF-U28SR, FSP12F-FGHR2 (bảng 2.1)

Bang 2.1.Danh sách cac môi dung trong phan ưng PCR thu nhận gen ITS-2,

28S và COX1.

Chuỗi

gen

Tên primer Trình tự chuỗi primer (5’→ 3’)

Kích thước chuỗi gen

2.4.3.2 Phương pháp thực hiện PCR và điện di kiểm tra sản phẩm

Mẫu được kiểm tra hình thái học để sàng lọc lựa chọn các mẫu cần tách

DNA, thực hiện PCR sử dụng vùng giao gen ITS-2 giữa gen 5.8S và 28S ribosome

của hệ gen nhân Ngoài ra còn sử dụng các cặp mồi được thiết kế cho phản ứng PCR nhân

vùng gen cox1 của hệ gen ty thể và gen 28S của gen nhân trong nghiên cứu về loài sán lá gan lớn Fasciola sp.

Gen 28 S: Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 94oC/5 phút

(1 chu kỳ); 35 chu kỳ cho các bước: (94oC/30 giây; 50oC/30 giây; 72oC/2 phút);

72oC/10 phút (1 chu kỳ cuối cùng); bảo quản sản phẩm tạm thời ở 4oC

Cox1: Sử dụng bộ kit PCR Master mix (Fermentas) thực hiện PCR Hỗn hợp PCR (50µl), gồm 25 µl PCR mastermix (Fermentas), 2 µl mỗi loại mồi (10 pmol/µl), 3 µl khuôn DNA, 2

µl DMSO (dimethyl sulfoxide) và 16 µl nước khử ion DEPC Phản ứng khuếch đại PCR đượcthực hiện trên máy MJ PTC-100 (USA), chu trình nhiệt gồm: 1 chu kỳ ở 95oC/5 phút, 35 chu

kỳ ở [94oC/1 phút,

52oC/3 phút; 72oC/2 phút], chu kỳ cuối ở 72oC/10 phút

Nguyên lý của điện di:

Dựa trên tính chất hóa học của acid nucleic là: các acid nucleic mang điện tích âmtrong môi trường pH trung tính do đó các gốc phosphat ở khung phosphatdiestetrong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi chúng di chuyển về cựcdương và dừng lại ở điểm có pH đẳng điện (pHi) đặc trưng của mỗi phân tử acid nucleic, tốc

độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử acid nucleic (loại có trọng lượng phân tử lớn

di chuyển chậm hơn loại có trọng lượng phân tử nhỏ) và môi trường đệm điện di Sản phẩmPCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% sử dụng bộ điện di DNA (Bio-Rad) vàchụp hình sản phẩm điện di trên máy soi gel

Các bước tiến hành:

Chuẩn bị gel agarose 1%: Lấy 0,4g agarose nguyên chất (dạng bột), cho vào cốc đongthủy tinh chịu nhiệt đổ vào đó 40ml dung dịch TAE 1 lần (TAE có thành phần gồm: Tris, acidacetic glacial, EDTA), cho vào lò vi sóng đặt nóng chảy trong 2 phút sao cho agarose 1% tanchảy hết Đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di đã gài sẵn lược có nhiều răng, đổ thạchngập răng lược khoảng 0,5

mm và để nguội ở nhiệt độ phòng (khoảng 20-30 phút) Khi nguội các răng lược tạo thành các lỗ để tra mẫu vật vào kiểm tra.

- Dìm ngập khay thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần

- Tra mẫu: Lấy 10µl sản phẩm PCR trộn với 2µl chỉ thị màu xanh (xanh

Bromophenol) tra riêng biệt vào từng giếng

- Tra chỉ thị phân tử: Lấy 6µl chỉ thị phân tử DNA marker, ở đây chúng tôi sử dụng

DNA của thực khuẩn thể lamda (λ) được cắt bằng enzyme giới hạn HindIII Chỉ thị phân tử

DNA được cắt thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb;

9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb Nhờ chỉ thị phân tử DNA mà có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu

- Chạy điện di ở 100V trong thời gian khoảng 30 - 35 phút

- Nhuộm gel chứa sản phẩm PCR trong dung dịch Ethidium Bromide

(2µg/µl) trong 10 phút

- Rửa gel bằng nước cất sau đó đưa bản gel lên soi qua tia cực tím (UV) và chụp ảnhtrên máy Dolphin-DOC (Wealtech-Mỹ)

2.4.4 Phương pháp giải trình tự

Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa và hoạt động của enzyme DNA

– polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, enzyme DNA – polymerase xúc tác gắn cácnucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3‘ có chứa nhóm (OH)- tự do, khi gặpnucleotide không chứa nhóm 3‘-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp dừng lại Đặc trưng củaphương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừngphản ứng một cách ngẫu nhiên Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau

và chỉ sai khác nhau một nucleotide

Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao gồm:

vùng liên kết, mồi bám và enzym Taq-polymerase cùng các điều kiện thích hợp

Thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP)

và 1% dideoxy NTP (ddNTP) tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên

thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng cho phản ứng nối dài chuỗi đơn

nucleotide dừng lại ngẫu nhiên)

Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5‘→3‘ dùng thuốc nhuộmhuỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazerdọc theo chuỗi để đọc trình tự Phân tích tự động bằng máy với các chương trình phần mềmtin–sinh học

Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo chiều 5‘→3‘.Mỗi lần giải tình tự, chuỗi thô (có thành phần DNA ban đầu chưa được xử lý) có độ dàikhoảng vài trăm đến vài nghìn nucleotide, thông thường là từ 500 -1000 nucleotide

2.4.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Trình tự DNA thu nhận được từ máy giải trình tự, được cung cấp ở hai dạng: chuỗinucleotide thô ở dạng chữ (.txt) và chuỗi nucleoide ở dạng giản đồ chromatogram (.ab1).Chuỗi ở dạng (.txt) cho phép nhận biết chuỗi giải trình tự có đạt yêu cầu hay không, cònchuỗi nucleotide ở dạng (.ab1) cho phép đưa các chương trình chuyên biệt (ví dụ: Chromas,BioEdit, SeqEd) để phân tích, biên tập chuỗi thô với mục đích xác định chính xác từngnucetide để có chuỗi cuối cùng (chuỗi tinh hay chuỗi đã biên tập) Cuối cùng, chuỗi đã đượcbiên tập (edited) được sử dụng ở dạng txt, vì ở dạng này, tất cả các chương trình tin-sinhhọc phân tích gen (ví dụ: MEGA, GeneDoc, Mac Vector) đều có thể nhận biết

Các chuỗi nucleotide hay amino acid được so sánh, sắp xếp và tính toán mức độ đồngnhất (identity) và tương đồng (homology) bằng chương trình GeneDoc2.7 làm dữ liệu chuyểnnạp vào MEGA6.06 cho phân tích phả hệ

* Chương trình so sánh và phân tích GeneDoc:

GeneDoc là một chương trình nổi (interface application) được lập trình cho máy tính

PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở dạng

.msf (multiple sequence file [56]

Sử dụng chương trình GeneDoc cho phép xác định trình tự amino acid suy diễn, đưa

ra cấu hình của các chuỗi đã được so sánh để chuyển nạp và MEGA cho phân tích phả hệ

* Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA):

MEGA (Molecular Eolutionary Genetics Analysis) làm một chương trình nối giao diện(interface application) được lập trình dễ sử dụng cho các nhà nghiên cứu di truyền học phân

tử với mục đích so sánh đối chiếu các chuỗi gen đồng chức năng từ các chủng loài trong cùnggiống/chi thuộc cùng một họ từ đó suy ra mối quan hệ nguồn gốc và phả hệ ở góc độ tiếnhóa phân tử [61]

* Xử lý số liệu trong nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xử lý giản đồ chromatogram của chuỗi nucleotidethô bằng chương trình SeqEdv1.03, sau đó so sánh các chuỗi sử dụng chương trìnhAsemblyLIGN v1.9 và phân tích thành phần nucleotide và amino acid hoặc các đặc tính gen vàchuỗi polypeptide bằng hệ chương trình MacVector

8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh Các trình tự nucleotide hay amino

acid được sắp xếp và tính toán mức độ tương đồng bằng chương trình GeneDoc

2.7, phân tích và xây dựng phả hệ bằng chương trình MEGA6.06 [61], trên máy tính PC

Các chuỗi gen cox1, ITS-2 và 28S được sử dụng để phân tích, so sánh về thành phần

nucleotide và amino acid, cũng như phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các chủng Fasciola sp

của Việt Nam và thế giới So sánh đối chiếu, phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các chuỗi thunhận trong nghiên cứu với các chuỗi đã công bố của Việt Nam và thế giới đă đăng ký trongNgân hàng gen

Mối quan hệ phả hệ nguồn gốc dựa trên trình tự nucleotide hoặc amino acid của một

phân đoạn gen giữa các chủng Fasciola sp sử dụng bằng phương pháp “kết nối liền kề“ (NJ,

Neighbour-Joining), với hệ số kiểm định tin tưởng (bootstrap) là 1000 lần [61]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Thunhận gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt

3.1.1 Thu thập mẫu sán lá gan lớn và phân loại hình thái

Các mẫu sán lá gan lớn gây bệnh trên bò của địa danh tỉnh Cao Bằng và trên trâu tỉnh Ninh Bình được thu nhận và bảo quản trong cồn 70o Tổng mẫu của

tỉnh Ninh Bình gồm 05 mẫu; số mẫu của tỉnh Cao Bằng gồm 16 mẫu

FspNB-VN A FspCB-VN B

Hình 3.1 Hình ảnh sán lá gan lớn FspNB-VN và FspCB-VN trong nghiên cứu

Sơ bộ phân loại về hình thái, chúng tôi chọn 01 con sán lá gan lớn có hình dạng dài

giống F gigantica (Hình 3.1A) được ký hiệu là FspNB-VN và 01 con của Cao Bằng (Hình 3.1B), chọn con số 11 có hình dạng giống chiếc lá và bề ngang ngắn, giống F hepatica, ký hiệu là

FspCB-VN để tách DNA tổng số bằng

bộ kit QIAamp DNA Mini kit (Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.1.2 Sử dụng gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt

Mẫu sán lá gan lớn FspCB-VN (Cao Bằng) và FspNB-VN (Ninh Bình) được tách DNAtổng số làm khuôn cho phản ứng PCR Các chuỗi gen ITS-2 được nhân lên bằng phản ứng PCRvới các cặp mồi 3SF – BD2R Vùng giao gen ITS-

2 có độ dài khoảng 550 bp (gồm cả phần 5,8S và 28S của mồi bám vào) Kết quả

PCR được trình bày ở hình 3.2

Hình 3.2 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR của vùng gen ITS-2.

1 Sản phẩm PCR của mẫu FspNB có kích thước ~ 0,5 kb;

2 Sản phẩm PCR của mẫu FspCB có kích thước ~ 0,5 kb; M: Chỉ thị

phân tử Lamda cắt bằng enzyme HindIII

Hình ảnh ở hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR có độ dài đúng với dự kiến (~ 0,5 kb) làmột băng DNA sáng rõ, đơn băng chứng tỏ cặp mồi bám đặc hiệu và chu trình nhiệt phù hợp.Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit AccuPrep™ Gel Purification Kit (Bioneer, HànQuốc)

Sử dụng chuỗi nucleotide của FspNB-VN và FspCB-VN để blast vào Ngân hàng gen thunhận các chuỗi tương ứng So sánh và đối chiếu trình tự gen ITS-2 của 16 chuỗi, trong đógồm: 2 chuỗi trong nghiên cứu và 14 chuỗi nucleotide gen ITS-2 đã đăng ký trong Ngân hànggen được sắp xếp và trình bày ở hình 3.3

Trình tự nucleotide gen ITS-2

* 20 * 40 * 60 *

FspNB-VN-3 :

ATAAACTATCACGACGCCCAAAAAGTCGTGGCTTGGGTTTTGCCAGCT GGCGTGATCTCCTCTATGAGTAATCAT : 75

FspCB-VN-3 : : 75

Fsp(Hel)CN : : 75 FspSaita-J : : 75 Fg-GX-CN-A : : 75

Fg-TL-AB20 : : 75

FspBDB-VN- : : 75

Fg(IndoT)- : : 75 Fh-UR-AB01 : : 75

FspHokai-J : : 75 Fh-IR-AB20 : : 75

Fh(Ca)SP-A : : 75 Fh-FR-AJ55 : : 75 Fsp-GHL-20 : : 75

Fsp(hu)-TL : : 75 FspCB-Khan : :

75 80 * 100 * 120 * 140 *

FspNB- GTGAGGTGCCAGATCTATGGCGTTTCCCTAATGTATC 1 FspCB-

VN-3 : : 1 5 Fsp(Hel)

CN : : 1 5 FspSait

a-J : : 1 5 Fg-GX-

CN-A : : 1 5 Fg-TL-

AB20 : : 1 5 FspBDB

-VN- : : 1 5 Fg(Indo

T)- : : 1 5 Fh-UR-

AB01 : : 1 5 FspHok

ai-J : : 1 5 Fh-IR-

AB20 : : 1 5 Fh(Ca)S

P-A : : 1 5 Fh-FR-

AJ55 : : 1 5 Fsp-

GHL-20 : 1 5 Fsp(hu)-

TL : : 1 5 FspCB- : 1 FspNB- 160 * 180 * 200 * 2 FspCB-

VN-3 : T : 2 2 Fsp(Hel)

CN : T : 2 2 FspSait

a-J : C : 2 2 Fg-GX-

CN-A : : 2 2 Fg-TL-

AB20 : : 2 2 FspBDB

-VN- : : 2 2 Fg(Indo

T)- : : 2 2 Fh-UR-

AB01 : T : 2 2 FspHok

ai-J : T : 2 2 Fh-IR-

AB20 : T : 2 2 Fh(Ca)S

P-A : T : 2 2 Fh-FR-

AJ55 : T : 2 2 Fsp-

GHL-20 T : 2 2 Fsp(hu)-

TL : T : 2 2 FspCB- T : 2 FspNB- * 240 * 260 * 280 * 3 FspCB-

VN-3 : T C C : 3 Fsp(Hel)

CN : T C C : 3 FspSait

a-J : : 3 0 Fg-GX-

CN-A : : 3 0 Fg-TL-

AB20 : : 3 0 FspBDB

-VN- : : 3 0 Fg(Indo

T)- : : 3 0 Fh-UR-

AB01 : T C C T : 3 FspHok

ai-J : T C C : 3 Fh-IR-

AB20 : T C C : 3 Fh(Ca)S

P-A : T C C : 3 Fh-FR-

AJ55 : T C C : 3 0 Fsp-

GHL-20 T C C : 3 Fsp(hu)-

TL : T C C : 3 FspCB- T C C 3 * 320 * 340 * 360 FspNB-