Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây tốc thằng cáng (anodendron paniculatum (wall ex roxb ) a DC )” tt

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC …………***………… HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC THẰNG CÁNG ANODENDRON PANICULATUM WALL

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

…………***…………

HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC THẰNG CÁNG

(ANODENDRON PANICULATUM (WALL EX ROXB.) A.DC.)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Huế, năm 2018

Công trình được hoàn thành tại:

Đại học Huế Trường Đại học Khoa học

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYỄN THỊ HOÀI

Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế - Đại học Huế

Phản biện 1: GS.TS Trần Đình Thắng

Phản biện 2: PGS.TS Phạm Xuân Núi

Phản biện 3: PGS.TS Trần Thị Văn Thi

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp tại:

Vào hồi: ……….giờ……… ngày………tháng……… năm

Có thể tìm hiểu Luận án tại:

- Thư viện

- Thư viện

1

MỞ ĐẦU

Sự gia tăng nhanh chóng của nhiều căn bệnh nguy hiểm có khả năng lan rộng như HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, dịch Ebola, chứng đầu nhỏ

do virus Zika… đang là một cuộc khủng hoảng thực sự cho sức khỏe cộng đồng và là thách thức không nhỏ cho hệ thống y tế trên toàn thế giới Nhằm bảo vệ con người trước những nguy cơ về bệnh tật, các nhà khoa học đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra các thuốc mới, các phương thức điều trị mới vừa hiệu quả vừa an toàn với cơ thể Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước cho thấy thực vật là nguồn tài nguyên có giá trị trong việc khám phá và phát triển thuốc

Trong quá trình sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư một số cây thuốc của đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị mà chúng tôi đã khảo sát, 10 cây thuốc chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống ung

thư đã được đưa vào sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro Trong

đó, cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum Roxb A.DC –

Apocynaceae) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tốt trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 thấp, đặc biệt là trên các dòng tế bào LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan) và MKN-7 (ung thư dạ dày) Tuy nhiên cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài này Việc sử dụng cây Tốc thằng cáng để chữa các bệnh liên quan đến khối u chủ yếu là dựa vào tri thức bản địa của đồng bào Pako, Vân Kiều Do đó loài cây này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học Từ những lí do nêu

trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc

tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum

2

(Wall ex Roxb.) A.DC.)” được đề xuất với 2 mục tiêu:

1 Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chính của loài

Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC

2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất

phân lập được từ loài này

Nội dung nghiên cứu của luận án:

1 Chiết tách, phân lập, tinh chế các hợp chất từ loài Anodendron

paniculatum (Roxb.) A.DC

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập

3 Thử hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các hợp

chất đã phân lập

Đóng góp mới của luận án:

1 Đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất mới [anopaniester, anopanin A–C] và 16 hợp chất đã biết từ loài

Anodendron paniculatum Trong đó, 14 hợp chất [cycloartenol,

(E)-phytol, desmosterol, esculentic acid, kaempferol-3-O-rutinoside, rutin, sargentol, 4-O-β-D-glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid,

inugalactolipid A, gingerglycolipid A–C, (2S)-1-O-palmitoyl-3-O-[

-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol, O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol] được phân

(2R)-1-lập lần đầu tiên từ chi Anodendron

2 Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của 17 hợp chất

phân lập được trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau (LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480, HL-60, LNCaP, MCF-7) Trong đó, desmosterol có tác dụng ức chế ở mức trung bình với 5 dòng tế bào LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480 với giá trị IC50 từ 28,11±1,95

đến 41,41±2,31 µg/mL Hợp chất ursolic acid, O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol thể hiện hoạt tính ức chế tế

(2R)-1-O-palmitoyl-3-3

bào LU-1 và MKN-7 với giá trị IC50 từ 30,89±3,60 đến 72,42±8,05 µg/mL

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bản luận án chính đã tổng quan tài liệu về họ Trúc đào và chi

Anodendron với các mục:

1.1 Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae)

1.2 Giới thiệu về chi Anodendron

1.2.1 Vị trí phân loại

1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

1.2.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

1.2.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.3 Giới thiệu sơ lược về loài Tốc thằng cáng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Phần trên mặt đất của loài Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC.)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất

Phối hợp các phương pháp sắc ký: Sắc ký bản mỏng, sắc ký cột trên Silica gel pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Kết hợp các thông số vật lý (mp, [α]D), các dữ kiện phổ (IR, UV,

MS, 1D-, 2D-NMR) và các chuyển hóa hóa học cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo

4

 Phương pháp xác định thành phần monosaccharide

Mẫu saponin được thủy phân bằng dung dịch TFA 4 M ở 105oC trong 4 giờ Monosaccharide sau đó được khử thành alditol bằng NaBH4 và được acetyl hóa bằng hỗn hợp acetic anhydride–pyridine (1:1, v/v) ở 110oC trong 2 giờ Các alditol per-acetate tạo thành được phân tích bằng phương pháp GC-MS Thành phần monosaccharide được xác định thông qua việc so sánh thời gian lưu của các dẫn xuất alditol per-acetate của chúng với các giá trị tương ứng của monosaccharide chuẩn trong cùng điều kiện phân tích

 Phương pháp xác định hợp phần acid béo của các glycolipid

Glycolipid được hòa tan trong toluene sau đó bổ sung thêm lần lượt MeOH, dung dịch HCl 8% (pha trong MeOH) Hỗn hợp được ủ

ở 45oC khoảng 2h (để thủy phân một phần) hoặc qua đêm (để thủy

phân hoàn toàn) Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm

n-hexane và nước để chiết lấy dẫn xuất methyl ester (FAME) tạo thành Các dẫn xuất FAME được phân tích bằng phương pháp GC-MS

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được thử trên 8 dòng tế bào

(HL-60, LNCaP, MCF-7, LU-1, Hep-G2, KB, MKN-7 và SW-480) theo phương pháp SRB tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

5

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Xử lý mẫu và chuẩn bị các cao chiết:

Bột nguyên liệu khô đã qua xử lý (2,5 kg) được chiết với MeOH (10,0 lít x 3 lần) ở nhiệt độ phòng (72 giờ/lần), cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao chiết MeOH (105 g) Cao chiết này được phân tán vào nước rồi lần lượt chiết với chloroform (CHCl3, 2 lít x3 lần), ethyl acetate (EtOAc, 2 lít x3 lần) Cất loại dung môi dưới

áp suất thấp thu được các phân đoạn tương ứng là CHCl3 (AC, 50,7 g), EtOAc (AE, 10,2 g) và nước (AW, 27,5 g)

3.2 Quá trình phân lập các hợp chất:

(1) Silica gel Gradient CHCl 3 –MeOH (100:00:100, v/v)

(2) Silica gel Gradient n-hexan–acetone (100:04:1, v/v)

(3) Silica gel n-hexan–EtOAc (10:1, v/v)

(4) YMC RP-18 MeOH–acetone–H 2 O (10:5:1, v/v)

(5) Silica gel n-hexan–acetone (5:1, v/v)

(6) Silica gel CHCl 3–MeOH (20:1, v/v)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn

chloroform của cây Tốc thằng cáng

(5) Silica gel CHCl 3 –MeOH–H 2 O (5:1:0,1, v/v)

(6) Silica gel CHCl 3 –MeOH–H 2 O (4:1:0,1, v/v)

(7) Sephadex LH-20 MeOH–H 2 O (4:1, v/v),

(8) YMC RP-18 MeOH–MeCN–H 2 O (3:2:3, v/v)

(9) Silica gel CHCl 3 –MeOH–H 2 O (3:1:0,1, v/v)

(10) Silica gel CHCl 3 –MeOH–H 2 O (3:1:0,1, v/v)

(11) YMC RP-18 MeOH–H 2O (3:2, v/v)

(12) YMC RP-18 MeOH–H 2 O (6:1, v/v)

(13) Silica gel EtOAc–MeOH–H 2 O (3:1:0,1, v/v)

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước

của cây Tốc thằng cáng

3.3.2 Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới)

Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3443, 2922, 2853,

1736, 1630, 1466, 1377, 1260, 1180, 1094; UV (MeOH) max (nm):

201, 231; HRESIMS: m/z 725,5805 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C48H78O3Na, 725,5849); CTPT: C48H78O3; M = 702; 1 H- NMR (500 MHz, CDCl3) H (ppm): 1,22 (H-1a), 1,60 (H-1b), 1,61 (H-

2a), 1,74 2b), 4,56 (dd, J = 11,0, 4,5 Hz, H-3), 1,42 5), 0,79 6a), 1,57 (H-6b), 1,08 (H-7a), 1,31 (H-7b), 1,52 (dd, J = 12,0, 4,5 Hz,

H-8), 1,11 11a), 1,98 11b), 1,61 12), 1,28 15), 1,29

(H-16a), 1,92 (H-16b), 1,58 (H-17), 1,96 (s, H-18), 0,33 (br.d, J = 4,0 Hz, H-19a), 0,57 (br.d, J = 4,0 Hz, H-19b), 1,38 (H-20), 0,88 (d, J = 7,0

Hz, H-21), 1,04 (H-22a), 1,41 (H-22b), 1,86 (H-23a), 2,03 (H-23b),

5,10 (t, J = 6,0 Hz, 24), 1,68 (s, 26), 1,60 (s, 27), 0,84 (s,

H-28), 0,89 (s, H-29, H-30), 2,30 (H-2), 1,61 (H-3), 1,30 (H-4), 1,30 (H-5), 1,30 (H-6), 1,36 (H-7), 2,17 (td, J = 8,0, 7,0 Hz, H-8), 5,43

(td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-9), 5,97 (dd, J = 11,5, 10,5 Hz, H-10), 6,51

(dd, J = 15,0, 11,5 Hz, H-11), 5,69 (dd, J = 15,0, 6,5 Hz, H-12), 4,20 (m, H-13), 2,33 (H-14), 5,36 (td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-15), 5,57 (td, J

= 10,5, 7,5 Hz, H-16), 2,06 (m, H-17), 0,97 (t, J = 7,5 Hz, H-18);

13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) C (ppm): 31,7 (C-1), 27,0 (C-2), 80,5 (C-3), 39,6 (C-4), 47,3 (C-5), 21,1 (C-6), 26,0 (C-7), 48,0 (C-8), 20,3 (C-9), 26,1 (C-10), 26,6 (C-11), 33,0 (C-12), 45,4 (C-13), 48,9 (C-14), 35,7 (C-15), 28,3 (C-16), 52,4 (C-17), 18,1 (C-18), 29,9 (C-19), 36,0

8

20), 18,4 21), 36,5 22), 25,1 23), 125,3 24), 131,0 25), 25,9 (C-26), 17,8 (C-27), 25,6 (C-28), 15,4 (C-29), 19,4 (C-30), 173,8 (C-1), 35,0 (C-2), 25,2 (C-3), 29,1 (C-4), 29,2 (C-5), 29,6 (C-

(C-6), 29,8 (C-7), 27,8 (C-8), 133,1 (C-9), 127,9 (C-10), 126,0 (C-11), 135,2 (C-12), 72,3 (C-13), 35,4 (C-14), 123,9 (C-15), 135,3 (C-16), 20,9 (C-17), 14,4 (C-18)

3.3.3 Hợp chất AP3: (E)-Phytol

Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3449, 2932, 1636,

1462, 1381, 1003; HRESIMS: m/z 319,2931 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C20H40ONa, 319,2977); CTPT C20H40O; M = 296; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.4 và Phụ lục 3

3.3.4 Hợp chất AP4: Desmosterol

Chất bột màu trắng; mp: 122–124oC; IR (KBr) max (cm-1): 3445,

2936, 1636, 1462, 1377, 1053; HRESIMS: m/z 385,3513 [M + H]+(tính toán lý thuyết cho công thức C27H45O, 385,3470); CTPT

3.3.6 Hợp chất AP6: Vanillin

Chất bột màu trắng; mp 82–84oC, UV (MeOH) λmax (nm): 204, 231,

278, 309; IR (KBr) νmax (cm-1): 3310, 1674, 1589, 1512, 1026, ESIMS:

m/z 175,0 [M + Na]+; CTPT C8H8O3; M = 152; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.7 và Phụ lục 6

3.3.7 Hợp chất AP7: Esculentic acid

Chất bột màu trắng; mp 267–268oC; IR (KBr) νmax (cm-1): 3425,

9

2927, 2363, 1690, 1458, 1038; HRESIMS: m/z 511,3390 [M + Na]+(tính toán lý thuyết cho công thức C30H48O5Na, 511,3399); CTPT

3.3.10 Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới)

3.3.11 Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới)

10

Hz, H-6a), 1,51 (H-6b), 1,03 (H-7a), 1,22 (H-7b), 1,52 (H-8), 1,06 (H-11a), 1,98 (H-11b), 1,60 (H-12a), 1,66 (H-12b), 1,48 (H-15a),

2,01 (H-15b), 5,27 (dd, J = 6,0, 6,0 Hz, H-16), 2,15 (s, CH3COO),

2,08 (dd, J = 10,2, 6,6 Hz, H-17), 1,01 (s, H-18), 0,20 (d, J = 4,2 Hz, H-19a), 0,46 (d, J = 4,2 Hz, H-19b), 1,78 (H-20), 1,02 (d, J = 6,0 Hz,

(H-1), 82,2 (C-2), 77,1 (C-3), 81,6 (C-4), 76,5 (C-5), 62,6 (C-6), 106,0 (C-1), 77,6 (C-2), 78,6 (C-3), 72,2 (C-4), 78,7 (C-5), 63,3 (C-6), 105,4 (C-1‴), 75,3 (C-2‴), 78,3 (C-3‴), 71,9 (C-4‴), 78,9 (C-5‴), 62,7 (C-6‴)

3.3.12 Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới)

11

C5D5N) H (ppm): 1,07 (H-1a), 1,42 (H-1b), 1,84 (m, H-2a), 2,27 (m,

H-2b), 3,38 (dd, J = 11,4, 4,2 Hz, H-3), 1,25 (H-5), 0,68 (q, J = 12,6

Hz, H-6a), 1,51 (H-6b), 1,01 (H-7a), 1,23 (H-7b), 1,52 (H-8), 1,04 (H-11a), 1,92 (H-11b), 1,62 (H-12a), 1,66 (H-12b), 1,48 (H-15a),

2,01 (m, H-15b), 5,33 (dd, J = 7,8, 7,2 Hz, H-16), 2,21 (s, CH3COO),

2,51 (dd, J = 10,8, 6,0 Hz, H-17), 1,03 (s, H-18), 0,20 (d, J = 3,6 Hz, H-19a), 0,46 (d, J = 3,6 Hz, H-19b), 1,68 (m, H-20), 1,21 (d, J = 6,6

Hz, H-21), 4,19 (m, H-22), 2,10 (m, H-23a), 2,29 (m, H-23b), 4,28

(H-24), 6,41 (d, J = 4,8 Hz, 24-OH), 1,31 (s, H-26), 1,53 (s, H-27), 1,30 (s, H-28), 1,14 (s, H-29), 1,06 (s, H-30), 4,86 (d, J = 7,8 Hz, H-

1), 4,29 (H-2), 4,30 (H-3), 4,25 (H-4), 3,83 (ddd, J = 9,6, 3,6, 3,0

Hz, H-5), 4,48 (H-6a), 4,53 (H-6b), 5,42 (d, J = 7,2 Hz, H-1), 4,10 (H-2), 4,23 (H-3), 4,35 (H-4), 3,94 (ddd, J = 9,6, 3,6, 3,6 Hz,

H-5), 4,46 (H-6a), 4,51 (H-6b), 5,16 (d, J = 8,4 Hz, H-1‴), 4,09

(H-2‴), 4,25 (H-3‴), 4,24 (H-4‴), 4,00 (m, H-5‴), 4,32 (H-6‴a), 4,50 (H-6‴b); 13 C-NMR (150 MHz, C5D5N) C (ppm): 32,5 (C-1), 30,3 (C-2), 89,4 (C-3), 41,7 (C-4), 48,2 (C-5), 21,5 (C-6), 26,7 (C-7), 48,0 (C-8), 19,8 (C-9), 26,8 (C-10), 27,1 (C-11), 33,5 (C-12), 47,1 (C-13), 48,0 (C-14), 46,2 (C-15), 80,3 (C-16), 171,0 (CH3COO), 22,1 (CH3COO), 56,2 (C-17), 19,4 (C-18), 30,4 (C-19), 38,3 (C-20), 12,8 (C-21), 76,3 (C-22), 39,6 (C-23), 78,3 (C-24), 82,8 (C-25), 27,1 (C-26), 24,2 (C-27), 26,2 (C-28), 15,8 (C-29), 20,2 (C-30), 105,1 (C-1), 82,2 (C-2), 77,1 (C-3), 81,6 (C-4), 76,5 (C-5), 62,6 (C-6), 105,9 (C-1), 77,6 (C-2), 78,6 (C-3), 72,2 (C-4), 78,7 (C-5), 63,3 (C-

6), 105,4 1‴), 75,3 2‴), 78,3 3‴), 71,9 4‴), 78,9 5‴), 62,7 (C-6‴)

(C-3.3.13 Hợp chất AP13: Sargentol

Chất bột màu trắng; 20

[ ]D –70 (c 0,05, MeOH), mp 271–272oC, UV

Chất bột màu trắng; [ ] 22D +35,7 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z

763,3423 [M+Na+4xO]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

C33H56O18Na, 763,3364); CTPT C33H56O14; M = 676; 1H và 13NMR: xem Bảng 4.20 và Phụ lục 16

3.3.18 Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C

Chất bột màu trắng; [ ] 22D +29,4 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z

703,3878 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H60NaO14, 703,3881); CTPT C33H60O14; M = 680; 1H và 13C-NMR: xem Bảng

13

4.22 và Phụ lục 18

3.3.19 Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-

D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D- galactopyranosyl]glycerol

Chất bột màu trắng; [ ] 22D +51,6 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z

677,3746 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C31H58O14Na, 677,3724); CTPT C31H58O14; M = 654; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.23 và Phụ lục 19

3.3.20 Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D- sulfoquinovopyranosyl)glycerol

(6-Chất bột màu trắng; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 2932, 2367, 1713,

1383, 1265, 1070; HRESIMS: m/z 579,2797 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C25H48O11SNa, 579,2815); CTPT C25H48O11; M

= 556; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.24 và Phụ lục 20

3.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số chất tinh khiết

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết từ

Tốc thằng cáng được thử nghiệm trên các dòng tế bào LU-1, Hep-G2, HL-60, KB, LNCaP, MKN-7, SW-480 và MCF-7 Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1