NGHIÊN cứu HOẠT CHẤT SINH học từ sản PHẨM TRAO đổi CHẤT của VI KHUẨN CỘNG SINH với TUYẾN TRÙNG STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21

MỤC LỤC BẢNGTrang Bảng 1 Số đo của tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 21Bảng 2 Các loài tuyến trùng và VKCS tương ứng Poinar G.O 30Bảng 3 Các chất kháng vi sinh vật được tổn

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀCÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -NGUYỄN THỊ NHÃ

“NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO

STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2009

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

“NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO

Hà Nội – 2009 LỜI CẢM ƠN

Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đàotạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoahọc và Công nghệ Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuậnlợi cho tôi trong quá trình học tập

Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Kế Longnghiên cứu viên Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, người đã tậntình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho tôi trong suốt thời gianthực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể phòng Hệ thống học phân tử

và Di truyền bảo tồn và phòng Tuyến trùng học, Viện Sinh thái vàTài nguyên sinh vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trìnhlàm thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm trong côngviệc để tôi có thể hoàn thành luận văn đúng thời gian qui định

Tôi cũng xin cảm ơn các đồng chí lãnh đạo trường THPT GiaBình - Bắc Ninh, cùng các đồng chí trong tổ bộ môn đã tạo điều kiệnthuận lợi, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thântrong gia đình đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốtthời gian làm luận văn

Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./

Hà nội, ngày 19 tháng12 năm 2009

Học viênNguyễn Thị Nhã

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kếtquả và số liệu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố

Học viên:

Nguyễn Thị Nhã

BSL Bướm sáp lớn Galleria mellonella

DMSO Dimethyl sulfoxide

EPN Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic

nematode)HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid

chromatography)HPLC/MS Sắc ký lỏng khối phổ hiệu năng cao (high performance liquid

chromatography/Mass Spectrometry)HPLC/UV Sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng máy dò tia tử ngoại (High

performance liquid chromatography/ultraviolet)

LB Một môi trường nhân nuôi vi khuẩn (Luria-Bertani)

IJ Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile)

MeOH Methanol CH3OH

NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance)

RFLP Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction

Fragment Length Polymorphism) SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope)

TTC Triphenyltetrazolium Chloride

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VKCS Vi khuẩn cộng sinh

1.1Tuyến trùng EPN 14

1.1.5 Quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn 16

1.1.6 Tình hình nghiên cứu EPN trên thế giới và trong nước 17

1.1.6.1.Tình hình nghiên cứu EPN trên thế giới 17

1.1.6.2.Tình hình nghiên cứu EPN trong nước 18

1.2 Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 19

2.1 Tuyến trùngSteinernema robustispiculum TN21 41

2.3.2 Nhân bản đoạn ADN đích bằng kỹ thuật PCR 43

MỤC LỤC BẢNG

Trang

Bảng 1 Số đo của tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 21Bảng 2 Các loài tuyến trùng và VKCS tương ứng (Poinar G.O) 30Bảng 3 Các chất kháng vi sinh vật được tổng hơp từ Xenorhabdus

và Photorhabdus

32

Bảng 4 Các nồng độ của nematophin phân lập từ X nematophilus ức

chế sinh trưởng của một số loài vi khuẩn và nấm

35

Bảng 5 Nồng độ của chất ST từ P.luminescens chống lại những

nấm bệnh quan trọng trong nông nghiệp và y học

35

Bảng 6 Phạm vi và mức độ kháng khuẩn của ES (Sundar và Chang

FN, 1992)

36

Bảng 7 Danh mục các chất kháng sinh và hoạt tính của chúng

được biết từ Xenorhabdus spp

37

Bảng10 Thành phần hỗn hợp phản ứng giải trình tự ADN 45Bảng11 Chu trình nhiệt của phản ứng giải trình tự ADN 45Bảng 12 Tổng số các nucleotide sai khác (số bên dưới), trung bình các

nucleotide sai khác có tính đến sự thiếu hụt các nucleotide (số

bên trên) thông tin di truyền đoạn gen 16S của Xenorhabdus

sp TN21 và các loài trong cùng nhóm

56

MỤC LỤC HÌNH

Trang

Hình 1 Sơ đồ vòng đời của EPN 15

Hình 2 Steinernema robustispiculum TN21 22

Hình 3 Ảnh SEM con đực của Steinernema robustispiculum TN21 24

Hình 4 Ảnh SEM con cái và IJ của Steinernema robustispiculum TN21 25

Hình 5 Mẫu RFLP vùng ITS của loài Steinernema

robustispiculum TN21 được cắt với 17 enzym

26

Hình 6 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của Steinernema

robustispiculum với 13 loài Steinernema dựa vào sự phân tích

Hình 8 Sơ đồ các bước phân lập vi khuẩn Xenorhabdus sp.

từ tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21

41

Hình 9 Sơ đồ các bước nhân nuôi vi khuẩn In-Vitro 47

Hình 10 Sơ đồ các bước tách chiết hoạt chất từ Xenorhabdus.sp 48

Hình 11 Sơ đồ các bước tinh sạch hoạt chất bằng RP- HPLC 49

Hình 12 Sơ đồ lý thuyết quá trình tiến hành chạy RP-HPLC 51

Hình 13 Hệ thống Bruker DRX 500 Spectrometer 52

Hình 14 Khuẩn lạc và tế bào VKCS với Steinernema

robustispiculum TN21

53

Hình 15 Mối quan hệ họ hàng của VKCS phân lập từ Steinernema

robustispiculum TN 21 với các loài Xenorhabdus spp Dựa

trên phân tích đoạn gen 16S bằng phương pháp Maximum

Parsimony

54

Hình 16 So sánh đoạn gen 16S của Xenorhabdus sp TN21 với các loài trong 56

Hình 17 Đồ thị phân tích sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của

Xenorhabdus sp cộng sinh với Steinernema robustispiculum

nề là sự ô nhiễm môi trường đất, nước và không khí Sức khoẻ của nhân loạiđang đứng trước nguy cơ đe doạ Cũng vì thế mà hiện nay có hàng loạt thuốctrừ sâu hoá học phải đưa vào trong danh mục cấm sử dụng Tương tự tronglĩnh vực y học, những thuốc kháng sinh mà trước đây tiêu diệt những tác nhân

gây bệnh - vi khuẩn và nấm thật sự dễ dàng, ngày nay lại có thể trở thành vôhiệu bởi sự kháng thuốc của những tác nhân này Hiện tượng nhờn thuốc thật

sự đáng lo ngại, đòi hỏi các nhà khoa học cần thiết phải nghiên cứu tìm ra cácloại thuốc mới đáp ứng nhu cầu chữa bệnh của con người trong thời đại ngàynay Hơn nữa, những bệnh như bệnh lao và các bệnh ưng thư luôn có xuhướng gia tăng số người mắc và tỉ lệ tử vong vì vậy mà tổ chức y tế thế giớikhẩn cấp khẩn thiết đối với những chính phủ tăng cường nghiên cứu của họ

để ngăn ngừa sự lây lan của dịch bệnh Do đó, một nhu cầu khẩn cấp nhữngthuốc kháng vi sinh vật mới để kiểm soát những căn bệnh một cách có hiệuquả đang trở nên cực kỳ cấp bách Hiện nay, nguồn các hoạt chất tự nhiênđược cung cấp chủ yếu từ xạ khuẩn (actinomycetes) tuy nhiên, ngành côngnghiệp dược phẩm đang tìm kiếm những chất kháng vi sinh vật từ nhữngnguồn khác nữa với hy vọng nhanh chóng tìm ra những chất kháng vi sinh vậtthích hợp có hiệu lực cao và hoạt phổ rộng

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (entomopathogenic nematodes– EPN) hiện đang là đối tượng để tìm các hoạt chất sinh học mới từ sản phẩmtrao đổi chất thứ cấp của các vi khuẩn cộng sinh cùng với chúng,

Xenorhabdus ở Steinernema và Photorhabdus ở Heterorhabditis Nhiều

nghiên cứu đã xác định các chất trao đổi thứ cấp này có khả năng kháng visinh vật hoạt phổ rộng, ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn, nấm và các tế

bào ung thư (Akhurst và Dunphy, 1993; Chen et al, 1994; Li et al., 1995a,b)

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở Việt Nam có tính đa dạngkhá cao Hiện nay, khoảng hơn 40 chủng EPN đã được phân lập từ các vùngsinh thái khác nhau của Việt Nam và đây cũng là nguồn VKCS rất quan trọngkhông chỉ ở Việt Nam mà còn đối với thế giới (Phan Kế Long và cộng sự,2003) tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về VKCS cũng như sản phẩm traođổi chất thứ cấp của chúng chính vì vậy chúng tôi thực hiên đề tài “Nghiên

cứu hoạt chất sinh học từ sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cộng sinh với

tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN 21“ với các mục tiêu chính sau:

-Xác định VKCS với Steinernema robustispiculum TN 21 bằng phương

pháp phân tích đoạn gen 16S

-Xác định hoạt chất sinh học từ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp củaVKCS này

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TUYẾN TRÙNG EPN

1.1.1 Khái niệm

Tuyến trùng là nhũng giun tròn đơn giản, sống tự do, ăn thịt, hay ký sinh.Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng được gọi là EPN (Entomopathogenicnematode) là những loài có lợi trong việc tấn công những côn trùng có hại, sâu bọ,phần lớn giết chết hay làm suy yếu những vật chủ mà chúng ký sinh, tuy nhiên lại

rất an toàn đối với người, động vật và thực vật Chúng có thể giết chết côn trùngvật chủ chỉ trong 24-48 h

Vị trí phân loại của EPN theo De Ley and Blaxter, 2002

1.1.3.Cơ chế gây bệnh của EPN

Cơ chế gây bệnh của EPN là nhờ vào VKCS mà ấu trùng của chúngmang theo trong ruột (Akhurst, 1983; Poinar, 1990) Các IJ xâm nhập vàoxoang máu của côn trùng vật chủ qua những lỗ mở tự nhiên (miệng, hậu môn,tuyến tơ hoặc nơi có lớp cutin mỏng) Trong xoang máu của côn trùng vật

chóng và tạo ra độc tố giết chết vật chủ trong vòng 48h (Dunphy, 1990;

Webster, 1985, 1988a; Bowen et al, 1988) Đây là khoảng thời gian cho sự

phát triển của vi khuẩn, cũng là khoảng thời gian dẫn đến cái chết của côn

trùng vật chủ và cũng là khoảng thời gian để ấu trùng của Steinernema và Heterorhabditis trong trứng nở ra và phát triển sang thế hệ thứ hai Các ấu

trùng xâm nhiễm sinh sôi nảy nở, chui ra khỏi xác chết côn trùng để tìm kiếmnhững côn trùng vật chủ mới (Poinar, 1990)

1.1.4 Vòng đời của EPN:

Hình 1: Sơ đồ vòng đời của EPN( theo H Kaya)

+ Trước tiên, ấu trùng xâm nhiễm tìm kiếm những côn trùng vật chủ vàbắt đầu những lây nhiễm Chúng thâm nhập vào trong khoang cơ thể sâu bọ,thông thường qua các lỗ mở tự nhiên của cơ thể (miệng, hậu môn, lỗ thở củacôn trùng) hay những vùng của biểu bì mỏng

+ Trong khoang cơ thể côn trùng:

- Vi khuẩn cộng sinh được giải phóng và nhân lên nhanh chóng dẫn tới

cái chết của sâu bọ (Xenorhabdus ở steinernematid, Photorhabdus ở heterorhabditid)

- Còn tuyến trùng, chúng ăn những chất dinh dưỡng từ xác côn trùng

vật chủ, lớn lên thành dạng trưởng thành; kết đôi giao phối (Steinernema đơn tính còn Heterorhabditis thì lưỡng tính) sinh sản ra nhiều ấu trùng xâm nhiễm

mới.Vòng đời được hoàn thành trong vài ngày, trong cơ thể côn trùng, tuyếntrùng sinh trưởng, phát triển và sinh sản 2 – 4 thế hệ

+ Cuối cùng, hàng loạt ấu trùng xâm nhiễm được giải phóng ra ngoàilại tiếp tục tìm kiếm những côn trùng vật chủ mới và khép kín vòng đời

1.1.5 Quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn

Thực chất mối quan hệ giữa tuyến trùng và VKCS là hiện tượng cộng

sinh mà cả 2 phía cùng có lợi

1.1.5.1 Vai trò của tuyến trùng

Tuyến trùng mang vi khuẩn trong ruột mình, bảo vệ vi khuẩn khi ởngoài côn trùng vật chủ; khi ở ngoài môi trường, vi khuẩn không tồn tại ởdạng tự do

Tuyến trùng còn đóng vai trò quan trọng là vector vận chuyển vi khuẩnvào xoang máu của côn trùng vật chủ, bảo vệ vi khuẩn trong xoang máu côntrùng vật chủ bằng cách chúng tiết ra một số chất có tác dụng làm trung hoà vàlàm mất tác dụng của kháng thể do côn trùng tiết ra để chống lại vi khuẩn Nhờ

1.1.4.2 Vai trò của VKCS

VKCS sản sinh độc tố giúp giết chết côn trùng vật chủ, chuyển biến xáccôn trùng vật chủ thành hỗn hợp chất chất dinh dưỡng cho tuyến trùng pháttriển ( Akhust và Dunphy, 1993) Độc tố do VKCS tiết ra làm côn trùng chếtmột cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48h Thời gian giết chết côn trùng vậtchủ khác nhau tuỳ tổ hợp tuyến trùng – VKCS và cũng phụ thuộc vào loại côntrùng vật chủ

Vi khuẩn còn cung cấp nguồn thức ăn cho côn trùng Khi mới bắt đầuxâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng sử dụng VKCS vừa giải phóng từ

cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡngcủa chúng, nhờ đó các ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 nhanh chóng phát triển sangtuổi 4 và đạt đến trưởng thành Từ thế hệ thứ II, tuyến trùng chuyển sang dinhdưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn hoạt hoá

VKCS hoạt hoá xác chết côn trùng nhờ việc tiết ra các enzyme Cácenzyme do vi khuẩn tiết ra có tác dụng hoạt hoá mô cơ thể côn trùng thànhnguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng Nhờ đó từ thế hệ thứ II, tuyến trùng

sử dụng chính xác chết của côn trùng để làm nguồn dinh dưỡng để tiếp tụcphát triển, sinh sôi nảy nở ở các thế hệ tiếp theo Thông thường trong cơ thểvật chủ, tuyến trùng phát triển từ 2 – 4 thế hệ

Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn đã sản sinh ra các chất trao đổithứ cấp mang hoạt tính kháng khuẩn, ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhậpvào xác chết côn trùng, bảo vệ nguồn thức ăn nguyên vẹn giành cho tuyếntrùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

1.1.6.Tình hình nghiên cứu EPN trên thế giới và trong nước

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

EPN được tìm thấy ở các vùng sinh thái đa dạng như đất rừng, bãi cỏ, đấthoang hóa, đất trồng trọt v.v và chúng đã được phát hiện ở 37 quốc gia EPN cónhiều ưu thế trong phòng trừ sinh học Hiện nay EPN đã được ứng dụng thànhcông trong phòng trừ sinh học dế trũi phá hoại sân golf ở Mỹ, sâu xanh bướmtrắng ở Indonesia Trung Quốc và Pakistan, dòi đục thân su hào ở Bỉ, Hà Lan vàĐức, sâu đục thân cọ ở Ả-rập Xê-út, và càng ngày càng có nhiều quốc gianghiên cứu ứng dụng EPN trong phòng trừ nhiều loài sâu hại khác nhau.

Trên thế giới tại nhiều nước phát triển như Mỹ, Ôxtrâylia và châu Âu đã

có hàng chục công ty sản xuất tuyến trùng hữu ích và đã thương mại hóa chếphẩm sinh học Tại Ðông Nam Á, Malaixia và Thái Lan cũng đang nghiêncứu theo hướng này, trong đó Thái Lan đã thương mại hóa một số chế phẩm.Ðặc biệt là Trung Quốc đã thương mại hóa các chế phẩm sinh học tuyến trùngdiệt sâu đục thân hại táo, lê, đào Hiện Trung Quốc có các nhà máy sản xuấtlớn ở Quảng Ðông, Bắc Kinh

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về tuyến trùng ở Việt Nam được bắt đầu từ năm 1997 và đếnnay đã đạt được một số thành tựu đáng kể Các nhà khoa học đã điều tra, phânlập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, mô tả cơ chế xâm nhập và pháttriển của tuyến trùng EPN Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất tuyếntrùng EPN, bước đầu xản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng - thuốc trừ sâusinh học đáp ứng cho nền nông nghiệp nước nhà Do EPN có khả năng kýsinh gây bệnh trên nhiều loại sâu hại khác nhau nhưng lại an toàn cho người,động vật, thực vật và môi trường

EPN ở việt Nam có tính đa dạng khá cao Hiện nay đã phân lập đượckhoảng hơn 40 chủng từ các vùng sinh thái khác nhau Trong đó điều đáng quan

tâm chú ý là các chủng VKCS với 2 giống tuyến trùng nói trên: Xenorhabdus cộng sinh với Steinernema và Photohabdus cộng sinh với Heternorhabditis

Tại Việt Nam, kể từ năm 1999, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

đã bắt đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng Cho tới nay, đã sản xuấtđược bảy chế phẩm trong đó một chế phẩm được sản xuất từ tuyến trùng nhậpnội và sáu chế phẩm sử dụng sáu chủng tuyến trùng bản địa Kết quả thửnghiệm cho thấy những chế phẩm này có thể diệt được gần 30 loài sâu hạikhác nhau Thử nghiệm trên quy mô 1-2 ha cho thấy các chế phẩm diệt đượcsâu keo da láng hại nho ở Ninh Thuận (tỷ lệ sâu chết là 70%), sâu xám hạithuốc lá ở Ba Vì (85-90%), bọ hung đen hại mía ở Thanh Hóa (50-65%) HiệnViện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã chuyển giao công nghệ sản xuất choNinh Thuận ở quy mô một xưởng sản xuất nhỏ và tiếp tục chuyển giao chomột số nơi khác (Phan Kế Long và cộng sự, 2003)

1.2 Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21

1.2.1 Địa điểm phát hiện

Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 được phân lập từ

đất rừng ở Sa Sơn, Sa Thầy thuộc dãy núi Chư Mom Ray Nam, tỉnh KonTum Việt Nam bằng phương pháp bẫy mồi (Bedding & Akhurst, 1975), sử

dụng mồi là ấu trùng BSL Galleria mellonella.

127 15(105 – 150)

4  1 (3

-3206  249(2745 - 3765)

193 18(165 – 240)

6  1 (5 - 8)

712  43(642 – 778)

28  3(26 – 35)

95 5(89 – 104)

173  7(162 – 186)

120  5(110 – 1290)50

46  4(39 – 56)

58 3(51 – 65)

13  1(11- 15)

41  3(36 -44)

6  1 (5- 8)4,6  0,4(4,2 – 5,6)

10 1 (8 –12)

108  8 (90 – 117)

226  6 (216 – 239)

148  9 (132 – 165)

29  5 (23 – 33)

73 9 (59 – 87)

17  1

54  4(50 – 68)

120  7(115 – 152)

84  4 (80 – 100)

75  5 (68 – 92)

16  1 (14 – 18)

25  3

8 1 (7 -9)

50  8(40 – 67)

56  5(50 – 63)

1,3  0,1 (1,1 -1,50)0,7  0,05(0,64 -0,79)2,40,56 (1,5 -3)

(15 – 19)

14  1(13 – 16)

160  17 (149 – 170)

48  3(39 – 53)

55  2 (50 – 58)

(18 – 29)

6  1(3,6 – 6,3)

10  1(6 – 11)

46  3(43 – 59)

75  5(67 – 87)

54  3 ( 49 – 62)

Bảng 1: Số đo của tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Hình 2: Steinernema robustispiculum TN21

A: Toàn bộ cơ thể con đực; B: Toàn bộ cơ thể IJ; C: phần đầu cơ thể con cái;

D, E: phần đầu IJ; F: Vùng vulval; G: Vùng đuôi con đực với sự sắp xếp củanhú sinh dục; H: Cấu trúc gai giao cấu và đĩa đệm; I: phần đuôi con cái; J:

đuôi IJ (Phan et al, 2004)

Con đực (thế hệ 1): cơ thể cong về phía bụng, dạng chữ C khi xử lí nhiệt.

Vỏ cutin nhẵn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học Đầu tròn, hơi táchbiệt với cơ thể Đỉnh đầu có thể nhìn thấy rõ 6 nhú môi nhọn và 4 nhú đầu.Xoang miệng nông dạng phễu hoặc dạng cái cốc Cấu trúc thực quản và vanthực quản điển hình Vòng thần kinh bao quanh ngay phía trước thực quảngốc Gai giao cấu lớn và cong mạnh về phía bụng, gốc gai tròn, thân gai dạnglưỡi liềm, phía cuối thẳng và có dạng thuỳ chẻ 3, phần sống lưng trước rộng

và cong về phía lưng, kết thúc từ phía sau đến đầu gai

Thuỳ bên của gai rộng về phía trước và kéo dài đến đầu gai, diềm gai lớnnhưng không bao phủ đến tận đầu gai Gai đệm dài bằng 70% chiều dài củagai giao cấu, có dạng thuyền, phình rộng ở giữa và cong ở phần đầu Khi quansát từ mặt bụng có thể thấy một cấu trúc dạng cái nêm dài, chẽ đôi nhưngkhông kéo dài đến thân của gai giao cấu mà được tách biệt ở phần trước Hệthống nhú sinh dục bao gồm: 1 nhú đơn trước huyệt sinh dục và 12 đôi nhú ởphần đuôi, trong đó có 5 đôi nằm về phía bụng trước hậu môn, 1 đôi bênngang mức nhú đơn trước huyệt, 1 đôi nhú bụng gần hậu môn, 3 đôi đuôi phíabụng bên và 1 đôi đuôi gần lưng Đuôi hình chóp, tận cùng đuôi có 1 mucronhỏ Plasmid không rõ

Hình 3: Ảnh SEM con đực của Steinernema robustispiculum TN21

A: bề mặt đầu; B: Sắp xếp nhú sinh dục ở vùng đuôi; C: đuôi; D,E: gai đệm;

F: gai giao cấu (Phan et al, 2004) Con cái (thế hệ 1): cơ thể lớn và cong về phía bụng, tạo thành hình chữ

C khi xử lý nhiệt.Vỏ cutin nhẵn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.Phần đầu tròn rộng và không tách biệt với phần thân Đỉnh đầu có 6 nhú

Cấu trúc thực quản và van thực quản điển hình Nhánh sinh dục kép, gấpkhúc phần sau, bên trong tử cung chứa đầy trứng Phần sau cơ thể hơiphình rộng về phía sau hậu môn Đuôi có cấu trúc vòm, tròn ,rộng Chiềudài của đuôi ngắn hơn chiều rộng cơ thể tại hậu môn Tận cùng đuôi có mộtcấu trúc như cái móc Plasmid không rõ.

Hình 4: Ảnh SEM con cái và IJ của Steinernema robustispiculum TN21

A-C: con cái thế hệ thứ nhất: A: Bề mặt đỉnh đầu; B:vùng vulval; C: Đuôi.D-F: Ấu trùng cảm nhiễm: D: đầu; E: Vỏ cutin và vùng bên ở phần giữa cơ

thể; F đuôi (Phan et al, 2004)

Ấu trùng xâm nhiễm: cơ thể hơi cong về phía bụng, có dạng chữ C khi xử

lý nhiệt Các nhú môi trên đỉnh đầu không rõ Thực quản dài, hẹp với eo thắtđiển hình được bao quanh bởi vòng thần kinh Phần sau thực quản dạng diều

và có cấu trúc van bên trong Van thực quản - ruột nổi bật Vị trí lỗ bài tiết ởphần giữa thực quản Túi vi khuẩn hình elip hoặc ô van dài Vùng bên tạiphần giữa cơ thể gồm 9 rãnh tạo thành 8 gờ, trong đó các rãnh sát mép ngoài

và rãnh trung tâm không rõ bằng các rãnh còn lại Đuôi hình chóp dài, hơi

thắt đặc biệt về phía bụng Plasmid rõ và nằm ở phần trước của đuôi (Phan et al., 2004)

Hình 5: Mẫu RFLP vùng ITS của loài Steinernema robustispiculum TN21

được cắt với 17 enzym (Phan et al., 2004)

1.2.4 Đặc điểm phân biệt

Loài Steinernema robustispiculum đặc trưng bởi chiều dài IJs là 712

(642 – 778)m, khoảng cách từ đỉnh đầu đến lỗ bãi tiết là 56 (50 – 68)m,chiều dài đuôi là 75 (68 – 92)m và các chỉ số E là 75 (67 – 87)m Ngoài racấu trúc vùng bên ở phần giữa cơ thể có 9 rãnh , trong đó các rãnh sát ngoài vàtrung tâm không rõ Gai giao cấu lớn với tỉ lệ chiều dài/ chiều rộng (SPL/SPW)

bằng 4,5m Về hình thái lượng của IJs thì gần với loài S monicolum được mô

tả từ Hàn Quốc, ngoại trừ vị trí của lỗ bài tiết nằm ở giữa thực quản (ở S monicolum , vị trí lỗ bài tiết nằm đố diện ở 1/3 phía trước thực quản) Hơn nữa loài Steinernema robustispiculum còn sai khác với loài S monicolum bởi chiều

dài gai giao cấu ngắn hơn, 58 (51 – 65)m và 70 (61 – 80)m, nhưng rộnghơn, SPL / SPW = 4,5 (3,8 – 5,6)m và 8,75 (8 – 8,71)m

Cả hai loài S intermedium và Steinernema robustispiculum đều có gai giao cấu rất lớn nhưng loài Steinernema robustispiculum có chiều dài đuôi lớn

hơn , 75 (68 - 92)m và 66 (53 – 74)m, tỉ lệ E nhỏ hơn, 75 (67 – 87)m và 96(89 – 108)m Ngoài ra gai giao cấu ngắn hơn, 58 (51 – 65)m, và 91 (84 –100)m; hình dạng gai cũng khác (cong hình cung và chỉ cong phần đầu cònphần sau hầu như thẳng); số lượng của các nhú sinh dục ở phần đuôi khác nhau(4 và 6 đôi) và sự hiện diện của mucro ở tận cùng đuôi con đực Cấu trúc vùng

bên ở loài Steinernema robustispiculum gần như ở loài S sangi Tuy nhiên có

thể phân biệt giữa chúng bởi các đặc trưng sai khác như: tỉ lệ E cao hơn 75 (67– 87)m và 62 (56 – 70)m; tỉ lệ D cao hơn, 46 (43 – 59)m và 40 (36 –44)m; gai giao cấu rộng hơn, SPL / SPW = 4,5 (3,8 – 5,6)m và 5,25 (5,7 –5,8)m và chiều dài gai ngắn hơn 58 (51 – 65)m và 63 (58 – 80)m

1.2.5 Mối quan hệ phát sinh chủng loại

Steinernema robustispiculum TN 21 có mối quan hệ gần gũi với S monticolum có nguồn gốc từ Nam Triều Tiên (Stock et al., 1997) và nằm trong nhóm “feltiae-kraussei-oregonense“

Hình 6: Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của Steinernema robustispiculum với

13 loài Steinernema dựa vào sự phân tích ITS-rDNA (Phan et al., 2003)

1.3.Vi khuẩn cộng sinh

1.3.1 Xenorhabdus

Các giống VKCS Xenorhabdus thuộc họ Enterobacterriaceae đều có

dạng que, chuyển động, gram âm, kị khí không bắt buộc và không tạo bào tử

Các loài vi khuẩn giống Xenorhabdus không tạo huỳnh quang và có phản ứng catlase âm tính Xenorhabdus cộng sinh với tuyến trùng

bào, gọi là pha sơ cấp (pha I) và pha thứ cấp (pha II) Pha I là dạng tế bào tựnhiên có quan hệ với tuyến trùng, còn pha II có thể xuất hiện một cách tự phátkhi các đĩa nhân nuôi vi khuẩn trong giai đoạn định vị không sinh trưởng Pha

II của các loài vi khuẩn Xenorhabdus spp có khả năng phục hồi lại pha I

(Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

1.3.2 Photohabdus

Các giống VKCS Photohabdus thuộc họ Enterobacterriaceae đều có

dạng que, chuyển động, gram âm, kị khí không bắt buộc và không tạo bào tử

Hầu hết các loài vi khuẩn giống Photohabdus có khả năng tạo huỳnh quang và

có phản ứng catlase dương tính Photohabdus cộng sinh với tuyến trùng Heternorhabditis, có khả năng sản sinh ra các dạng biến thể tế bào, gọi là pha sơ cấp (pha I) và pha thứ cấp (pha II) Pha II của các loài vi khuẩn Photohabdus

spp không có khả năng phục hồi lại pha I (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Bảng dưới đây thống kê 15 loài Steinernema và 3 loài Heterorhabditis với

những VKCS tương ứng của chúng; cả hai giống tuyến trùng này đều có nhữngdạng chưa được mô tả và kỹ thuật phân tử đang được sử dụng để phân loại chúng(Curran, 1990), sẽ còn nhiều loài mới cũng sẽ được mô tả trong thời gian tới

Mracek et al, 1994

Akhurst và Boemare, 1990Akhurst và Boemare, 1990Poinar, 1990

Akhurst và Boemare, 1990

P luminescens

P luminescens

P luminescens

Nishimura et al, 1994 Kaya et al, 1993

Nguyen và Smart, 1992Akhurst và Boemare, 1990

Cabanillas et al, 1994 Kaya et al, 1993

Trong tự nhiên mỗi loài tuyến trùng thường chỉ cộng sinh với một loài

vi khuẩn mặc dù một loài vi khuẩn có thể cộng sinh với một vài loài tuyếntrùng (Akhurst và Boemare, 1990)

1.4 Các chất trao đổi thứ cấp

1.4.1 Nguồn gốc và hoạt tính sinh học

Xenorhabdus / Photorhabdus - Những loài khác nhau của các vi khuẩn

này sản xuất nhiều sản phẩm trao đổi thứ cấp khác nhau có hoạt tính kháng visinh vật (Forst và Nealson, 1996): Những chất màu, những enzim ngoại bào,những tinh thể protein và sự phát quang sinh học ở trong tế bào Chúng là

những dẫn xuất indol, xenorhabdins và xenocoumacins (McInerney et al, 1991a, b; Li et al, 1995) ; những chất có bản chất protein như xenorhabdincin

và chitinases (Akhurst và Dunphy, 1993; Thaler et al, 1995; Chen et al,

1995); nhóm không có bản chất protein, có hoạt tính kháng mạnh vi khuẩn

gram dương và một số vi khuẩn gram âm (Akhurst và Dunphy, 1993: Li et

1995; McInerney et al, 1991a, b); xenorhabdincin có hoạt tính chống lại vi khuẩn (Thaler et al, 1995); chitinases có hoạt tính chống nấm (Chen et al,

1995) Những dẫn xuất indol, xenorhabdins những dẫn xuất stilbene,dithiolopyrrolones hay xenorhabdins và những dẫn xuất benzopyranone hay

xenocoumacins, nematophin được phân lập từ X nematophilus, và xenorxides phân lập từ X bovienii Các hợp chất này đã được chứng minh tính tích cực

chống lại tác nhân gây bệnh con người, động vật và thực vật như: Xenorxides

đã được chứng minh khả năng chống lại những dòng tế bào khối u khác nhau,

và một số vi khuẩn và nấm nhất định, Nematophin thì đặc biệt có hiệu quảchống lại các loài tụ cầu khuẩn mà hiện thời đang là một thách thức lớn đốivới ngành y tế Hơn nữa, với cấu trúc đơn giản của nematophin thì có thể dễdàng tổng hợp được, cung cấp nhiều ý tưởng thú vị cho Dược học và Y học(Li và cộng sự, 1997)

A24

F1

RT319UmeaA21

Dan

PhageXenorcoumacin 1Xenorcoumacin 2Bacteriocin

PhageXenorhabdicinPhage

Indole 1-2Xenorhabdin 1-3Xenorhabdin1,2,4,5Indole 1-4

Xenorhabdin1,2,6,7Bacteriocin

Poinar et al., 1980a McInerney et al., 1991b McInerney et al., 1991b Boemare et al., 1992 Boemare et al., 1992 Paul et al., 1981 Baghdiguian et al., 1993 Paul et al., 1981

McInerney et al., 1991a McInerney et al., 1991a

Li et al., 1995a

Li et al., 1995a Boemare et al., 1992

ATCC 29304X

K80HmHiK18

PhageBacteriocinPhageXenorhabdin 1-4Xenorcoumacin 1Bacteriocin

PhageStilbenesBacteriocinAnthraquinonesStilbenes

AnthraquinonesStilbene

BacteriocinAnthraquinonesBacteriocinBacteriocinBacteriocinBacteriocin

Boemare et al., 1992 Boemare et al., 1992 Boemare et al., 1992 McInerney et al., 1991a McInerney et al., 1991b Baghdiguian et al.,1993 Poinar et al., 1980a Paul et al., 1981 Baghdiguian et al., 1993 Richardson et al., 1988 Richardson et al., 1988

Li et al., 1995b

Li et al., 1995b Baghdiguian et al., 1993 Sztaricskai et al., 1992 Boemare et al., 1992 Baghdiguian et al., 1993 Baghdiguian et al., 1993 Baghdiguian et al., 1993

Bảng 3: Các chất kháng vi sinh vật được phân lập từ Xenorhabdus và

Photorhabdus

1.4.1.2 Hoạt tính sinh học

Một số sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của vi khuẩn giống

Xenorhabdus cộng sinh với tuyến trùng giống Steinernema có tác dụng

chống vi khuẩn hay những hoạt tính chống nấm Có nhiếu báo cáo vềnhững sản phẩm chuyển hóa kháng vi sinh vật bao gồm: nematophins(derivatives3 indole), xenorhabdins4 (dithiolopyrrlones), hydroxystilbenes,

chủng vi khuẩn Xenorhabdus Cấu trúc và những hoạt tính chống khối u

của những dẫn xuất phenethylamide, lần đầu tiên được phân lập từ 11dạng

tự nhiên của giống Xenorhabdus (Seunguk và cộng sự, 2001)

Chen et al., 1994 đã theo dõi hoạt tính kháng nấm mạnh mẽ của vi khẩn đối với nhiều loại nấm: Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Mucor piriformis, Pythium coloratum, Pythium ultimum, Penicillium spp, Rhizoctonia solani, Trichoderma pseudokingii và Verticillium dahliae.

Sau khi Paul et al., (1981) lần lượt tìm ra vai trò kháng sinh của chất hydroxystilbenes và indoles từ mẻ vi khuẩn Xenorhabdus và Photohabdus, có nhiều công bố khác như xenorhabdins (McInerney et al., 1991a), xenocoumacins (McInerney et al., 1991b), xenorxides (Li et al., 1998), xenomins , nematophin (Li et al., 1977) Chi A2 của X boviennii xuất hiện

trở thành bất thường trong tính đa dạng của các phân tử nhỏ kháng khuẩn tìmthấy từ: xenomins, xenorxides, xenorhabdins Từ chi này, cả 3 hợp chất trên

đã được phân lập (Chen, 1996)

Chất kháng sinh indoles và hydroxy-stilbenes có cấu trúc rất khác nhaunhưng đều có chung hoạt tính kháng khuẩn (Sundar và Chang, 1992, 1993)

Các xenocoumacins cũng được xem xét về hoạt tính và cấu trúc Chúng

có hoạt tính kháng vi khuẩn gram dương: Staphylococus, Streptococus và vi khuẩn gram âm: Escherichia coli (McInerney et al., 1991b) Xenocoumacins cũng có hoạt tính kháng nấm: Aspergillus, Trichophyton, Candida, Cryptococus (McInerney et al., 1991b).

Xenorhabdin I: R1 = H, R2 = n-pentyl; Xenorhabdin II: R" = H, R2 =4-methylpentyl; Xenorhabdin III: R" = H, R2 = n-heptyl; Xenorhabdin IV: R"

= CH3, R2 = n-pentyl; Xenorhabdin V: R1 = CH3, R2 = 4-methylpentyl lànhững chất kháng sinh và thuốc trừ sâu Quá trình tổng hợp sinh học các chất

này từ Xenorhabdus nemtophilus hay X luminescens Hai sản phẩm chuyển

hóa, có tên là xenorhabdin 1 và 3 được phân lập lập từ một sự dạng của

X.bovienii ATCC 39497 nhờ sử dụng sắc kí cột Những hợp chất hóa học này

tương ứng với Xenomides 1 và 3 Một số trong bốn hợp chất này đều có tính

kháng khuẩn và tính kháng nấm khi chúng lần lượt chống lại Bacillus subtilis

và Botrytis cinerea (Webster et al., 2002).

Hoạt tính kháng sinh của những hợp chất này đã được biết đến vàchúng đã được phát triển để ứng dụng trong y học, điều đó thật cần thiết đểxác định những tham số như của chúng như sự ổn định dưới những điều kiện

thí nghiệm nuôi cấy in vitro và in vivo và xác định hoạt tính độc của chúng

chống lại những tế bào khối u Cũng như mức độ tinh sạch của chúng.Xenorxides và xenorhabdins là chất độc tế bào đối với 6 loại tế bào ung thư

mà đã được kiểm tra rõ ràng tại thời điểm 4h và 24 h Tại 4h thì xenorxides

có nhiều độc tố đối với tế bào hơn so với xenorhabdins nhưng sau 24 hxenorhabdins lại có nhiều độc tố đối với tế bào hơn so với xenorxides.Những dẫn xuất của: 3,4- dihydro-8- hydroxy-1 H -2- benzopyran-1, được

tổng hợp in vitro, có hoạt tính ngăn ngừa ung thư, vi khuẩn và nấm (Gregson

& McInerney, 1989; McInerney et al., 1991)

Nematophin, đã được phân lập từ biến dạng BC1 của Xenorhabdus nematophilus và phát hiện trong tất cả các dạng của X nematophilus Cấu

trúc của nó giống như 3- Indoleethyl (3'- me-thyl-2'- oxo) pentanamide cóhoạt tính mạnh mẽ chống lại một loạt các loài nấm và vi khuẩn

Nấm và vi khuẩn Nồng độ của nematophin

Staphylococus aureus 0017

Aspergillus fumigatus ATCC 13073

Aspergillus flavus ATCC 24133

>100 12 12

>100

>100

Bảng 4: Các nồng độ của nematophin phân lập từ X nematophilus ức chế sinh

trưởng của một số loài vi khuẩn và nấm (Li et al., 1997) Hai chất kháng sinh là 3,5 – dihydroxy – 4 iso propylstilben (ST) và

3,5-dihydroxy-4-ethyl-trans-stilbene (ES), đã được tách ra từ các mẻ vi khuẩn

P luminescens cộng sinh với tuyến trùng Heternorhabditis và định lượng

bằng HPLC – UV và chứng minh hoạt tính sinh học chống lại những nấm

bệnh quan trọng trong nông nghiệp và y học

Tên loài nấm gây bệnh Nồng độ của chất ST

Bảng 5: Nồng độ của chất ST từ P.luminescens chống lại những nấm bệnh quan

trọng trong nông nghiệp và y học (Li et al., 1995)

Bảng 6: Phạm vi và mức độ kháng khuẩn của ES (Sundar và Chang, 1992)

Có hơn 30 chất trao đổi thứ cấp thuộc về một vài nhóm được công bố

từ mẻ vi khuẩn Xenorhabdus và Photohabdus: Xenorhabdins, Xenorsides,

Xenorcoumacins, Indoles, Isoflavonoids, Hdroxyl stilbens, Anthra – quinons,

Nucleosides, Macrolides Hầu hết các loài của giống Xenorhabdus và Photohabdus sản sinh ra nhiều hơn một nhóm hoạt chất sinh học và các loài Xenorhabdus tiết ra các chất thuộc nhiều nhóm hơn so với các loài Photohabdus Xenorhabdins thường được sản sinh bởi X bovienii, Xenorcoumacins X nematophilus, Hidroxyl stilbens và Anthra – quinons được sản sinh bởi Photohabdus spp Những hợp chất hoá học này không chỉ

có cấu trúc hoá học khác nhau mà còn có nhiều hoạt tính sinh học khác nhaunhư: tính kháng sinh, kháng nấm, hoạt tính diệt côn trùng, hoạt tính tiêu diệttuyến trùng khác, khả năng ngăn ngừa u xơ, ung thư, tính kháng vi rút

(Webster et al., 1998).

Tên loài chất kháng sinh hoạt tính Tài liệu tham khảo

X nematophilus Phage

XenocoumacinXenorhabdins

Bacteriocin

11,2,31,2,4

1

Boemare et al., 1992 McInemey et al., 1991 a McInemey et al., 1991 b; Li

et al., 1995 Boemare et al., 1992