TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ

Để xác định các loài EPN trên cùng với VKCS này, chúng tôi thực hiện đềtài: “Phân tích mối quan hệ di truyền của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng và vi khuẩn cộng sinh phân lập tạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

o0o

Phạm Ngọc Tuyên

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2010

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

o0o

PHẠM NGỌC TUYÊN

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHAN KẾ LONG

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự cảm ơn sâu sắc tới TS Phan Kế Long - chủ nhiệm dự án “Tiếp cận gen trong khai thác sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của Xenorhabdus và Photorhabdus”, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các cán bộ trong Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia, Hà Nội đã có những nhận xét, những chỉ dẫn quý báu cũng như cung cấp những tài liệu cần thiết giúp tôi hoàn thành nghiên cứu này.

Trong thời gian học tập, thực hiện đề tài nghiên cứu luận văn tôi đã nhận được sự tạo điều kiện, sự giúp đỡ nhiệt tình của các lãnh đạo, các đồng nghiệp trong Phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, phòng Tuyến Trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Tôi xin chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ quý báu đó.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, các đồng nghiệp khác trong và ngoài Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!

Học viên

Phạm Ngọc Tuyên

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG, VI KHUẨN CỘNG SINH VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG 3

1.1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 3

1.1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 5 1.1.3 Mối quan hệ giữa EPN và vi khuẩn cộng sinh 8

1.2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ VI KHUẨN

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

1.2.3 Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong việc nghiên cứu về tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh 21

1.3 KHÁI QUÁT ĐIỀU KIỆN ĐỊA LÝ TỰ NHIÊN VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ

22 1.3.1 Vị trí địa lý 22

1.3.2 Khí hậu 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.2 VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 25

2.2.1 Vật liệu 25

2.2.2 Trang thiết bị27

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyến trùng28

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn 34

2.3.3 Phân tích dữ liệu 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 KẾT QUẢ ĐIỀU TRA VÀ THU THẬP MẪU 38

3.2 KẾT QUẢ PHÂN LOẠI DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 39 3.2.1 Đặc điểm hình thái của tuyến trùng 39

3.2.2 Kết quả hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn 43

3.3 SẢN PHẨM PCR CỦA CÁC MẪU VỚI MỒI ĐẶC HIỆU 43

3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN 45

3.4.1 Đối chiếu trình tự của tuyến trùng 45

3.4.2 Đối chiếu trình tự của vi khuẩn 56

3.4.3 Quan hệ di truyền 73

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

4.1 KẾT LUẬN 81

4.2 KIẾN NGHỊ 81

Tài liệu Tiếng Việt 82

Tài liệu nước ngoài 83

PHỤ LỤC 91

EtBr : Ethidium Bromide

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit

TAF : Triethanolamine formalin

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 5

Hình 2 Mối quan hệ họ hàng của các loài Steinernema phân lập ở Việt Nam (Phan Ke Long, 2004) 20

Hình 3 Bản đồ hành chính Vườn Quốc Gia Ba Vì 23

Hình 4 Màu sắc của ấu trùng bướm sáp lớn do tuyến trùng gây chết 39

Hình 5 Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn 43

Hình 6 Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose với cặp mồi đặc hiệu của tuyến trùng 44

Hình 7 Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose đối với cặp mồi đặc hiệu của vi khuẩn 44

Hình 8 Đối chiếu trình tự nucleotit đoạn gen ITS của tuyến trùng Steinernema sp.B1 với các loài trong nhóm .50

Hình 9 Đối chiếu trình tự nucleotit đoạn gen ITS của tuyến trùng Heterorhabditis sp.D9 với các loài trong nhóm 55

Hình 10 Đối chiếu trình tự nucleotit gen 16S-rARN của VKCS Xenorhabdus sp.B1 với các loài trong nhóm 63

Hình 11 Đối chiếu trình tự nucleotit gen 16S-rARN của VKCS Photorhabdus sp.D9 với các loài trong nhóm 72

Hình 12 Cây phát sinh chủng loại ME của tuyến trùng Steinernema 74

Hình 13 Cây phát sinh chủng loại MP của tuyến trùng Steinernema 74

Hình 14 Cây phát sinh chủng loại ME của nhóm Heterorhabditis 76

Hình 15 Cây phát sinh chủng loại MP của nhóm Heterorhabditis 76

Hình 16 Cây phát sinh chủng loại ME của nhóm Xenorhabdus 78

Hình 17 Cây phát sinh chủng loại MP của nhóm Xenorhabdus 78

Hình 18 Cây phát sinh chủng loại ME của nhóm Photorhabdus 80

Hình 19 Cây phát sinh chủng loại MP của nhóm Photorhabdus 80

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh tương ứng 6

Bảng 2 Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 30

Bảng 3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 31

Bảng 4 Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự ADN 33

Bảng 5 Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự ADN 33

Bảng 6 Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 36

Bảng 7 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 36

Bảng 8 Thành phần loài tuyến trùng thu được tại VQG Ba Vì 38

Bảng 9 Số đo các chỉ tiêu của ấu trùng cảm nhiễm BVB1 40

Bảng 10 Số đo ấu trùng cảm nhiễm BVD9 41

Bảng 11 Thống kê sự biến đổi nucleotit trong nhóm Steinernema 73

Bảng 12 Ma trận khoảng cách di truyền của nhóm Steinernema theo mô hình Jukes-Cantor 73

Bảng 13 Sự biến đổi các nucleotit của nhóm Heterorhabditis 75

Bảng 14 Ma trận khoảng cách di truyền của nhóm Heterorhabditis theo mô hình Jukes-Cantor 75

Bảng 15 Sự biến đổi nucleotit của nhóm Xenorhabdus 77

Bảng 16 Ma trận khoảng cách di truyền của nhóm Xenorhabdus theo mô hình của Jukes-Cantor 77

Bảng 17 Sự biến đổi nucleotit của nhóm Photorhabdus 79

Bảng 18 Ma trận khoảng cách di truyền của nhóm Photorhabdus theo mô hình Jukes-Cantor 79

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có sự đa dạngphong phú về các loài thực vật, bên cạnh đó nước ta còn có sự đa dạng rất lớn

về các loài côn trùng Hàng năm, các côn trùng gây hại làm giảm đến 40-50%

sản lượng của sản xuất nông nghiệp (Phạm Văn Lực et al, 1999)

Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân đã sử dụng rất nhiềuloại thuốc trừ sâu khác nhau Tuy nhiên, các loài côn trùng đã trở nên ngàycàng kháng thuốc trừ sâu, và họ đã phải tăng nồng độ thuốc trừ sâu thậm chítrong một số trường hợp phải sử dụng cả loại thuốc có độ độc hại rất cao.Điều này đã dẫn đến một nồng độ ngày càng tăng của các hóa chất độc hạitrong chuỗi thức ăn tự nhiên Xu hướng chung trên thế giới và của Việt Namhiện nay là sử dụng các sản phẩm sinh học để diệt sâu hại mà một trongnhững sản phẩm hữu ích nhất là thuốc sinh học tuyến trùng phòng trừ sâu hại.Thuốc này có nhiều đặc điểm như: có khả năng ký sinh gây chết cho nhiềuloại sâu hại khác nhau; an toàn cho người, động vật, thực vật và môi trường;

sâu hại không có khả năng kháng thuốc…(Vũ Tứ Mỹ et al., 2004)

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes

– EPN) thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis hiện đang rất được

quan tâm trên thế giới do khả năng phòng trừ sinh học sâu hại của chúng Cơ

chế gây bệnh là nhờ các vi khuẩn cộng sinh (VKCS) (Xenorhabdus ở Steinernema và Photorhabdus ở Heterorhabditis) Sau khi thâm nhập vào vật

chủ, các vi khuẩn này sản sinh rất nhanh và tạo ra độc tố giết chết vật chủ,thêm vào đó các vi khuẩn này cũng tiết ra một số chất chống lại các tác nhâncạnh tranh khác trong môi trường như vi khuẩn, nấm (Akhurst and Dunphy,1993) Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hoạt chất sinh ra trong quátrình trao đổi chất của các chủng/loài vi khuẩn này có khả năng kháng sinh,kháng nấm, ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào ung thư chính vì vậy các

chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus/Photorhabdus là nguồn hợp chất tự nhiên

quan trọng để nghiên cứu các loại thuốc mới cho con người (Chen et al.,

1994)

Do mỗi chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus/Photorhabdus tạo ra các

hoạt chất khác nhau chính vì vậy việc tìm ra các chủng/loài mới của loại vikhuẩn này là rất cần thiết Tuy nhiên để có các chủng/loài vi khuẩn này cầnphải phân lập các chủng/loài EPN tương ứng trước Từ năm 1997 đến nay,khoảng hơn 60 chủng EPN đã được phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau

ở Việt Nam Đây là nguồn VKCS rất quan trọng không chỉ ở Việt Nam màcòn đối với thế giới Kết quả nghiên cứu bước đầu đã chứng minh một số

chủng/loài Xenorhabdus ở Việt Nam tạo ra một số chất có khả năng kháng

sinh kháng khuẩn và một số hoạt chất mới Với mục đích tìm kiếm thêm cácchủng EPN mới, chúng tôi đã tiến hành phân lập EPN tại vườn Quốc gia Ba

Vì, Hà Nội và đã thu được 1 chủng Steinernema và 1 chủng Heterorhabditis.

Để xác định các loài EPN trên cùng với VKCS này, chúng tôi thực hiện đềtài:

“Phân tích mối quan hệ di truyền của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng và vi khuẩn cộng sinh phân lập tại Vườn Quốc Gia Ba Vì”

Với các mục đích sau:

- Xác định loài tuyến trùng EPN trên cơ sở phân tích hình thái và phântích thông tin di truyền vùng gen ITS-rADN và mối quan hệ di truyền củachúng

- Xác định loài vi khuẩn cộng sinh trên cơ sở phân tích đoạn gen rARN và mối quan hệ di truyền của chúng

16S-CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG, VI KHUẨN CỘNG SINH VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG

1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode EPN) là những loài giun tròn có ích ký sinh ở những loài côn trùng, làm suyyếu hoặc giết chết những côn trùng vật chủ này, nhưng lại rất an toàn đối vớingười, động vật và thực vật

-Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc 2 giống Steinernema và Heterorhabditis, thuộc 2 họ khác nhau: giống Steinernema thuộc họ Steinernematidae và Heterorhabditis thuộc họ Heterorhabditidae của ngành

giun tròn Dưới đây là vị trí của chúng trong hệ thống phân loại (De Ley andBlaxter, 2002):

Cơ chế gây bệnh của EPN là nhờ vào VKCS mà ấu trùng của chúngmang theo trong ruột (Akhurst, 1983; Poinar, 1990) Trong vòng đời pháttriển của EPN trải qua các giai đoạn ấu trùng, con trưởng thành đực và cái.Một chu kỳ xâm nhập vào côn trùng vật chủ và phát triển của tuyến trùngEPN trong xác chết côn trùng vật chủ bắt đầu từ pha ấu trùng cảm nhiễm (IJs)(tồn tại ở trong đất) đến pha ký sinh phát triển bên trong cơ thể côn trùng vậtchủ và sau khi kết thúc pha ký sinh chúng lại quay trở về pha IJs bên ngoàicôn trùng vật chủ Khi tìm được vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào cơ thểcôn trùng qua các lỗ tự nhiên như miệng, hậu môn hoặc lỗ thở hoặc một sốdạng IJs được trang bị mấu kitin dạng sừng có thể đục thủng thành cơ thể côntrùng tại nơi xung yếu là ranh giới giữa các đốt cơ thể để xâm nhập Sau khivào cơ thể vật chủ IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu Tại đây vikhuẩn cộng sinh sẽ được giải phóng ra khỏi cơ thể tuyến trùng qua miệng

(Heterorhabditis spp.) hoặc hậu môn (Steinernema spp.) để vào xoang máu

của côn trùng Nhờ môi trường thích hợp là huyết tương vật chủ vi khuẩncộng sinh nhân nhanh số lượng và tạo ra độc tố gây chết vật chủ trong vòng48h Màu sắc của côn trùng vật chủ cũng là điểm đặc trưng khác biết giữa 2

giống tuyến trùng: đối với các loài Heterorhabditis spp thì khi côn trùng vật chủ chết sẽ có màu đỏ gạch, da xác chết khô và dai, còn đối với các loài Steinernema

spp khi côn trùng chết sẽ có màu nâu, xác chết côn trùng không có mùi thối(Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Các tuyến trùng sau đó sẽ trải qua các thế hệ khácnhau, và cuối cùng khi nguồn thức ăn đã hết, thế hệ cuối cùng trong sẽ chui rakhỏi xác và phát tán ra môi trường bên ngoài và trở thành IJs để tiếp tục mộtchu kỳ phát triển mới với một côn trùng vật chủ mới

Hình 1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

Xenorhabdus cộng sinh với Steinernema và Photorhabdus cộng sinh với Heterorhabditis thuộc họ Enterobacteriaceae Đa số các loài thuộc 2

giống vi khuẩn này gây bệnh cho côn trùng khi xâm nhập vào máu Ngoài ra

còn có các chủng vi khuẩn không phải cộng sinh như P asymbiotica được xác định là gây bệnh cho người (Farmer et al., 1989) và một nhóm khác chưa xác định đến loài gây nhiễm bệnh cần liệu pháp điều trị kháng sinh (Peel et al., 1999) Các nghiên cứu trong 20 năm qua từ giun tròn cho thấy Xenorhabdus cộng sinh ở ruột của ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema và Photorhabdus ở Heterorhabditis (Forst et al., 1997) Mỗi loài tuyến trùng

thường chỉ cộng sinh với một loài vi khuẩn mặc dù một loài vi khuẩn có thểcộng sinh với vài loài tuyến trùng Hiện nay các nhà khoa học đã phân lập và

mô tả được 18 loài vi khuẩn Xenorhabdus và 8 loài Photorhabdus Bảng 1

dưới đây trình bày các tuyến trùng và các vi khuẩn cộng sinh tương ứng:

Bảng 1 Tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh tương ứng

ST

T

Vi Khuẩn cộng sinh Tuyến trùng Nguồn

1 Xenorhabdus nematophila Steinernema

carpocapsae

Akhurst và Boemare,1990

2 X bovienii S affine, S feltiae, S

intermedium, S

kraussei, S weiseri

Akhurst, 1983; Akhurstand Boemare (1993),

7 X ehlersii S serratum Lengyel et al., 2005.

8 X innexi S scapterisci Lengyel et al., 2005

9 X szentirmaii S rarum Tailliez et al., 2006

10 X indica S abbasi Tailliez et al., 2006

11 X kozodoii S apulia,

S arenarium

Fischer-Le Saux et al., 1998

12 X doucetiae S diaprepesi Tailliez et al., 2006

13 X griffiniae S hermaphroditum Fischer-Le Saux et

al., 1998, Tailliez et al., 2006

14 X hominickii S kari, S

monticolum

Tailliez et al., 2006

15 X romanii S puertiricense Tailliez et al., 2006

16 X cabanillasii S riobravis Tailliez et al., 2006

17 X koppenhoeferi S scarabaei Tailliez et al., 2006

18 X stockiae S siamkayai Tailliez et al., 2006

19 Photorhabdus temperata

subsp cinerea

Heterorhabdis downesi

Tímea Tóth và

(2008)

24 Photorhabdus luminescens

subsp luminescens

Heterorhabditis bacteriophora

Marion Fisscher etal., (1999)

Các loài thuộc giống Xenorhabdus không sinh bào tử, hình que kích

thước 0.3-2 x 2-10 µm, gram âm, kị khí không bắt buộc có cả kiểu hô hấp vàlên men Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 280C; một số chủng phát triển

ở 400C Lên men đường glucose sinh axit (không sinh khí) và một số đườngkhác ít lên men Phản ứng catalase âm tính và không khử nitrate thành nitrite

Sự chuyển pha xuất hiện ở các mức độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy(Boemare and Akhurst, 1988) Pha I sản sinh nguyên sinh chất trong giai đoạn

nuôi cấy (Boemare et al., 1983), di động bằng lông rung và có thể tập trung lại trong môi trường thạch 0.6-1.2% (Givaudan et al., 1995) Pha II không bắt

màu (Akhurst, 1980), sản sinh kháng sinh (Akhurst, 1982), protein và một

số đặc tính khác của pha Một số chủng di động ở pha II, nhưng thường pha Imới di động Đa số các chủng có deoxyribonuclease và protease dương tính

Giống Photorhabdus hình que, kích thước (0.5-2 x 1-10 µm), Gram

âm, không sinh bào tử, và di động bằng lông rung Kị khí không bắt buộc, có

cả hô hấp và lên men Nhiệt độ tối ưu là 280C; một số chủng phát triển ở

37-380C Tất cả các chủng đều có phản ứng catalase dương tính, nhưng khôngkhử nitrate Âm tính với nhiều đặc điểm của họ Enterobacteriaceae Thủyphân gelatin, hầu hết các chủng gây tan huyết cừu và ngựa, một số sản sinhgây tan huyết hình khuyên trên môi trường máu cừu ở 250C Lên menGlucose sinh axit, nhưng không sinh khí Cũng lên men đường Fructose, D-mannose, maltose, ribose, và N-acetylglucosamine sinh axit Lên menglycerol yếu

1.3 Mối quan hệ giữa EPN và vi khuẩn cộng sinh

Mối quan hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh là hiện tượng cộngsinh mà cả 2 phía cùng có lợi

Tuyến trùng mang vi khuẩn trong ruột mình, bảo vệ vi khuẩn khi ởngoài côn trùng vật chủ; khi ở ngoài môi trường, vi khuẩn không tồn tại ởdạng tự do Tuyến trùng còn đóng vai trò quan trọng là vector vận chuyển vikhuẩn vào xoang máu của côn trùng vật chủ, bảo vệ vi khuẩn trong xoangmáu côn trùng vật chủ bằng cách chúng tiết ra một số chất có tác dụng làmtrung hoà và làm mất tác dụng của kháng thể do côn trùng tiết ra để chống lại

vi khuẩn Nhờ vậy mà vi khuẩn cộng sinh có thể sinh sôi nhanh chóng trongruột côn trùng (Boemare and Akhurst, 2006)

Vi khuẩn cộng sinh sản sinh độc tố giúp giết chết côn trùng vật chủ,chuyển biến xác côn trùng vật chủ thành hỗn hợp chất chất dinh dưỡng chotuyến trùng phát triển (Akhust và Dunphy, 1993) Độc tố do vi khuẩn cộngsinh tiết ra làm côn trùng chết một cách nhanh chóng Thời gian giết chết côntrùng vật chủ khác nhau tuỳ tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn cộng sinh và cũngphụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ

Vi khuẩn còn cung cấp nguồn thức ăn cho côn trùng Khi mới bắt đầuxâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng sử dụng vi khuẩn cộng sinh vừagiải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn

dinh dưỡng của chúng, nhờ đó các ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 nhanh chóngphát triển sang tuổi 4 và đạt đến trưởng thành Từ thế hệ thứ 2, tuyến trùngchuyển sang dinh dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn hoạt hoá Vikhuẩn cộng sinh hoạt hoá xác chết côn trùng nhờ việc tiết ra các enzyme Cácenzyme do vi khuẩn tiết ra có tác dụng hoạt hoá mô cơ thể côn trùng thànhnguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng Nhờ đó từ thế hệ thứ 2, tuyến trùng

sử dụng chính xác chết của côn trùng để làm nguồn dinh dưỡng để tiếp tụcphát triển, sinh sôi nảy nở ở các thế hệ tiếp theo (Boemare and Akhurst,2006)

Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn đã sản sinh ra các chất trao đổi thứcấp mang hoạt tính kháng khuẩn, ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vàoxác chết côn trùng, bảo vệ nguồn thức ăn nguyên vẹn giành cho tuyến trùng

2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH

2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

a Tuyến trùng

Trên thế giới, đã từ lâu có rất nhiều các nhà khoa học, các công trìnhnghiên cứu về EPN, vi khuẩn cộng sinh và các sản phẩm trao đổi chất củachúng Từ năm 1923 đến nay, các nhà khoa học đã điều tra, phân lập, mô tả

khoảng 63 loài Steinernema và 19 loài Heterorhabditis từ khắp các quốc gia

trên thế giới Phân loại tuyến trùng bằng các phương pháp chuẩn như hình

thái và hình thái lượng khá đúng đắn (Hominick et al., 1997), một số đặc

điểm hình thái có ích cho việc phân loại loài và sắp xếp chúng vào trong cácnhóm khác nhau như chiều dài và đặc điểm đường bên của ấu trùng cảm

nhiễm (Mraceck and Bednarek, 1991; Hominick et al, 1997), và các đặc điểm

hình thái của gai giao cấu và tuyến sinh dục (Nguyen and Smart, 1997) Tuynhiên nhiều loài có nhiều đặc điểm giống nhau về mặt hình thái, vì vậy nếu

chỉ mô tả về mặt hình thái là chưa đủ độ tin cậy Hominick et al., (1996) đã đề

xuất kỹ thuật phân tử dựa trên các đặc điểm phân tử của các loài giúp cho việcphân loại đến loài và nhóm loài chính xác hơn Phương pháp này sử dụng kỹthuật PCR để nhân vùng gen ITS-rADN của tuyến trùng rồi sau đó giải trình

tự và so sánh trình tự giữa các loài với nhau Cho đến nay, phương pháp nàyđược sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu về các loài tuyến trùng mới.Jennifer và Harry (1988) đã nghiên cứu tỉ mỉ các loài tuyến trùng thuộc 2

giống Steinernema và Heterorhabditis Các tác giả đã mô tả những đặc điểm

sinh học, sinh thái học chung của các loài tuyến trùng thuộc 2 giống

Steinernema và Heterorhabditis Các phương pháp nghiên cứu tuyến trùng và

phân lập vi khuẩn từ 2 giống này cũng được trình bày trong bài báo này

Patricia Stock et al., (2000) đã so sánh và phân tích tính đa dạng hình

thái của các cá thể đực và ấu trùng cảm nhiễm tuổi 3 của chủng tuyến trùng

Steinernema kraussei (Steiner, 1923) phân lập từ Canada, US Nghiên cứu

này cho thấy rằng có sự sai khác về mặt hình thái giữa các vùng địa lý, nhưngkhông thay đổi trong một vùng

Năm 2000, Sudershan Ganguly và L K Singh đã phân lập một loài

tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng mới, Steinernema thermophilum từ

vùng nông thôn ở New Delhi, Ấn Độ Loài này đã được mô tả và so sánh về

mặt hình thái với một số loài trong giống Steinernema Một số đặc điểm sinh

học của loài mới này: chiều dài cơ thể của ấu trùng cảm nhiễm trong khoảng

480 - 620μm, gần tương đồng với loài S carpocapsae Khả năng giết vật chủ

từ 24 - 36h, vòng đời từ 2 - 3 thế hệ trong 5 - 6 ngày ở 30 - 350C Cá thể đực

và cái trưởng thành thế hệ một được hình thành trong 24 - 48h sau khi vật chủchết, cá thể trưởng thành thế hệ 2 được hình thành sau 72 - 96h

Hussaini et al., (2001) sử dụng phương pháp RFLP khuếch đại PCR

vùng trình tự ITS-rDNA với 17 enzym giới hạn của 3 loài tuyến trùng

Steinernema Kết quả sau đó được phân tích và cho thấy 1 loài Steinernema

tami được tìm thấy ở rừng Việt Nam, 1 loài S abbasi ở nam nước hồi giáo của Oman và 1 loài chưa được mô tả Steinernema sp SSL2 từ Sri Lanka.

Năm 2001, Steinernma pakistanense được Shahina et al., mô tả là loài

mới Loài này được tìm thấy trong các mẫu từ các vùng khác nhau của

Pakistan Đặc điểm để phân biệt loài này với các loài Steinernema khác là 2

cấu trúc giống như sừng nhô ra trên vùng miệng của các cá thể ấu trùng cảmnhiễm tuổi 3 Những kiểm tra về hình thái và DNA tách rời loài này từ 2 loài

có hình thái tương đồng S bicornutum và S certophorum Các đặc điểm sinh

học cũng được mô tả kĩ lưỡng bao gồm chiều dài cơ thể trung bình (683 μm),

8 đường bên, chiều dài thực quản, vị trí lỗ bài tiết và gai giao cấu Thêm vào

đó, phân tích RFLP của vùng ITS-rDNA cũng cho thấy sự khác biệt với các

loài Steinernema khác.

Những nghiên cứu về tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh với chúng giaiđoạn trước năm 1998 đã được Boemare N tổng hợp vào năm 2002 Tác giả

đã trình bày đầy đủ các đặc điểm hình thái, sinh học của các loại tuyến trùng

của 2 giống Steinernema và Heterorhabditis đã được phân loại từ trước năm

1998 cũng như các đặc điểm sinh học và hoạt tính của các vi khuẩn cộng sinhvới 2 chủng tuyến trùng nói trên

Sekcuk Hazir (2003) nghiên cứu những đặc điểm về kích thước hình

thái để công bố một loài mới thuộc giống Steinernema, Steinernema anatoliense với các đặc điểm riêng biệt so với các loài khác: chiều dài cơ thể

của ấu trùng cảm nhiễm tuổi 3 (507 - 580μm) với 6-8 đường bên theo chiềudọc cơ thể, hình thái đuôi của con đực thế hệ 1 với mucro biểu bì, hình dángcủa gai giao cấu và dây dẫn và sự sắp xếp của các nhú sinh dục Các tác giảcũng đã tiến hành lai chéo và phân tích RFLP vùng trình tự ITS-rDNA của

loài này cũng cho thấy sự khác biệt với 50 loài Steinernema khác.

Cũng trong năm này, Christopher Cutler và Patricia Stock đã sử dụngcác đặc điểm về hình thái, dữ liệu trình tự gen 28S rDNA và phân tích RFLP

để công bố loài Steinernema mới ở Trung Quốc Steinernema websteri có các

đặc điểm hình thái: chiều dài cơ thể con đực trưởng thành thế hệ 1 trung bình1712μm, con cái thế hệ 1 trung bình 5542 μm, ấu trùng cảm nhiễm có chiềudài 584 μm Christopher Cutler phân tích RFLP cho thấy rằng loài mới này

cùng với loài S carpocapsae có kết quả phân tích đa hình cắt giới hạn bằng enzym tương tự nhau Trong cây phát sinh chủng loại, loài mới S websteri có mối quan hệ gần với nhánh gồm 4 loài S abbasi, S riobrave, S ceratophorum và S bicornutum.

Năm 2004 là năm đánh dấu sự phát hiện của nhiều loài tuyến trùng

mới Ở Mexico, Khuong B Nguyen et al., (2004) đã tìm thấy một loài tuyến

trùng mới trong giống Heterorhabditis ở phía bắc của bang Tamaulipas Dữ

liệu hình thái và phân tử chỉ ra rằng tuyến trùng này là loài mới Loài mới

được mô tả là Heterorhabditis mexicana và là taxon lớn hơn H indica Heterorhabditis mexicana có hình thái giống với H bacteriophora, H brevicaudis và H indica và có thể phân biệt với những loài này bằng các đặc điểm của con đực và con cái Các mẫu của H mexicana có tới 70% con cái có

8 nhú, trong khi tất cả các loài khác là 9 Tỉ lệ của ống dẫn tinh so với chiều

dài gai giao cấu cao hơn so với H bacteriophoora, H brevicaudis, H indica

và chiều dài tương đối của gai giao cấu so với chiều rộng cơ thể tại anus (SW)

lại ngắn hơn so với tất cả các loài Trong vùng ITS của rDNA, H mexicana

tiến hóa 13 trạng thái đặc điểm nucleotide giống nhau, khác biệt hẳn so với H.indica ở 113 vị trí khớp

Steinermena jollieti được mô tả loài mới bởi Spiridonow et al., Mẫu

này được phân lập từ một mẫu dất thu được trong rừng ở Mỹ vào năm 1999.Hình thái học và trình tự phân tử của ITS-rDNA chỉ ra rằng loài mới phân bố

rộng Một đặc điểm đặc trưng của S jollieti ấu trùng cảm nhiễm chỉ có 6

đường bên ở giữa cơ thể, và những cá thể cái thế hệ thứ 2 có một mucro trên

mấu đuôi Trình tự ITS rDNA của S jollieti thuộc một nhánh cùng với nhóm

S krausei, S feltiae, S weiseri và S oregonense, trình tự này cũng cho thấy mức độ sai khác cao hơn so với các loài Steinernema

Năm 2004, Spiridonov et al sau khi phân tích mối quan hệ phát sinh

chủng loại vùng gen ITS1-5.8S-ITS2 của rADN của các loài tuyến trùng

Steinernema đã phân chúng ra thành 5 nhóm có mối liên hệ về hình thái ấu

Nhóm ‘arenarium-glaseri-karii-longicaudum’ : chiều dài cơ thể IJs lớn

hơn 1000μm, nhóm này có 11 loài

Nhóm ‘bicornutum-ceratophorum-riobrave’ : có cấu trúc mấu đôi ở

vùng môi IJs, nhóm này có 7 loài

Patricia Stock et al., (2004) đã quan sát các đặc điểm hình thái và

nghiên cứu các bằng chứng về phân tử (các nghiên cứu lai chéo) để chỉ ra

những khác biệt của S hermaphroditum từ những Steinernema spp khác.

Loài mới này được mô tả bởi sự có mặt lưỡng tính trong cá thể trưởng thànhthế hệ 1 Những đặc điểm hình thái chính bao gồm: một đuôi hình ngón với 1mucro và một túi nhận tinh dạng tuyến chứa tinh dịch trong cá thể lưỡng tínhthế hệ 1 Các bằng chứng phân tử từ những phân tích RFLP về ITS rDNA,trình tự 28S rDNA, và xây dựng lại cây phát sinh chủng loại Loài mới này có

quan hệ gần gũi với loài S carabaei.

Mutsuhiro Yoshida (2004) đã nghiên cứu và mô tả 1 loài EPN mới,

Steinernema litorale đã được phân lập từ các mẫu đất cát ở Nhật bản Loài

mới này được mô tả theo những đặc điểm về hình thái: ấu trùng cảm nhiễm

tuổi 3 có chiều dài cơ thể trung bình 909 ± 42,1μm, chiều dài đuôi trung bình

83 ± 4,5 μm Loài này khác biệt hẳn so với các loài giống nhau về hình thái

(S feltiae, S thanhi, S karii, S scarabaei, S kraussei, S oregonense, S loci

và S diaprepesi) bằng các phân tích RFLP Những nghiên cứu về hình thái và phân tử cũng cho thấy loài mới này rất giống với S feltiae, nhưng các kiểm

tra lai chéo đã cho thấy rằng đó là loài mới

Dựa trên các dữ liệu về hình thái và phân tử, Khuong b Nguyen, 2004

đã đưa ra một loài mới phân lập từ Yirgalem, Ethiopia Steinernema yirgalemense Loài mới này thuộc nhóm bicornutum là nhóm tuyến trùng có

các cấu trúc giống sừng trong vùng môi của ấu trùng cảm nhiễm Cá thể ấutrùng cảm nhiễm có chiều dài cơ thể khoảng 635 μm, chiều dài đuôi 62 μm.Bằng việc mô tả chiều dài trình tự ITS (960bp), ITS1 (270bp) ITS2 (284bp)

chứng tỏ loài mới Steinernema yirgalemense có quan hệ họ hàng với S abbasi.

L Qiu et al., (2005) đã nghiên cứu và mô tả một loài EPN mới là Steinernema akhursti được thu thập từ các mẫu đất tại tỉnh Yunan, Trung Quốc Dữ liệu về hình thái cũng như phân tử đều chỉ ra rằng S akhursti thuộc

về nhóm loài S feltiae Những đặc điểm về hình thái khác biệt của Steinernema akhursti như: chiều dài gai 90 ± 4,6 μm, đầu mút của gai có một

kẽ hở ở mặt bụng Các đặc điểm hình thái của ấu trùng cảm nhiễm được môtả: chiều dài cơ thể 812 ± 19 μm, đuôi dài và mảnh có phần thắt lại trong suốtvới chiều dài 73 ± 2,9 μm, đây là đặc điểm để xác định loài mới Việc xác

định trình tự của chuỗi 28S rDNA cũng chứng minh S akhursti là loài mới, kết quả kiểm tra lai chéo cho thấy loài này gần gũi với S feltiae và S oregonense.

Khương B Nguyễn (2006) đã nghiên cứu một loài EPN mới,

Steinernema khoisanae được mô tả từ Nam Mỹ Loài mới có các đặc điểm

hình thái về ấu trùng cảm nhiễm với chiều dài cơ thể 1076 μm, chiều rộng cơ

thể 33 μm, chiều dài từ đầu đến lỗ bài tiết 94 μm, đuôi dài 84 μm Số đườngbên của loài mới là 2, 7, 8, 6, 4 và 2 Cá thể đực trưởng thành thế hệ 1 có thể

phân loại bởi vulva không thò ra và đuôi có mucron lồi lên Steinernema khoisanae được mô tả về mặt di truyền bởi các trình tự của các vị trí đệm và các vùng D2/D3 của 28S rDNA Cây phát sinh phả hệ cho thấy S khoisanae

và các thành viên khác của nhóm S glaseri thuộc một nhánh

b Vi khuẩn cộng sinh

Song song với việc nghiên cứu về tuyến trùng, các nhà khoa học cònnghiên cứu về các loài vi khuẩn cộng sinh với các tuyến trùng Phương phápPCR khuyếch đại gen 16S-rARN của vi khuẩn là phương pháp nhanh nhất và

phổ biến nhất hiện nay trong phân loại vi khuẩn (Brunel et al, 1997) Bằng

phương pháp này các nhà khoa học đã phân loại đến loài 18 chủng vi khuẩn

Xenorhabdus và 8 chủng Photorhabdus

Năm 1997, Emília Szállás et al đã phân tích trình tự của gen 16S

rRNA của 40 chủng vi khuẩn cộng sinh được phân lập từ tuyến trùng

Heterorhabditis spp và 7 vi khuẩn cộng sinh của tuyến trùng Steinernema

spp được phân lập từ những vùng địa lý khác nhau, và trình tự của một vàichủng tham khảo trong họ Enterobacteriaceae Kết quả giải trình tự cho thấy

chiều dài gen của chủng Xenorhabdus khoảng 1339 nucleotide, còn của các

chủng vi khuẩn còn lại nằm trong khoảng 1428 đến 1452 nucleotide Phân

tích phát sinh chủng loại cho thấy các loài thuộc chủng Xenorhabdus, Photorhabdus và các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae phân ra thành 3 nhánh khác nhau, trong đó Photorhabdus được phân chia thành 5

nhánh phụ

Marion Fischer et al., (1998) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của

117 chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

Xenorhabdus và Photorhabdus bằng sự phân tích RFLP của sản phẩm PCR

gen 16S rRNA (rDNAs) Tác giả đã xác định được 30 kiểu gen 16S riêng biệt

và nhóm chúng vào các giống Xenorhabdus và Photorhabdus Cả 2 giống đều

đa dạng về kiểu gen và có liên quan tới sự phân bố của tuyến trùng vật chủ

Marion Fisscher et al., (1999) đã dựa trên những đặc tính về hình thái, sinh lý, hóa sinh để sắp xếp một số chủng vi khuẩn Photorhabdus vào 3

nhóm: nhóm I (nhiệt độ sinh trưởng tối đa từ 35-39C) gồm những vi khuẩn

cộng sinh với tuyến trùng Heterorhabditis bacteriophora và Heterorhabditis indica Nhóm II (nhiệt độ sinh trưởng tối đa 33-350C) gồm những chủng vi

khuẩn cộng sinh với H megidis, H zealandica Nhóm III (nhiệt độ sinh

trưởng tối đa là những vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh ở người.Dựa trên phân tích cây phát sinh chủng loại xây dựng từ trình tự gen 16S

rRNA các tác giả đã đề xuất phân 2 loài mới: P luminescens subsp luminescens, P luminescens subsp akhurstii, P luminescens subsp laumondii, tách ra từ chủng Photorhabdus luminescens, và 2 loài P temperata, P temperata subsp., temperata tách ra từ chủng Photorhabdus temperata.

Isabelle Babic et al., (2000) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Heterorhabditis indica với vi khuẩn

Ochrrobactrum spp Các vi khuẩn cộng sinh tự nhiên Photorhabdus

luminescens subsp akhurstii được phân lập từ tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis indica 14 vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng được

chọn lọc từ 3 đảo Caribbean khác nhau, được mô tả bằng những kiểm tra kiểuhình thường, phân tích trình tự và đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn củaPCR gen 16S rRNA (16S rDNAs) Các phân lập được nhóm vào 3 kiểugenome, mỗi nhóm tương ứng với một đảo Caribbean Các đặc điểm kiểu

hình và phân tích 16S rDNA chỉ ra rằng vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus có quan hệ gần gũi với Ochrobactrum anthropi.

Liu et al., 2001 đã so sánh trình tự của 2 chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Heterorhabditis marelatus và Steinernema oregonense thu được

từ bờ biển Bắc Mỹ Trình tự 16S của loài Xenorhabdus spp mới gần giống với loài X bovienii (cộng sinh với S feltiae) Loài Photorhabdus spp mới rất khá biệt với các loài Photorhabdus đã biết mặc dù nó có quan hệ gần gũi với nhóm P temperata.

Martin Sergeant et al., (2006) đã giải trình tự gen 16S rRNA, 4 gen giữ nhà (asd, ompR, recA và serC) và gen fliC của các chủng Xenorhabdus từ

những tuyến trùng phân lập từ các mẫu đất ở Vương quốc Phần lớn cácchủng (191/197) được tìm thấy có các gen với sự tương đồng lớn nhất với loài

Xenorhabdus bovienii, và 6 chủng có gen giống với Xenorhabdus nematophila Nhìn chung, trình tự 16S rRNA và các dạng trình tự dựa trên

gen quản gia là tương đồng Phân tích thống kê cho thấy rằng sự tái tổ hợp

xảy ra ở locus serC Locus fliC chứa một vùng trung tâm biến đổi cao Tất cả các chủng X nematophila đều có gen độc tố trừ sâu xpt A1A2B1C1.

Patrick Tailliez et al., (2006) đã nghiên cứu tỉ mỉ tính đa dạng của 76 chủng Xenorhabdus phân lập từ ít nhất 27 loài của tuyến trùng Steinernema

và chọn lựa trong 32 quốc gia, bằng cách sử dụng 3 phương pháp bổ sung:giải trình tự gen 16S rRNA, mô tả đặc điểm phân tử và kiểu hình Các trình tự

gen 16S rRNA của các chủng Xenorhabdus được bảo tồn ở mức cao Dựa trên

những so sánh về trình tự gen 16S rRNA, các tác giả đã phân loại 13 nhóm và

7 trình tự đơn nhất, và đã mô tả 10 loài Xenorhabdus mới: Xenorhabdus cabanillasii, Xenorhabdus doucetiae, Xenorhabdus griffiniae, Xenorhabdus hominickii, Xenorhabdus koppenhoeferi, Xenorhabdus kozodoii, Xenorhabdus mauleonii, Xenorhabdus miraniensis, Xenorhabdus romanii, Xenorhabdus stockiae Các chủng Xenorhabdus đã nghiên cứu ở đây có

những mẫu kiểu hình giống nhau, nhưng các điểm đặc trưng kiểu hình khác

nhau theo các loài: X bovienii, X cabanillasii, X hominickii, X kozodoii, X nematophila, X poinarii và X szentirmaii Dựa trên phân tích kiểu hình tác

giả đã xác định 2 nhóm chủng chính Nhóm kiểu hình GA gồm những chủng

có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ 35-420C, và nhóm kiểu hình GB gồmnhững chủng sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 350C.

Tímea Tóth và Tamás Lakatos (2008) đã mô tả vi khuẩn cộng sinhphân lập từ tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở Hungari, một số loài vi

khuẩn đã phân lập từ Heterorhabditis downesi và Heterorhabditis megidis

cho thấy rằng chỉ có sự giống nhau về trình tự gen 16S rRNA của tất cả các

loài và phân loài Photorhabdus đã mô tả Dựa trên trình tự gen 16S rRNA,

mối quan hệ phát sinh chủng loại của những chủng là không chắc chắn, vì giá

trị bootstrap thấp Tác giả đã sử dụng các trình tự gysB cho phân tích cây phát sinh chủng loại, và đã chứng minh vi khuẩn phân lập từ Heterorhabdis downesi là loài mới Photorhabdus temperata subsp cinerea subsp.

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về tuyến trùng ở Việt Nam được bắt đầu từ năm 1997 và đếnnay đã đạt được một số thành tựu đáng kể Các nhà khoa học đã điều tra, phânlập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, mô tả cơ chế xâm nhập và pháttriển của tuyến trùng EPN Một số loài tuyến trùng EPN đã được nghiên cứu

về khả năng diệt sâu hại để ứng dụng trong thực tiễn phòng trừ sinh học

Nguyễn Ngọc Châu et al., (1999) đã nghiên cứu hiệu lực gây chết của các chủng tuyến trùng Steinernema sp TK10 và Heterorhabditis sp TK3 đối với

một số sâu hại ở cây trồng Việt Nam cho thấy phổ gây chết sâu hại của 2 chủng

tuyến trùng này khá rộng, trong đó chủng Steinernema sp TK10 có phổ ký sinh

gây bệnh lớn hơn Hiệu lực gây chết qua chỉ số LC50 của 2 chủng tuyến trùngtrên 7 loại sâu hại đều ở mức tương đối thấp (13-95IJs) cho thấy đây là 2 chủng

có hiệu lực gây chết cao đối với một số chủng khác của thế giới và có thể đápứng tiêu chuẩn tác nhân phòng trừ sinh học

Ke Long Phan et al., (2001) đã nghiên cứu và mô tả 2 loài tuyến trùng mới thuộc giống Steinernema (Rhabditida): Steinernema loci và S thanhi

được phân lập từ các mẫu đất bãi biển ở 2 tỉnh Thanh hóa và Hà Tĩnh Sự kết

hợp các nghiên cứu về hình thái học và dữ liệu phân tích rDNA-RFLP cho

thấy sự khác biệt của 2 loài này với các loài Steinernema khác Các đặc điểm hình thái ấu trùng cảm nhiễm tuổi 3 của Steinernema loci gồm: chiều dài cơ

thể từ 896 - 1072 μm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết từ 71 - 86 μm, chiềudài đuôi từ 66 - 83 μm, 9 đường bên riêng biệt Các đặc điểm hình thái ấu

trùng cảm nhiễm của Steinernema thanhi gồm: chiều dài cơ thể 720-960 μm,

khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết 68-84 μm, chiều dài đuôi 52-72 μm, 9

đường bên Phân tích RFLP cho thấy Steinernema thanhi có thể phân biệt từ loài S arenarium bởi 9 enzym giới hạn, từ loài S glaseri bởi 11 enzym, và 4 enzym từ loài S loci.

Bằng việc mô tả các đặc trưng về sinh thái và phân tích RFLP vùng

trình tự ITS r-DNA, Long Phan Ke et al., (2001) đã đưa ra 1 loài tuyến trùng Steinernema mới được thu thập tại tỉnh Thanh hóa, S sangi Loài mới này có một đặc điểm tương đồng với loài S kraussei là ấu trùng cảm nhiễm cùng có

8 đường bên, nhưng chiều dài cơ thể lại ngắn hơn (753 và 951 μm), khoảngcách từ đầu đến lỗ bài tiết ngắn hơn (51 và 63 μm), chiều dài gai giao cấu dàihơn (63 và 49 μm) Việc phân tích RFLP cũng cho thấy sự khác biệt giữa 2loài này bởi 9 enzym giới hạn

Phan Kế Long et al., (2003) đã nghiên cứu sự phân bố của các chủng

tuyến trùng thu được Xác xuất bắt gặp tuyến trùng trong các mẫu đất thuđược là không cao (44 mẫu có 1 chủng EPN trong tổng số 910 mẫu đất)

Trong đó giống Heterorhabditis bắt gặp ít hơn so với giống Steinernema (12

và 32 loài) H indica là loài phổ biến nhất ở Việt Nam Trong số 32 loài của Steinernema ở Việt Nam thì có 4 loài mới cho khoa học (S tami, S sangi, S thanhi và S loci) Cũng trong năm 2003 Phan Kế Long và cs đã dựa trên

những đặc điểm sinh học và phân tích RFLP vùng trình tự ITS để công bố

loài mới Heterorhabditis baujardi Loài mới này có quan hệ gần gũi với H indica.

Phan Kế Long (2004) đã sử dụng phương pháp Maximum parsimony để

xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các kết quả nghiên cứu về hình thái và giải mã vùng ITS-rADN của 29 loài thuộc chủng Steinernema thu

được tại Việt Nam Các loài này được chia thành 5 nhóm (Hình 2)

Hình 2 Mối quan hệ họ hàng của các loài Steinernema phân lập ở Việt

Nam (Phan Ke Long, 2004)

Nguyễn Ngọc Châu, 2008 mô tả đặc điểm sinh học của các loài tuyếntrùng ở Việt Nam Tác giả cũng đã xây dựng khóa định loại các loài tuyếntrùng của Việt Nam

2.3 Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong việc nghiên cứu về tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh.

a Tuyến trùng

Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái đã được các nhà khoa học sửdụng như một công cụ hữu ích trong việc phân loại các loài tuyến trùng((Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Tuy nhiên, những nhầm lầm trong mô tả hìnhthái là khó tránh khỏi, do đó đi đôi với việc mô tả các đặc điểm hình thái, cácnhà khoa học đã tiến hành giải trình tự vùng gen ITS-rADN của tuyến trùnggiúp cho việc định loại đến loài chính xác hơn ((Phan Kế Long, 2004) Đâycũng là phương pháp phổ biến hiện nay cho việc định loại các loài tuyến trùngmới Vùng gen ITS-rADN có những ưu điểm:

- Vùng gen này chứa nhiều sai khác thích hợp cho phân loại đến loài vàphân loài ở tuyến trùng

- Vùng gen này có tính bảo thủ cao, thông tin di truyền ổn định củanhóm tuyến trùng

- Cơ sở dữ liệu của trình tự ITS-rADN trên Genbank rất phong phú và

có nhiều thuận lợi cho các nhà khoa học có thể so sánh đối chiếu và đánh giákết quả

b Vi khuẩn cộng sinh

Hệ thống phương pháp nghiên cứu về vi khuẩn ngày càng được hoànthiện, từ những nghiên cứu ban đầu về hình thái khuẩn lạc cho tới ứng dụngcác kỹ thuật hiện đại Việc nghiên cứu về hình thái khuẩn lạc tuy rất đơn giản

song cũng ngày càng bộc lộ nhiều hạn chế trong việc phân tích kết quả nghiêncứu do: Kết quả về hình thái khuẩn lạc dễ bị lẫn lộn không ổn định do phụthuộc vào điều kiện nuôi cấy; thử hoạt tính sinh hóa phức tạp, để ổn địnhphải yêu cầu điều kiện thí nghiệm rất nghiêm ngặt Các thí nghiệm tiến hànhtiêu tốn nhiều thời gian trong khi đó kết quả đem lại khó đối chiếu do khôngđồng nhất về điều kiện thí nghiệm và các thông tin thu được khó số hóa Đánhgiá sự đa dạng và mối quan hệ phát sinh ít đem lại kết quả cao.

Trong nghiên cứu định loại về vi khuẩn và xác định quan hệ di truyềnthì trình tự 16S rDNA được đánh giá là tiêu chuẩn vàng với những ưu điểm:

- Đây là trình tự mã hóa cho riboxom có cấu trúc di truyền ổn địnhtrong cả giới vi khuẩn

- Trình tự này mang thông tin di truyền để có thể phân biệt quan hệgiữa các loài khác nhau thậm chí là cả các phân loài, chủng

- Việc phân lập, giải trình tự của trình tự này hoàn toàn dễ dàng vàthuận lợi do nó mang những vùng bảo thủ thuận lợi cho việc thiết kế mồi

- Cơ sở dữ liệu của trình tự 16S rDNA trên Genbank rất phong phú và cónhiều thuận lợi cho các nhà khoa học có thể so sánh đối chiếu và đánh giá kếtquả

Chính vì vậy mà việc ứng dụng kỹ thuật sinh học hiện đại đặc biệt là kỹthuật giải trình tự 16S rDNA đã đưa đến một kết quả nhanh chóng, dễ dàng và

có độ tin cậy cao, đáp ứng được mục tiêu và yêu cầu mà đề tài hướng tới

3 KHÁI QUÁT ĐIỀU KIỆN ĐỊA LÝ TỰ NHIÊN VƯỜN QUỐC GIA

BA VÌ

3.1 Vị trí địa lý

Vườn quốc gia Ba Vì nằm trên địa bàn 5 huyện: Ba Vì, ThạchThất, Quốc Oai, Thành phố Hà Nội, huyện Lương Sơn, Kỳ Sơn tỉnh HòaBình

Hình 3 Bản đồ hành chính Vườn Quốc Gia Ba Vì

Phía Nam giáp giác xã Phúc Tiến, Dân Hòa thuộc huyện Kỳ Sơn, xãLâm Sơn thuộc huyện Lương Sơn tỉnh Hòa Bình

Phía Đông giáp các xã Vân Hòa, Yên Bài thuộc huyện Ba Vì, xã YênQuang thuộc huyện Lương Sơn, các xã Yên Bình, Yên Trung, Tiến Xuânthuộc huyện Thạch Thất, xã Đông Xuân thuộc huyện Quốc Oai, Thành phố

Hà Nội

Phía Tây giáp các xã Khánh Thượng, Minh Quang huyện Ba Vì, HàNội, và xã Phú Minh huyện Kỳ Sơn, tỉnh Hòa Bình

Khí hậu: đặc điểm chung của Ba Vì bị chi phối bởi các yếu tố vĩ độ

Bắc, cơ chế gió mùa, sự phối hợp giữa gió mùa và vĩ độ tạo nên khí hậu nhiệtđới ẩm với mùa đông lạnh và khô Nhiệt độ bình quân năm trong khu vực là23,40C Ở vùng thấp, nhiệt độ tối thấp xuống tới 2,70C; nhiệt độ tối cao lên tới

lên nhiệt độ chỉ còn 160C Nhiệt độ thấp tuyệt đối có thể xuống 0,20C Nhiệt

độ cao tuyệt đối 33,10C Lượng mưa trung bình năm 2.500mm, phân bốkhông đều trong năm, tập trung nhiều vào tháng 7, tháng 8 Độ ẩm không khí86,1% Vùng thấp thường khô hanh vào tháng 12, tháng 1 Từ độ cao 400mtrở lên không có mùa khô Mùa đông có gió Bắc với tần suất >40% Mùa Hạ

có gió Đông Nam với tấn suất 25% và hướng Tây Nam

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là những chủng tuyến trùng thu được tại vườnquốc gia Ba Vì tháng 6/2010

Danh sách tuyến trùng và vi khuẩn sử dụng để phân tích được lấy từgenbank được trình bày trong phần phụ lục 1

5 VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

5.1 Vật liệu

- Ấu trùng bướm sáp lớn, Galleria mellonella.

- Môi trường NBTA (Nutrient agar supplemented with bromothymolblue and triphenyl tetrazolium chloride) dùng để nhân nuôi vi khuẩn có thànhphần như sau:

Hoà lẫn hỗn hợp này trong nước, ngoại trừ TTC và hấp ở 1210C trong

15 phút Chỉ trước khi rót ra đĩa (agar < 500C), thêm TTC Nếu TTC vôtrùng, cân cẩn thận từng tí một trong 1 cốc sạch khuẩn và rót nó vào môitrường đã hấp Xoáy nước để trộn đều Nếu TTC khô, thêm vài ml nước cất

và cho đi qua 1 siêu phin lọc trước khi cho vào môi trường đã nguội TTC sẽhỏng khi thêm vào môi trường quá nóng

- Bộ sinh phẩm DNeasy Blood and Tissue Kit của hãng QIAgen dùng đểtách chiết ADN tổng số từ khuẩn lạc của vi khuẩn

- Bộ sinh phẩm MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR

- Dung dịch đệm điện di TBE (Tris/Borate/EDTA) 1X được pha loãng từdung dịch gốc TBE 5X có thành phần như sau:

Tris base: 53g EDTA 0,5M pH 8,0: 20ml

Axit boric: 27,5g Nước khử ion vừa đủ 1lit

- Gel agarose 1% Cân 0,4g bột agarose hoà trong 40 ml dung dịch đệmTBE 1X, đun trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút cho bột agarose tan hết Khigel hạ nhiệt độ xuống khoảng 50ºC, đổ vào khay điện di đã đặt sẵn lược điện

di có độ dày răng lược thích hợp Để gel đông và ổn định hoàn toàn trongkhoảng 1 giờ

- Dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0,05 μg/ml (EtBr): Pha 1 gamEtBr trong 100 ml nước cất Dung dịch EtBr gốc được giữ trong lọ màu ởnhiệt độ phòng

- Đệm tra mẫu (Loading Dye) có thành phần như sau:

- Cồn 96°, dung dịch ATL, dung dịch Proteinase K

- Dung dịch TAF: cố định và bảo quản tuyến trùng:

Formalin(40%) 7mlTriethanolamine 2ml

- Dung dịch WLB (Worm Lysis Buffer) dùng để tách ADN tổng số củatuyến trùng bao gồm: 500 mM KCl; 100mM Tris-Cl pH = 8,3; 1,5 mMMgCl2; 10 mM DTT; 4,5% Tween 20% gelatin).

- Kẹp nhỏ và que cấy tiệt trùng

- Bộ điện di ADN (Advance Tech, Nhật Bản)

- Cân phân tích 10-4g (Mettler Toledo)

- Lò vi sóng

- Máy ly tâm (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ)

- Máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI)

- Máy soi chụp ảnh gel (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh (Sorvall Biofuge Fresco)

- Máy xác định trình tự ADN tự động (ABI 3100 Avant GeneticAnalyzer)

6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyến trùng

a Phương pháp thu mẫu tuyến trùng

EPN sống trong đất là các ấu trùng cảm nhiễm, chúng sống chủ yếu ởnhững nơi đất ẩm, tơi xốp vì vậy sử dụng túi nylon để chứa các mẫu đất là tốtnhất Mẫu vật nên được bảo quản trong điều kiện lạnh 5-100C, nếu cao quáhoặc thấp quá có thể ảnh hưởng không tốt đến tuyến trùng Tránh tác độngtrực tiếp của tia nắng mặt trời Mẫu đất sau đó sẽ được cho vào hộp nhựa và

bỏ 4-5 ấu trùng bướm sáp lớn Gamellia và lật úp hộp sao cho Gamellia di

chuyển trong đất giúp cho khả năng tiếp xúc vật chủ của EPN tốt hơn Cácmẫu đất có sâu chết sẽ được làm White trap để thu tuyến trùng (Nguyễn NgọcChâu, 2008)

b Phương pháp phân loại tuyến trùng bằng hình thái

EPN trước khi phân loại sẽ được làm tiêu bản cố định ở giai đoạn ấutrùng cảm nhiễm để quan sát dưới kính hiển vi quang học cho phép nhanhchóng phân biệt các giống thông qua các đặc trưng hình thái quan trọng như:cấu trúc vùng đầu vị trí lỗ bài tiết, cấu trúc dạng đuôi Phương pháp xử lýtuyến trùng làm tiêu bản bằng glycerol - ethanol (Seinhorst, 1959): Ấu trùngcảm nhiễm của tuyến trùng sau khi bị giết bằng nước nóng ở 500C - 600C sẽđược bảo quản trong lọ thủy tinh có chứa dung dịch cố định TAF Sau 1 tuần,tuyến trùng sẽ được chuyển sang đĩa thủy tinh sâu có chứa 0,5ml dung dịch I.Đặt đĩa này trong bình thủy tinh đậy kín, có chứa khoảng 1/10 thể tích là cồn96% và áp suất bão hòa Đặt toàn bộ bình thủy tinh trong tủ ấm trong thờigian tối thiểu 12h ở 400C Sau thời gian này, chuyển các đĩa thủy tinh ra khỏibình và tiếp tục đặt trong tủ ấm Bổ xung dung dịch II cho gần đầy đĩa và đậynắp và tiếp tục để trong tủ ấm tối thiểu 12h Sau đó tuyến trùng có thể sửdụng làm tiêu bản

Các số đo sẽ được sử dụng trong phân loại tuyến trùng: Công thức số đotuyến trùng là hệ thống các chỉ số đo kích thước các phần cơ thể và tỷ lệtương quan giữa các phần của chúng Công thức số đo được áp dụng rộng rãi

để phân loại và là phần bắt buộc khi mô tả một loài tuyến trùng Có một sốcông thức số đo khác nhau được áp dụng trong đó công thức theo de Man(1880) Ý nghĩa của các chỉ số theo de Man được xác định như sau:

W : Chiều rộng lớn nhất của cơ thể

EP : Chiều dài từ đỉnh đầu đến lỗ bài tiết

NR : Chiều dài từ đỉnh đầu vòng thần kinh

ES : Chiều dài từ đỉnh đầu đến tận cùng thực quản

ABW : Chiều rộng cơ thể tại anus

a : Chiều dài cơ thể/chiều rộng lớn nhất

b : Chiều dài cơ thể/Chiều dài từ đỉnh đầu đến tận cùngthực quản

c : Chiều dài cơ thể / Chiều dài đuôi

c Phương pháp phân loại tuyến trùng dựa trên trình tự ITS

- Tách ADN tổng số:

ADN tổng số của EPN được tách chiết theo Joyce et al (1994) và Reid

et al (1997) với các bước:

- Gắp một cá thể trưởng thành vào 1 ống effendorf có chứa 8μl dungdịch đệm WLB và 10μl nước cất 2 lần

- Nghiền mẫu tuyến trùng bằng máy nghiền rung (Vibro Mixer) trong2-3 phút

- Thêm 2μl proteinase K

- Ủ ở nhiệt độ 650C trong ít nhất 60 phút

- Chuyển sang tủ lạnh sâu -750C trong ít nhất 60 phút

- Chuyển sang ủ ở nhiệt độ 650C trong 60 phút

- Bảo quản ADN thu được ở tủ -200C.

- Nhân đoạn ADN đích bằng kỹ thuật PCR

Đoạn ADN đích sẽ được nhân bản (PCR) dùng các mồi đặc hiệu Phảnứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25ml đựng trong ống eppendorf baogồm các thành phần được đưa ra trong bảng 2:

Trong đó cặp mồi để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu được mô tả bởi Joyce

et al, 1994 gồm có: cặp mồi 18S (5'-GTACACACCGCCCGTCGCTG-3’) và 26S (5'-AATCCTAGTTAGTTTCTTTTCC-3') cho tuyến trùng Steinernema

và cặp mồi TW81 (5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’) và AB28

(5’ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’) cho tuyến trùng Heterorhabditis.

Căn cứ thông số kỹ thuật của mồi do nhà sản xuất cung cấp, chúng tôi đãthiết lập được chu trình nhiệt cho phản ứng như sau:

Bảng 3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Các giai đoạn PCR Nhiệt độ ( o C) Thời gian (giây) Số chu kì

Điện di ADN trên gel agarose

- Chuẩn bị gel agarose 1%

- Đặt gel vào bể điện di, đổ dung dịch TBE 1X ngập mặt gel và nhẹnhàng rút răng lược ra

- Tra mẫu: mẫu ADN được trộn với dung dịch loading dye theo tỷ lệ 5:1

và tra mỗi mẫu vào một giếng điện di theo thứ tự mẫu

- Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100V Cácphân tử ADN sẽ chạy từ cực âm sang cực dương

- Gel sau khi chạy điện di được lấy ra và ngâm vào dung dịch EthidiumBromide nồng độ 0,05 μg/ml trong khoảng 15 phút để nhuộm ADN Băng ADNtrong gel có thể nhìn thấy trên máy soi gel bằng tia tử ngoại có bước sóng 302 nm

Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng bộ kit MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR.Các bước tinh sạch sản phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít vàtóm tắt như sau:

Bước1: Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%

Bước2: Cắt đoạn gel chứa băng ADN đặc hiệu của từng mẫu bằng daonhỏ, sắc, sạch Cho băng ADN đã cắt vào ống eppendorf 1,5 ml

Bước 3: Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt Thêm 3 lần thể tích dung dịch

QG theo trọng lượng từng mẫu (1g gel tương đương 1000 µl dung dịch QG)