Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Wall. ex Roxb.) A.DC.)”

2.Đánh giá hoạt tính gây độctếbào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài này Nội dung nghiên cứu của luận án: 1.. 2.Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập 3.Thửho

Trang 1

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

(WALL EX ROXB.) A.DC.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HUẾ, NĂM 2018

Trang 2

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

(WALL EX ROXB.) A.DC.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Hoài

HUẾ, NĂM 2018

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Thị Hoài Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

Hoàng Thị Như Hạnh

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện nhiệt tình và quý báu của nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Nguyễn Thị Hoài, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học, Bộ môn Hóa hữu cơ và Ban Giám Hiệu Trường THPT Đặng Trần Côn đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Tôi cũng xin chân thành cám ơn tập thể cán bộ phòng Dược liệu – Dược

cổ truyền – Thực vật dược, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Huế, ngày tháng năm 2018

Tác giả luận án

Hoàng Thị Như Hạnh

Trang 5

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC x

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae) 3

1.2 Giới thiệu về chi Anodendron 3

Vị trí phân loại 3

Đặc điểm thực vật và phân bố 4

Các nghiên cứu về thành phần hóa học 6

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học 18

1.3 Giới thiệu sơ lược về loài Tốc thằng cáng 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất 24

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 24

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 26

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 29

3.1 Xử lý mẫu và chuẩn bị các cao chiết 29

3.2 Quá trình phân lập các hợp chất 30

3.3 Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập 33

3.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số chất tinh khiết 36

Chương 4 BÀN LUẬN 38

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập 38

Hợp chất AP1: Cycloartenol 38

Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) 40

Hợp chất AP3: (E)-Phytol 49

Hợp chất AP4: Desmosterol 50

Hợp chất AP5: Ursolic acid 52

Hợp chất AP6: Vanillin 54

Hợp chất AP7: Esculentic acid 55

Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside 57

Hợp chất AP9: Rutin 60

Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) 62

Trang 6

Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) 79

Hợp chất AP13: Sargentol 87

Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid 89

Hợp chất AP15: Inugalactolipid A 90

Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A 94

Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B 97

Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C 99

Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D -galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol 101

Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D -(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol 102

4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết 105

KẾT LUẬN 112

KIẾN NGHỊ 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

Trang 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều

1H-1H DEPT Distortionless Enhancement by

Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

HRESIMS High Resolution - Electrospray

Ionization - Mass Spectrometry

Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử HSQC Heteronuclear Single Quantum

qua một liên kết HMQC Heteronuclear Multiple Quantum

Coherence

bằng Hz NOESY Nuclear Overhauser Effect

tính bằng phần triệu

Trang 8

HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thư máu cấp tính

HT-29

Human colon carcinoma Ung thư ruột kết SW-480

K562 Chronic myelogenous leukemic Ung thư bạch cầu tủy

KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô

NBT-T2 Rat bladder epithelial Ung thư bàng quang chuột

Các ký hiệu viết tắt khác

DBE Double Bond Equivalent Số tương đương nối đôi

ED50 Effective Dose 50% Liều có tác dụng đối với

50% cá thể FAME Fatty Acid Methyl Ester Dẫn xuất methyl ester của

acid béo FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power Lực chống oxy hóa được

đo bằng khả năng khử ion sắt (III)

IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối

Trang 9

MFC Minimum Fungicidal Concentration Nồng độ diệt nấm tối

thiểu MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác

Trang 10

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận 4

Bảng 1.2 Sự phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam 5

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập từ A formicinum 19 Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế sự phát triển của ấu trùng Bombyx mori của cardenolide từ A affine 20

Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc của các hợp chất đã phân lập trên các dòng tế bào ung thư 1

Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất AP1 và hợp chất tham khảo 39

Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR hợp phần triterpenoid của hợp chất AP2 41

Bảng 4.3 Số liệu phổ NMR hợp phần acid béo của hợp chất AP2 42

Bảng 4.11 Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP10 70

Bảng 4.12 Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP10 và chất tham khảo 71

Bảng 4.14 Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP11 78

Bảng 4.16 Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP12 85

Bảng 4.19 Số liệu phổ NMR của hợp chất AP15 92

Trang 11

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc chung (a) và vị trí dễ bị oxy hóa (b) của cardenolide 15

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp của cardenolide 15

Hình 1.3 Hệ thống vòng ngưng tụ kiểu cis-trans-cis của cardenolide aglycone 16 Hình 1.4 Phần đường của các cardenolide glycoside phân lập từ họ Apocynaceae 17

Hình 2.1 Loài Tốc thằng cáng: a Phần trên mặt đất, b Lá và quả, c Đại bổ đôi, d Hạt mang chùm lông 23

Hình 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng 29

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform của cây Tốc thằng cáng 31

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước của cây Tốc thằng cáng 32 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 38

Hình 4.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 43

Hình 4.3 Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP2 44

Hình 4.4 Tương tác NOESY chính của hợp chất AP2 44

Hình 4.5 Phổ HRESIMS của hợp chất AP2 44

Hình 4.6 Phổ UV của hợp chất AP2 45

Hình 4.7 Phổ IR của hợp chất AP2 45

Hình 4.8 Phổ 1 H-NMR của hợp chất AP2 46

Hình 4.9 Phổ 13 C-NMR của hợp chất AP2 46

Hình 4.10 Phổ HMQC của hợp chất AP2 47

Hình 4.11 Phổ HMBC của hợp chất AP2 47

Hình 4.12 Phổ COSY của hợp chất AP2 48

Hình 4.13 Phổ NOESY của hợp chất AP2 48

Hình 4.15 Tương tác HMBC chính của hợp chất AP3 50

Hình 4.16 Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP4 52

Trang 12

Hình 4.21 Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp

chất AP8 59

Hình 4.27 Phổ DEPT của hợp chất AP10 65

Hình 4.31 Phổ ROESY của hợp chất AP10 67

Hình 4.34 Tương tác ROESY chính của hợp chất AP10 69

Hình 4.35 Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất alditol hexaacetate của hợp chất AP10 69

Trang 13

Hình 4.60 Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY (b) chính của hợp chất AP13 88

Hình 4.65 Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP16 96

Hình 4.67 Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP17 99

Trang 14

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các phổ của hợp chất AP1 PL1 Phụ lục 2 Các phổ của hợp chất AP2 PL3 Phụ lục 3 Các phổ của hợp chất AP3 PL6 Phụ lục 4 Các phổ của hợp chất AP4 PL9 Phụ lục 5 Các phổ của hợp chất AP5 PL13 Phụ lục 6 Các phổ của hợp chất AP6 PL17 Phụ lục 7 Các phổ của hợp chất AP7 PL20 Phụ lục 8 Các phổ của hợp chất AP8 PL24 Phụ lục 9 Các phổ của hợp chất AP9 PL29 Phụ lục 10 Các phổ của hợp chất AP10 PL34 Phụ lục 11 Các phổ của hợp chất AP11 PL37 Phụ lục 12 Các phổ của hợp chất AP12 PL39 Phụ lục 13 Các phổ của hợp chất AP13 PL41 Phụ lục 14 Các phổ của hợp chất AP14 PL46 Phụ lục 15 Các phổ của hợp chất AP15 PL50 Phụ lục 16 Các phổ của hợp chất AP16 PL56 Phụ lục 17 Các phổ của hợp chất AP17 PL58 Phụ lục 18 Các phổ của hợp chất AP18 PL60 Phụ lục 19 Các phổ của hợp chất AP19 PL62 Phụ lục 20 Các phổ của hợp chất AP20 PL64 Phụ lục 21 Biên bản giám định tên khoa học của cây Tốc thằng cáng PL69 Phụ lục 22 Biên bản thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng PL70

Trang 15

MỞ ĐẦU

Sự gia tăng nhanh chóng của nhiều căn bệnh nguy hiểm có khả năng lan rộng như HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, dịch Ebola, chứng đầu nhỏ do virus Zika… đang là một cuộc khủng hoảng thực sự cho sức khỏe cộng đồng và là thách thức không nhỏ cho hệ thống y

tế trên toàn thế giới Nhằm bảo vệ con người trước những nguy cơ về bệnh tật, các nhà khoa học đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc mới, các phương thức điều trị mới vừa hiệu quả vừa an toàn với cơ thể Một xu hướng quan trọng trong quá trình này là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên bởi chúng thường phù hợp với cơ thể sống, ít độc, thân thiện với môi trường, đa dạng

về cấu trúc, có thể sử dụng trực tiếp để làm thuốc, hoặc làm các mô hình để nghiên cứu tổng hợp thuốc mới Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước cho thấy thực vật là nguồn tài nguyên có giá trị trong việc khám phá và phát triển thuốc

Có thể kể một vài ví dụ điển hình như taxol từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia); vinblastine, vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus); camptothecin từ cây

Hỉ thụ (Camptotheca acuminata); podophyllotoxin từ cây Khoai ma Mỹ (Podophyllum peltatum)…

Trong quá trình sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư một số cây thuốc của đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị mà chúng tôi đã khảo sát, 10 cây thuốc chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống ung thư đã được đưa vào sàng lọc hoạt tính gây

độc tế bào in vitro Trong đó, cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum Roxb

A.DC – Apocynaceae) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tốt trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 thấp, đặc biệt là trên các dòng

tế bào LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan) và MKN-7 (ung thư dạ dày) [4] Tuy nhiên cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học

và tác dụng sinh học của loài này Việc sử dụng cây Tốc thằng cáng để chữa các bệnh liên quan đến khối u chủ yếu dựa vào tri thức bản địa của đồng bào Pako, Vân Kiều Điều này cho thấy loài cây này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học

Trang 16

Từ những lí do trên, chúng tôi đềxuất đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa

học và hoạt tính gây độctế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron

paniculatum(Wall exRoxb.)A.DC.)”

Mục tiêu của luận án:

1 Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chính của loài Anodendron paniculatum(Roxb.) A.DC

2.Đánh giá hoạt tính gây độctếbào ung thư của các hợp chất phân lập được

từ loài này

Nội dung nghiên cứu của luận án:

1 Chiết tách, phân lập, tinh chế các hợp chất từ loài Anodendron paniculatum(Roxb.) A.DC

2.Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập

3.Thửhoạt tính gây độccác dòngtếbào ung thư của các hợp chất đã phân lập

Trang 17

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae)

Họ Trúc đào (Apocynaceae) là họ lớn, được chia thành 5 phân họ (Plumerioideae, Apocynoideae, Periplocoideae, Secamonoideae và Asclepiadoideae) với gần 200 chi, hơn 2000 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới [2], [8]

Họ Trúc đào gồm các đại diện là thân cỏ hoặc thân gỗ to hay nhỏ, phần lớn là dây leo hay bụi đứng Cây có nhựa mủ trắng, thường độc Lá đơn, nguyên, mọc đối, đôi khi mọc cách hoặc mọc vòng, không có lá kèm Hoa đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hoặc hình xim, ở nách lá hay ở ngọn Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, đài 5 thường hợp Tràng hình ống thường có phần phụ ở trong ống tràng, giống như lông hay vảy hoặc tạo thành tràng phụ Tiền khai hoa vặn [2]

Bộ nhị gồm 5 nhị đính trên ống tràng Chung đới có thể kéo dài thành mũi nhọn, đôi khi có mang lông dài hoặc úp lên mặt trên của đầu nhụy Chỉ nhị rời hoặc dính liền thành một ống bao quanh bầu Bao phấn thường chụm vào nhau tạo như một cái mái che trên đầu nhụy và có thể đính vào đầu nhụy (phân họ Echitoideae) hoặc đính vào 5 mặt của đầu nhụy 5 góc Phía ngoài bộ nhị có thể mang những phụ

bộ, tạo thành một tràng phụ thứ nhì do nhị sinh ra Hạt phấn rời hay dính thành tứ tử hoặc phấn khối [2]

Bộ nhụy gồm 2 lá noãn (ít khi 3-5), tự do ở phần đầu, dính nhau ở phần vòi, một vòi duy nhất Đầu nhụy hình trụ ngắn hoặc hình mâm 5 góc Mỗi lá noãn có nhiều noãn tạo thành bầu 2 ô, đính noãn trung trụ hay bầu 1 ô, đính noãn bên Đáy bầu thường có đĩa mật Quả đại, quả nang, đôi khi gặp quả mọng Hạt có cánh hay có chùm lông và nội nhũ Các cây trong họ Trúc đào thường có ống nhựa mủ thật, libe quanh tủy Trong thân có hai vòng libe Mạch thủng lỗ đơn, một số có mạch thang ngắn Ở Việt Nam, họ Apocynaceae có khoảng 100 chi với khoảng 280 loài [2], [8]

1.2 Giới thiệu về chi Anodendron

Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [116], chi Anodendron A.DC có vị

trí phân loại như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc lan

Trang 18

(Magnoliopsida), phân lớp Hoa môi (Lamiidae), bộ Long đởm (Gentianales), họ

Trúc đào (Apocynaceae), chi Anodendron

Dự án “The plant list” khởi động từ năm 2010 đã thống kê được 38 tên loài

thuộc chi Anodendron thu thập từ nhiều cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới, trong

đó chỉ có 17 tên loài được chấp nhận (Bảng 1.1) [52]

Bảng 1.1 Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận

STT Tên khoa học

1 Anodendron affine (Hook &Arn.) Druce

2 Anodendron axillare Merr

3 Anodendron benthamianum Hemsl

4 Anodendron borneense (King & Gamble) Mabb

5 Anodendron candolleanum Wight

6 Anodendron coriaceum (Blume) Miq

7 Anodendron gracile (King & Gamble) Mabb

8 Anodendron howii Tsiang

9 Anodendron nervosum Kerr

10 Anodendron oblongifolium Hemsl

11 Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC

12 Anodendron pauciflorum Hook.f

13 Anodendron punctatum Tsiang

14 Anodendron seramense Mabb

15 Anodendron tubulosum (Ridl ex Burkill&M.R.Hend.) Mabb

16 Anodendron whitmorei Mabb

17 Anodendron wrayi King & Gamble

Đặc điểm thực vật và phân bố

Các loài trong chi Anodendron chủ yếu ở dạng dây leo gỗ Lá mọc đối, nách

lá có nhiều tuyến nâu Cụm hoa ở đầu cành, kiểu xim kép, ít khi ở nách kiểu xim nhiều ngả, 5 lá đài bé và hẹp, gốc đài có nhiều tuyến mọc cách với lá đài, rất ít khi không có tuyến (các loài ở Việt Nam đều có tuyến) Ống tràng dạng ống ngắn Họng tràng không có vảy và tràng phụ Cánh tràng thường dạng lưỡi dài hơn rộng, phủ nhau phải, dài hơn ống tràng, đối xứng hai bên, không có phần phụ và không gặp trong nụ Nhị đính nửa ống tràng phía dưới hoặc ở đáy Chỉ nhị rất ngắn Bao

Trang 19

phấn hình mũi tên, lưng nhẵn, triển hình vòng nguyên hoặc xẻ thùy nông, nhẵn Bầu trên gồm 2 lá noãn rời, đỉnh bầu nhẵn Noãn nhiều Vòi nhụy ngắn Đầu nhụy hình nón dài Quả gồm 2 đại rời nhau, phình to ở gốc, đầu nhọn, mỗi đại không có cuống riêng, vỏ quả nhẵn Giá noãn hóa gỗ Hạt nhiều dạng thuôn, đầu thu hẹp thành mỏ dài mang chùm lông, vỏ hạt nhẵn, chùm lông tồn tại, khó rụng [3], [8], [79]

Theo Phạm Hoàng Hộ [3], chi Anodendron ở Việt Nam gồm 3 loài:

 A affine (Hook & Arn.) Druce

 A paniculatum (Roxb.) A.DC

 A nervosum Kerr

Năm 2004, Phan Kế Lộc và cộng sự bổ sung loài A howii Tsiang vào hệ

thực vật Việt Nam [7]

Các loài thuộc chi Anodendron phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á: Ấn

Độ, Mianma, Nam Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin, Việt Nam [3], [8], [79] Ở Việt Nam, chi này phân bố rải rác khắp

cả nước Dưới đây là bảng phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam [8]

Bảng 1.2 Sự phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam

1 A paniculatum Tốc thẳng, Tốc

thằng cáng, Ngà voi, Dây duy tù, Đay nhui

Quảng Trị, Thừa thiên Huế (Phú Lộc, Bạch Mã), Đắc Lắc, Khánh Hòa (Nha Trang), Đồng Nai (Biên Hòa), Bến Tre, Kiên Giang (Phú Quốc)

2 A affine Ngà voi, Dây duy Hà Giang (Yên Minh), Bắc Giang, Hòa

Bình (Lạc Thủy), Hải Dương (Chí Linh),

Hà Nam (Ninh Thái), Ninh Bình (Cúc Phương)

Trang 20

Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Anodendron ở

trong nước còn khá hạn chế Trong khi đó, nghiên cứu về hóa thực vật của chi này trên thế giới đã được thực hiện lần đầu tiên vào năm 1969 bởi Sasaki và Hirata

[103] Tính đến nay, chỉ có 3 loài của chi này là A affine, A paniculatum và A

formicinum được nghiên cứu về thành phần hóa học với khoảng 88 hợp chất được

phân lập

1.2.3.1 Thành phần hóa học loài A affine

Hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Anodendron chủ yếu

tập trung vào loài này và được thực hiện bởi các nhà hóa học Nhật Bản trong giai đoạn 1969-1994 Tính đến nay, hơn 70 hợp chất đã được phân lập từ loài này trong

đó chủ yếu là các cardenolide glycoside

Năm 1969, Sasaki và Hirata đã phân lập được 2 alkaloid mới khung pyrrolizidine, anodendrine (1), alloanodendrine (2), cùng với một amine bậc bốn, choline (3) Cả hai hợp chất mới (1–2) đều tồn tại ở dạng muối amoni bậc bốn [103] Cấu trúc hóa học của chúng được thiết lập thông qua các chuyển hóa hóa học Hydro hóa anodendrine (1), xúc tác Pd thu được (+)-laburninic acid trong khi

đó tiến hành tương tự với alloanodendrine (2) lại dẫn đến sản phẩm isoretronecanolic acid (đồng phân C-1 epimer của (+)-laburninic acid) Các cấu trúc này cũng được củng cố thông qua tổng hợp toàn phần [104]

(+)-Năm 1971, Shima và cộng sự đã phân lập 2 flavonoid là kaempferol (4), astragalin (5) từ lá [108], [111] và một glycoside của syringic acid là glucosyringic

acid (6) từ thân cây A affine Hợp chất 6 cũng được tổng hợp từ syringic acid và

-acetobromo-D-glucose nhằm chứng minh cấu trúc [109] Nhóm này tiếp tục phân lập β-sitosterol (7), daucosterol (8), sucrose (9), dambonitol (10) và một cardenolide mới chưa xác định được cấu trúc từ thân cây Ngoài ra, các tác giả cũng thu được ursolic acid (11) từ hoa của loài này [107], [111] Tiếp đó, một benzopyran mới là

2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-carboxylic (12) (hay còn được gọi là anofinic

acid) được xác định thông qua các dữ kiện phổ và tổng hợp hóa học [110] Hợp chất

Trang 21

(Russulaceae), Curvularia fallax (Hyphomycetes), hoặc thân gỗ cây Bhesa

paniculata (Celastraceae) [115] Một nghiên cứu khác của nhóm Shima dẫn đến việc phân lập và xác định 2 hợp chất mới từ dịch chiết ether của thân cây gồm 4-hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)benzoic acid (13) và anodendroic acid (14) [112]

Năm 1979, Yamauchi và cộng sự tách được 4 steroid khung prenane chứa nhóm chức 4,16-diene-3-one và 4,6,16-triene-3-one gồm 12β-hydroxyprena-4,6,16-triene-3,20-dione (15), 12β-hydroxyprena-4,16-diene-3,20-dione (16), pregna-4,6,16-triene-3,12,20-trione (17), pregna-4,16-diene-3,12,20-trione (18) Trong đó,

hợp chất 15 còn được gọi là nerolidone A cũng được tách ra từ thân rễ loài Nerium

indicum, các hợp chất 15–17 với nồng độ rất nhỏ (không quá 20 ppm) có tác dụng

làm ngưng chuyển động của cá vàng [133] Cũng trong thời gian này, hai cardiac glycoside mới gồm affinoside A (19), affinoside B (20) được xác định từ vỏ cây

Trang 22

Đáng ghi nhận là cấu trúc của affinoside B (20) được xác định lại bằng phương pháp nhiễu xạ tia X [134]

Các nghiên cứu của Abe, Hanada, Fukuyama và cộng sự trong những năm

1982-1994 đã đóng góp rất lớn trong việc hoàn thiện hóa thực vật của loài A affine

Năm 1982, Abe và cộng sự phân lập được 7 cardenolide glycoside mới, affinoside C–H (21–26), affinoside J (27) cùng với affinoside A (19) Phần đường của các hợp

chất này giống với phần đường của affinoside B (20), đều là

4,6-dideoxy-3-O-methyl-2-hexosulopyranose Phần đường này liên kết với vòng A của nhân steroid tại C-2 và C-3 [10] Cũng trong năm này, Abe và cộng sự tiếp tục công bố một loạt cardenolide aglycone gồm affinogenin C (28), affinogenin D-I–D-V (29–33), cùng với affinoside S-I–S-IX (34–42) từ thân và lá [11] Sự hiện diện của cả 3 dạng đồng phân của 2,3-dihydroxy có thể được hiểu dưới góc độ sinh tổng hợp là do sự tồn tại đồng thời các 2-oxo-3-hydroxy-cardenolide

Trang 23

Năm 1985, hai cardenolide glycoside khác, có cấu trúc tương tự affinoside A

là affinoside M (43), affinoside K (44) đã được phát hiện từ hạt [13] Cấu trúc của hai hợp chất này giống với các glycoside được phân lập từ thân cây (có phần đường

là 4,6-dideoxy-3-O-methyl-2-hexosulopyranose) hơn so với các glycoside được phân lập từ lá cây (có phần đường là 6-deoxy-3-O-methyl-2-hexosulopyranose) Tiếp đó, các ester của p-O-glucosyl- và p-O-primverosylnervogenic acid với

carbohydrat (glucose, sucrose, dambonitol) được phân lập dưới tên gọi anodendrosin A–I (45–53) [14] Ngoài ra, affinoside La–Le (54–58) cũng được nhóm nghiên cứu của Abe thông báo trong năm này [12] Điểm nổi bật của chúng là

sự hiện diện của các nhóm chức mang oxy (oxo, hydroxyl, acetyl) tại 11 hoặc

C-12 trong khi vẫn bảo lưu kiểu liên kết giữa nhóm 2,3-dihydroxy của aglycone với phần đường như các cardenolide glycoside trước đó

Trang 24

Năm 1986, ba glycoside lượng nhỏ là affinoside O (59), affinoside N (60), affinoside I (61) được phân lập từ lá cây cùng với affinogenin D-VI (62) [16] Trong cấu trúc của affinoside O (59), do sự tồn tại của liên kết đôi tại C-3 nên kiểu liên kết qua 2 cầu oxy với C-2, C-3 của aglycone bị ngăn cản Trong khi đó,

affinogenin D-VI (62) là 16-O-acetyl cardenolide duy nhất được phát hiện từ loài

này mặc dù 16 cardenolide hiện diện khá phổ biến ở dạng tự do cũng như dạng

glycoside Năm 1992, Hanada công bố hai hợp chất diester của

4-O-glucosyl-3,5-diprenyl-4-hydroxybenzoic acid với sucrose dưới tên thông thường là anodendrosin

J (63), anodendrosin K (64) [45] Cấu trúc hóa học của chúng được thiết lập thông qua các phương pháp phổ đồng thời kết hợp thủy phân từng phần với KHCO3 0,2% trong MeOH Các glycoside khác gồm affinoside S-X (65), affinoside S-XI (66), affinoside P–T (67–71) cũng được thông báo trong năm này [46]

Trang 25

Năm 1993, Abe và Yamauchi tách được affinoside Lf (72), affinoside Lg (73)

có nhóm mang oxy tại C-11, C-12 từ lá cây tươi cùng với 11 hợp chất đã biết [15]

Sự đa dạng các cardenolide glycoside trong các nghiên cứu về loài A affine được

giải thích là do sự khác biệt trong điều kiện thu thập mẫu và chiết xuất Cùng năm này, Fukuyama và cộng sự thông báo phân lập được các chất mới, 4,5-dehydro-12-

Trang 26

oxo-affinoside E (74), 12-oxo-affinoside E (75), 16β-hydroxyaffinoside A (76) cùng với các affinoisde A, E, M đã biết [38] Trong công trình này, các phổ 2D-NMR (COSY, NOESY) đã được áp dụng để thiết lập cấu trúc cardenolide glycoside thay cho các phương pháp chuyển hóa hóa học trước đây Fukuyama và cộng sự còn phát hiện thêm một cardenolide mới khác là 2α,3β,5,11α,14-pentahydroxy-12-oxo-

5β,14β-card-20(22)-enolide (77) khi nghiên cứu thân và vỏ cây A affine [39]

1.2.3.2 Thành phần hóa học loài A paniculatum

Trên thế giới hiện có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này Năm 1970, Polonia và cộng sự đã tách được 5 cardiac glycoside là anodendroside A (78), E1 (79), E2 (80), F (81) và G (82) [94] Tuy nhiên, với các dữ kiện phổ (UV, IR) ít ỏi, các tác giả chỉ có thể dự đoán phần genin của anodendroside E1, F chứa vòng D bão hòa và mạch nhánh butenolide có cấu trúc thông thường, anodendroside

A, E2, G có thể chứa nối đôi 16 Tín hiệu phổ IR cũng ghi nhận sự hiện diện nhóm carbonyl trong phân tử các anodendroside Cấu trúc của các chất này sau đó được xác nhận bởi Lichtia và cộng sự vào năm 1972 dựa vào phổ NMR, HRMS [73] Riêng nhóm methylendioxy bất thường trong cấu trúc của anodendroside A (78), E1

Trang 27

(79), E2 (80) được khẳng định thông qua sự giải phóng 1 đương lượng mol của formaldehyde khi thủy phân trong môi trường acid

O O

O

O O

O

OH

O OHHO

O O

1.2.3.3 Thành phần hóa học loài A formicinum

Trong khoảng 20 năm (1994-2014), hầu như không có một nghiên cứu nào

về hóa thực vật của chi Anodendron Cho đến gần đây, loài A formicinum được

quan tâm nghiên cứu bởi các nhà hóa học Trung Quốc trong nỗ lực tìm kiếm các chất có hoạt tính kháng khuẩn từ thực vật [96] Theo đó, 8 dẫn xuất của prenylbenzoic acid đã được tách ra, trong đó có 3 chất mới tại thời điểm công bố là formicinuoside A–C (83–85) và 5 chất đã biết gồm 4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid

(13), anodendrosin E (49) , 4-(O-β-D-glucopyranosyl)-3,5-diprenylbenzoic acid

methyl ester (86), 4-(O-β-glucopyranosyl)-3,5-diprenylbenzoic acid (87) và

canthoside C (88) [96]

Trang 28

Nhìn chung, lớp chất chính được tách ra từ chi này có khung cardenolide Đây là nhóm hợp chất có trong nhiều loài thực vật, chúng thường đóng vai trò là chất độc giúp cây chống lại các loài sâu bọ và động vật ăn cỏ Cardenolide có cấu trúc hóa học rất đa dạng, hiện diện ở 12 họ thực vật Riêng với họ Apocynaceae, hơn 30 chi được phát hiện sở hữu các chất chuyển hóa thứ cấp khung cardenolide với khoảng 109 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc [19], [127]

Về mặt cấu trúc, cardenolide là nhóm hợp chất có khung steroid C23 với các nhóm methyl gắn ở C-10, C-13 và một vòng -lactone bất bão hòa gắn ở C-17 Sự

đa dạng của lớp chất này đến từ sự khác biệt cấu hình ở các trung tâm 3, 5,

C-17 cũng như sự có mặt, hoặc mất đi của các nhóm thế, nối đôi trong phân tử (Hình 1.1) [114] Theo quan điểm sinh tổng hợp, cardenolide có nguồn gốc từ cholesterol Theo đó, mạch nhánh của cholesterol bị hydroxyl hóa dần ở C-20, C-22, sau đó phân cắt liên kết C-20/22 tạo thành pregnenolone Vòng A của pregnenolone bị epoxy hóa thành progesterone Sau quá trình khử hóa đặc thù lập thể, progesterone

chuyển thành 3β-hydroxy-5β-pregnan-20-one với kiểu ngưng tụ A/B cis Quá trình

14β-hydroxyl hóa gây ra sự đảo ngược cấu hình C-14 và góp phần tạo nên kiểu

ngưng tụ C/D cis Tiếp đó 3β,14β,21-trihydroxy-5β-pregnan-20-one phản ứng với

malonate ester theo sau bởi phản ứng cộng aldol cho phép xây dựng vòng -lactone (Hình 1.2) [127]

Trang 29

Hình 1.1 Cấu trúc chung (a) và vị trí dễ bị oxy hóa (b) của cardenolide

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp của cardenolide

Về mặt hóa lập thể, vòng lactone tại C-17 định hướng β trong hầu hết trường hợp Nhân steroid của phần aglycone có hệ thống vòng ngưng tụ khác biệt so với các hệ thống vòng steroid nói chung Cụ thể, có 2 dạng: vòng A/B và C/D ngưng tụ

Trang 30

dạng cis, vòng B/C ngưng tụ dạng trans (cis-trans-cis), kiểu vòng ngưng tụ này làm

cho phần aglycone có dạng chữ “U” (Hình 1.3), hoặc vòng A/B và B/C ngưng tụ

dạng trans, vòng C/D ngưng tụ dạng cis (trans-trans-cis) Trên thực tế, các cardenolide có kiểu ngưng tụ trans-trans-cis thường không phổ biến, có thể được

tạo ra thông qua sự khử trực tiếp (xúc tác enzyme) của liên kết đôi 5 của cholesterol Kiểu ngưng tụ này chỉ có hoạt tính yếu hoặc thậm chí không có hoạt tính

Hình 1.3 Hệ thống vòng ngưng tụ kiểu cis-trans-cis của cardenolide aglycone

Đối với các cardenolide glycoside phân lập từ họ Apocynaceae, phần đường thường có từ 1 đến 3 đơn vị monosaccharide liên kết với aglycone tại C-3, với cấu hình β là chủ yếu Khoảng 17 loại đường được tìm thấy gồm D-glucose, gentiobiose, gentiotriose, 6-deoxy-hexose (ví dụ: 6-deoxyallose), 2,6-dideoxy-hexose (ví dụ: L-oleandrose, D-sarmentose), các dẫn xuất 3-methyl ether (ví dụ: L-acofriose, L-thevetose, D-digitalose, D-diginose), 2-methyl ether (ví dụ: 2-O-methyl-

D-digitalose), 2-acetyl ester (ví dụ: 2-O-acetyl-L-thevetose) [127] (Hình 1.4) Trật tự liên kết của các đơn vị đường thường theo quy luật aglycone–(đường hiếm)m–(glucose)n [114]

Cardenolide glycoside thuộc nhóm cardiac glycoside, thường được dùng để chữa bệnh tim mạch Các nghiên cứu gần đây cho thấy lớp chất này còn có hoạt tính kháng ung thư Trong tổng số 109 cardenolide glycoside từ họ Apocynaceae có

Trang 31

khoảng ¼ hợp chất thể hiện tác dụng ức chế sự tăng sinh, gây ra sự tự chết của nhiều dòng tế bào ung thư [127] Người ta nhận thấy, hoạt tính của cardenolide glycoside thường mạnh hơn dạng aglycone tương ứng của chúng Về cơ chế tác dụng, cardenolide glycoside liên kết và ức chế enzyme Na+/K+-ATPase Sự thay đổi cấu dạng của Na+/K+-ATPase đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, vận động

và tự chết của tế bào Ngoài ra còn có một số cơ chế khác đã được ghi nhận như: làm thay đổi tính lưu động của màng tế bào; giảm hoạt các yếu tố sao mã NF-B, JNK, AP-1; tăng canxi nội bào; tăng sản sinh ROS, tổn thương ti thể; ức chế FGF-2; làm suy yếu receptor IL-8…

Hình 1.4 Phần đường của các cardenolide glycoside phân lập từ họ Apocynaceae

Trang 32

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.2.4.1 Hoạt tính kháng ung thư

Một trong những con đường để tìm kiếm các tác nhân kháng ung thư đó là sàng lọc theo định hướng tác dụng chỉnh sửa DNA của nấm men Áp dụng phương

2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-cacboxylic acid (12) (phân lập lần đầu tiên từ loài A affine và cũng được tìm thấy trong lá của loài Piper aduncum) có khả năng ức chế sự tăng trưởng của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiaenhờ sự phá hủy cấu trúc DNA [24]

Cụ thể, hợp chất này ức chế các chủng đột biến RS 321N và RS 322YK với giá trị

IC12 tương ứng là 120 và 100 g/mL

12β-hydroxyprena-4,6,16-triene-3,20-dione (15) với tên gọi neridienone A từ cây Trúc đào (Nerium

oleander – Apocynaceae) [23] Hợp chất này có khả năng gây độc tế bào khối u ác tính (VA-13) gây ra từ nguyên bào sợi WI-38 và tế bào ung thư gan ở người (Hep-G2) với giá trị IC50 lần lượt là 0,68 và 2,5 g/mL Đáng lưu ý là 12β-hydroxyprena-4,6,16-triene-3,20-dione (15) ít độc hơn trên tế bào WI-38 bình thường (IC50 = 4,5

µM Hoạt tính này được đánh giá tương đương đến mạnh hơn so với chất đối chứng được sử dụng trong cùng thí nghiệm là digoxin và digitoxigenin Đặc biệt, tác dụng của affinoside T (71) trên dòng tế bào MCF-7 mạnh gấp 4 lần so với digoxin, gấp

29 lần so với digitoxigenin và có độ chọn lọc cao hơn so với chất đối chứng [91]

Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Hoài và cộng sự đã tiến hành sàng lọc hoạt tính

gây độc tế bào in vitro của dịch chiết methanol cây Tốc thằng cáng (A

paniculatum) trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu các cây thuốc của đồng

Trang 33

bào dân tộc thiểu số Pako, Vân Kiều ở Miền Trung theo hướng tác dụng chống oxy hoá, diệt tế bào ung thư” Kết quả cho thấy dịch chiết methanol thể hiện hoạt tính ức chế đối với 5/6 dòng tế bào thử nghiệm và có tính hướng đích tốt, với các giá trị

IC50 thấp, đặc biệt là trên các dòng tế bào ung thư phổi (LU-1, IC50 = 14,24 µg/mL), ung thư gan (Hep-G2, IC50 = 11,78 µg/mL) và ung thư dạ dày (MKN-7, IC50 = 4,03 µg/mL) [5]

1.2.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn

Năm 2014, các nhà hóa học Trung Quốc đã tiến hành phân lập và thử hoạt

tính kháng khuẩn của các chất phân lập được từ loài A formicinum Kết quả nghiên cứu cho thấy 4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid (13), anodendrosin E (49) và 4-(O-β-

glucopyranosyl)-3,5-diprenylbenzoic acid (87) có hoạt tính ức chế mạnh chủng vi

khuẩn Providensia smartii với các giá trị MIC đều bằng 0,781 µg/mL (Bảng 1.3)

[96] Bên cạnh đó, anodendrosin E (49) còn cho thấy khả năng kháng khuẩn rất

mạnh đối với chủng Escherichia coli với giá trị MIC là 0,781 µg/mL, tương đương

với chất đối chiếu là gentamycin [96]

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập từ A formicinum

Hợp chất glucosyringic acid (6) phân lập từ loài A affine cũng đã được

Wangensteen và cộng sự chứng minh khả năng ức chế enzyme 15-lipoxygenase (15-LO), một loại enzyme xúc tác cho quá trình oxy hóa của lipoprotein tỉ trọng

Trang 34

nghiên cứu này, tại nồng độ 167 M, glucosyringic acid (6) có tác dụng ức chế

15-LO ở mức 38±4%

1.2.4.4 Hoạt tính khác

Hợp chất dambonitol (10) có trong lá của loài A affine cũng được phân lập

từ mủ cây Dyera costulata (Apocynaceae) Theo Sakurai và cộng sự, dambonitol

(10) cho thấy khả năng chống dị ứng dựa trên phản ứng phản vệ thụ động da, một

mô hình cho phản ứng dị ứng loại I [101]

Các hợp chất phân lập được từ loài A affine như affinoside A (19),

affinoside M (43) và 4,5-dehydro-12-oxo-affinoside E (74) đều cho thấy khả năng

ức chế sự phát triển ấu trùng loài tằm bướm (Bombyx mori) với các giá trị ED50 lần lượt là 1,0; 7,5 và 3,0 ppm (Bảng 1.4) [38]

Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế sự phát triển của ấu trùng Bombyx mori của

Hai hợp chất 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-cacboxylic acid (12),

4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid (13) được Elsebai và cộng sự nghiên cứu khả năng ức chế enzyme HLE (Human Leukocyte Elastase) – enzyme chịu trách nhiệm cho sự phân chia elastin (protein đàn hồi trong các mô liên kết) Enzyme này nằm trong bạch cầu đa nhân và liên quan đến sự di chuyển của bạch cầu từ máu sang các mô khác [85], [137] Hoạt động quá mức của enzyme này có thể dẫn đến các bệnh như khí phế thủng phổi, viêm khớp dạng thấp, và xơ nang [9], [66] Kết quả nghiên cứu cho thấy

hợp chất 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-cacboxylic acid (12) thể hiện hoạt tính ức

chế yếu (IC50 = 22,9±4,4 µM) trong khi 4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid (13) thể hiện tác dụng ức chế rất mạnh đối với enzyme HLE (IC50 = 8,1 µM) [36]

Trang 35

Nhận xét chung: Hóa học của chi Anodendron còn khá sơ khai với chỉ 3

trong tổng số 17 loài được nghiên cứu, 88 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc Trong đó, cardenolide là thành phần hóa học chính, chiếm 2/3 tổng số chất

đã phân lập Đây là lớp hợp chất thiên nhiên chứa nhiều đặc điểm lý thú về mặt cấu trúc do sở hữu nhiều trung tâm lập thể, nhiều cấu dạng, nhiều loại nhóm thế khác nhau trong cấu trúc khung steroid Hơn nữa, chính sự phức tạp về hóa học của hợp phần đường cũng góp phần mang lại tính đa dạng về cấu trúc của cardenolide

glycoside Các nghiên cứu về hoạt tính cho thấy chi Anodendron có một số tác dụng

sinh học rất đáng quan tâm như kháng khuẩn, kháng viêm, ức chế ấu trùng, ức chế enzyme HLE…, đặc biệt là kháng u và ung thư mạnh Vì vậy, hoá thực vật và hoạt tính sinh học của chi này cần được tiếp tục nghiên cứu nhằm khám phá các cấu trúc

và hoạt tính mới, làm sáng tỏ cơ chế tác dụng cũng như mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính của các hoạt chất; góp phần làm giàu tri thức về hợp chất thiên nhiên, cung cấp các chất tiềm năng cho quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới từ tự nhiên 1.3 Giới thiệu sơ lược về loài Tốc thằng cáng

Tên khoa học: Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC

Tên đồng nghĩa: A lanceolatum King & Gamble, A moluccanum Miq., A

rhinosporum Thwaites., A manubriatum (Wall ex Steud.) Merr, A parviflorum

(Roxb) IM Turner, Echites paniculatus Roxb., E manubriatus Wall ex Steud

[79], [86]

Tên Việt Nam: Tốc thẳng, Tốc thằng cáng, Ngà voi, Dây duy tù, Đay nhui Đặc điểm thực vật: Dây leo dài 15m, thân to 5–7cm, chứa nhựa mủ màu trắng, cành vuông, không lông Lá có phiến dài 10–20cm, dai, không lông, gân bên 12–14 đôi, cuống dài 1–2cm, xim tam phân ở nách lá và ngọn nhánh Hoa trắng hay ngà; dài 1mm; vành có ống dài 2mm, có lông mặt trong, tai 3mm; tiểu nhụy gắn dưới giữa ống; dĩa mật có 5 răng cao Quả đại nhọn, dài 10–15cm, rộng 2cm, vỏ quả dày 2–2,5mm, hạt dài 1,5–2cm, dẹp, mỏ dài mang lông mào dài đến 9cm Ra hoa quả từ tháng 2 đến tháng 8 [3], [8]

Trang 36

Phân bố và sinh thái: Ở nước ta loài Tốc thằng cáng chủ yếu phân bố ở Quảng Trị, Thừa thiên Huế (Phú Lộc, Bạch Mã), Đắc Lắc, Khánh Hòa (Nha Trang), Đồng Nai (Biên Hòa), Bến Tre, Kiên Giang (Phú Quốc) [8]

Thành phần hóa học: Tính đến nay, chỉ 5 cardenolide glycoside đã được phân lập và xác định cấu trúc từ loài Tốc thằng cáng bao gồm anodendroside A (78), E1 (79), E2 (80), F (81) và G (82) [94]

Công dụng: Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, rễ của loài Tốc thằng cáng

có tác dụng kích thích mạnh niêm mạc và da Do đó, rễ cây được dùng làm thuốc gây nôn và trị ho [1] Theo tài liệu nghiên cứu cây thuốc bản địa của Pankaj Oudhia, loài Tốc thằng cáng được Y học cổ truyền Ấn Độ xếp vào đông dược chữa các bệnh hầu họng và miệng, cụ thể là chữa khó thở, khó nuốt, gây nôn, chỉ ho Liều dùng với rễ và

vỏ cây khô khoảng 5g/ngày, dùng riêng, không phối hợp với các thuốc khác Ngoài

ra, ở Ấn Độ người ta còn dùng loài này trong các phương thuốc phối hợp điều trị biến chứng tiểu đường, teo tinh hoàn ở nam giới, các bệnh phù (họng, phổi và tim), chữa rối loạn thần kinh [51] Ở Andhra Pradesh, Ấn Độ, loài Tốc thằng cáng đã được tổ chức quốc tế về bảo tồn thiên nhiên (IUCN) đưa vào danh sách các cây thuốc có nguy

cơ tuyệt chủng hoặc bị đe doạ [129] Ở Papuasia, người dân sử dụng mủ cây để giải độc rắn cắn [37] Ngoài ra, cao chiết methanol từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng thu hái ở Việt Nam thể hiện hoạt tính ức chế từ trung bình đến mạnh đối với 5/6 dòng tế bào thử nghiệm và có tính hướng đích tốt [5]

Trang 37

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Phần trên mặt đất của loài Tốc thằng cáng (A paniculatum (Roxb.) A.DC.)

được thu hái tại huyện Đăkrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng 6 năm 2014 (Hình 2.1) Tên khoa học được xác định (Phụ lục 21) bởi TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam Tiêu bản được lưu giữ tại Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Huế

Mẫu nguyên liê ̣u sau khi thu hái đươ ̣c rửa sa ̣ch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở

50-60oC, sau đó xay thành bô ̣t thô và bảo quản ở nơi khô thoáng

Hình 2.1 Loài Tốc thằng cáng: a Phần trên mặt đất, b Lá và quả,

c Đại bổ đôi, d Hạt mang chùm lông

Trang 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất

Sắc ký bản mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng trắng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và RP-18 F254s (Merck) Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi hiện màu

DC-Sắc ký cột (CC) được thực hiện trên chất hấp phụ pha thường (Silica gel (40–63 µm, Merck, Đức) và (40-50 µm, Kanto, Nhật Bản)); pha đảo Cosmosil 75C18-OPN (Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), YMC RP-18 (30–50 µm, Fuji Silysia Chemical, Nhật Bản); Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich, Mỹ); nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich, Mỹ)

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa các thông số vật lý, các dữ kiện phổ và các chuyển hóa hóa học cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo

Trang 39

tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ khối phân giải cao (HRESIMS) được đo trên máy micrOTOF-Q 10187 tại Phòng thí nghiệm phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh; máy LTQ Orbitrap XL mass spectrometer (Thermo Scientific, Massachusetts, USA) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và máy LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Nhật Bản) tại Đại học Toyama

f) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy Varian Union 600 spectrometer (Varian, California, Mỹ) (với TMS là chất chuẩn nội) tại Đại học Toyama

Phương pháp xác định thành phần monosaccharide

Các dẫn xuất alditol per-acetate được điều chế theo phương pháp được mô tả bởi Pettolino và cộng sự [93] với một vài chỉnh sửa nhỏ Mẫu saponin được thủy phân bằng dung dịch trifluoroactetic acid 4 M ở 105oC trong 4 giờ Monosaccharide sau đó được khử thành alditol bằng NaBH4 và được acetyl hóa bằng hỗn hợp acetic anhydride–pyridine (1:1, v/v) ở 110oC trong 2 giờ Các alditol per-acetate tạo thành được phân tích bằng phương pháp GC-MS trên hệ thống GCMS-QP2010 Plus (Shimadzu, Kyoto, Nhật) với cột mao quản DB-5 (30 m x 0,25 mm) Khí mang He với tốc độ dòng 1,2 mL/phút Chương trình nhiệt độ lò GC: nhiệt độ đầu 80oC trong

2 phút, tăng 10oC/phút đến 180oC và giữ ở 180oC trong 2 phút, , tăng 2oC/phút đến

220oC và giữ ở 220oC trong 5 phút, tiếp tục tăng 2oC/phút đến 240oC và giữ trong 5 phút ở nhiệt độ này Nhiệt độ buồng tiêm, đầu dò được đặt lần lượt ở 220 và 230oC Thành phần monosaccharide được xác định thông qua việc so sánh thời gian lưu và

dữ kiện phổ EIMS của các dẫn xuất alditol per-acetate của chúng với các giá trị tương ứng của monosaccharide chuẩn (Sigma-Aldrich, Mỹ) trong cùng điều kiện phân tích

Trang 40

Phương pháp xác định hợp phần acid béo của các glycolipid

a) Methanol phân các glycolipid

Glycolipid được hòa tan trong toluene sau đó bổ sung thêm lần lượt MeOH, dung dịch HCl 8% (pha trong MeOH) Hỗn hợp được ủ ở 45oC khoảng 2h (để thủy phân một phần) hoặc qua đêm (để thủy phân hoàn toàn) Quá trình phản ứng được

kiểm tra bằng TLC Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm n-hexane và nước

để chiết lấy dẫn xuất methyl ester của acid béo (FAME) tạo thành [55] Các dẫn xuất FAME được phân tích bằng phương pháp GC-MS

b) Phân tích GC-MS đối với các FAME

Các dẫn xuất FAME được phân tích trên máy Shimadzu QP2010 Plus [Cột Equity®-5 (Supelco) (0,25 mm x 30 m)] cùng với đầu dò khối phổ MS QP2010 Plus Chế độ ion hóa va đập điện tử được sử dụng với năng lượng 70 eV Khí mang

He với tốc độ dòng 1,5 mL/phút Nhiệt độ buồng tiêm, giao diện MS, buồng ion hóa lần lượt là 250, 250 và 300oC Điện thế đầu dò 0,82 kV, dải quét 15÷350 amu Chương trình nhiệt độ lò GC: nhiệt độ đầu 100oC, tăng 5oC/phút đến 185oC (giữ đẳng nhiệt trong 10 phút), tăng 5oC/phút đến 220oC (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút) (CT1) hoặc nhiệt độ đầu 80oC (giữ đẳng nhiệt trong 2 phút), tăng 5oC/phút đến

185oC (giữ đẳng nhiệt trong 10 phút), tăng 10oC/phút đến 250oC (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút) (CT2)

Việc nhận dạng các hợp chất được thực hiện bằng cách so sánh dữ kiện phổ EIMS của chúng với giá trị tương ứng đã được liệt kê trong các thư viện NIST 11, WILEY 7 Hàm lượng của các FAME được tính toán thông qua diện tích của píc tương ứng trên sắc ký đồ GC

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

a) Vật liệu

+ Hóa chất: các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco,

Invitrogen bao gồm: L-glutamine, sodium bicarbonate, glucose, HEPES hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), sodium pyruvate, fetal bovine serum, sulforhodamine B, DMSO 10%, trichloroacetic acid, 5% acetic acid,

Định dạng
Số trang	210
Dung lượng	13,63 MB