Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới - Phạm Hùng Vân

Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới Phạm Hùng Vân* *Chủ Tịch Hội Vi Sinh Lâm Sàng TP.. Màng phổi Máu Màng não ĐÀM hay BỆNH PHẨM CÓ ĐÀM

Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây

nhiễm khuẩn hô hấp dưới

Phạm Hùng Vân*

*Chủ Tịch Hội Vi Sinh Lâm Sàng TP HCM

Chủ Tịch Chi Hội SHPT Y Khoa Việt Nam

Trưởng Đơn Vị Vi Sinh – SHPT Lâm Sàng BV NTP

Màng phổi

Máu

Màng não

ĐÀM hay BỆNH PHẨM CÓ ĐÀM

DỊCH

MÀNG

PHỔI

CẤY MÁU

CẤY DNT

QUYỆT HỌNG

Không ý nghĩa

Quệt MŨI SAU Phát hiện virus

Thách thức trong cấy đàm

 Phải bắt được vi khuẩn gây bệnh từ

mẫu tạp nhiễm, do vậy phải lấy đúng

bệnh phẩm đàm và phải đánh giá để chọn đúng vi khuẩn gây bệnh mọc

trên mặt thạch phân lập

 Có nhiều loại là vi khuẩn gây bệnh là

khó mọc, do vậy phải cấy ngay và có

đủ các loại môi trường cần thiết

Lấy đúng bệnh phẩm đàm

 Phải hướng dẫn bệnh nhân lấy đàm,

 Phải có phương tiện và phương pháp lấy

đàm khi bệnh nhân không thể khạc đàm

 Phải lấy đàm ngay khi chẩn đoán và

trước khi dùng kháng sinh

 Phải đánh giá đại thể mẫu đàm rước khi

gửi mẫu đi đến phòng xét nghiệm

Nguyên tắc chọn VK gây bệnh

hình ảnh vi khuẩn thấy trong vùng bạch cầu của phết nhuộm Gram mẫu đàm

lượng hay bán định lượng

Lưu ý: Vi khuẩn có số lượng nhiều nhưng cũng có thể

không phải là vi khuẩn gây bệnh mà chỉ là VK quần cư, vi khuẩn thường trú hầu họng (Streptococci tiêu huyết )

Song cầu Gram [+] giống

LÝ DO NUÔI CẤY THẤT BẠI

 S pneumoniae, H influenzae là chủ yếu

nhưng không dễ nuôi cấy, đòi hỏi các môi trường phân lập ít có sẵn

 Bệnh phẩm ít được cấy ngay

 Bệnh nhân dùng kháng sinh trước

 Mẫu không tin cậy do lẫn nước bọt (tạp

khuẩn hầu họng)

 Không biết cách đánh giá kết quả nuôi cấy

để chọn đúng VK gây bệnh

 Cấy máu là phương tiện tốt nhất xác định tác

nhân vi khuẩn gây viêm phổi (CAP), tuy nhiên không phải tất cả mọi trường hợp CAP đều cấy máu [+] (Tối đa chỉ 14-16%)

 Coi chừng ngoại nhiễm trong cấy máu Kết

quả [+] trong 24 giờ, hay cả 2 chai cấy cùng [+] một loại VK thường ít khi là ngoại nhiễm

 Kết quả cấy máu phải kịp thời, muống vậy

phải dùng phương tiện thích hợp và phải có qui trình trả kết quả nhanh

Cấy máu

Thách thức trong cấy máu

 Phát hiện kháng nguyên hòa tan VK gây

bệnh (S pneumoniae, L pneumophila)

trong nước tiểu Độ nhạy thấp

 Phát hiện kháng nguyên trong mẫu đàm,

quyệt mũi sau bằng ELISA, MDHQ: Phát

hiện tác nhân virus, VKKĐH Độ nhạy thấp

 Huyết thanh học tìm kháng thể đặc hiệu

phát hiện tác nhân virus, VKKĐH: Nếu là

IgG thì phải huyết thanh kép cách 10

ngày; nếu là IgM thì phải có giá trị cắt và

tùy thuộc chất lượng kit

Phát hiện tác nhân bằng kỹ thuật miễn dịch

Phát hiện tác nhân vi sinh gây ARI

GIẢI PHÁP NÀO PHÙ HỢP?

Không nhạy, không đầy đủ

Không hữu dụng (IgG), kém đặc hiệu (IgM)

Độ nhạy kém

Độ nhạy cao, đặc hiệu cao

Định danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa học

biểu hiện từ các kiểu gen hay một trình tự đặc hiệu của đoạn gen Xác định dựa vào kích thước đoạn gen

PCR là nuơi cấy đoạn gen

cơ sở của độ đặc hiệu khơng khác nuơi cấy

Ct curve

Standard curve Melt curve

Real-time PCR

Chạy PCR đồng thời phát hiện kết quả

Chọn lựa tuỳ tác nhân

Chứng nội kiểm soát chất lượng

Nuôi cấy Pos Neg PCR

S pneumoniae Neg Pos 5 43 3 201

H Influenzae Neg Pos 5 62 0 185

M catarrhalis Neg Pos 4 8 6 234

PCR so với nuôi cấy phát hiện các tác nhân vi khuẩn

Takahashi et al BMC Infectious Diseases 2013, 13:296

Tỷ lệ phát hiện tác nhân gây bệnh

S pneumoniae 39%

H influenzae 14%

M catarrhalis 5%

Mycoplasma 21%

Chlamydia 13%

B pertussis 4%

Influenzavirus A 1%

Parainfluenzavirus 1

1% Parainfluenzavirus 3 1%

Respiratory Syncitial

Virus 1%

S pneumoniae

(N=30)

H influenzae (N=11)

29.03

45.45

Tỷ lệ phối hợp VK không điển hình

với tác nhân gây bệnh chính là S pnemoniae và H influenzae

Nnghiên cứu trên 124 trường hợp

viêm phổi cộng đồng nhập viện tại BV NTP

Trần thị Thanh Vy (2013) Luận văn ThS vi sinh

Real-time PCR so với nuôi cấy

phát hiện tác nhân VK gây HAP

kết quả [+] kết quả [-]

87.5%

Tác nhân vi sinh gây viêm phổi không đáp ứng điều trị ở trẻ nhỏ

Bùi Lê Hữu Bích Vân (2015)

Luận văn Thạc Sĩ nhi Thực hiện tại BV NĐ1

N=32

Xác định tác nhân gây bệnh

ĐỊNH LƯỢNG >10 5 /ml

3.13 3.13

34.38 15.63

3.13 3.13 3.13 3.13 3.13 3.13 3.13 3.13 3.13 3.13

12.5

HIN HIN+PSA PNE PNE+MP PNE+pInf3 PNE+pINF3+KLP+Eco

NO

So sánh real-time và nuôi cấy

Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thùy ở trẻ em

 Trẻ em bị viêm phổi thùy

 Mẫu NTA tin cậy qua thang điểm Barlett

 Thực hiện real-time PCR phát hiện 28 tác

nhân vi sinh (bao gồm 8 tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện)

 Vật liệu, phương pháp và kiểm soát chất

lượng real-time PCR như nghiên cứu trước

Luận văn Thạc Sĩ nhi Thực hiện tại BV NĐ1 (2016)

PNE: S pneumoniae, MP: M pneumoniae, HI: H influenzae, MR: M

catarrhalis, MRSA: Methicillin Resistant S aueus, TB: M tuberculosis

NHẬN ĐỊNH

 Tác nhân vi sinh chủ yếu gây CA-LRTI là S

pneumoniae, H influenzae, M catarrhalis

 Tuy nhiên tác nhân vi khuẩn không điển hình

cũng đóng vai trò đáng kể

 Tiếp cận sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật

real-time PCR là cần thiết vì giúp lâm sàng chỉ định và điều chỉnh KS bước đầu giúp điều trị thành công và tránh lạm dụng kháng sinh

 Giải pháp này rất khả thi nhờ:

o “streamline real-time PCR”

Bệnh phẩm lấy từ đường hô hấp

Tách chiết DNA/RNA

Real-time PCR Real-time RT-PCR