Bài giảng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp thụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp thụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột , Sự tác một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong bài này có 2 kiểu hấp phụ: Sắc ký hấp phụ pha thuận (NPHPLC): Pha tĩnh phân cực,pha động không phân cực Sắc ký hấp phụ pha đảo (RPHPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO- HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)

SẮC KÝ

MỤC TIÊU HỌC TẬP

1 Giải thích được nguyên tắc hoạt động của máy HPLC

2 Trình bày được cấu tạo của máy HPLC

3 Mô tả được các kỹ thuật của HPLC: sắc ký phân bố, sắc

ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel, sắc ký ái lực và sắc ký huỳnh quang.

4 Vận dụng tính toán các chỉ số trong điều kiện chạy HPLC.

Sắc ký được ĐN là pp tách một hỗn hợp các chất thành các chất riêng.

Kỹ thuật này dựa trên sự khác nhau về tốc độ di chuyển các chất của hỗn hợp qua pha tĩnh dưới ảnh hưởng của một số dung môi hoặc khí (pha động).

SẮC KÝ

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ PP sắc ký cột cổ điển

• HPLC là một PP chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng LKHH với các nhóm chức HC

mAU

Separation in based upon differential migration between the stationary and

mobile phases Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g C18, Silica

Mobile Phase - carries the sample through the stationary phase as it moves through the column.

Injector

Detector Column

Mixer

Pumps

Injector

Detector Column

Injector

Detector Column

The Chromatogram

t

tRmAU

tR

Vùng diện tích (chiều cao)

để định lượng

Tại sao lại dùng HPLC

• Phân tích đồng thời

• Độ phân giải cao

• Độ nhạy cao

• Tính lặp lại tốt

• Điều kiện phân tích trung bình

• Dễ phân đoạn và tinh khiết

• Không độc hại

• Trọng lượng phân tử của chất tan

• Độ tan trong nước của chất tan

• Sự phân cực của chất tan

• Tính chất ion hóa, tính chất không ion của chất tan

Các loại HPLC phụ thuộc vào:

2 PHÂN LOẠI HPLC

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành các loại:

1 SK phân bố

2 SK trao đổi ion hiệu năng cao.

3 SK lỏng hiệu năng cao trên gel

4 SK hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

5 SK ái lực

6 SK đồng phân quang học

2 PHÂN LOẠI HPLC

• Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất quá trình sắc ký.

Chất hấp phụ SK hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

Chất trao đổi ion SK trao đổi ion

Chất lỏng SK phân bố (SK chiết)

Gel SK gel hoặc rây phân tử

2 PHÂN LOẠI HPLC

1 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

SK phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).

PHÂN LOẠI HPLC

Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất

mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

• Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid

chromatography).

• Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết

2.1 Sắc ký phân bố

• Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng do:

– Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha

động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.

– Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

2.1 Sắc ký phân bố

Pha tĩnh

• Hay dùng: dẫn chất siloxan

• Tính chất phân cực phụ thuộc vào các nhóm thế:

- Pha tĩnh ko phân cực: nhóm thế là các gốc hydrocarbon no hoặc

Ảnh hưởng của pha tĩnh

Dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động,

Sk phân bố được chia 2 loại :

+ Sắc ký pha thường (SK pha thuận): Pha tĩnh phân cực > Pha động

+ Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh phân cực < pha động.

2.1 Sắc ký phân bố

• SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại SK trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động PP này dùng phân tích các HC từ ko phân cực đến phân cực

• Hầu hết các HCHC có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ

là các DM phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng, rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn

SKPT.

2.1 Sắc ký phân bố

2.1 Sắc ký phân bố

Mối quan hệ giữa độ phân cực và thởi gian lưu

2.1 Sắc ký phân bố

Nguyên tắc chọn pha tĩnh, pha động

Chọn pha tĩnh và pha động dựa vào độ phân cực

của các thành phần tham gia theo nguyên tắc:

1 Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha tĩnh,

và khác xa độ p/cực của pha động.

2.Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha động

2.1 Sắc ký phân bố

Pha tĩnh của

SK pha đảo

Ứng dụng: chủ yếu SK pha đảo

2.1 Sắc ký phân bố

Dược Kháng sinh, giảm đau, an thần, steroid

Hóa sinh Aminoacid, protein, lipid, carbonhydrat

Thực phẩm Chất làm ngọt, phụ gia, chất chống oxy hóa Hóa CN HC thơm, chất màu, chất hđ bề mặt

Môi trường Các chất trừ sâu diệt cỏ, dẫn chất phenol

Hóa pháp lý Các chất độc, thuốc ngủ

Y học lâm sàng Acid mật, các chất chuyển hóa của thuốc

2.2 Sắc ký trao đổi ion

• Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh

• Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích (+) trên pha tĩnh hút anion chất tan.

• Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích (-) trên pha tĩnh hút cation chất tan.

• Chất trao đổi ion là polymer không tan trong nước mang các nhóm trao đổi ion.

2.2 Sắc ký trao đổi ion

2.2 Sắc ký trao đổi ion

Có 2 loại nhựa trao đổi ion:

-Nhựa trao đổi cation: loại acid mạnh mang nhóm acid sulfonic, loại yếu mang nhóm acid carboxylic

-Nhựa trao đổi anion: có nhóm base amin liên kết với phân tử polymer Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin bậc 4, dạng base yếu có nhóm amin bậc 2 hoặc bậc 3

2.2 Sắc ký trao đổi ion

2.2 Sắc ký trao đổi ion

Một số nhóm hoạt động của nhựa trao đổi ion

Sulfopropyl Sulfoethyl Phosphat Carboxymethyl

-O(CH2)3- SO3H -O(CH2)2-SO3H -OPO3H

DEAE PAB

Trimethylaminpethyl Diethyl (2-

hydroxypropylquartern aryamino

Diethylaminoethyl P-amino benzyl

-O(CH2) N + (CH2CH3)3-O(CH2)2N + (CH2CH3)2

CH2CH(OH)-CH3-O(CH2)2N(CH2CH3)2

Ứng dụng:

2.2 Sắc ký trao đổi ion

- Dùng cân bằng trao đổi ion để tinh chế nguyên liệu loại tạp chất Ví dụ các ion kim loại M2+ và anion X-

để điều chế nước tinh khiết (nước khử ion)

-Dùng nhựa trao đổi ion để tăng nồng độ của các thành phần vi lượng trong dung dịch đủ cho phân tích

- Áp dụng cho sắc ký

2.2 Sắc ký trao đổi ion

Ứng dụng:

• Nguyên lý: Tách riêng các chất dựa vào KT phân tử.

• Ko có liên kết hoặc tương tác hấp phụ với pha tĩnh.

• Các gel có vai trò như các sàng phân tử các chất có KTPT khác nhau được tách riêng ra Có các loại:

- SK thấm gel: dùng gel để tách các polymer hòa tan/dung môi Pha động kỵ nước.

- Sắc ký lọc gel: dùng gel để tách các polymer sinh học Pha động ưa nước

2.3 Sắc ký lỏng trên gel

2.3 Sắc ký lỏng trên gel

2.3 Sắc ký lỏng trên gel

2.3 Sắc ký lỏng trên gel

Pha tĩnh (có các lỗ xốp):

•Các loại gel mềm hay dùng: cellulose, dextran,

agarose hoặc poly acrylamid

•Các gel cứng bán cứng: polystyren, alkyl dextran

trong môi trường không chứa nước

2.3 Sắc ký lỏng trên gel

2.3 Sắc ký lỏng trên gel

• Nguyên tắc tách là sự hấp phụ của chất phân tích trên bề mặt pha rắn.

• Pha tĩnh là chất rắn phân cực Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh

2.4 Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

Sự khác nhau giữa SK phân bố và SK hấp phụ

Pha tĩnh

Tương tác mạnh

Tương tác yếu

Mobile Phase

2 1

2.4 Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

• Pha tĩnh:

- Slica: hay dùng/ SK pha thuận Bề mặt có nhiều nhóm silanol dạng tự do Hấp phụ mạnh, pH ổn định 2-8.

- Alumina: pH ổn định 2-12 Tách các base hữu cơ.

- Titan oxyd và zirconi oxyd: pH ổn định rộng.

* Pha động: Sử dụng các dung môi hữu cơ thông dụng

2.4 Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

2.4 Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

2.4 Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

• Ứng dụng:

- Thường tách các chất phân tích có M dưới 5000, ít tan /nước hoặc trong hh nước-dmhc không thích hợp với SK pha đảo.

- Tách các đồng phân vị trí các HCHC.

- Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm.

2.4 Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

2.5 Sắc ký ái lực (affinity chromography)

Dùng TT liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp Lưu giữ chất phân tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc các cặp

có trong cơ thể sống như: Kháng nguyên – kháng thể, enzym –cơ chất, hormon – receptor…

2.5 Sắc ký ái lực

• Cố định một thành phần của cặp trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đưa vào cột Mẫu phân tích có thành phần thứ 2 đưa vào cột nhờ pha động (y/cầu pH, dd đệm) Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng nên được rửa giải vào pic các chất ko lưu giữ

• Tương tác đặc hiệu giữa phần chọn lọc và phối tử ái lực trong cột.

• Nhờ dd đệm rửa giải phá vỡ liên kết và đưa thành phần chọn lọc

ra cột

2.5 Sắc ký ái lực (affinity chromography)

2.5 Sắc ký ái lực

2.5 Sắc ký ái lực (affinity chromography)

2.5 Sắc ký ái lực (affinity chromography)

• Phối tử ái lực: yêu cầu đặc hiệu cao Một số phối tử hay dùng:

• Các loại hình sắc ký ái lực:

- SK ái lực sinh học: chủ yếu tinh chế enzym

- SK ái lực miễn dịch: Phối tử là kháng nguyên hoặc kháng thể, chủ yếu tinh chế và PT các chất có nguồn gốc sinh học.

- SKAL phối tử phẩm màu: dùng triazin hoặc

triphenylmethan làm phối tử ái lực để tinh chế enzym, hoặc các PT sinh học khác.

2.5 Sắc ký ái lực (affinity chromography)

2.5 Sắc ký ái lực (affinity chromography)

2.6 Sắc ký đồng phân quang học

• Mục đích: Tách các đồng phân quang học

• Pha tĩnh thường dùng là slica có gắn cyclodextrin có khả năng liên kết với các đồng phân đối quang ở các mức năng lượng khác nhau

2.6 Sắc ký đồng phân quang học

2.6 Sắc ký đồng phân quang học

2.6 Sắc ký đồng phân quang học

2.6 Sắc ký đồng phân quang học

Tóm lại: Cơ chế của các loại HPLC

SK hấp phụ

SK phân bố

SK trao đổi ion SK trên gel

3 HỆ THỐNG MÁY HPLC

3.1 Hệ thống cấp pha động

Pha động thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau

để tách với độ phân giải phù hợp Có 2 cách dùng pha động rửa giải:

•Đẳng dòng: thành phần ko thay đổi/ qt sắc ký

•Gradien t: Tỷ lệ dung môi thay đổi theo chương trình

3 HỆ THỐNG MÁY HPLC

Long Time Analysis

MeOH / H2O = 6 / 4

Bad Separation MeOH / H2O = 8 / 2

Đẳng dòng Đẳng dòng

MeOH%

Time

Gradient

3 HỆ THỐNG MÁY HPLC

Isocratic System

Simple system with one pump and one solvent reservoir

If more than one solvent is used, solvents should be premixed.

Data processor

Pump

Injector

Column Oven

Detector

Mobile Phase

High-pressure Gradient System

Data processor

• Excellent gradient accuracy.

• 2-3 pumps required - one pump per solvent used.

• Một vài loại khí tan /DMHC, khi áp suất cao được bơm, sự hình thành bong bóng khí tăng làm ảnh hưởng đến qt tách, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền và hình dạng của đỉnh.

• Do đó việc loại khí là rất quan trọng và nó có thể được

thực hiện bằng nhiều cách khác nhau: chạy siêu âm, sục

khí trơ heli…

3.1 Hệ thống cấp pha động

• Lọc chân không: không phải là luôn luôn đáng tin cậy và đầy đủ.

• Đưa khí Heli: cho khi heli vào dung môi, rất hiệu quả nhưng Heli rất đắt

• Siêu âm: sử dụng siêu âm làm chuyển đổi tần số cực cao thành rung động cơ học

3.1 Hệ thống cấp pha động

3.2 Hệ thống bơm

• Tạo áp suất khoảng 5000 psi trở lên

• Các vật liệu trong bơm chịu được tác động của các dmôi (ko

bị ăn mòn) Bơm, van mẫu, cột… được chế từ kim loại titan (tránh ảnh hưởng đến mẫu sinh học)

• Đảm bảo tốc độ dòng chảy dao động từ 0,01 -10 ml / phút

• Bơm phải có khả năng lấy dmôi từ một bình chứa hoặc nhiều bình chứa có chứa dmôi khác nhau cùng một lúc.

3.2 Hệ thống bơm

3.2 Hệ thống bơm

Bơm đẩy một pistong 3.2 Hệ thống bơm

motor and cam

plunger

plunger seal

check valve pump head

5 - 50µL out

in check valve

Bơm đẩy một pistong

motor and cam

plunger

plunger seal

check valve pump head

5 - 50µL out

check valve

Bơm đẩy một pistong

• Dung môi được bơm qua lại

bằng một động cơ piston

• Hai van kiểm tra mở và đóng

kiểm soát lưu lượng

• Piston tiếp xúc trực tiếp với

Bơm làm đầy nhanh

Hay dùng

Rẻ

3.2 Hệ thống bơm

Bơm kéo đẩy kéo

Kết nối hai bơm

một pistong

3.2 Hệ thống bơm

3.3 Hệ tiêm mẫu

3.3 Hệ tiêm mẫu

• Dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay

ở đầu cột mà ko cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu

• Van tiêm tự động hóa, máy tính điều khiển, kiểm soát

hệ bơm mẫu tự động

3.4 Cột và pha tĩnh

3.4 Cột và pha tĩnh

Đầu vào Cột bảo vệ

Vỏ bảo vệ bằng nhôm

Cột chính

• Đặt trước cột sắc ký

• Bảo vệ và kéo dài tuổi thọ của cột tách

• Ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng

có kích thước hạt lớn hơn

Cột bảo vệ (guard column)

3.4 Cột và pha tĩnh

3.4 Detector

• Phát hiện các chất phân tích có thể dựa vào:

• Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang

• Tính chất chung của chất phân tích trong pha động, như detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện

Hiện nay có nhiều loại detector, thường dùng 6 loại thuộc 2 nhóm quang học và điện hóa:

• Detector hấp thụ UV-VIS

- Phổ biến nhất, dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS

Ba cấu hình của detector hấp thụ UV-VIS:

+ Detector có bước sóng cố định

+ Detector đo ở bước sóng thay đổi: có bộ thay đổi bước sóng + Detector mảng diod

3.4 Detector

• Detector huỳnh quang: Rất nhạy, chọn lọc Dùng trong phân tích vết.

3.4 Detector

• Ưu điểm:

- Độ nhạy cao hơn máy dò UV-Vis

- Tính chọn lọc cao vì ít chất có huỳnh quang

• Nhược điểm:

- Khó đoán được huỳnh quang

- Bị ảnh hưởng lớn bởi môi trường: Dung môi, pH, nhiệt độ,

độ nhớt, cường độ ion, khí tan

kém bay hơi hơn so

với pha động của sk

lỏng

3.4 Detector

Detector điện hóa: Phát hiện chất ptích dựa vào độ dẫn điện của pha động có mặt các chất ptích ion hoặc dòng điện tạo thành do p/ứ oxy hóa khử ở điện thế xác định

4 CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG

4.1 Hằng số cân bằng K

Là tỉ lệ phân bố giữa 2 pha được tính như sau:

Với CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.

       C M : nồng độ cấu tử trong pha động.

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.

4.2 Thời gian lưu

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột

đến detector.

tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực

với pha tĩnh đi qua cột; cũng là thời gian pha

động đi từ đầu cột đến cuối cột (còn gọi là thời

gian lưu chết).

tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử. 

4 CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG

Nếu k’ càng lớn (tR  càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời

4 CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG

4.4 Số đĩa lý thuyết N

đặc trưng cho khả năng tách mũi

sắc ký của các cấu tử trên cột

N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.

4.5 Độ chọn lọc

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột

Thông thường, α dao động 1,05-2 là tốt Nếu α càng lớn thì thời gian chạy sắc ký sẽ kéo dài

4 CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG

4.6 Độ phân giải

Là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc

ký: sự giải hấp phụ, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó

được xác định qua phương trình sau:

4 CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG

Bài 1 Khi chạy sắc ký một hỗn hợp 2 chất A và B thu được thời

gian lưu lần lượt là 10,8 phút và 11,7 phút, chiều dài của cột là

40 cm Một chất không lưu giữ qua cột ở 1,7 phút Chiều rộng đáy pic của A và B tương ứng là 1,51 phút và 1,65 phút Tính:

a Tính số đĩa trung bình?

b Hệ số chọn lọc cho A và B?

c Độ phân giải?