Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn, nấm mốc nội sinh rễ tiêu kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh trên cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông

LỜI CẢM ƠNĐể hoàn thành đề tài: “ Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn, nấm mốc nội sinh rễ tiêu kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh trên cây hồ tiêu Piper nigrum L.

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài: “ Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn,

nấm mốc nội sinh rễ tiêu kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh trên cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh

Đăk Nông”, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các thầy, cô giáo Bộ môn

sinh học thực nghiệm, Khoa khoa học tự nhiên & công nghệ và Viện Công nghệsinh học & Môi trường trường Đại học Tây Nguyên, các tập thể, cá nhân, giađình và bạn bè

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Phương Hạnh

đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ truyền đạt kiến thức, dìu dắt tôi trong suốt quátrình thực hiện đề tài cũng như hoàn chỉnh chuyên đề này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinhhọc thực nghiệm, khoa Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Ban lãnh đạo ViệnCNSH và MT đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốtquá trình học tập và rèn luyện tại trường Đại học Tây Nguyên

Tôi xin cảm ơn bố mẹ tôi những người đã luôn quan tâm, chăm sóc, lo lắng,chia sẻ những lúc tôi gặp khó khăn, mệt mỏi Gia đình luôn là nguồn động viên

to lớn nhất đối với tôi, giúp tôi có thể hoàn thành tốt chương trình học và chuyên

đề tốt nghiệp này

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến tất cả bạn bè và tập thểlớp Công Nghệ Sinh Học khóa 2014 đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốtquá trình học tập và thực hiện khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Buôn Ma Thuột, tháng 5 năm 2018

Sinh viênPhan Thị Mộng Trầm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

4 Giới hạn đề tài 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về cây hồ tiêu 3

1.1.1 Lịch sử phát triển của cây hồ tiêu 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hồ tiêu 4

1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây hồ tiêu 7

1.1.4 Sâu bệnh hại chính ở cây hồ tiêu 9

1.2 Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne incognita 11

1.2.1 Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne incognita 11

1.2.2 Vòng đời của tuyến trùng Meloidogyne incognita 14

1.3.Tổng quan về vi sinh vật vùng rễ 15

1.4 Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong kiểm soát tuyến trùng hại thực vật.16 1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 21

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 21

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 23

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nội dung nghiên cứu 26

2.2 Đối tượng nghiên cứu 26

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.4 Hóa chất- dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 26

2.5 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 26

2.6 Phương pháp nghiên cứu 28

2.6.1 Thu thập, phân lập các chủng VSV vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Chư Sê, Gia Lai 28

2.6.1.1 Phương pháp thu mẫu và xử lí mẫu: 28

2.6.2.Tuyển chọn các chủng VSV vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita cao trong phòng thí nghiệm (in vitro) 29

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật vùng rễ hồ tiêu tại Chư Sê, Gia Lai 33

3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu 33

3.1.2 Kết quả phân lập nấm vùng rễ cây hồ tiêu 38

3.1.3 Kết quả phân lập xạ khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu 45

3.2 Kết quả tuyển chọn các chủng VSV vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita cao trong phòng thí nghiệm (in vitro) 47

3.2.1 Kết quả tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita 47

3.2.2 Kết quả tuyển chọn nấm vùng rễ kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita .49

3.2.3 Kết quả tuyển chọn xạ khuẩn vùng rễ kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

Kết luận 55

Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 61

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HL : Hiệu quả ức chế tiêu diệt tuyến trùng

KAM : Kenknight & Munaier

PDA : Potato dextrose Agar

TSA : Trypticase Soy Agar

TT : Tuyến trùng

VSV : Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập tại huyệnChư Sê, tỉnh Gia Lai (Trên môi trường TSA) 32Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm vùng rễ phân lập tại huyện Chư

Sê, tỉnh Gia Lai (Môi trường PDA) 37Bảng 3.3: Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn vùng rễ phân lập tại huyệnChư Sê, tỉnh Gia Lai (trên môi trường KAM) 44

Bảng 3.4: Hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita của các chủng vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình1.1: Đặc điểm của hồ tiêu 4

Hình 1.2: Tuyến trùng xâm nhập và gây u sưng rễ 13

Hình 1.3: Vòng đời của tuyến trùng 15

Hình 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 37

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm 43

Hình 3.3: Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn 45

Hình 3.4: Hình ảnh tuyến trùng đã tử vong 47

Hình 3.5: Hình ảnh tuyến trùng bị vây bởi hệ sợi của nấm 50

Hình 3.6: Hình ảnh tuyến trùng đã tử vong 52

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp dài ngày có giá trị kinh tế cao,

được trồng ở nhiều nơi và có giá trị xuất khẩu cao trên thế giới Hiện nay, cảnước có khoảng 100.000 ha trồng hồ tiêu, và được trồng nhiều ở các tỉnh BìnhDương, Bình Phước, Đồng Nai, Gia Lai, Đắk Lắk và Bà Rịa- Vũng Tàu ( Hiệphội Hồ tiêu Việt Nam, 2013) Trong đó, các tỉnh Tây Nguyên chiếm 51,6%, cáctỉnh Đông Nam Bộ chiếm 39,6% diện tích hồ tiêu của cả nước Từ năm 2000 đếnnay, Việt Nam là một trong những quốc gia xuất khẩu hồ tiêu lớn của thế giới,theo Tổng cục Hải quan, từ đầu năm đến giữa tháng 11/2016, nước ta đã xuấtkhẩu 164.299 tấn hạt tiêu, trị giá 1,327 tỷ USD, chiếm hơn 50% sản lượng toàncầu với năng suất hồ tiêu bình quân của cả nước đã đạt 2,16 tấn tiêu khô một ha,được xếp vào loại cao nhất thế giới Trong đó Tây Nguyên là khu vực đứng đầu

về diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu.[14]

Trong những năm gần đây, diện tích Hồ tiêu tại Tây Nguyên nói chung, tạihuyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông nói riêng tăng nhanh nhưng việccanh tác loại cây này của các hộ dân đang gặp nhiều khó khăn Một trong nhữngđối tượng gây hại quan trọng trên cây tiêu hiện nay là tuyến trùng sần rễ (root

knot nematodes) Meloidogyne incognita Người nông dân vẫn chủ yếu sử dụng

một số loại thuốc hoá học có trên thị trường Tuy vậy biện pháp này đã thểhiện rõ những mặt trái của nó như sử dụng không có hiệu quả do sự khángthuốc, lại ảnh hưởng xấu đến chất lượng nông sản và đặc biệt là gây ô nhiễmmôi trường nghiêm trọng

Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng một số loạithuốc hóa học đặc hiệu như Marshal, Oncol, Nokaphho… Hiệu quả của việc sửdụng thuốc có làm giảm mật độ tuyến trùng, nhưng vườn cây vẫn bị bệnh và

phải áp dụng thuốc cho các năm tiếp theo Việc sử dụng thuốc liên tục sẽ dẫnđến hiện tượng kháng thuốc, mất cân bằng hệ sinh vật và vi sinh vật đất, dễ dẫnđến hiện tượng bộc phát các dịch bệnh khác và đặc biệt là ảnh hưởng môi trường

và tồn dư thuốc trong nông sản làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu [1]

Đứng trước tình hình đó thì biện pháp tối ưu hiện nay để phòng và chốngcác bệnh trên hồ tiêu đó là sử dụng các loài vi sinh vật bản địa để đối kháng

tuyến trùng Meloidogyne incognita hại tiêu, vì vậy tôi tiến hànhthực hiện đề tài

nghiên cứu: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn, nấm mốc nội

sinh rễ tiêu kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh trên cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông.”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Phân lập và mô tả các chủng xạ khuẩn, nấm nội sinh từ mẫu rễ thu thập đượctại huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông

Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn, nấm nội sinh có khả năng kháng tuyến

trùng Meloidogyne incognita gây bệnh ở cây hồ tiêu tại huyện Đăk R’Lấp, Đăk

Song tỉnh Đăk Nông

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn, nấm nội sinh có khả

năng kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh trên cây hồ tiêu, đồng

thời cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng đối kháng của một số xạ khuẩn,nấm nội sinh cây hồ tiêu làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và ứng dụng

làm chế phấm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita.

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài góp phần vào việc tạo ra các chế phẩm sinh học để phòng

trừ các bệnh do tuyến trùng Meloidogyne incognita gây nên, góp phần quan

trọng trong việc ứng dụng biện pháp sinh học phòng trừ bệnh có hiệu quả và antoàn với môi trường và sức khoẻ con người

4 Giới hạn đề tài

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 02/2018 đến tháng 05/2018

Đề tài chỉ tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn, nấm nội sinh

có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh trên cây hồ tiêu

tại huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU1.1 Tổng quan về cây hồ tiêu

1.1.1 Lịch sử phát triển của cây hồ tiêu

Hồ tiêu còn gọi là cổ nguyệt, hắc cổ nguyệt, bạch cổ nguyệt

Tên khoa học: Piper nigrum

Thuộc họ: Piperaceae

Thuộc chi: Piper

Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) được trồng cách đây khoảng 6000 năm (Sasikumar và ctv., 1999; Ravindra và ctv., 2000)[32], có nguồn gốc Tây Nam

Ấn Độ nằm ở vùng Ghats và Assam, mọc hoang trong rừng (đây là vùng nhiệtđới ẩm) Hồ tiêu được người Ấn Độ phát hiện và sử dụng đầu tiên Họ cho rằngphát hiện này rất quý giá vì hạt tiêu có thể dùng làm lễ vật triều cống và bồithường chiến tranh

Từ thế kỉ 13, hồ tiêu được canh tác và sử dụng rộng rãi trong bữa ăn hằngngày Trong nhiều năm, Ấn Độ là nước trồng hồ tiêu nhiều nhất thế giới, tậptrung canh tác ở Kerela và Mysore Từ Ấn Độ sau đó được trồng lan rộng sangcác vùng Nam Á, Đông Nam Á (Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Srilanka,Campuchia, Việt Nam, Lào ) Từ cuối thế kỉ 19, hồ tiêu bắt đầu được phổ biếnsang trồng ở Châu Phi với Madagasca là địa bàn canh tác nhiều nhất và ở Châu

Mỹ, Brasil là nước canh tác hồ tiêu nhiều nhất [32]

Ở Việt Nam, cây tiêu mọc hoang được tìm thấy từ trước thế kỷ XVI, nhưng

đến thế kỷ XVII mới được đưa vào trồng (Chevalier, 1925; Phan Hữu Trinh và ctv.,

1987) [15] Hồ tiêu được du nhập và trồng đầu tiên ở Hà Tiên, Phú Quốc, PhướcTuy, Bà Rịa Từ sau năm 1975, ngành trồng tiêu phát triển mạnh ở Bình Long,Phước Long (tỉnh Bình Phước) Miền Trung phát triển mạnh ở vùng Khe Sanh(Quảng Trị) Năm 1965 toàn miền Nam có khoảng 465 ha với sản lượng 605 tấntiêu bột Hiện nay hồ tiêu được trồng nhiều ở các vùng như Đắk Lắk, Gia Lai, Kon

Tum, Bình Thuận , Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Bà Rịa – Vũng Tàu chođến các tỉnh miền Tây Nam bộ : Cần Thơ, Sóc Trăng, Kiên Giang trồng tiêu pháttriển mạnh.

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hồ tiêu

Cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) thuộc họ Piperaceae, bộ Piperales có số

nhiễm sắc thể 2n = 52 Họ Hồ tiêu (Piperaceae) là những cây thân cỏ đứng hoặc

leo bò trên vách đá hay bám trên các thân gỗ khác nhờ rễ bám Hồ tiêu là một loại dây leo, thân dài, nhẵn không mang lông, bám vào các cây khác bằng

rễ Thân mọc cuốn, mang lá mọc cách Lá như lá trầu không, nhưng dài và thuôn hơn Có hai loại nhánh: một loại nhánh mang quả, và một loại nhánh dinh dưỡng, cả hai loại nhánh đều xuất phát từ kẽ lá Đối chiếu với lá là một cụm hoa hình đuôi sóc Khi chín, rụng cả chùm Quả hình cầu nhỏ, chừng 20-30 quả trên một chùm, lúc đầu màu xanh lục, sau có màu vàng, khi chín

có màu đỏ Từ quả này có thể thu hoạch được hồ tiêu trắng, hồ tiêu đỏ, hồ tiêu xanh và hồ tiêu đen Đốt cây rất dòn, khi vận chuyển nếu không cẩn thận thì cây có thể chết Quả có một hạt duy nhất.[42]

Hình 1.1: Đặc điểm của hồ tiêu

(Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Hồ_tiêu)

* Hệ thống rễ tiêu

Cây hồ tiêu có 4 loại rễ chính:

- Rễ cọc: chỉ có khi trồng tiêu bằng hạt Sau khi gieo phôi hạt phát triểnđâm sâu vào đất, có thể ăn sâu 2 – 2.5m, nhiệm vụ chính là hút nước

- Rễ cái: Rễ cái phát triển từ hom tiêu (nếu trồng bằng hom), mỗi hom có

từ 3 – 6 rễ cái, nhiệm vụ chính là hút nước, chống hạn cho tiêu trong mùa nắng,sau 1 năm trồng rễ cái có thể ăn sâu tới 2m

- Rễ phụ (rễ con): Rễ phụ mọc ra từ các rễ cái và mọc thành từng chùmmang nhiều lông hút, tập trung nhiều ở độ sâu 15 – 40 cm Nhiệm vụ chính làhút nước và dưỡng chất để nuôi cả nọc tiêu, đây là loại rễ quan trọng nhất củatiêu trong sinh trưởng và phát triển

- Rễ bám (rễ khí sinh, rễ thằn lằn): Rễ này mọc từ các đốt của thân chínhhoặc cành của cây tiêu, bám vào nọc, vách đá Nhiệm vụ giữ cây tiêu vững chắc

và việc hấp thụ thì chủ yếu là thẩm thấu (hấp thụ yếu)

* Cành

Có 3 loại cành:

-Cành vượt (cành tược):

Mọc ra từ các mầm nách lá ở những cây tiêu nhỏ hơn 1 tuổi và mọc thẳnghợp với thân chính 1 góc nhỏ hơn 450 Cành này phát triển rất mạnh, nếu dùnglàm hom để giâm cành thì cho cây tiêu chậm ra hoa hơn cành mang trái nhưngtuổi thọ kéo dài hơn (20 – 30 năm)

Trong trồng trọt ứng dụng cành tược như sau:

Đối với cây nhỏ hơn 1 tuổi: bấm ngọn thân chính để kích thích cành tượcnhằm tạo tán tiêu

Khi cây lớn (cho trái): tỉa bỏ những cành tược để hạn chế cạnh tranh dinhdưỡng với cành trái

- Dây lươn:

Mọc ở phần gần mặt đất từ những mầm nách lá, xu hướng bò trên mặt đất,

nó mọc dài ra, nhỏ hơn, lóng rất dài làm tiêu hao chất dinh dưỡng của thân chính

và nhánh ác Trong sản xuất thường người ta cắt bỏ nó đi và được dùng làm homgiâm cành, cành giâm của nó có tỉ lệ sống thấp, chậm ra hoa (4 năm sau mới cóhoa), tuổi thọ cao, năng suất cao Nếu không có thân chính và cành vượt thìkhông nên dùng nhánh ác mà nên dùng dây lươn để làm cành giâm

*Lá

Lá tiêu thuộc lá đơn, hình trái tim, mọc cách Cuống lá dài 2 – 3 cm, phiến

lá dài 10 – 25 cm, rộng 5 – 10 cm tùy thuộc vào giống

Lá cũng là bộ phận để nhận diện giống, trên phiến lá có 5 gân lá hình lôngchim, mặt trên bóng láng và xanh đậm hơn mặt dưới, tùy thuộc vào điều kiệnthời tiết và chế độ chăm sóc, giống.

* Hoa, trái, hạt

Hoa:Hoa mọc thành từng gié treo lủng lẳng trên cành quả hoặc nhánh ác.

Một gié dài khoảng 7 – 12 cm, trung bình có từ 20 – 60 hoa trên gié, sắp xếptheo hình xoắn ốc, dưới mỗi hoa có 1 lá bắc nhỏ nhưng rụng rất sớm khó thấy.Hoa tiêu có thể lưỡng hoặc đơn tính và có thể đồng chu, dị chu hoặc tạp hoa.Hoa tiêu không có bao hoa, không có đài và có màu vàng hoặc xanh nhạtgồm có 3 nhánh hoa, 2 – 4 nhị đực, bao phấn có 2 ngăn, hạt phấn tròn và rất nhỏ,đời sống rất ngắn khoảng 2 – 3 ngày Bộ nhụy cái gồm: bầu noãn có 1 ngăn vàchứa 1 túi noãn (tiêu chỉ có 1 hạt)

Từ khi xuất hiện gié đến khi hoa nở đầy đủ khoảng 29 – 30 ngày Sự thụphấn của hoa không phụ thuộc vào gió, mưa hoặc côn trùng mà phấn của hoatrên thụ hoa dưới của một gié (geotonogamy)

Sự thụ phấn của hoa phụ thuộc rất lớn bởi ẩm độ không khí, ẩm độ đất Đây

là điều cần lưu ý cho việc tưới nước cho vùng trồng tiêu ở miền Đông Nam bộ(chú ý: ngoài việc tưới gốc còn tưới phun để tăng ẩm độ không khí)

Trái: Trái tiêu chỉ mang 1 hột có dạng hình cầu, đường kính 4 – 8 mm;

thay đổi tùy giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc Thời gian từ lúc hoa nở đếntrái chín kéo dài 7 – 10 tháng, chia ra các giai đoạn:

- Hoa xuất hiện và thụ phấn: 1 – 1,5 tháng

- Thụ phấn đến trái phát triển tối đa: là 3 – 4,5 tháng, là giai đoạn cần nhiềunước nhất

- Trái phát triển tối đa đến trái chín: 2 – 3 tháng

Ở miền nam trái chín tập trung vào khoảng tháng 1 – 2 trong năm có thểkéo dài tháng 4 – 5 (do xuất hiện hoa trễ)

Hạt tiêu: Cấu tạo bởi 2 lớp, bên ngoài gồm có vỏ hạt và bên trong chứa

phôi nhũ và các phôi (đây là bộ phận tiêu dùng)

1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây hồ tiêu

Theo Phan Quốc Sủng (2001) [11] cây tiêu có yêu cầu về điều kiện sinhthái như sau:

- Nhiệt độ

Tiêu là một loại cây đặc trưng của vùng nhiệt đới Về mặt nhiệt độ, các tàiliệu cho thấy cây tiêu có thể trồng được ở khu vực vĩ tuyến 20 0 Bắc và Nam, nơi

có nhiệt độ từ 10 - 350C Nhiệt độ thích hợp cho cây tiêu từ 18 - 27 0C Khi nhiệt

độ không khí cao hơn 40 0C và thấp hơn 10 0C đều ảnh hưởng xấu đến sinhtrưởng cây tiêu Cây tiêu sẽ ngừng sinh trưởng ở nhiệt độ 150C kéo dài Nhiệt độ

6 -10 0C trong thời gian ngắn làm nám lá non, sau đó lá trên cây bắt đầu rụng

- Ánh sáng

Cây tiêu ưa ánh sáng tán xạ, nguồn gốc cây tiêu trong rừng tại phía tâyvùng Ghats thuộc miền Nam Ấn Độ Ánh sáng tán xạ nhẹ phù hợp với yêu cầusinh lý về sinh trưởng và phát dục, ra hoa đậu quả của cây tiêu và kéo dài tuổithọ của vườn cây hơn, do vậy trồng tiêu trên các loại cây trụ sống là kiểu canhtác thích hợp cho cây tiêu Trong giai đoạn cây con cần che bóng rợp cho tiêu,còn trong giai đoạn trưởng thành thì cây tiêu phát triển xum xuê nên tự che bóngcho nhau Đối với cây choái sống cần chú ý rong tỉa tán che của cây choái hợp lý

để cung cấp đầy đủ ánh sáng cho vườn tiêu

- Lượng mưa và ẩm độ

Cây tiêu ưa thích điều kiện khí hậu nóng ẩm Lượng mưa trong năm cần

từ 1500 - 2500mm phân bố tương đối điều hòa Tiêu cũng cần một giai đoạn hạntương đối ngắn sau vụ thu hoạch để phân hóa mầm hoa tốt và ra hoa đồng loạtvào mùa mưa năm sau Cây tiêu cần ẩm độ không khí lớn từ 70 -90%, nhất làvào thời kỳ ra hoa Độ ẩm cao làm hạt phấn dễ dính vào nuốm nhị và làm chothời gian thụ phấn kéo dài do nuốm nhị trương to khi có độ ẩm Tuy vậy cây tiêurất kỵ mưa lớn làm đọng nước ở rễ gây úng.

- Gió

Cây tiêu ưa thích môi trường lặng gió, hoặc gió nhẹ Gió nóng, gió lạnh,bão đều không hợp với cây tiêu Do vậy khi trồng tiêu tại những vùng có gió lớn,việc thiết lập các hệ đai rừng chắn gió cho cây tiêu là điều không thể thiếu được

- Yêu cầu đất đai

Câytiêu trồng được trên nhiều loại đất khác nhau như đất đỏ phát triểntrên đá bazan, đất đỏ vàng phát triển trên sa phiến thạch, diệp thạch, đất cát xámtrên đá granit, đất phù sa, đất sét pha cát miễn là đạt các yêu cầu cơ bản sau

+ Đất dễ thoát nước, có độ dốc dưới 5%, không bị úng ngập dù chỉ úngngập tạm thời trong vòng 24 giờ

+ Tầng canh tác dày trên 70cm, mạch nước ngầm sâu hơn 2m

+ Đất giàu mùn, thành phần cơ giới nhẹ đến trung bình, pHKCl từ 5 - 6

- Trụ tiêu [16]

+ Hồ tiêu là cây leo bám nên cần phải có trụ, trụ tiêu đóng vai trò quyếtđịnh trong đời sống cây hồ tiêu và chi phí cho trụ tiêu chiếm tỉ trọng lớn nhấttrong chi phí thiết lập vườn hồ tiêu mới (ICARD, 2005).

+ Tại những vùng trồng hồ tiêu lâu đời ở Việt Nam, nông dân thường ưa sửdụng trụ gỗ vì cho rằng hồ tiêu leo bám dễ dàng, không bị cạnh tranh về nước,dinh dưỡng, ánh sáng như khi trồng trụ sống và không bị nóng làm hồ tiêu tànlụi sớm như khi trồng với trụ bê-tông hoặc bồn gạch xây Tuy vậy, thực tế sảnxuất hiện nay cho thấy hồ tiêu có thể đạt được năng suất cao trên tất cả các loạitrụ, nếu có chế độ chăm sóc phù hợp

+ Các loại trụ sống rất phong phú như vông (Erythrina spp.), keo (Leucena leucocephala), lồng mức (Wrightia annamensis), đỗ quyên (Gliricidia sepium), mít (Artocarpus heterophyllus), muồng cườm (Adenanthera pavonina), cóc rừng (Spondias pinnata) và gòn (Ceiba spp.) đang được sử dụng ở nhiều vùng trồng

hồ tiêu trọng điểm hiện nay như Đắk Lắk, Bình Phước, Quảng Trị và Phú Yên.Đặc biệt ở Quảng Trị, do có gió Lào khô nóng, cây trụ sống tỏ ra đặc biệt thíchhợp cho việc trồng hồ tiêu, các thử nghiệm trồng hồ tiêu trên trụ bê-tông và bồngạch không mấy thành công ở vùng này

1.1.4 Sâu bệnh hại chính ở cây hồ tiêu

 Mối hại tiêu: mối xông đất tạo thành đường di chuyển trên trụ, dây và rễ

tiêu Mối gây hại phần non của rễ, phần vỏ của thân và tạo vết thương trên các

bộ phận này tạo điều kiện cho nấm, tuyến trùng xân nhập và gây hại cho tiêu

 Rệp sáp giả( Pseudococidae): gây hại trên đọt non, lá non, chum quả, dây

tiêu trên mặt đất, hoặc gốc tiêu, rễ tiêu dưới mặt đất

Thiếu Mg: Phổ biến ở giai đoạn ra hoa và lúc trái già, lá mất màu diệp lục,gân lá màu vàng, lá trưởng thành có màu xanh nhạt, và sau đó lá bị rụng.

Thiếu Ca: Cây cằn cỗi, các lóng ngắn lại, lá non màu xanh nhạt, mép lácháy xém gần phiến lá màu xanh nhạt, xuất hiện các đốm nâu ở giữa gân lá mặttrên và mặt dưới lá

 Bệnh chết nhanh: Nguyên nhân do nấm Phytophthora sp Do tác động của

côn trùng, chăm sóc sới xáo, ngập úng,… làm tổn thương rễ, sau đó nấm xâmnhập và gây hại Các đọt mầm sinh trưởng không dài ra thêm, lá chuyển màuxanh nhạt, cành mềm yếu Những ngày tiếp theo lá chuyển sang màu vàng làm

lá, hoa và cành bị rụng Bệnh gây hại trên tất cả các bộ phận của cây

 Bệnh chết chậm: bệnh do nhiều loại nấm gây hại: Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Pythium sp., các loại nấm này thường tồn tại trong đất, trên tàn

dư của cây trồng trước, trên cây giống,… cây bị bệnh sinh trưởng và phát triểnchậm, lá nhạt, màu vàng hoặc biến dạng Hoa quả rụng dần từ gốc đến ngọn, cácđốt cũng rụng dần từ trên xuống dưới, gốc thối, bó mạch thân cây hóa nâu

 Bệnh thán thư: bệnh do nấm Colletotrichum sp gây ra Cây bị bệnh trên

lá, đọt hoa và quả gây xuất hiện nhiều đốm vàng nhạt không đều có quầng đenbao quanh Hoa, quả khô đen sau đó lan sang nhánh làm khô cành, rụng đốt

 Bệnh tiêu điên: do virus gây nên tác nhân truyền bệnh là rầy làm lá cong,

cây lùn, lá nhỏ lại cằn cỗi, năng suất giảm

 Bệnh tuyến trùng:

Cây bị nhiều loại tuyến trùng gây hại trong đócó hai loại tuyến trùng phổ

biến nhất là: tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne và tuyến trùng đục hang

Radopholus.

Triệu chứng: sự phát triển yếu đi dần dần và đặc điểm lá bị vàng là triệu

chứng đầu tiên do tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne gây ra Hiện tượng bạc vàng

lá xuất hiện ở toàn bộ cây M incognita làm giảm khả năng hấp thu các khoáng:

P, K, Cu, Zn và Mn (Ferraz và cộng sự, 1988) Sắc tố của lá bị gảm đáng kể bởituyến trùng bướu rễ, làm cho lá già và chết ( Ferraz và Lordello, 1989) Ở rễ xuấthiện các khối u lớn, tại đó tuyến trùng cái sẽ đẻ trứng và ký sinh sâu trong các

mô rễ (Ramana, 1991, Rnamana và cộng sự, 1994) Rễ bị thối, cây sinh trưởngkém đi, trở nên còi cọc, than khô héo, tuyến trùng bướu rễ tạo ra các u buớu ở rễtạo điều kiện cho nấm bệnh xâm nhập và phát triển mạnh.[7]

1.2 Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne incognita

1.2.1 Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyneincognita

* Phân loại:

Tuyến trùng Meloidogyne incognita (Kofoid &White, 1919; Chitwood,

1949) là loài tuyến trùng nội ký sinh rễ thuộc:

Tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne được Berkeley phát hiện đầu tiên vào

năm 1855 trên cây dưa chuột ở Anh

* Đặc điểm sinh học:

Trong số các loài Meloidogyne, Meloidogyne incognita (Kofoid – White

1949) là loài phổ biến ở vùng nhiệt đới, gây hại hầu hết các loại cây trồng và câydại như dưa chuột, cà chua, thuốc lá, hồ tiêu, cà pháo, cà bát, ớt, cà phê, chuối, dứa,cây dược liệu, cây bầu bí, mướp, mồng tơi, su hào, cải bắp … (Khan và cs., 2008).[27]

Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọcgelatin (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ Đôi khi các bọc trứng

này cũng có thể nằm bên trong nốt sần Sau quá trình phát triển phôi thai, trứngphát triển thành ấu trùng tuổi 1 ngay bên trong trứng Lần lột xác thứ nhất xảy ratrong trứng và phát triển thành ấu trùng tuổi 2 Trứng nở ra ấu trùng tuổi 2 dạngcảm nhiễm IJ2 (infective juvenile = IJ) mà không cần có sự kích thích của rễthực vật.

Ấu trùng cảm nhiễm có thể xâm nhập vào ngay cạnh nốt sần hoặc có thể xâmnhập vào rễ mới Tuyến trùng chỉ xâm nhập vào những cây trồng thích hợp vớichúng Khi chưa gặp cây chủ thích hợp chúng có thể tồn tại một thời gian tương đốidài ở trong đất Tuyến trùng xâm nhập tạo những nốt sưng ở rễ rất dễ nhận biết,tuyến trùng non có dạng dài nhỏ, chiều dài thân 15 - 18 micromét Kim chíchnhọn dài 10 - 12 micromét, tròn như đầu kim gút Con cái lúc nhỏ màu trắng sữa,khi trưởng thành cơ thể màu trong suốt, có dạng cầu tròn, phần cổ hẹp, kimchích dài 15 - 17 micromét Lớp vỏ có túi bao bọc cơ thể mỏng, mềm Con đựchình trụ dài 1,2 - 2,2 mm chiều ngang thân 60 - 70 micromét, đầu tròn gai giaophối nằm sát nút đuôi

Khi chuẩn bị xâm nhập vào rễ, IJ2 tập trung dọc theo các tế bào non ngaytại phía sau vùng đỉnh rễ IJ2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ,nơi các rễ bên mọc ra tạo nên điểm xâm nhập cho các IJ2 khác và làm cho bềmặt rễ bị tổn thương Khi IJ2 tiếp xúc với bề mặt rễ, chúng thường dùng kim hútchâm chích và xâm nhập ngay vào trong rễ Sự xâm nhập của chúng có thể xảy

ra ở bất kỳ phía nào của rễ Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng dichuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyếntrùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ và bắt đầu quá trình dinh dưỡng

Khi dinh dưỡng, tuyến trùng cắm phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ,tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hìnhthành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng Vùng này gồm 5 - 6 tế bào khổng lồ(tế bào có nhiều nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc vùng mô libe nơi

đầu tuyến trùng Đây là sự thích nghi chuyển hóa cao của tế bào, chúng được tạo

ra và duy trì bằng tuyến trùng ký sinh Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồcác mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần rễ(gall hoặc root-knot) Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1 - 2 ngày saukhi tuyến trùng xâm nhập Kích thước của nốt sần liên quan đến cây ký chủ, sốlượng IJ2 xâm nhập và loài tuyến trùng ký sinh

Hình 1.2: Tuyến trùng xâm nhập và gây u sưng rễ

(Nguồn: http://images.google.com/imgres?i)

Bản thân tuyến trùng cảm nhiễm, sau khi xâm nhập vào rễ cũng bắt đầumột cách nhanh chóng quá trình thay đổi về hình thái: cơ thể chúng phình ra vàcác nội quan cũng dần được phát triển Quá trình phát triển của tuyến trùng trong

rễ từ IJ2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành Lần lột xác cuối cùng là

sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng cuộn gấp khúc trong IJ4 chúng được

nở ra và có dạng hình giun, trong khi đó con cái có dạng hình tròn như quả lêhay quả chanh

Tuyến trùng Meloidogyne sinh sản bằng 2 cách: một vài loài sinh sản hữu

tính - giao phối bắt buộc (amphimixis) và phần lớn các loài sinh sản lưỡng tính(parthenogenessis) không cần con đực Đối với các loài hữu tính thì con đực cặpđôi ngay với con cái sau lần lột xác cuối cùng Tuyến trùng sần rễ có quan hệmật thiết với các điều kiện môi trường (nhiệt độ và các yếu tố sinh thái đất như

độ ẩm, cấu trúc đất, độ thoáng khí, pH, )

Có thể phân biệt 2 nhóm tuyến trùng dựa vào khả năng thích nghi với điều

kiện nhiệt độ là nhóm ưa nóng (các loài điển hình như Me incognita, Me javanica, Me exigua) và nhóm ưa lạnh (các loài điển hình như Me hapla, Me chitwooodi và có thể cả Me naasi) Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với cây

trồng thường có liên quan đến loại đất kiềm, là môi trường tạo ra các sốc bất lợi(stress) cho thực vật (Vũ Triệu Mân, 2007) [3] [8].

1.2.2 Vòng đời của tuyến trùng Meloidogyne incognita

Cũng như các loài tuyến trùng gây hại cây khác, tuyến trùng Meloidogyne incognita con cái nhiều hơn con đực, đẻ trứng thành từng bọc, trứng nở ra tuyến trùng non Meloidogyne incognita sinh sản đơn tính, mặc dù con đực phổ biến và

có thể tập hợp ở giai đoạn cuối để dẫn dụ con cái (Whitehead, 1998)

Vòng đời của Meloidogyne incognita thường từ 32 - 42 ngày ở nhiệt độ 25

- 30o C (Campos, 1990) Một khối trứng của Meloidogyne incognita khoảng

1000 trứng Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hoạt động tuyến trùng đặc biệt là sự

nở trứng Trứng của Meloidogyne incognita nở tốt nhất trong nước ở nhiệt độ

250C (Mustika, 1990)

Nguyễn Vũ Thanh và Nguyễn Ngọc Châu (1993) [3] vòng đời của tuyến

trùng Meloidogyne incognita phát triển qua 5 giai đoạn chính: Trứng (ấu trùng

tuổi 1) ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm) ấu trùng tuổi 3 ấu trùng tuổi 4 tuyến trùng trưởng thành Giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở trong đất, còn các giaiđoạn khác hình thành và phát triển trong rễ tiêu Trong 5 giai đoạn này thì ấu

-trùng tuổi 2 và tuyến -trùng Meloidogyne cái thường dùng để xác định loài Thời gian phát triển và hình thành một vòng đời của tuyến trùng Meloidogyne incognita phụ thuộc vào nhiệt độ và ẩm độ.

Hình 1.3: Vòng đời của tuyến trùng

(Nguồn: Trạm thí nghiệm nông nghiệp bang New York)

1.3 Tổng quan về vi sinh vật vùng rễ

Lugtenberg and Kamilova (2009) [29] cho biết: vùng rễ, lớp đất chịu ảnhhưởng bởi rễ thực vật, tập trung nhiều vi sinh vật hơn so với đất xung quanh.Điều này là do rễ cây tiết ra các chất chuyển hóa có thể được vi sinh vật sử dụngnhư là chất dinh dưỡng Vùng này được gọi là vùng rễ ("rhizosphere") và đượcđịnh nghĩa bởi Lynch là vùng bao gồm cả endorhizosphere (bên trong rễ),rhizoplane (bề mặt rễ) và ectorhizosphere (vùng đất bị ảnh hưởng bởi dịch tiết từrễ) Vi sinh vật ở vùng rễ thường bị hấp dẫn bởi rễ thực vật sinh trưởng rất mạnh

do nguồn dinh dưỡng dồi dào tiết ra từ rễ (Persmark and Jansson, 1997) Mặc dùnồng độ vi sinh vật trong vùng rễ cao hơn trong đất 10 - 1000 lần, nó vẫn thấphơn 100 lần so với nuôi cấy trên môi trường nhân tạo trong phòng thí nghiệm Visinh vật chỉ tập trung trên một phần nhỏ ở bề mặt rễ thực vật Vị trí vi sinh vậtvùng rễ thường tập trung là vùng giao giữa tế bào biểu bì và vị trí rễ phụ xuấthiện (Lugtenberg và Kamilova 2009)

Vi sinh vật xâm chiếm vùng rễ của cây chủ được gọi là vi sinh vật vùng rễ("rhizosphere microorganisms) Phần lớn trong số chúng là những loài có ích(Siddiqui 2006).Thông qua việc xâm chiếm rễ cây kí chủ, vi sinh vật đã giúp íchcho cây trồng thông qua kích thích tăng trưởng thực vật và gia tăng đối khángvới các tác nhân gây bệnh ở thực vật Việc sử dụng nhóm vi sinh vật đối kháng

đã được nghiên cứu rất nhiều trên thế giới (Siddiqui 2006) Chúng có thể trực

tiếp kích thích cây trồng tăng trưởng tốt bằng cách sản sinh kích thích tố tăngtrưởng thực vật (Ping và Boland 2004), cố định đạm (Giller 2001; Iniguez và cs.2004), hoà tan lân và các chất dinh dưỡng khác (Islama và cs 2007; Rodrı́guez

và Fraga 1999; Spaepen và cs 2009) hoặc gián tiếp thông qua ức chế mầm bệnhnhờ kháng sinh hay enzyme phân huỷ vách tế bào (Khan và cs 2008; Nielsen vàSorensen 1997) hoặc chúng có thể cạnh tranh dinh dưỡng và nơi cư trú với mầmbệnh (Khan và cs 2008; Siddiqui 2006; Tian và Riggs 2000) [27]

Ngoài ra, vi sinh vật vùng rễ còn có khả năng kích kháng trên cây trồngchống lại các tác nhân gây bệnh Các vi sinh vật vùng rễ di động có thể xâmchiếm rễ dễ dàng hơn các vi sinh vật không di động do đó hoạt động vùng rễ vàchuyển đổi chất dinh dưỡng tốt hơn Chúng cũng loại bỏ các sinh vật có hại khỏivùng rễ bằng cách loại chúng khỏi ổ sinh thái do đó làm cho cây phát triển tốthơn (Siddiqui 2006) Kháng hệ thống cảm nhiễm là một trong những cơ chế màcác vi sinh vật vùng rễ giúp kiểm soát các tác nhân gây thông qua sự vận độngvật chất của các cây chủ và các thuộc tính sinh hóa (Siddiqui 2006)

1.4 Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong kiểm soát tuyến trùng hại thực vật

 Nghiên cứu sử dụng vi nấm trong kiểm soát tuyến trùng hại thực vật

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng kiểm soát tuyến trùnghại thực vật của vi nấm Tuy nhiên, những công trình nghiên cứu này thườngkhông đền cập đến nguồn gốc những chủng nấm này là từ vùng rễ hay từ trongđất Do vậy, trong phần này chỉ đề cập đến vi nấm nói chung

Trong số các vi sinh vật đối kháng tuyến trùng, nấm có tiềm năng cao vàđóng vai trò quan trọng Hiện nay có hơn 150 loài nấm có khả năng kí sinh tuyếntrùng, chúng được chia thành hai nhóm chính: Nhóm ký sinh bắt buộc và nhóm

ký sinh không bắt buộc Nhóm ký sinh bắt buộc thường ký sinh tuyến trùng nhờ

bào tử, các bào tử này xâm nhập qua đường thức ăn như nấm Harposporium spp.

hay bào tử tiếp xúc và thiết lập quan hệ trên lớp kitin của tuyến trùng và sau đó

xâm nhập như nấm Drechmeria coniospora và Verticillium spp Nhóm ký sinh

không bắt buộc sử dụng tuyến trùng như nguồn thức ăn bổ sung và thường kísinh trứng, các nang và một số tuyến trùng sống tự do, nhóm này bao gồm nhóm

kí sinh cơ hội và nhóm ký sinh ăn thịt có đặc điểm là hình thành các bẫy để bắttuyến trùng (Siddiqui and Mahmood, 1999) [35]

Các phương thức đối kháng của nấm với tuyến trùng: ký sinh bắt buộc, kýsinh theo phương thức hình thành các bẫy, bắt và ăn thịt; ký sinh cơ hội và đối

kháng theo cơ chế nấm tiết ra độc tố ảnh hưởng đến tuyến trùng: Paecilomyces, Verticillium, Hirsutella, Nematophthora, Arthrobotrys, Drechmeria, Fusarium

và Monacrosporium Hiện nay, việc sử dụng các nấm đối kháng này trong phòng

trừ sinh học có nhiều kết quả nhất định (Siddiqui and Mahmood, 1999) [35]

Nấm nội ký sinh thuộc nhóm ký sinh bắt buộc có khả năng sống hoại sinhkém, sợi nấm sống trong đất, xâm nhập và hoàn thành vòng đời trong cơ thể

tuyến trùng Trong nhóm nấm này, nấm thuộc lớp Chytridiomycetes có bào tử

động để tiếp xúc và xâm nhiễm Đặc điểm của nhóm nấm này là cần nước hay

ẩm độ cao, khó phát triển trên môi trường nhân tạo và khả năng cạnh tranh yếutrong điều kiện sống tự do (Siddiqui and Mahmood 1996).[35]

Hơn 50 loài nấm thuộc nhóm kí sinh theo phương thức hình thành bẫy

sống trong đất thuộc vài chi trong lớp Hyphomycetes và vài loài thuộc lớp Zoopagales Khả năng giăng bẫy bắt mồi của nấm tỷ lệ nghịch với tuổi tuyến

trùng Để tăng hiệu quả ký sinh, giai đoạn sinh học hình thành bẫy thường trùnghợp với giai đoạn tuyến trùng xâm nhập vào cây và thời gian để nấm đạt đượcđỉnh sinh trưởng tạo bẫy khoảng 12 - 15 ngày sau mẫu phân lập nhiễm Nấm bẫy

ký sinh tuyến trùng với với nhiều dạng bẫy khác nhau: sợi nấm hình thành cácnhánh có khả năng bám dính tuyến trùng, sợi nấm có chùy bám dính, bẫy vòngtròn có hạch hay không có hạch Nấm ký sinh giăng bẫy có khả năng sống hoạisinh yếu và bị các nấm khác đối kháng

Nấm ký sinh cơ hội có khả năng kí sinh các cơ quan sinh sản của tuyếntrùng và phân hủy hoàn toàn các bộ phận này Tuyến trùng thuộc nhóm lưỡnggiao, tuyến trùng tuổi 2 và trứng mẫn cảm với nhóm nấm này Nấm này có khảnăng kí sinh bên trong rễ hay khi tuyến trùng lộ ra bề mặt rễ, chúng phát triểnmạnh ở vùng rễ cây và ký sinh vào nang hay trứng (Casas-Flores and Herrera-Estrella, 2007, Dong and Zhang, 2006).[20]

Nấm ký sinh tuyến trùng được tuyển chọn để phát triển thành chế phẩmsinh học cần phải có các đặc điểm sau: (i) Khả năng kí sinh tuyến trùng cao; (ii)

có khả năng ký sinh nhiều loại tuyến trùng nhưng không kí sinh thực vật; (iii)sinh trưởng tốt trong ngưỡng pH và nhiệt độ rộng; (iv) có thể nuôi cấy trong môitrường nhân tạo; (v) xác định và biết được cơ chế tác động; (vi) có thể phát triểnthành các dạng sản phẩm thương mại (Casas-Flores and Herrera-Estrella, 2007,Dong and Zhang, 2006) [20]

Cơ chế ký sinh và các bằng chứng về sinh học phân tử trong quá trình kýsinh của nấm vào tuyến trùng đã được làm rõ: Một số enzym liên quan đến quátrình kí sinh tuyến trùng gồm: serine proteases, chitinase, lipases Nấm còn tiết rađộc tố để làm yếu tuyến trùng trước khi kí sinh sử dụng tuyến trùng như nguồndinh dưỡng (Morton và cs., 2004)

 Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn vùng rễ trong kiểm soát tuyến trùng hại thực vật

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào khả năng đối khángtiêu diệt tuyến trùng của các vi khuẩn vùng rễ Các vi khuẩn vùng rễ có khả năng

đối kháng tuyến trùng nốt sưng là Bacillus subtilis, B.sphaericus and Pseudomonas fluorescens (Becker và cs., 1988; Sikora, 1992; Tian và cs., 2007);

Corynebacterium, Enterobacter, Klebsiella, Paenibacillus, Phyllobacillus, Rhizobium, Telluria, and Xanthomonas (Spiegel và cs, 1991; Kloepper và cs,).

Trong quá khứ, các nhà nghiên cứu đã khẳng định rằng vi khuẩn vùng rễkhông ký sinh có hại đối với tuyến trùng, đặc biệt là sau khi chất hữu cơ đã đưavào đất (Rodriguez-Kabana và Morgan-Jones, 1987) hoặc trong điều kiện yếmkhí (Jacq và Fortuner, 1979) Các vi khuẩn có liên quan bao gồm một hỗn hợpnhiều loài với nhiều cơ chế gây hại khác nhau Hầu hết các"rhizobacteria" gâyhại tuyến trùng thực vật thông qua các sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa,các enzyme và độc tố chứ không phải bởi khả năng ký sinh

Các hoạt động giết tuyến trùng ("nematicidal") của các vi khuẩn có thể là

do các các chất kháng sinh mà chúng sản xuất trên môi trường thạch (Becker vàctv., 1988) Rhizobacteria không ký sinh được ứng dụng để xử lý hạt giống và củgiống hoặc thậm chí áp dụng cho đất, làm giảm khả năng xâm nhập của tuyếntrùng vào rễ của nhiều loài cây trồng trong chậu, trong nhà kính và ngoài đồngruộng (Oostendorp và Sikora, 1990; Siddiqui và Mahmood, 1993, 1995a, 1995b,1997)[35] Sử dụng phối hợp các rhizobacteria không ký sinh cùng với các visinh vật khác như vi khuẩn nốt sẫn rễ, nấm hoại sinh và nấm cơ hội trên tuyếntrùng cho thấy có lợi trong việc làm giảm mật độ tuyến trùng trên nhiều đốitượng cây trồng khác nhau

Ngoài tác dụng đối kháng tuyến trùng kí sinh thực vật, các vi khuẩn vùng

rễ còn được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong nông nghiệp do chúng cókhả năng sản xuất nhiều hợp chất khác nhau bao gồm phytohormones, axit hữu

cơ , siderophores, cố định nitơ trong khí quyển, hòa tan phosphate, tổng hợp kíchthích tố, tạo kháng sinh và một số cơ chế khác chưa được xác định (Siddiqui2006) Hiệu quả của vi sinh vật vùng rễ trong việc làm tăng khả năng sinhtrưởng phát triển cây trồng, tiết kiệm phân bón hoá học cũng như tăng năng suất,chất lượng nông sản đã được khẳng định trong nhiều công trình nghiên cứu của

nhiều nước trên thế giới (Kennedy và cs 1997; Pathma và cs 2011; Richardson

2001) Các sản phẩm vi sinh như phân bón vi sinh, chế phẩm VSV phòng trừbệnh cây trồng đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay có ý nghĩa quan trọngtrong việc bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp bền vững VSV tácđộng đến cây trồng trực tiếp hoặc gián tiếp Sự tác động trực tiếp của VSV đếncây trồng thể hiện qua sự tổng hợp, khoáng hoá hoặc chuyển hoá các chất dinhdưỡng xảy ra trong quá trình chuyển hoá vật chất của VSV như quá trình cố địnhnitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp auxin, giberellin, etylen, v.v Những vi khuẩnnày có khả năng giúp cây trồng tăng khả năng huy động và dễ dàng sử dụng cácnguồn dinh dưỡng từ môi trường Tác động gián tiếp đến sinh trưởng của câytrồng xảy ra khi các chủng VSV có khả năng làm giảm bớt hoặc ngăn chặn cácảnh hưởng có hại từ môi trường hoặc từ các VSV bất lợi đối với thực vật, trong

đó VSV có thể cạnh tranh dinh dưỡng với VSV bất lợi hoặc sinh tổng hợp cácchất có tác dụng trung hoà, phân huỷ, chuyển hoá các tác nhân có hại hoặc tiêudiệt, ức chế các VSV bất lợi Mỗi loại VSV trong tự nhiên có thể có 1 hoặc cả 2

tác động nêu trên đối với cây trồng (Nakkeeran và cs 2006; Siddiqui và Shahid

2003; Siddiqui 2006)

Việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao đối với tuyến trùng làrất quan trọng Để có được các chủng hiệu quả, việc phân lập vi khuẩn nên đượctiến hành trên cùng môi trường nơi chúng sẽ được sử dụng để kiểm soát tuyếntrùng (Weller & ctv., 1985) Việc tuyển chọn các chủng có hiệu quả trên đồngruộng có thể được đơn giản hóa nhờ các khảo nghiệm trong nhà lưới Điều quantrọng là việc chủng các tác nhân tiềm năng, điều kiện môi trường và liều lượng

vi khuẩn (Siddiqui &Mahmood, 1999) Khả năng xâm chiếm rễ cũng là mộttham số khác để sàng lọc các chủng vi khuẩn có hiệu quả (Siddiqui &Mahmood,1999) [35]

 Nghiên cứu xạ khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng tuyến trùng kí sinh thực vật

Ruanpanun và cs (2010)[33] đã phân lập được 83 dòng xạ khuẩn từ đất

vùng rễ của một số loại cây trồng bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne

spp tại Thái Lan Phần lớn (97.6%) các dòng xạ khuẩn phân lập được đều thuộc

giống Streptomyces Trong số đó, có 7 dòng xạ khuẩn có khả năng giảm tỷ lệ trứng tuyến trùng nở và diệt ấu trùng M incognita sau 7 ngày ủ Phần lớn các dòng vi sinh vật có khả năng đối kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita đều thuộc giống Streptomyces Trong số các dòng vi sinh vật vùng rễ đối kháng với tuyến trùng M incognita, 10 dòng có khả năng sinh tổng hợp IAA, 9 dòng sản sinh siderophore Chủng Streptomyces sp CMU-MH021 được coi là tác nhân kiểm soát sinh học tiềm năng, làm giảm tỷ lệ nở của trứng M incognita xuống

còn 33,1% và tăng tỷ lệ chết của ấu trùng lên 82%, trong khi các tỷ lệ này ở cáccông thức đối chứng lần lươt là 79,6 và 3,6% Ngoài ra, chủng này còn sinh tổnghợp IAA (28.5 pg ml-1), siderophore (26.0 pg ml-1) và có khả năng đối kháng vớimột số nấm bệnh khác (Ruanpanun và cs., 2010)

Streptomyces được ghi nhận là xạ khuẩn đối kháng tuyến trùng kí sinh

thực vật bằng cách sản sinh các chất chuyển hóa diệt tuyến trùng (nematicidalmetabolites) (Dicklow và cs 1993; Sun và cs 2006) [22][36] Ngoài ra, chúngcòn có khả năng kiểm soát một số nấm gây bệnh thứ cấp trên cây trồng làm giảmtổn thất về mặt năng suất

Thu thập đất vùng rễ của 16 loại cây thuốc, Khamna và cs (2008) [26] đã

phân lập được 445 dòng xạ khuẩn, trong đó chủ yếu là Streptomyces (89%) và 11% còn lại là Actinomadura sp., Microbispora sp., Micromonospora sp., Nocardia sp, Nonomurea sp Trong số đó, có 23 dòng Streptomyces có hoạt tính đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật (Alternaria brassicicola, Collectotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Penicillium digitatum

và Sclerotium rolfsii).

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Tuyến trùng, một đối tượng phá hại cây trồng nghiêm trọng đã trở thànhmối quan tâm lớn của các nhà khoa học hiện nay Tuyến trùng phân bố khắp nơitrên thế giới từ ôn đới, á nhiệt đới đến vùng cận xích đạo.

Bệnh vàng lá cây tiêu hay còn gọi là bệnh ”vàng lá chết chậm” hoặc tuyếntrùng được Van Der Vecht báo cáo lần đầu tiên năm 1932 trên đảo Bangka,Indonesia (Van Der Vecht, 1950)[39].Triệu chứng tương tự cũng được tìm thấytrên cây tiêu ở các nước trồng tiêu trên thế giới như ở Ấn Độ (Nambiar & Sarma,1977) [25], Indonesia (Harper, 1974) [24], (Bridge,1978) [19]

Nguyên nhân gây bệnh vàng lá của cây tiêu ở đảo Bangka, Indonesia là do

sự kết hợp giữa thiếu hụt dinh dưỡng và sự tấn công của tuyến trùng (Zaubin,1979) [41] Nguyên nhân cơ bản là do sự thiếu hụt dinh dưỡng trong đất vàtuyến trùng được xem như là tác nhân gây bệnh thứ hai (Wahid, 1976) [38], (DeWaard, 1979) [21]

Hallmann và cs (1995) [37] báo cáo rằng vi khuẩn vùng rễ góp phần kiểmsoát tuyến trùng ký sinh thực vật Họ đánh giá 7 chủng vi khuẩn phân lập từ

vùng rễ dưa chuột và bông kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita, giảm 50%

về số lượng các u sưng trên dưa chuột Trong một nghiên cứu khác, Munif và cs

(2000) vi khuẩn phân lập từ rễ cà chua đối với tuyến trùngM incognita cà chua

trong điều kiện nhà kính Họ đã cho thấy tính chất đối kháng của 21 trong số 181

loại vi khuẩn vùng rễ đối với tuyến trùngM incognita.

Chahal và Chahal (1999) [37] đã kiểm tra ảnh hưởng của các chủng B thuringiensis khác nhau trên nốt sưng lúa mì và về số lượng trứng của Meloidogyne incognita Các kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ đối với trứng và tất cả J2S của M incognita Các bọc gelatin của trứng đã tan rã do hoạt

động của vi khuẩn, có thể là do khả năng sản xuất enzyme gelatinase và chitinasecủa vi khuẩn (Chigaleichik 1976), một enzym thủy phân chitin hiện diện trong

vỏ trứng và bọc gelatin của khối trứng (Spiegel và Cohn 1985), do đó ảnh hưởngđến tính thấm.

Ali (1996) [37] nhận thấy mật độ của loài tuyến trùng giảm khi sử dụng

năm chủng vi khuẩn (Arthrobacterium spp., Bacillus spp., Corynebacterium spp., Serratia spp., Streptomyces spp.) mật độ tuyến trùng dao động từ 46% đến 100% Youssef et al (1998) nghiên cứu tiềm năng của A chroococcum, Bacillus megaterium, và Rhizobium lupin đối với kiểm soát M incognita nhiễm cây đậu đũa và cà chua Họ nhận thấy mật độ và khối trứng của M incognita đã giảm trong đất khi được xử lý bằng B megatherium và A chroococcum ngoại trừ đất được điều trị bằng R Lupin El-Sherif và cs (1995) đã nghiên cứu ảnh hưởng

của chất lọc culture của 5 chủng cho tác dụng độc tuyến niệu đối với tuyến trùng

ký sinh thực vật (Bacillus spp., Corynebacterium spp., Serratia Spp., Arthrobacterium spp., Và Streptomyces spp.) Các tác giả đã xác định nồng độ

đạt 0,1% để ức chế sự nở của trứng và 0,6% có độc tính cao với tuyến trùng tuổi

2, tác động độc hại của chất lọc khác nhau với các loài tuyến trùng khác nhau

Phân lập vi sinh vật vùng rễ rau, Li và cs (2005) [28] đã tuyển chọn được

2 chủng vi khuẩn Brevibacillus brevis và Bacillus subtilis không những có khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne javanica trong điều kiện nhà lưới mà còn ức chế sự phát triển của nấm bệnh Rhizoctonia solani SX-6, Pythium aphanidermatum ZJP-1 và Fusarium oxysporum f.sp cucumerinum trong điều kiện invitro và gia tăng sinh trưởng ở cây đậu xanh (Li và cs 2005)

Ở các nước Đông Nam Á, giống Meloidogyne và Rotylenchus được coi là kẻ

thù vô cùng nguy hiểm đối với cây hồ tiêu Tại Indonesia năm 1975 tuyến trùng làmgiảm sản lượng hồ tiêu khoảng 10%, còn Malaysia nhiều cánh đồng trồng tiêu đã bị

chết trụi do tuyến trùng kí sinh nốt sần Meloidogyne spp (Nguyễn Vũ Thanh, 1983)

[12].Trên cây hồ tiêu có khoảng 36 loài tuyến trùng gây hại được báo cáo, trong

đó có hai loài quan trọng là Radopholus similis và Meloidogyne spp (Sharma và

Loof, 1974; Ichinohe, 1975; Reddy, 1977; Bridge, 1978; Dosgupta, 1987; Rama,1987) [21] [23] [31] [34].

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Chi cục Kiểm dịch thực vật vùng II (1987) [4] cho rằng tác nhân gây bệnhtrên tiêu gồm một số loài tuyến trùng tấn công gây hại bộ rễ tiêu, trong đó quan

trọng nhất là tuyến trùng M.incognita và nấm Fusarium spp Sự kết hợp giữa

hai tác nhân nấm bệnh và tuyến trùng tuỳ điều kiện ngoại cảnh, đất đai, chế độchăm sóc, mực nước ngầm , đã gây ra các triệu chứng khác nhau trên cây tiêu

Bệnh hại trên tiêu ở Tây Nguyên được Phan Quốc Sủng nghiên cứu (1987,1988) [10], cho rằng bệnh hại rễ nguyên nhân là do tuyến trùng nốt sần

Meloidogyne incognita và tuyến trùng đục hang Radopholus similis Cùng tác dộng bởi tuyến trùng còn có các loại nấm như: Fusarium spp., Rhizoctonia bataticola.

Bệnh tuyến trùng ở hồ tiêu được coi là bệnh nan giải nhất và đang gây ranhững thiệt hại rất lớn cho các vườn tiêu hiện nay ở khu vực miền Trung – TâyNguyên và các tỉnh miền Nam Việt Nam (Phạm Văn Biên, 1989) [2]

Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1993) [3] cho biết đã xác địnhđược 49 loài kí sinh trên cây Tiêu (thuộc 19 giống, 14 họ, 3 bộ), trong đó

Meloidogyne incognita là một trong những loài kí sinh gây hại nguy hiểm nhất, đặc biệt ở các nước nhiệt đới Ở Việt Nam, Meloidogyne incognita gây hại trên

100 cây trồng khác nhau, đặc biệt là bệnh sần rễ cây hồ tiêu

Đào Thị Lan Hoa (2000) [5] cho biết tuyến trùng Meloidogyne incognita và nấm Fusarium solani riêng lẻ hay phối hợp có tỉ lệ gây chết sau lây nhiễm hai

tháng đạt cao hơn so với công thức đối chứng Kết quả phân tích đất trồng tiêu

tại Đăk Nông cho thấy tuyến trùng gây u sưng Meloidogyne spp., có mật độ

cao hơn các loại tuyến trùng khác Trong số 200 mẫu phân tích có 15,4% mẫukhông có tuyến trùng, 28,1% mẫu bị nhiễm ở mức nhẹ (mật độ tuyến trùng

Meloidogyne spp <50 con/50g đất), 34,4% nhiễm ở mức trung bình (mật độ tuyến trùng Meloidogyne spp <500 con – 1000 con/50g đất), 10% bị nhiễm ở mức độ rất nặng (mật độ tuyến trùng Meloidogyne spp >1000 con/50g đất).

Viện Bảo vệ thực vật (2008) [18], tuyến trùng gây hại hồ tiêu ở Đăk Nông

chủ yếu là loài M.incognita, khi kết hợp với một số nấm gây hại: Phytophthora, Pythium, Fusarium làm cho cây rụng đốt, bệnh nặng gây chết cây, quá trình gây

hại diễn ra từ từ, có khi một vài tháng hoặc vài năm

Theo nghiên cứu của Võ Mai và Nguyễn Hữu Huân (1987) ở Huyện ĐứcLinh- Thuận Hải có 10 giống tuyến trùng hại rễ hồ tiêu, trong đó có tuyến trùng

Meloidogyne incognita gây hiện tượng sần rễ hồ tiêu là phổ biến nhất, có 12 bệnh trên thân, lá và gốc tiêu như than thư (Gloosporium sp.), rụng đốt (Điploia sp.), thối gốc (Fusarium sp., ).

Theo Nguyễn Ngọc Châu (1995) thì thành phần bệnh hồ tiêu ở Tân Quảng Trị có tới 65 loài, Trong đó tuyến trùng 49 loài, nấm bệnh 7 loài Trong

Lâm-49 loài tuyến trùng ký sinh có 4 loài ký sinh gây hại nặng trên cây hồ tiêu là

Meloidogyneincognita gây sần rễ, có khả năng gây thành dịch trên diện rộng, loài Radophlusreniformis gây đen nụ, loài Xyphenemaamenicanum mang virut gây vàng lá tiêu, loài Pratrichodorus nanusmang virut gây bệnh sắn lá tiêu.

Đỗ Thị Kiều An, Hoàng Ngọc Duyên, Nguyễn Văn Nam (2015) [1] đãphân lập được 36 chủng nấm từ mẫu đất và rễ tại những vườn tiêu tại Đăk Nông

có biểu hiện vàng lá sinh trưởng chậm, rễ có u sưng nhằm sàng lọc và đánh giákhả năng đối kháng của một số chủng vi nấm đối với tuyến trùng

Meloidogyneincognita Trong số 21 chủng nấm thử nghiệm, 66,7% chủng có khả

năng kí sinh tuyến trùng ( trong đó: 23,8% kí sinh mạnh,14,3% kí sinh trung

bình, 28,6% kí sinh yếu) Bốn chủng nấm Trchoderma koningii, Trichoderma ernaceum, Trichoderma haziaum, và Trichoderma astroviride phân lập được từ

vùng rễ và đất tiêu bị bệnh vàng lá chết chậm tại Đăk Nông có khả năng kí sinhcao và ức chế tuyến trùng gây hại gây tiêu con trong điều kiện nhà lưới

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập, phân lập các chủng VSV vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.)tại Chư Sê, Gia Lai.

Nội dung 2: Tuyển chọn các chủng VSV vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến

trùng Meloidogyne incognita cao trong phòng thí nghiệm (in vitro).

2.2 Đối tượng nghiên cứu

- Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại huyện Chư Sê, tỉnh Gia Lai.

- Các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu

- Các chủng xạ khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu

- Các chủng nấm vùng rễ cây hồ tiêu

- Tuyến trùng gây u rễ Meloidogyne incognita trên cây hồ tiêu.

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: tại viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trườngĐại học Tây Nguyên

- Thời gian thực hiện: từ tháng 02/2016 đến tháng 05/2017

2.4 Hóa chất- dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

- Bình định mức 50 ml, 100 ml, 1000 ml, ống nghiệm, đĩa petri đường kính

9 cm, erlen 250 ml, 500 ml, eppendorf loại 500 μl, 1,5 ml, 2 ml, phễu, giấy lọc,

…; Micropipet loại 100 μ, 200 μ, 1000μ , 5000μ ; Các dụng cụ thủy tinh

- Bếp điện, nồi nấu môi trường; Các dụng cụ thủy tinh; Kính hiển viOlympus CH30, kính lúp soi nổi Olympus; Tủ ấm Sanyo Mou 112F, Tủ sấySanyo Mov – 112; Nồi hấp khử trùng; Máy lắc; Máy cất nước Hamilton; Cânphân tích, cân kỹ thuật; Box cấy vô trùng

2.5 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

 Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar) (g/l)

Pancreatic Digest of Casein 15g

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Thu thập, phân lập các chủng VSV vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Chư Sê, Gia Lai.

2.6.1.1 Phương pháp thu mẫu và xử lí mẫu:

Thu thập các mẫu rễ hồ tiêu ở nhiều khu vực, vườn khác nhau ở Chư Sê,Gia Lai Đặc biệt quan tâm đến các vườn hồ tiêu lâu năm, khỏe mạnh, ít có triệuchứng bệnh, tuổi 3-10 năm tuổi Mẫu được đựng trong túi nilon đã khử trùng.Các mẫu sau khi lấy được ghi nhãn nơi thu, ngày thu và tên của người thu mẫu

Mẫu rễ sau khi thu được đem tới phòng thí nghiệm, rửa thật sạch đất bám ở

rễ dưới vòi nước chảy, để ráo tự nhiên, để riêng từng mẫu rồi tiến hành phânlập.Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi phân lập không quá 15 ngày và giữ ở tủlạnh 40C để đảm bảo không ảnh hưởng đến các chủng vi sinh vật rễ cây tiêu

2.6.1.2 Nghiên cứu phân lập các vi sinh vật vùng rễ cây hồ tiêu

Thí nghiệm phân lập được các chủng giống vi khuẩn, xạ khuẩn và nấmvùng rễ cây hồ tiêu tại Chư Sê, Gia Lai

Phương pháp phân lập vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu:

Phương pháp phân lập được thực hiện theo qui trình của Laura, W (2015)

có cải tiến cho phù hợp với đối tượng cây trồng như sau:

Thu thập các mẫu rễ hồ tiêu ở nhiều khu vực, vườn khác nhau Đặc biệtquan tâm đến các vườn hồ tiêu lâu năm, khỏe mạnh, ít có triệu chứng bệnh.Cácmẫu rễ sẽ được ngâm, lắc nhẹ trong nước cất vô trùng để loại bỏ các viên đấtlớn, sau đó cho các mẫu rễ vào các ống ly tâm nhựa 25mL (Falcon 25 mL) có