Do đó, mặc dù nhiệt độ tăng được biết như ảnh hưởng đến sinh lý, sinh sản, tăng trưởng, miễn dịch, tỷ lệ sống…của động vật thủy sản, giả thiết OCLTT the oxygen- and capacity-limited ther
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC THỰC HIỆN VÀ HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VÀ TRƯỜNG ĐẠI HỌC AARHUS
Người hướng dẫn chính: PGS.TS Đỗ Thị Thanh Hương Người hướng dẫn phụ: PGS.TS Mark Bayley
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Họp tại: ……… Vào lúc: … giờ … ngày … tháng … năm …
Phản biện 1: ……… Phản biện 2: ………
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
Ishimatsu, A., Wang, T and Bayley, M., 2017 Recovery
of blood gases and haematological parameters upon anaesthesia with benzocaine, MS-222 or Aqui-S in the
hypophthalmus Ichthyological Research, 64(1),
pp.84-92.
2 Phuong, L.M., Huong, D.T.T., Nyengaard, J.R and
Bayley, M., 2017 Gill remodelling and growth rate of
striped catfish Pangasianodon hypophthalmus under impacts of hypoxia and temperature Comparative
Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 203, pp.288-296
3 Phuong, L.M., Huong, D.T.T., Malte, H., Nyengaard,
J.R, and Bayley, M., 2017 Ontogeny and morphometric
of the gill and swim bladder of air-breathing striped
catfish Pangasianodon hypophthalmus Journal of
Experimental Biology In press
Trang 4CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Theo dự đoán của IPPC (2014), nhiệt độ môi trường đang dần tăng lên và là hậu quả của biến đổi khí hậu toàn cầu Khi nhiệt độ tăng sẽ dẫn đến nồng độ oxy trong nước giảm, tuy nhiên tại cùng thời điểm, nhu cầu oxy cho trao đổi chất của động vật thủy sản tăng Và vì thế phạm vi hiếu khí (aerobic scope) của động vật thủy sản sẽ giảm Do đó, mặc dù nhiệt độ tăng được biết như ảnh hưởng đến sinh lý, sinh sản, tăng trưởng, miễn dịch, tỷ lệ sống…của động vật thủy sản, giả thiết OCLTT (the oxygen- and capacity-limited thermal tolerance) của Pörtner (2010) đề xuất rằng sự vận chuyển và phân phối oxy trong cơ thể động vật thủy sản dưới tác động của nhiệt độ tăng mới là nguyên nhân chính ảnh hưởng nghiêm trọng đến các sinh vật này Ngoài ra, theo giả thiết của Tewksbury và ctv (2008), động vật thủy sản ở các khu vực nhiệt đới sẽ chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi sự nóng lên toàn cầu nhiều hơn so với các đối tượng ở khu vực ôn đới Điều này là do động vật thủy sản là các loài biến nhiệt (nhiệt độ bên trong của chúng sẽ thay đổi theo sự biến đổi của nhiệt độ môi trường), và do các loài ở vùng nhiệt đới hiện đang rất gần với ngưỡng chịu nhiệt trên của chúng, nên chúng sẽ dễ bị tác động khi nhiệt độ tiếp tục tăng trong tương lai Vì thế sự tăng lên của nhiệt độ có thể đe dọa nguồn thực phẩm của con người về lâu dài Khu vực Đông Nam Á nói chung và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng theo dự đoán sẽ chịu tác động nghiêm trọng bởi biến đổi khí hậu do nền kinh tế và đời sống của người dân ở các khu vực này phần lớn phụ thuộc vào nguồn tài nguyên thiên nhiên, vào nông sản và thủy sản Do đó, việc tìm hiểu sự tác động của hiện tượng nóng lên toàn cầu lên nuôi trồng thủy sản cũng như tìm hiểu các cơ chế thích ứng của động vật thủy sản với các biến đổi của môi trường sẽ thiết yếu cho các chính sách và chiến lược quản lý trong tương lai góp phần cho sự phát triển bền vững của ngành thủy sản
Cá tra Pangasianodon hypophthalmus là đối tượng nuôi
thủy sản quan trọng ở Đông Nam Á và đặc biệt ở các khu vực
Trang 5ĐBSCL (Phuong và Oanh, 2010) Theo Lefevre và ctv (2011),
cá tra là loài hô hấp khí trời không bắt buộc và có khả năng hô hấp trong nước để duy trì quá trình trao đổi chất và chỉ hô hấp trong không khí khi môi trường nước thiếu oxy Tuy nhiên, hiện có rất ít thông tin nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, các phản ứng sinh lý hô hấp của cá tra với các biến đổi của môi trường, đặc biệt là với điều kiện nhiệt độ tăng và tình trạng thiếu oxy trong nước (hypoxia) Ngoài ra, hiện chưa có minh chứng (định lượng) về hình thái học của các cơ quan hô hấp cho thấy cá tra có khả năng hô hấp tốt trong nước và trong không khí, và các thông số này có biến đổi hay không dưới tác động của nhiệt độ và oxy trong nước biến đổi
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện nhằm cung cấp thông tin có giá trị khoa học góp phần đánh giá các tác động của nhiệt độ cao và tình trạng thiếu oxy lên cấu trúc cơ quan hô hấp của cá
tra P hypophthalmus bằng phương pháp mô học lập thể Đồng
thời khảo sát sự tăng trưởng cảu cá Tra dưới tác động của các điều kiện này Một số chỉ tiêu sinh lý máu của cá cũng được khảo sát khi cá trong tình trạng thiếu oxy (trong quá trình gây mê) và khi cá phục hồi (sau khi gây mê) Ngoài ra, nghiên cứu này cũng khảo sát mối liên hệ giữa sự biến đổi cấu trúc mang (nếu có) với khả năng điều hòa acid-bazo trong máu cá
1.3 Các nội dung nghiên cứu
a) Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc mê thường dùng trong nuôi trồng thủy sản lên các thông số sinh lý máu cá
tra (Pangasianodon hypophthalmus)
b) Khảo sát sự biến đổi hình thái của mang và sự tăng
trưởng của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) dưới tác
động của điều kiện nhiệt độ cao và/hoặc hàm lượng oxy thấp c) Khảo sát sự tương quan giữa các thông số hô hấp trên
mang và bong bóng khí với khối lượng của cá tra (P hypophthalmus) ở các kích cỡ khác nhau và khảo sát ảnh
hưởng của bơ lội lên cấu trúc mang cá Tra bằng phương pháp
mô học lập thể
d) Khảo sát sự biến đổi cấu trúc mang lên khả năng điều
hòa axit-bazo ở cá Tra P hypophthalmus
Trang 61.4 Ý nghĩa nghiên cứu
Kết quả đạt được từ nghiên cứu này sẽ rất cần thiết trong việc tìm ra khả năng thích nghi của loài với nhiệt độ tăng cũng như tìm các biện pháp khắc phục với hậu quả gây ra bởi hiện tượng nóng lên toàn cầu Từ đó đề ra các chiến lược đối phó với hiện tượng nóng lên toàn cầu và góp phần bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản trong tương lai Đồng thời, kết quả đạt được từ nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng như nguồn tài liệu sinh lý cá cho các nghiên cứu tiếp sau cũng như đóng vài trò quan trọng trong giảng dạy bởi nguồn tài liệu hiện
có về lĩnh vực này còn rất hạn chế
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng của các loại thuốc mê
thường dùng trong nuôi trồng thủy sản lên các thông số sinh lý
máu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
Cá thí nghiệm: P hypophthalmus 700-1000 g
Thuốc mê: Benzocaine (100 mg l-1
), Aqui-S (30 mg l-1),
MS-222 (100 mg l-1)
Thiết kế thí nghiệm: Ba loại thuốc mê được xem như 3
nghiệm thức Mỗi nghiệm thức được lặp lại 7 lần (1 cá thể /lần) Cá được gây mê trong bể nhỏ (20 L) chứa từng loại thuốc mê đã chuẩn bị cho đến khi mất trạng thái thăng bằng và bất động Khi đã được gây mê, cá được đút ống bằng ống nhựa
y tế (I.D 0.58 mm, O.D 0.96 mm) đã chứa sẵn chất chống đông (heparin nồng độ 50 IE ml-1
trong nước muối sinh lý) vào động mạch lưng (theo Soivio và ctv, 1975) Các mẫu máu được thu tại thời điểm ngay sau khi đút ống, và lần lượt sau 3,
6, 24, 48, 72 giờ từ thời điểm cá phục hồi trong bể nước (200 L) có sục khí và không có thuốc mê Trong quá trình lấy máu phải thật sự cẩn thận để không làm cá hoảng sợ
Các thông số sinh lý máu: PCO2, pHe, [lactate], Hct, [Hb], RBC, [glucose], [cortisol], [Cl-]e, và [Cl-]i
Thống kê: Phép phân tích thống kê một nhân tố có lặp lại
(One-way repeated measures ANOVA) được áp dụng để xác
Trang 7định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các lần thu mẫu cho mỗi thông số sinh lý máu
2.2 Nội dung 2: Khảo sát sự biến đổi hình thái của mang
và sự tăng trưởng của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) dưới tác động của điều kiện nhiệt độ cao và/hoặc hàm lượng
oxy thấp
Cá thí nghiệm: P hypophthalmus 12 ± 0.8 g; 2.4 ± 0.05 g Thiết kế thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Cá được bố trí ngẫu nhiên trong 4 bể (20
cá thể/bể 500L) tại nhiệt độ ban đầu 27ᵒC và 92% oxy bão hòa (normoxic) Sau 2 ngày, mẫu mang từ 3 con cá trong mỗi bể được thu và cố định trong dung dịch cố định formaline trung tính 4% như dược mô tả bên trên Các mẫu mang này được xem như mẫu đối chứng Số cá còn lại trong 4 bể dần dần được cho thích nghi với các điều kiện nhiệt độ và oxy khác nhau: 27ᵒC & normoxia; 27ᵒC & hypoxia; 33ᵒC & normoxia; 33ᵒC & hypoxia Mức nhiệt độ và PO2 trong điều kiện thí nghiệm được duy trì và kiểm soát thông qua phần mềm Commander Pacific thuộc công ty OxyGuard® Pacific (Farum, Đan Mạch), với độ chính xác dao động lần lượt là
±0.5ᵒC và ±5% oxy bão hòa Cá được bố trí trong điều kiện trên trong 5 tuần Sau đó, 5 cá thể ở mỗi bể được thu mẫu Khối lượng và chiều dài cơ thể của mỗi con cá được ghi nhận; đồng đời mẫu mang cũng cố định trong formaline trung tính 4%
Thí nghiệm 2: Mỗi cá thể cá được cân và đo chiều dài cơ
thể, và được đánh dấu bằng một PIT tag (chiều dài khoảng
0.5cm) được tiêm vào trong cơ lưng của cá Sau đó, cá được
bố trí trong 4 bể (30 con cá/bể 500L) ở nhiệt độ ban đầu 27ᵒC
và 92% oxy bão hòa (normoxic) Sau 2 ngày, cá dần dần được cho thích nghi với các điều kiện nhiệt độ và oxy trong nước như sau: 27ᵒC & normoxia; 27ᵒC & hypoxia; 33ᵒC & normoxia; 33ᵒC & hypoxia Cá sau đó được cho ăn 2 lần mỗi ngày bằng thức ăn viên, thức ăn thừa được loại bỏ mỗi ngày Sau mỗi 2 tuần, khối lượng và chiều dài cơ thể của mỗi con cá (đã được đánh dấu) trong các bể được ghi nhận và từ đó có thể ước tính tỷ lệ tăng trưởng của cá Thí nghiệm được tiến hành
Trang 8trong khoảng thời gian 4 tháng Sau 4 tháng, mẫu mang (n=6/bể) cũng được thu và cố định trong dung dịch cố định formaline trung tính 4% như dược mô tả bên trên
Phương pháp Stereology: Quy trình xử lý, đúc khối và cắt
mẫu sẽ được thực hiện theo phương pháp được mô tả trong da Costa và ctv (2007) Trên mỗi cung mang, các phần xương sụn cứng được cẩn thận loại bỏ sao cho các tia mang trên cung mang đó vẫn còn liên kết với nhau và không bị tổn hại Phần
mô mang này được thu mẫu theo tỷ lệ phù hợp tùy theo kích
cỡ (Gundersen và ctv, 1988), và lần lượt được khử nước trong các dung dịch ethanol có nồng độ khác nhau (từ 70% đến 99%) và các dung dịch Technovit 7100, và được đúc khối trong dung dịch methyl methacrylate Technovit®7100 Mỗi
mô mang trong một khối sẽ được xoay 40ᵒ so với mô mang được đúc trước đó Khối này sẽ được cắt theo chiều dọc (vertical uniform random sections - VUR theo Baddeley và ctv, 1986) bằng máy cắt mẫu (microtorm) Tổng số 8-10 lát cắt (3 µm/lát cắt) sẽ được chọn trong một khối Các lát cắt được chọn sẽ được nhuộm với thuốc nhuộm Eosin & Haematoxylin trước khi khảo sát dưới kính hiển vi Bằng cách áp dụng phần mềm NewCast (VIS®, Olympus, Denmark), các thông số về thể tích và diện tích bề mặt hô hấp của mang được định lượng bằng hệ thống đếm điểm (Points counting system) và hệ thống đếm đoạn (test lines system) (Gundersen và ctv, 1988; Howard
và Reed, 1998; Michel và Cruz-Orive, 1988); khoảng cách khuếch tán trên mang được xác định theo Jensen và ctv (1979)
Thống kê: Phép kiểm định Two-way MANCOVA (Ramos và
ctv, 2012) được áp dụng để kiểm tra tác động có ý nghĩa thống
kê của các nhân tố nhiệt độ, oxy, ký sinh trùng lên các thông
số hô hấp trên mang Two-way ANOVA được áp dụng để kiểm định tác động có ý nghĩa thống kê của nhiệt độ và/hoặc oxy lên tăng trưởng của cá Tra thí nghiệm đồng thời so sánh
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức trong mỗi đợt thu mẫu
2.3 Nội dung 3: Khảo sát sự tương quan giữa các thông
số hô hấp trên mang và bong bóng khí với khối lượng của cá tra (P hypophthalmus)
Trang 9Cá thí nghiệm: P hypophthalmus, 4.5 ± 0.8 g (n=6); 24.3 ±
0.7 g (n=6); 276 ± 19 g (n=6); 703 ±41 g (n=4); 1760 ± 160 g (n=2); và 50.1±1.0 g (n=40)
Thiết kế thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Mang và bong bóng khí của cá Tra ở các
kích cỡ khác nhau: 5 ± 0.8 g (n=6); 24.3 ± 0.7 g (n=6); 276 ±
19 g (n=6); 703 ±41 g (n=4); 1760 ± 160 g (n=2) được thu cẩn thận và cố định trong formalin trung tính 4%, sau đó được xử
lý và phân tích theo phương pháp stereology như mô tả bên trên
Thí nghiệm 2: Hai nhóm cá (50.1±1.0 g; n=20) được
thuần ở 27°C và 33ᵒC với điều kiện normoxia trong thời gian
30 ngày Mang cá ở 2 nghiệm thức được thu (n=6) và xem như nhóm đối chứng Các mẫu mang này được cố định và phân tích bằng phương pháp stereology như mô tả bên trên Cá còn lại được sử dụng cho thí nghiệm bơi lội Mỗi cá thể cá được đặt vào máy kích thích bơi lội (Swimming respirometer, Loligo Systems, Tjele, Denmark) trong 16h, với tốc độ bơi 1BL/s (1 body length/s), sau đó tăng dần đến 5 BL/s Nước và không khí trong các khoang máy được tự động làm mới; nhiệt
độ và oxy trong nước được duy trì như điều kiện thuần cá ban đầu Nguyên lý hoạt động của máy được mô tả chi tiết trong Lefevre và ctv (2013) Thí nghiệm kết thúc trong khoảng 20h, sau đó mang cá được thu và xử lý theo phương pháp stereology
Thống kê: Phép phân tích thống kê hai nhân tố (Two-way
ANOVA) được áp dụng để kiểm định sự tác động có ý nghĩa của hoạt động bơi lội và nhiệt độ lên diện tích bề mặt hô hấp của mang; Phương pháp phân tích tương quan tuyến tính được
áp dụng để xác định sự tương quan của các thông số hô hấp trên mang và bong bóng khí với khối lượng cá
2.4 Nội dung 4: Khảo sát sự biến đổi cấu trúc mang lên
khả năng điều hòa axit-bazo ở cá Tra P hypophthalmus
Cá thí nghiệm: P hypophthalmus (400-500 g)
Thiết kế thí nghiệm: Hai nhóm cá (433±28 g, n=6) được
thuần trong các điều kiện oxy khác nhau: hypoxia (30% không
Trang 10khí bão hòa) và hyperoxia (>120% không khí bão hòa), trong 24h ở 30ᵒC Sau đó, cá trong mỗi nghiệm thức được gây mê và đút ống PE50 vào động mạch lưng như mô tả trong thí nghiệm
ở Nội dung 1 (Soivio et al., 1975) Cá sau khi đút ống được
phục hồi trong điều kiện thuần ban đầu Sau 24h, 3% khí CO2
(22mmHg) được sục vào các bể cá đã đút ống, và các mẫu máu lần lượt được thu sau 0, 4, 8, 18, và 24h Khi kết thúc thí nghiệm, mang cá được thu và xử lý theo phương pháp stereology như mô tả bên trên
Các chỉ tiêu sinh lý máu: PaCO2, pHe, Hct, [Na+], [Cl-], và áp suất thẩm thấu (ASTT)
Thống kê: Phép phân tích thống kê hai nhân tố có lặp lại
(Two-way repeated measures ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các lần thu mẫu cho mỗi thông số sinh lý máu
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng của các loại thuốc mê
thường dùng trong nuôi trồng thủy sản lên các thông số sinh lý máu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
Ngay sau thời điểm đút ống, sự acid hóa huyết tương xãy
ra đáng kể nhưng sau đó trở về giá trị bình thường kể từ thời
điểm 6 đến 24 giờ PCO2 trong động mạch cũng tăng lên trong thời điểm này đặc biệt ở nhóm cá gây mê bằng Benzocaine
(lên đến 6 mmHg) Trong quá trình phục hồi, PCO2 giảm còn 2.5 mmHg ở tất cả các nghiệm thức Ngay sau khi đút ống, [HCO3
-] của cá ở nghiệm thức MS-222 giảm nhưng chỉ số này phục hồi sau 6 giờ và ở mức 9 mmol l-1 Đồ thị Davenport cho
thấy trạng thái hô hấp của cá tra (P hypophthalmus) trong và
sau khi tiến hành gây mê ở 3 nghiệm thức, đồng thời cũng cho thấy sự giảm thấp của pHe ngay sau khi đặt ống gây ra sự acid hóa máu
Hiện có rất nhiều nghiên cứu về điều hòa acid/base và điều hòa ion trên nhiều loài cá hô hấp trong nước nhưng các nghiên cứu tương tự về các loài cá có thể hô hấp khí trời còn
Trang 11khá ít (Shartau và Brauner, 2014) Sự rối loạn điều hòa
acid/base gây ra tình trạng tăng PCO2 giảm pHe có thể xuất phát từ điều kiện môi trường bất lợi như hàm lượng oxy thấp
và CO2 cao cũng như khi cá hoạt động quá mức (Baker và ctv, 2009; Shartau và Brauner, 2014) Hô hấp trong không khí gắn
liền với sự tăng lên của PCO2 do sự khác nhau về khả năng hòa tan của CO2 trong nước và không khí (Dejours, 1981) Thêm vào đó, khả năng điều hòa pHe của cá hô hấp khí trời thường thấp, điều này có thể do sự tiêu giảm của mang và và giảm sự tuần hoàn máu qua các cung mang và cho thấy cần thiết phải có sự cân bằng giữa nhu cầu oxy hấp thu với khả năng trao đổi ion và điều hòa pH của cá hô hấp khí trời (Ishimatsu và Itazawa, 1983; Shartau và Brauner, 2014) Nghiên cứu này đã chứng tỏ khả năng điều hòa nhanh pHe trên
cá tra và điều này là đặc biệt đối với một loài cá hô hấp khí trời Đồng thời khả năng điều hòa nhanh acid/base trên loài cá này khi gây mê có thể được thực hiện giống như trên một loài
cá hô hấp hoàn toàn trong nước chẳng hạn như cá hồi
Trang 121
0h
6h 3h
3h 6h
72h
Hình 3.1 Biểu đồ Davenport: (a) Aqui-S, (b) MS222, và (c)
Benzocaine
3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự biến đổi hình thái của mang
và sự tăng trưởng của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) dưới tác động của điều kiện nhiệt độ cao và/hoặc hàm lượng
oxy thấp
Kết quả từ thí nghiệm này cho thấy diện tích bề mặt mang cá có sự biến đổi theo thời gian thí nghiệm, theo sự biến đổi của nhiệt độ và oxy trong môi trường nước (Hình 3.2A, B) Tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm ở 27ᵒC & normoxic, cá
có kích cỡ nhỏ (12.4±0.8 g) có diện tích bề mặt hô hấp của mang cao (212±22 mm2 g-1) Tuy nhiên, sau 5 tuần ở cùng điều kiện 27ᵒC, however, diện tích mang giảm mạnh còn 12.9±7.9
mm2 g-1 ở nhóm normoxia, và 4.9±2.3 mm2 g-1 ở nhóm hypoxia mặc dù không có khác biệt ý nghĩa thống kê giữa 2