NGHIÊN CỨU SỰ ỔN ĐỊNH CỦA CÁC VI KHUẨN E. coli, Salmonella, S. aureus, P. aeruginosa, C. perfringens, B. cereus TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN ĐÔNG SÂU

cereus trên các dung dịch bảo vệ khác nhau tôi đưa ra một số kết luận sau: Nhiệt độ bảo quản đông sâu cho các chủng vi khuẩn khảo sát là -700C trừ vi khuẩn S.. Mỗi phương pháp bảo quản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ ỔN ĐỊNH CỦA CÁC VI KHUẨN E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C perfringens, B cereus

TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN ĐÔNG SÂU

Sinh viên thực hiện : TRẦN THÙY TRANG Niên khóa : 2008 – 2012

Tháng 07/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ ỔN ĐỊNH CỦA CÁC VI KHUẨN E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C perfringens, B cereus

TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN ĐÔNG SÂU

KS TRẦN THỊ QUỲNH DIỆP

Tháng 07/2012

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp tôi luôn được sự giúp đỡ của các tổ chức, cá nhân Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả các quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3, phòng thử nghiệm vi sinh – GMO đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Phạm Vân An, CN Chu Nguyên Thanh, ThS Trần Thị Ánh Nguyệt cùng các chị trong phòng thử nghiệm vi sinh – GMO và KS Trần Thị Quỳnh Diệp đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn chu đáo trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn tập thể lớp DH08SH luôn chia sẻ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp

Và sau cùng, con xin cảm ơn Ba, Mẹ - người đã sinh ra, nuôi dưỡng và luôn giành cho con những lời động viên, an ủi khi gặp khó khăn Công ơn Ba, Mẹ con sẽ không bao giờ quên

Xin chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng 7 năm 2011

Trần Thùy Trang

TÓM TẮT

Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng rất đặc biệt, là nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trường Trong quá trình bảo quản, các tế bào vi sinh vật sẽ bị chết, vì vậy cần tìm ra phương pháp bảo quản tối ưu nhằm hạn chế thấp nhất khả năng chết của chúng Hiện nay, phương pháp bảo quản đông sâu được nghiên cứu nhiều trên thế giới, đạt kết quả khá khả quan nhưng ở Việt Nam chưa được nghiên cứu nhiều Sự ổn định khi bảo quản các chủng vi khuẩn qua một thời gian dài có ý nghĩa thực tiễn rất lớn đối với các phòng thử nghiệm vi sinh thực phẩm Vì thế,

đề tài: “Nghiên cứu sự ổn định các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella, S aureus, P

aeruginosa, C perfringens, B cereus trong điều kiện bảo quản đông sâu” được thực hiện

nhằm thiết lập quy trình bảo quản tối ưu cho các chủng vi khuẩn này

Sau khi tối ưu hóa quá trình đông sâu các yếu tố như nhiệt độ đông sâu, nhiệt độ rã

đông sẽ tiếp tục khảo sát sự ổn định lâu dài các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella, S aureus,

P aeruginosa, C perfringens, B cereus trên các dung dịch bảo vệ khác nhau tôi đưa ra một

số kết luận sau:

Nhiệt độ bảo quản đông sâu cho các chủng vi khuẩn khảo sát là -700C (trừ vi khuẩn S

aruginosa là skim milk 10%; đối với vi khuẩn E.coli là hỗn hợp skim milk 10% và 10%

glycerol; đối với vi khuẩn S aureus và B cereus dung dịch bảo quản thích hợp là skim milk 10% hay hỗn hợp skim milk 10% và glycerol 10%; còn đối với C perfringens được

bảo quản tốt trong môi trường nước mắm Sau khi bảo quản, các chủng vi khuẩn trêncó thể được rã đông tự nhiên ở điều kiện phòng thí nghiệm (25 - 270C)

SUMMARY

Thesis title “Research on the stability of the E coli, Salmonella, S aureus, P

aeruginosa, C perfringens and B cereus in deep-freezing storage condition”

Preservation of microorganism is the foundation for basic researches and applications relating to many fields such as: biology, medicine, agriculture and environment During the storage, the microbial cells maybe decrease of viability, so it’s necessary to find the suitable preservation method to reduce the mortality rate Stability of the bacteria after long time of preservation has great significance for the food testing laboratory in microbiology

Currently, preservation of bacteria by freezing has been studied in the world and has got quite expected results, but it is still not popular in Vietnam As the result, the thesis

"Research on the stability of the E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C

perfringens and B cereus in deep-freezing storage condition” was performed in order to

establish optimal preservation procedure for these bacterial strains

Optimization of some factors which affect the deep-freezing process such as temperature of deep-freezing and thawing as well as examining the long-term stability of the tested bacteria strains on the different preservation solutions, was done

The optimized deep – freezing temperature for most of tested bacteria strains was

-700C, except for S aureus of which the optimized deep – freezing temperature is -200C

The best preservation solution for Salmonella and P Aeruginosa was skim milk 10%; for

E.coli was the mixture of skim milk 10% and 10% glycerol; for S aureus and B cereus

was skim milk 10% or the mixture of skim milk 10% and glycerol 10%; in particularly for C perfringens was fish sauce After the preservation, thawing was be carried out

naturally in laboratory conditions (25 - 270C)

Key words: deep-freezing, glycerol, long-term stability, preservation, skim milk, thawing

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Vi khuẩn E coli 3

2.1.1 Giới thiệu chung 3

2.1.2 Phân loại khoa học 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 3

2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy 3

2.1.5 Đặc điểm sinh hóa 4

2.2 Vi khuẩn Salmonella 4

2.2.1 Giới thiệu chung 4

2.2.2 Phân loại khoa học 4

2.2.3 Đặc điểm hình thái 4

2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.2.5 Đặc điểm sinh hóa 5

2.2.6 Đặc điểm kháng nguyên của Salmonella 5

2.2.7 Đặc điểm sinh hóa 5

2.3 Vi khuẩn S aureus 6

2.3.1 Giới thiệu chung 6

2.3.2 Phân loại khoa học 6

2.3.3 Đặc điểm hình thái 6

2.3.4 Tính chất nuôi cấy 6

2.3.5 Tính chất sinh hóa 7

2.4 Vi khuẩn B cereus 7

2.4.1 Giới thiệu về vi khuẩn B cereus 7

2.4.2 Phân loại khoa học 7

2.4.3 Đặc điểm và tính chất nuôi cấy vi khuẩn B cereus 7

2.4.4 Đặc điểm sinh hóa 8

2.5 Vi khuẩn P aeruginosa 8

2.5.2 Giới thiệu chung 8

2.5.2 Phân loại khoa học 8

2.5.3 Đặc điểm vi khuẩn P aeruginosa 8

2.5.4 Tính chất nuôi cấy 8

2.5.5 Đặc điểm sinh hóa 9

2.6 Vi khuẩn C perfringens 9

2.6.1 Giới thiệu chung 9

2.6.2 Phân loại khoa học 9

2.6.3 Đặc điểm vi khuẩn C perfringens 10

2.7 Giới thiệu một số phương pháp bảo quản vi sinh vật 10

2.7.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 10

2.7.2 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng 10

2.7.3 Giữ giống vi sinh vật trên đất, cát và trên hạt 11

2.7.4 Bảo quản vi sinh vật bằng phương pháp đông khô 11

2.7.5 Phương pháp bảo quản đông sâu (hay lạnh sâu) 12

2.8 Tình hình nghiên cứu về việc bảo quản đông sâu các chủng vi khuẩn 13

2.8.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 13

2.8.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 15

3.2.2.1 Dụng cụ 15

3.2.2.2 Thiết bị 15

3.2.3 Môi trường sử dụng 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Phương pháp đếm mật số vi khuẩn 16

3.3.1.1 Pha loãng mẫu 16

3.3.1.2 Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa 16

3.3.1.3 Đếm vi khuẩn bằng phương pháp cấy trang 17

3.3.1.4 Cách tính kết quả khuẩn lạc 17

3.3.2 Phương pháp tối ưu hóa quá trình đông sâu các vi khuẩn 18

3.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đông sâu lên mật số vi khuẩn 18

3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ rã đông sau bảo quản lên mật số vi khuẩn 19

3.3.3 Phương pháp khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn trên các dung dịch bảo quản 20

3.3.4 Thử sinh hóa các vi khuẩn 22

3.3.4.1 Vi khuẩn S aureus 22

3.3.4.2 Vi khuẩn B cereus 23

3.3.4.3 Vi khuẩn C perfringens 23

3.3.4.4 Vi khuẩn P aeruginosa 24

3.3.4.5 Vi khuẩn Salmonella 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu các vi khuẩn 25

4.1.1 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu E coli 25

4.1.2 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu Salmonella 26

4.1.3 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu S aureus 27

4.1.4 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu B cereus 28

4.1.5 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu P aeruginosa 30

4.1.6 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu C perfringens 31

4.2 Khảo sát sự ổn định lâu dài các vi khuẩn trên các dung dịch bảo quản 32

4.2.1 Khảo sát sự ổn định vi khuẩn E coli 32

4.2.2 Khảo sát sự ổn định vi khuẩn Salmonella 33

4.2.3 Khảo sát sự ổn định vi khuẩn S aureus 33

4.2.4 Khảo sát sự ổn định vi khuẩn B cereus 34

4.2.5 Khảo sát sự ổn định vi khuẩn P aeruginosa 35

4.2.6 Khảo sát sự ổn định vi khuẩn C perfringens 35

4.2.6.1 Trên dung dịch bảo quản glycerol, đệm phosphate, skim milk 35

4.2.6.2 Trên dung dịch bảo quản nước mắm 36

4.3 Các thử nghiệm sinh hóa các vi khuẩn 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 44

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn E coli 25

Bảng 4.2 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn E coli 26

Bảng 4.3 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn Salmonella 26

Bảng 4.4 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn Salmonella 27

Bảng 4.5 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn S aureus 27

Bảng 4.6 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn S aureus 28

Bảng 4.7 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn B cereus 29

Bảng 4.8 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn B cereus 29

Bảng 4.9 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn P aeruginosa 30

Bảng 4.10 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn P aeruginosa 30

Bảng 4.11 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn C perfringens 31

Bảng 4.12 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn C perfringens 31

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi điện tử 3

Hình 2.2 Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi điện tử 4

Hình 2.3 Vi khuẩn S aureus dưới kính hiển vi 6

Hình 2.4 Vi khuẩn B cereus dưới kính hiển vi 7

Hình 2.5 Vi khuẩn P aeruginosa dưới kính hiển vi 8

Hình 2.6 Vi khuẩn C perfringens dưới kính hiển vi 9

Hình 3.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản 18

Hình 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ rã đông 19

Hình 3.3 Khảo sát sự ổn định lâu dài các vi khuẩn B cereus, E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa trên 4 dung dịch bảo quản 20

Hình 3.4 Khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn C perfringens trên 4 dung dịch bảo quản 21

Hình 3.5 Khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn C Perfringens trên môi trường nước mắm 22

Hình 3.6 Phản ứng đông huyết tương vi khuẩn S aureus 22

Hình 3.7 Các phản ứng sinh hóa của B cereus 23

Hình 3.8 Các phản ứng sinh hóa C perfringens 23

Hình 3.9 Các phản ứng sinh hóa P aeruginosa 24

Hình 3.10 Các phản ứng sinh hóa Salmonella 24

Hình 4.1 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài E coli trên 4 dung dịch bảo vệ 32

Hình 4.2 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài Salmonella trên 4 dung dịch bảo vệ 33

Hình 4.3 Khảo sát sự ổn định lâu dài S aureus trên 4 dung dịch bảo vệ 33

Hình 4.4 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài B cereus trên 4 dung dịch bảo vệ 34

Hình 4.5 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài P aeruginosa trên 4 dung dịch bảo vệ 35

Hình 4.6 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài C perfringens

trên 3 dung dịch bảo vệ 36

Hình 4.7 Biểu đồ khảo sát sự ổn định lâu dài C perfringen trên môi trường nước mắm 36

Hình 4.8 Vi khuẩn E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C perfringens , B cereus trên môi trường đặc trưng 38

Hình 4.9 Phản ứng đông huyết tương 38

Hình 4.10 Các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn Salmonella 39

Hình 4.11 Các thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn C perfringens 39

Hình 4.12 Các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn P aeruginosa 40

Hình 4.13 Các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn B cereus 40

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất và rất đa dạng về chủng loài Tuy nhỏ bé nhất trong sinh giới nhưng năng lực hấp thu và chuyển hóa của vi sinh vật vượt xa các sinh vật bậc cao và chúng có tốc độ tăng trưởng và sinh sôi nảy nở cực kì lớn Chúng đóng vai trò rất quan trọng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người Bên cạnh đó, vi sinh vật lại rất dễ bị thoái hoá nếu không được bảo quản đúng kỹ thuật Chính vì vậy, việc bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng rất lớn Đây là nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và các ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp, công nghiệp và môi trường Từ đó thiết lập nên bộ sưu tập vi sinh vật phục

vụ cho các hoạt động liên quan

Bảo quản ở đây không những duy trì khả năng sống của vi sinh vật, thuần chủng, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo tính ổn định di truyền và các đặc tính sinh học trong suốt quá trình bảo quản Nếu chúng ta không giữ được đặc tính ban đầu của vi sinh vật thì mọi thành quả thu được coi như là vô ích Vì vậy, trên thế giới nhiều nước đã chuẩn bị cho các khâu bảo quản giống mang tính tầm cỡ, thành lập các trung tâm, các bảo tàng giống vi sinh vật, các viện nghiên cứu

Hiện nay có nhiều phương pháp bảo quản vi sinh vật được sử dụng Mỗi phương pháp bảo quản vi sinh vật có những ưu nhược điểm riêng và được áp dụng đối với các chủng vi sinh vật thích hợp Việc lựa chọn phương pháp bảo quản còn phụ thuộc vào khả năng của từng phòng thử nghiệm, khả năng sống của từng giống và sự ổn định di truyền của nó Tuy nhiên phương pháp bảo quản vi sinh vật ở điều kiện đông sâu được nghiên cứu nhiều trên thế giới với kết quả khá khả quan nhưng Việt Nam chưa được nghiên cứu nhiều

Tại các phòng thử nghiệm vi sinh thực phẩm ở Việt Nam, phương pháp này được sử dụng để bảo quản các chủng vi sinh vật phục vụ cho công tác kiểm soát chất lượng Sự ổn định khi bảo quản các chủng vi khuẩn qua một thời gian dài có ý nghĩa thực tiễn rất lớn và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thiết lập bộ sưu tập chủng vi sinh vật hay phục vụ cho các hoạt động thường xuyên của phòng thử nghiệm Từ đó, nâng cao hiệu quả công

tác kiểm soát chất lượng, kiểm soát độ thu hồi của môi trường, kiểm soát quy trình thí nghiệm, kiểm tra tay nghề nhân viên, kiểm tra và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thử nghiệm (phát hiện các thông số giới hạn phát hiện, độ tái lập, độ lặp lại,…) nhằm đảm bảo kết quả thử nghiệm được chính xác

Hiện nay, số lượng vi sinh vật tương đối lớn, thời gian thực hiện đề tài ngắn nên chỉ

nghiên cứu trên các đối tượng chính là E coli, Salmonella, S aureus, P Aeruginosa, C

perfringens , B cereus Đây là các chủng vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong phòng

thử nghiệm

Xuất phát từ những lý do trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM và sự cho phép của Ban lãnh đạo Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3 hiện đề tài “Nghiên cứu sự ổn định các chủng

vi khuẩn E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C perfringens, B cereus trong

điều kiện bảo quản đông sâu” được tiến hành thực hiện

1.2 Yêu cầu

Thiết lập quy trình bảo quản tối ưu E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C

perfringens , B cereus ở điều kiện đông sâu đồng thời khảo sát sự ổn định của chúng qua

các mốc thời gian bảo quản lâu dài

1.3 Nội dung thực hiện

Tối ưu hóa quá trình đông sâu: khảo sát nhiệt độ bảo quản và nhiệt độ rã đông sau bảo quản của các chủng vi khuẩn khảo sát

Khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn trên các dung dịch bảo quản khác nhau: khảo

sát độ ổn định của E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C perfringens , B cereus

trong bảo quản đông sâu trên các dung dịch bảo quản khác nhau Thử nghiệm đặc tính

sinh hóa của các chủng

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn E coli

2.1.1 Giới thiệu chung

E coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện trong đường ruột của người và các loài

động vật máu nóng Hầu hết các dòng E coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng

trong việc ổn định sinh lý đường ruột (Trần Linh Thước, 2006)

2.1.2 Phân loại khoa học

E coli là vi khuẩn gram âm có hình que, hai đầu tròn, thường có tiêm mao mọc khắp

bề mặt, có khả năng di động, không có khả năng hình thành bào tử, có khả năng hình thành giáp mạc (vỏ nhày) khi gặp môi trường dinh dưỡng tốt, có kích thước dài ngắn khác nhau 2

– 3 µm x 0,5 µm (Lê Xuân Phương, 2008)

2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy

thích hợp nhất ở 370C và pH (7,2 – 7,4), phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường thạch thường có khuẩn lạc dạng S (nhẵn bóng, bờ đều), đôi khi hình thành khuẩn lạc dạng R (nhăn nheo) hoặc dạng M (nhày) Trên môi trường

lỏng, E coli làm đục môi trường sau 4 – 5 giờ Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA

Hình 2.1 Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi

điện tử (www.bioweb.uwlax.edu)

(Nutrient agar) hay TSA (Trypticase soy agar) tạo khóm tròn ướt màu trắng đục nếu để lâu khóm sẽ nhăn nheo Khóm có kích thước 2 - 3 mm

2.1.5 Đặc điểm sinh hóa

E.coli lên men đường lactose, có phản ứng Indole dương tính, VP âm tính, Methy

Red Voges-Proskauer dương tính, kiểm tra trên môi trường thạch simmon citrate âm tính (Lê Văn Việt Mẫn và Lại Mai Hương, 2011)

2.2 Vi khuẩn Salmonella

2.2.1 Giới thiệu chung

Salmonella thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột được phát hiện từ năm 1885 do

Salmon tại Mỹ Salmonella thường xuyên sinh sống trong đường ruột của người và một số

động vật Chúng gây ra các bệnh như sốt thương hàn, viêm ruột, nhiễm khuẩn huyết

2.2.2 Phân loại khoa học

Salmonella có hình gậy, ngắn mập, hai đầu tròn, kích thước 0,7 – 1,5 x 2 – 5 µm

Các loài khác thuộc giống đều có lông roi nên có thể chuyển động được (trừ loài Salmonella gallinarum không có lông roi) (Lê Văn Việt Mẫn và Lại Mai Hương, 2011)

2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy

Salmonella phát triển được ở các môi trường thông thường, mọc được ở điều kiện

hiếu khí hoặc kỵ khí nhưng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 370C và pH trung tính Các môi

trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS, BPLS,…Cường

độ và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi

trường cũng khác nhau

Hình 2.2 Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển

vi điện tử (www.upload.wikimedia.org)

Trên môi trường XLD khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen

Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bong rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc

Trên môi trường HE, khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen Một số dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc Trên môi trường BS khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím Môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau

đó khuẩn lạc chuyển thành đen nếu kéo dài thời gian ủ Trên môi trường BPLS khuẩn lạc

có màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển màu đỏ (Trần Linh Thước, 2006)

2.2.5 Đặc điểm sinh hóa

Vi khuẩn Salmonella có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và

mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S (Trần Linh Thước, 2006)

2.2.6 Đặc điểm kháng nguyên của Salmonella

Salmonella có 3 loại kháng nguyên Kháng nguyên O là kháng nguyên thân ở vách

tế bào vi khuẩn, bản chất là lipopolysaccharide, có tính kháng nguyên mạnh và đặc hiệu

Đây cũng chính là nội độc tố của Salmonella Kháng nguyên O của các chủng rất khác

nhau Kháng nguyên H là kháng nguyên lông của vi khuẩn, có bản chất là một protein kém chịu nhiệt, dễ bị phá hủy bởi cồn nhưng chịu được formalin 5% Kháng nguyên Vi là kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn, chúng bao bọc bề ngoài kháng nguyên O Vì vậy, chúng cản trở quá trình thực bào và ngăn chặn hoạt động của bổ thể Ở những chủng mà kháng nguyên Vi phát triển, nó thường ức chế quá trình ngưng kết của kháng nguyên O

Có 2 chủng có kháng nguyên Vi là S typhi và S paratyphi (Nguyễn Thị Chính và Trương

Thị Hòa, 2005)

2.2.7 Đặc điểm sinh hóa

Vi khuẩn Salmonella có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và

mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không

phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine trừ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S (Trần Linh Thước, 2006)

2.3 Vi khuẩn S aureus

2.3.1 Giới thiệu chung

S aureus là vi khuẩn phân bố khắp nơi, nhưng chủ yếu phân lập từ da, màng nhầy

của người và động vật máu nóng Đây là một vi khuẩn được xem là khá nguy hiểm vì chúng có khả năng sản xuất ra nhiều độc tố có thể làm cho người bị nhiễm dễ mắc bệnh

Một trong các bệnh liên quan đến vi khuẩn S aureus là viêm dạ dày ruột

2.3.2 Phân loại khoa học

S aureus có dạng hình cầu, gram dương, đường kính 0,5 – 1,5micromet, có thể

đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn hoặc từng chùm không đều nhau như chùm nho Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử

2.3.4 Tính chất nuôi cấy

S aureus không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp Theo Mc Landsborough L

(2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S aureus là 18 – 400C Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp cho quá trình tiết sắc tố ở vi khuẩn là 20 - 250C Trên môi trường đặc, S aureus tạo khuẩn lạc màu vàng Trên môi trường BP, khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có màu đen

nhánh, bóng, lồi, đường kính 1 – 1,5 mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc (Trần Linh Thước, 2006)

Hình 2.3 Vi khuẩn S aureus dưới kính hiển vi

vi điện tử (www.28.media.tumblr.com)

2.3.5 Tính chất sinh hóa

S aureus có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả

năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose Một số dòng có khả năng tan máu trên môi trường thạch máu Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩn lạc (Trần Linh Thước, 2006)

2.4 Vi khuẩn B cereus

2.4.1 Giới thiệu về vi khuẩn B cereus

B cereus cũng là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có mặt khắp nơi Vi khuẩn này có

khả năng gây viêm ruột (vi khuẩn S aureus cũng có khả năng gây viêm dạ dày ruột) Người

bị phơi nhiễm vi khuẩn có thể bị viêm ruột trong vòng 1 đến 6 giờ, và dẫn đến tiêu chảy, ói mửa, và đau bụng trong vòng 6 đến 24 giờ Ở Mĩ, cơm chiên được xem là một trong những

nguyên nhân hàng đầu của nhiễm vi khuẩn B cereus (Nguyễn Văn Tuấn, 2008)

2.4.2 Phân loại khoa học

2.4.3 Đặc điểm và tính chất nuôi cấy vi khuẩn B cereus

B Cereus là những trực khuẩn, Gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, di động,

tạo nội bào tử, tăng trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 500C, tối ưu ở 35 - 400C; pH dao động từ 4,5 - 9,3 dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng Trên môi trường chọn lọc loài này mọc khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn Trên môi trường MYP tạo khuẩn lạc khóm hồng, chung quanh có vòng sáng (Trần Linh Thước, 2009)

Hình 2.4 Vi khuẩn B cereus dưới kính

hiển vi (www.sciencephoto.com)

2.4.4 Đặc điểm sinh hóa

Vi khuẩn B cereus lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, không lên men mannitol, khử nitrat thành nitrit, phản ứng VP dương tính (+), phân giải tyrosin, catalase dương tính (+), citrat dương tính (+), mọc trên NB + 0,001% lysozyme

2.5 Vi khuẩn P aeruginosa

2.5.2 Giới thiệu chung

P aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ biến gây

bệnh ở động vật và con người Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới

2.5.2 Phân loại khoa học

2.5.3 Đặc điểm vi khuẩn P aeruginosa

Vi khuẩn P aeruginosa là trực khuẩn gram âm, hình que, kích thước 0,6 x 2 μm có

khả năng di động nhờ một tiêm mao đơn cực, không bào tử, đứng một mình hay thành đôi

hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn Đây là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối, nhưng P aeruginosa

có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu có NO3 làm chất nhận điện tử (Nguyễn Quốc Tuấn, 2009)

2.5.4 Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn hiếu khí, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang, nhiệt độ thích hợp 30 - 370C, nhưng có thể phát triển được ở 410C, pH thích hợp là 7,2 - 7,5 nhưng có thể phát triển được ở pH 4,5 - 9,0

Hình 2.5 Vi khuẩn P aeruginosa dưới

kính hiển vi (www.lisando.com)

Khuẩn lạc thường lớn, trong, bờ đều hoặc không đều, có thể có ánh kim loại, màu xám nhạt trên nền môi trường màu hơi xanh, mùi thơm (Hoàng Thế Hưng, 2010)

Một đặc điểm khác của P aeruginosa so với các loài Pseudomonas là sự sản xuất

sắc tố hòa tan gồm 2 loại là pyoverdine và pyocyanine Pyoverdine là sắc tố phát huỳnh quang màu xanh vàng khi được kích thích bởi bước sóng thấp hơn 260 nm Sắc tố này được tạo ra trong môi trường có nồng độ sắt thấp, dễ khuếch tán và có chức năng trong cơ chế trao đổi sắt của vi khuẩn Pyocyanine là sắc tố có màu xanh ở pH trung tính hay kiềm, màu đỏ trong môi trường acid Sắc tố này là yếu tố tạo màu xanh trong mủ xanh là đặc

tính gây bệnh bởi P aeruginosa (Trần Linh Thước, 2009)

2.5.5 Đặc điểm sinh hóa

Một số đặc tính sinh hóa chính của P aeruginosa như: không lên men glucose, có

khả năng thủy giải gelatin, tinh bột, khử nitrate (+), oxidase (+), ADC (+), khử nitrate (+),

sử dụng citrate (+), sử dụng malonate (+) (Trần Linh Thước, 2009)

2.6 Vi khuẩn C perfringens

2.6.1 Giới thiệu chung

Vi khuẩn C perfringens thường nhiễm thịt bò và thịt gà, vịt Vi khuẩn này có thể

sống sót ngay khi thực phẩm được nấu ở nhiệt độ 16 - 520C Người bị nhiễm vi khuẩn C

perfringens có thể bị tiêu chảy trong vòng 8 đến 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm

khuẩn (Nguyễn Văn Tuấn, 2008)

2.6.2 Phân loại khoa học

2.6.3 Đặc điểm vi khuẩn C perfringens

C perfringens là vi khuẩn hình gậy, ngắn, kích thước 1 – 1,5 x 3 – 8 µm, không

chuyển động, thuộc nhóm kỵ khí bắt buộc Bên ngoài thành tế bào vi khuẩn là bao nhầy

có bản chất hóa học là polysaccharide C perfringens tạo bào tử có hình bầu dục và nắm

ở gần một đầu tế bào hình gậy Nha bào của C perfringens dễ đề kháng với nhiệt độ (Lê

Văn Việt Mẫn và Lại Mai Hương, 2011; Trịnh Xuân Nhất, 2008)

2.7 Giới thiệu một số phương pháp bảo quản vi sinh vật

2.7.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết

2.7.2 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng

Phương pháp này được Lumiere và Chevrotier tìm ra năm 1914, ứng dụng các chủng dễ, như số lớn các vi khuẩn và nấm men cũng như tảo và nguyên sinh động vật Lúc đầu chỉ dùng với các chủng gây bệnh, ngày nay phương pháp này được dùng trong kỹ thuật vi sinh (Lương Đức Phẩm, 1998)

Giống trên môi trường thạch nghiêng thường được bảo quản ở 4 - 50C Ở điều kiện này vẫn xảy ra hiện tượng mất nước của môi trường làm cho môi trường khô dần và giống

có thể bị chết Để khắc phục hiện tượng khô môi trường người ta làm cách mặt thạch với không khí bằng một lớp dầu khoáng (parafin, vazơlin hoặc các chất keo y học) (Lương Đức Phẩm, 1998)

Môi trường được phủ một lớp dầu parafin dầy khoảng 10 mm Lớp dầu này làm cho nước không bay hơi nên các chất hòa tan không thay đổi, do đó áp lực thẩm thấu cũng không đổi nên không gây nguy hại đến đời sống của vi sinh vật Mặt khác, lớp dầu chỉ cho phép oxy của không khí thấm rất chậm vào môi trường và việc cấy lại chủng không kéo theo sự phá hủy chủng giống nguyên thủy Những chủng đã xử lý được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C và có thể bảo quản nhiều năm

Phương pháp giữ giống với dầu khoáng tương đối thuận tiện và cho kết quả tốt Giống dưới lớp dầu khoảng sau 12 tháng vẫn giữ được hình dáng bề ngoài bình thường Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi để giữ nhiều loại vi sinh vật: 73% chủng nấm mốc, 100% chủng xạ khuẩn, 80% chủng nấm men và 74% chủng vi khuẩn Bên cạnh đó,

có một số chủng giữ giống dưới lớp dầu khoáng không đạt yêu cầu như: Aetobacter,

Pseudomonas, Staphylococcus, Vibrio, Leuconostoc (Lương Đức Phẩm, 1998)

2.7.3 Giữ giống vi sinh vật trên đất, cát và trên hạt

Một số vi khuẩn và hầu hết nấm mốc, xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử Giữa bào tử của

vi khuẩn, bào tử của nấm mốc và xạ khuẩn có nhiều điểm khác nhau nhưng chúng có một tính chất gần giống nhau là ít chịu tác dụng của điều kiện bên ngoài Chính vì vậy, những bào tử đó có khả năng sống ở nhiều điều kiện khó khăn trong thời gian dài Người ta có thể ứng dụng đất, cát là môi trường nghèo dinh dưỡng để bảo quản bào tử vi sinh vật có kết quả rất tốt Có nhiều loại bào tử có khả năng sống tới 10 đến 20 năm (Lương Đức Phẩm, 1998)

2.7.4 Bảo quản vi sinh vật bằng phương pháp đông khô

Có hai phương pháp đông khô chủng giống: Đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp

Phương pháp đông khô vi sinh vật: Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái đông sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và

tế bào động vật (Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thanh, 2010)

Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp: Phương pháp này khác phương pháp trên

ở chỗ dịch huyền phù vi khuẩn được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống ở nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là: Tuổi của vi sinh vật bảo

quản, thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật, tốc độ đông khô thấp nhất, nhiệt độ

đông khô thấp nhất, khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu

Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu Thông thường theo phương pháp này, vi sinh vật được bảo quản từ 10 - 20 năm Nói chung, cả hai phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khác như thời gian bảo quản lâu hơn, tiết kiệm được công sức, giảm sai sót nhãn mác và tạp nhiễm Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất phương pháp này là giá thành thiết bị Độ ổn đinh của các chủng vi sinh vật theo các đợt đông khô là khác nhau Hơn thế nữa, các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hóa trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các

đặc tính sinh học

2.7.5 Phương pháp bảo quản đông sâu (hay lạnh sâu)

Phương pháp bảo quản đông sâu là phương pháp vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ đông sâu (-1960

C -> -200C) Trong trường hợp giữ giống ở nhiệt độ 4 - 60C bình thường thì không tránh khỏi sự phân chia tế bào Sự phân chia tế bào chỉ dừng lại ở trường hợp lạnh đông hoặc sấy khô

Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như

nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut

Tuy nhiên, với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước đá trong tế bào Vì vậy, để khắc phục nhược điểm này, trước khi làm đông sâu ta trộn sinh khối của giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ (hay còn gọi là dung dịch nhũ hoá) như glycerin 15%, huyết thanh ngựa, dung dịch glucose, lactose 10% hay skim milk 10% Để hạn chế việc vi sinh vật

có thể bị chết, ngoài dung dịch bảo quản trên cần phải quan tâm đến các thông số như: nhiệt độ bảo quản (-200C, -700C,…), nhiệt độ rã đông (nhiệt độ phòng 25 – 270C, 370C), tuổi vi sinh vật bảo quản (chủng bảo quản là các chủng trưởng thành nhưng già)

Việc bảo quản theo phương pháp đông sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau Ở mức nhiệt độ cao hơn -300C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối

cao sinh ra từ các chất điện giải Với phương pháp này cũng cấy truyền và làm lại, nhưng thời gian giữa các lần cấy truyền kéo dài hơn so với phương pháp giữ giống trên thạch ở điều kiện bảo quản bình thường Không nên làm đông lạnh và làm tan băng nhiều lần, như vậy sẽ làm giảm sức sống của chủng bảo quản Phương pháp này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut Đặc biệt, phương pháp bảo quản đông sâu trong nitơ lỏng cho hiệu quả rất cao Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn , nấm sợi, nấm men, virut, tảo và các dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp này cũng

có một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro cháy

nổ Đặc biệt, phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung, phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quý mà không thích hợp với phương pháp đông khô (Lê Gia Hy và Khuất

Hữu Thanh, 2010)

2.8 Tình hình nghiên cứu về việc bảo quản đông sâu các chủng vi khuẩn

2.8.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Tanguay (1958) nghiên cứu sự bảo quản vi khuẩn khảo sát bằng cách đông lạnh trực

tiếp Tanguay tiến hành bảo quản các chủng vi khuẩn lactobacillus leichmannii,

streptococcus faecalis, Saccharomyces carlsbergensis, leuconostoc mesenteroides, Acetobacter suboxydans, Lactobacillus casei, Micrococcus Pyogenes var aureus trong

dung dịch đệm phosphate với 15% glycerol và một số thành phần phụ khác, ở -400C Nghiên cứu cho thấy việc bảo quản đông sâu có thêm acetone không thành công Khả năng sống tốt nhất được quan sát bởi sự làm lạnh chậm (15 đến 30 phút) như đề nghị của Meryman (1956) Hầu hết các vi khuẩn này có thể sống trong 1 năm hoặc có thể kéo dài

đến 2 năm (ngoài trừ vi khuẩn Lactobacillus casei)

Hollander và Nell (1954) nghiên cứu “Cải thiện quá trình bảo quản đông sâu

Treponema pallidum và các vi khuẩn khác với glycerol” Hollander và Nell (1954) tiến hành

khảo sát 2 dung dịch bảo quản, và nồng độ % glycerol khi bảo quản cũng như nhiệt độ bảo

quản trên vi khuẩn E coli và Diplococcus pneumonia, Treponema pallidum thì thấy các vi

khuẩn này bảo quản tốt nhất trong dung dịch glycerol 15%, ở -700C

Cody và ctv (2008) nghiên cứu đề tài “Nâng cao chất lượng bảo quản các chủng vi khuẩn ở điều kiện đông sâu -800C bằng skim milk” Khi bảo quản các vi khuẩn

Streptococcus pyogenes, Campylobacter jejuni, Borrelia burgdorferi, Salmonella enterica

subsp enterica serovar typhimurium, P aeruginosa và E coli trên 2 dung dịch bảo quản

skim milk 10% và glycerol 15%, ở -800C nhận thấy sau bảo quản mật độ các vi khuẩn trong glycerol 15% giảm xuống nhanh chóng so với khi bảo quản trong skim milk 10%

2.8.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2011, Ngô Thị Minh Phương thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp bảo

quản nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger và vi khuẩn Acetobacter xylinum” Sau khi bảo quản nấm men, nấm mốc, vi khuẩn phương pháp đông

sâu ở -200C với các dung dịch bảo vệ lactose, glucose, glycerol 15%, saccarose, skim milk 10% và trong môi trường bình thường không có chất bảo vệ Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp bảo quản tốt nhất đối với nấm men là glycerol 15%, skim milk 10%, đối với nấm mốc là lactose, glycerol 15% và skim milk 10%, đối với vi khuẩn là glycerol 15%

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2012 – 06/2012 tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn chất lượng đo lường 3 – Địa chỉ: Số 7, đường số 1, Khu Công nghiệp Biên Hòa 1, tỉnh Đồng Nai

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn: E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C perfringens ,

B cereus được cung cấp bởi Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3

Máy vortex (Labnet)

Máy ly tâm lạnh Mikro 200R (Hettich

Môi trường MYP (MERCK)

Môi trường Pseudomonas (MERCK)

Huyết tương thỏ (MERCK)

(MERCK)

Môi trường lactose- gelatin (MERCK)

(MERCK) (MERCK)(MERCK)

(MERCK)Môi trường L-Lysine decarboxylation (MERCK)

Ure (MERCK), cồn 70%, cồn 96%

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp đếm mật số vi khuẩn

3.3.1.1 Pha loãng mẫu

Sử dụng các chuỗi ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng đệm phosphate đã được hấp khử trùng

Dùng pipette hút ra 1 ml từ ống chứa dịch khuẩn ban đầu cho vào trong ống chứa 9

ml dung dịch pha loãng đầu tiên, lắc kỹ ống nghiệm chứa mẫu Dùng một pipptte mới hút

1 ml mẫu từ ống pha loãng thứ 1 sang ống pha loãng thứ 2 Thực hiện lại thao tác như trên với các độ pha loãng tiếp theo Cứ tiếp tục như vậy cho đến khi đạt được độ pha loãng mong muốn Mỗi độ pha loãng chỉ được phép sử dụng 1 pipette

3.3.1.2 Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa

Đếm khuẩn lạc E coli: môi trường PCA sau khi hấp khử trùng được làm mát trong

tủ 450C Dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển 1 ml dịch chứa giống vi sinh vật đĩa petri vô trùng Mỗi độ pha loãng thường được cấy vào hai đĩa petri (sử dụng các pipette sạch cho mỗi độ pha loãng) Chỉ chọn cấy vào đĩa petri những độ pha loãng có mật độ vi sinh vật phù hợp, thường trong khoảng 25 - 300 tế bào/ml Đổ vào mỗi đĩa đã cấy 15 – 20

ml môi trường đã được đun chảy và làm nguội vào đĩa Xoay đĩa cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ khoảng 5 - 6 lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và đợi cho đến khi môi trường trong đĩa đông đặc Sau đó, lật ngược đĩa và ủ trong nhiệt độ 370C, 24 giờ

Đếm khuẩn lạc C Perfringens: đối với vi khuẩn C perfringens sử dụng môi trường

TSC Đổ vào đĩa 1 lớp mỏng (5 – 10 ml) môi trường TSC và dàn đều, để thạch đông lại Cấy 1 ml mẫu ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa Đổ 1 lớp mỏng TSC (15 – 20 ml) vào đĩa

và xoay đều đĩa Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và đợi cho đến khi môi trường trong đĩa đông

đặc Lật ngược đĩa, ủ trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ 350C, 20 giờ Chọn các khuẩn lạc đen từ 25 - 300 tế bào/ml

3.3.1.3 Đếm vi khuẩn Salmonella, S aureus, P aeruginosa, B cereus bằng phương

pháp cấy trang

Chuẩn bị môi trường chọn lọc của các vi khuẩn: việc đổ đĩa được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Rót mỗi đĩa một lượng môi trường thích hợp sao cho bề dày đạt khoảng 3 -

4 mm (Salmonella môi trường XLD, S aureus môi trường BP, P aeruginosa môi trường

Pseu, B cereus môi trường MYP) Sau đó đặt nắp lên đĩa , để yên đĩa cho đến khi thạch

đông lại Đĩa được giữ ở nhiệt độ thường trong tủ cấy hoặc giữ trong tủ lạnh đến khi dùng Trong trường hợp giữ trong tủ lạnh, khe giữa hai nắp của đĩa môi trường cần được dán kín bằng băng keo hoặc bằng màng parafin để tránh mất nước làm khô môi trường Khi sử dụng bề mặt thạch bị ướt có thể được làm khô để tránh hiện tượng vi sinh vật mọc loang bằng cách ủ trong tủ ấm ở 30 – 400C

Sau đó, dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thủy tinh vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa để khử trùng Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch Trong khi trải xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, ủ ở nhiệt độ và

thời gian thích hợp trong tủ ấm (Salmonella, S aureus, P aeruginosa, B cereus ở 370C,

24 giờ) Đếm các đĩa khoảng 25 - 300 khuẩn lạc đặc trưng (khuẩn lạc E.coli có màu xanh lơ; khuẩn lạc S aureus có hình tròn, xám đen đến đen, lồi, đường kính khoảng 2 – 3 mm,

có vòng phân dải không màu bao quanh, khuẩn lạc Salmonella

quầng trong sáng, hơi đỏ; khuẩn lạc B cereus có màu hồng)

3.3.1.4 Cách tính kết quả khuẩn lạc

d n n

V

C X

2

Trong đó:

X: số khuẩn lạc trong 1 ml (0,1 ml) dịch khuẩn

C: tổng số khuẩn lạc đếm được ở đĩa trên 2 nồng độ liên tiếp

n1: số đĩa đếm ở độ pha loãng thứ nhất

n2: số đĩa đếm ở độ pha loãng thứ hai

d: độ pha loãng ứng với độ pha loãng đầu tiên để đếm khuẩn lạc

V: thể tích cấy (1 ml hay 0,1 ml)

3.3.2 Phương pháp tối ưu hóa quá trình đông sâu các vi khuẩn B cereus, E coli,

Salmonella, S aureus, P aeruginosa, C perfringens

3.3.2.1 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đông sâu lên mật số

vi khuẩn

Hình 3.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản

Quy trình thực hiện:

- Các chủng giống vi khuẩn được tăng sinh 24 giờ trong môi trường TSB (trừ vi

khuẩn C perfringens tăng sinh trong môi trường thioglycollate

- Đếm mật số vi khuẩn trước đông sâu trong ống tăng sinh

- Hút 1 ml dịch vi khuẩn đã tăng sinh vào tube, đem ly tâm và rửa lại bằng đệm phosphate Sau đó, chuyển 1 ml từ tube sang 84 ml đệm phosphate và bổ sung 15 ml glycerol vào

- Phân phối dịch khuẩn vào các 18 tube (Sử dụng máy lắc trong suốt quá trình)

- Bảo quản 9 tube ở nhiệt độ bảo quản -200C, 9 tube ở -700C

- Kiểm tra mật độ sống sót của vi khuẩn sau 1, 2, 3 tuần, mỗi lần kiểm tra đồng thời

3 tube nhiệt độ -200C, và 3 tube -700C (Rã đông ở nhiệt độ phòng thử nghiệm, khoảng từ (25 - 270C)

- So sánh mật độ sau bảo quản và trước bảo quản để rút ra được nhiệt độ tối ưu của mỗi vi khuẩn

3.3.2.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ rã đông sau bảo quản đông sâu lên mật số vi khuẩn

- Quá trình thực hiện như 3.3.2.1, nhưng tiến hành bảo quản ở -700C và sau bảo quản khảo sát ở 2 cách rã đông: rã đông ở 370C và rã đông ở nhiệt độ phòng thử nghiệm (25 - 270C)

Hình 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ rã đông

3.3.3 Phương pháp khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn trên các dung dịch bảo quản

- Các chủng giống vi khuẩn được tăng sinh 24 giờ trong môi trường TSB (trừ vi

khuẩn C perfringens tăng sinh trong môi trường Thioglycollate)

- Đếm mật độ mỗi vi khuẩn trước đông sâu trong ống tăng sinh

Các vi khuẩn B cereus, E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa bảo quản đông

sâu trên các dung dịch: glycerol 15%, đệm phosphate, skim milk 10%, hỗn hợp skim milk

10% và glycerol 10%, còn C perfringens bảo quản trên glycerol 15%, đệm phosphate,

skim milk 10%, môi trường nước mắm ở -700C, môi trường nước mắm ở nhiệt độ thường

 Đối với B cereus, E coli, Salmonella, S aureus, P aeruginosa phương pháp

tiến hành như sau:

Hình 3.3 Khảo sát sự ổn định lâu dài các vi khuẩn B cereus, E coli,

Salmonella, S aureus, P aeruginosa trên 4 dung dịch bảo quản

- Chuyển 1 ml dịch khuẩn tăng sinh sang 99 ml skim milk 10%

- Chuyển 1 ml dịch khuẩn tăng sinh sang 89 ml skim milk 10%, bổ sung 10ml glycerol (skim milk 10% và glycerol 10%)

- Đối với mỗi trường hợp, phân phối dịch khuẩn vào các 36 tube 1,5 ml (Sử dụng máy lắc trong suốt quá trình)

- Bảo quản các tube ở nhiệt độ bảo quản tối ưu.(ở mục 3.3.1.1)

- Sau mỗi tuần thực hiện rã đông các tube ở nhiệt độ tối ưu và kiểm tra đồng thời mỗi trường hợp trong 3 tube

- So sánh tỷ lệ vi khuẩn sống sót của mỗi trường hợp trên sau khi bảo quản và trước khi bảo quản để xác định môi trường bảo quản thích hợp

 Bảo quản C perfringens được tiến hành như sau:

- Chuẩn bị các tube bảo quản trên glycerol 15%, đệm phosphate, skim milk 10%

được thực hiện như quy trình chuẩn bị các vi khuẩn B cereus, E coli, Salmonella, S

aureus, P aeruginosa Bảo quản các tube ở nhiệt độ bảo quản tối ưu (ở mục 3.3.1.1)

Hình 3.4 Khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn C perfringens trên 4 dung dịch bảo quản

- Từ môi trường nước mắm có vi khuẩn C perfringens phân phối vào 72 tube 1,5 ml

Trong đó, 36 tube bảo quản ở -700C, 36 tube bảo quản ở nhiệt độ phòng (25 - 270C)

- Sau mỗi tuần thực hiện rã đông các tube ở nhiệt độ tối ưu và kiểm tra đồng thời mỗi trường hợp trong 3 tube

- So sánh tỷ lệ vi khuẩn sống sót của mỗi trường hợp trên sau khi bảo quản và trước khi bảo quản để xác định môi trường bảo quản thích hợp

Hình 3.5 Khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn C perfringens trên môi trường nước mắm

3.3.4 Thử sinh hóa các vi khuẩn

3.3.4.1 Vi khuẩn S aureus

Hình 3.6 Phản ứng đông huyết tương vi khuẩn S aureus

3.3.4.4 Vi khuẩn P aeruginosa

Hình 3.9 Các phản ứng sinh hóa P aeruginosa 3.3.4.5 Vi khuẩn Salmonella

Hình 3.10 Các phản ứng sinh hóa Salmonella

Các số liệu được phân tíc bằng chương trình Microsoft Office Excel và MSTATC

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu các vi khuẩn E coli, Salmonella,

S aureus, P aeruginosa, C perfringens , B cereus

Quá trình bảo quản các vi khuẩn trong điều kiện đông sâu phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như nhiệt độ đông sâu, nhiệt độ rã đông, dung dịch bảo quản Vì vậy, để xây dựng được quy trình bảo quản vi khuẩn ở điều kiện đông sâu ổn định nhất trước tiên cần khảo sát nhiệt độ đông sâu, nhiệt độ rã đông tìm ra được các yếu tố tối ưu

4.1.1 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu vi khuẩn E coli

Chuẩn bị dịch khuẩn E coli trong các ống 1,5 ml, tiến hành bảo quản ở -700C,

-200C Sau mỗi tuần kiểm tra mật số vi khuẩn sống sót ở 2 điều kiện trên Kết quả thu được sau 3 tuần được thể hiện trong bảng 4.1

Bảng 4.1 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn E coli

Nhiệt độ đông

sâu

Mật số vi khuẩn sau thời gian bảo quản (106 CFU/ml) ± SD

Trung bình

-200C 6,9 ± 0,35 Aa 5,6 ± 0,50 Bbc 3,0 ± 0,26 Cd 2,2 ± 0,31 Cd 4,43 -700C 6,9 ± 0,35 Aa 6,1 ± 0,44 Bab 5,0 ± 0,20 Bc 4,9 ± 0,25 Bc 5,73

Các giá trị có kí tự thường (trong bảng) và kí tự hoa (trong cùng một hàng) theo sau khác nhau biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05)

Từ kết quả ở bảng 4.1 cho thấy mật số vi khuẩn sau bảo quản giảm xuống đáng kể

so với trước khi bảo quản Trong cả 2 điều kiện nhiệt độ bảo quản, mật số vi khuẩn ban đầu là 6,9 x 106

CFU/ml, nhưng sau mỗi tuần kiểm tra thì mật số vi khuẩn sống sót ở

-700C đều lớn hơn khi bảo quản ở -200C Sau 3 tuần mật số vi khuẩn khi bảo quản ở -700C, -200C lần lượt là 4,9 x 106 CFU/ml; 2,2 x 106 CFU/ml Từ kết quả đó cho thấy điều kiện

bảo quản thích hợp của E coli là ở -700C Vì vậy, tiến hành khảo sát sự ổn định lâu dài

của E coli ở điều kiện bảo quản -700C

Sau khi bảo quản dịch khuẩn ở -700C, tiến hành kiểm tra đồng thời mật độ vi khuẩn

được sau 3 tuần kiểm tra thể hiện ở bảng 4.2

Bảng 4.2 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn E coli

Nhiệt độ rã

đông

Mật số vi khuẩn sau thời gian bảo quản (106 CFU/ml) ± SD

Trung bình

370C 11 ± 0,58Aa 9,1 ± 0,21 Bcd 8,7 ± 0,21Bd 7,6 ± 0,15 Ce 9,10 Nhiệt độ

370C, nhiệt độ phòng lần lƣợt là 7,6 x106 CFU/ml,9,1 x 106 CFU/ml Nhƣ vậy, sau thời

gian bảo quản vi khuẩn E coli thực hiện rã đông ở phòng thí nghiệm

4.1.2 Tối ƣu hóa quá trình bảo quản đông sâu vi khuẩn Salmonella

Chuẩn bị dịch khuẩn Salmonella trong các ống 1,5 ml, tiến hành bảo quản ở -700C,

-200C Sau mỗi tuần kiểm tra mật độ vi khuẩn sống sót ở 2 điều kiện trên Kết quả thu đƣợc

sau 3 tuần đƣợc thể hiện trong bảng 4.3

Bảng 4.3 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn Salmonella

Nhiệt độ đông

sâu

Mật số vi khuẩn sau thời gian bảo quản (106 CFU/ml) ± SD

Trung bình

-200C 47 ± 1,15 Aa 15 ± 0,58 Bc 6,4 ± 0,36 Ce 1,1 ± 0,05 Df 17,38 -700C 47 ± 1,15 Aa 32 ± 1,15 Bb 16 ± 0,58 Cc 9,6 ± 0,31 Dd 26,15

Các giá trị có kí tự thường (trong bảng) và kí tự hoa (trong cùng một hàng) theo sau khác nhau biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05)

Dựa vào kết quả thu đƣợc ở bảng 4.3 cho thấy vi khuẩn Salmonella thích hợp khi tiến

hành bảo quản ở -700C Sau mỗi tuần kiểm tra mật số sống sót vi khuẩn Salmonella ở điều

kiện nhiệt độ bảo quản, mật số vi khuẩn ban đầu là 4,7 x107 CFU/ml Sau 3 tuần mật số vi khuẩn khi bảo quản ở -700C, -200C lần lƣợt là 4,9 x106 CFU/ml, 1,1 x106 CFU/ml Vì vậy,

0

Sau khi bảo quản dịch khuẩn Salmonella ở -700C, tiến hành kiểm tra đồng thời mật

độ vi khuẩn sống sót ở 2 điều kiện rã đông: 370C và nhiệt độ phòng (25 - 270C) Kết quả thu được sau 3 tuần kiểm tra thể hiện ở bảng 4.4

Bảng 4.4 Khảo sát nhiệt độ rã đông vi khuẩn Salmonella

Nhiệt độ rã

đông

Mật số vi khuẩn sau thời gian bảo quản (107 CFU/ml) ± SD

Trung bình

370C 8,6 ± 0,21Aa 5,9 ± 0,21Bc 2,1 ± 0,23Ce 1,7 ± 0,12Ce 4,58 Nhiệt độ

Kết quả thể hiện ở biểu đồ 4.4 cho thấy vi khuẩn Salmonella không bị ảnh hưởng

nhiều bởi 2 điều kiện rã đông Mật độ vi khuẩn có giảm nhưng giảm không đáng kể Tuy nhiên, rã đông ở nhiệt độ phòng mật độ vi khuẩn giảm ít hơn khi rã đông ở 370C (Trước bảo quản mật độ vi khuẩn 8,6 x 107 CFU/ml; sau 3 tuần bảo quản -700C: rã đông ở 370C mật độ vi khuẩn 1,7 x 107 CFU/ml, rã đông ở nhiệt độ phòng mật độ vi khuẩn 2,0 x 107

CFU/ml) Nên khi khảo sát sự ổn định lâu dài vi khuẩn Salmonella, thực hiện rã đông ở

nhiệt độ phòng

4.1.3 Tối ưu hóa quá trình bảo quản đông sâu vi khuẩn S aureus

Chuẩn bị dịch khuẩn S aureus trong các ống 1,5 ml, tiến hành bảo quản ở -700C, - 200C Sau mỗi tuần kiểm tra mật độ vi khuẩn sống sót ở 2 điều kiện trên Kết quả thu được sau 3 tuần được thể hiện trong bảng 4.5

Bảng 4.5 Khảo sát nhiệt độ đông sâu vi khuẩn S aureus

Nhiệt độ đông

sâu

Mật số vi khuẩn sau thời gian bảo quản (105 CFU/ml) ± SD

Trung bình

-200C 60 ± 2,08Aa 54 ± 2,52Bb 35 ± 0,58Cc 29 ± 1,73Dd 44,50 -700C 60 ± 2,08Aa 29 ± 2,08Bd 8 ± 0,21Ce 6,8 ± 0,31Ce 25,95

Các giá trị có kí tự thường (trong bảng) và kí tự hoa (trong cùng một hàng) theo sau khác nhau biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05)

Qua kết quả ở bảng 4.5 cho thấy mật số vi khuẩn S aureus sau bảo quản giảm theo

thời gian Sau mỗi tuần kiểm tra mật số vi khuẩn sống sót nhận thấy sự khác biệt rõ rệt khi