THIẾT LẬP QUI TRÌNH TÁI SINH CÂY IN VITRO VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN VÀO CÂY CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM) THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUI TRÌNH TÁI SINH CÂY IN VITRO VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN VÀO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUI TRÌNH TÁI SINH CÂY IN VITRO VÀ KHẢO

SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN VÀO CÂY CÀ CHUA

(LYCOPERSICON ESCULENTUM) THÔNG QUA

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN XUÂN TUẤN Niên khóa : 2008 – 2012

Tháng 07/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUI TRÌNH TÁI SINH CÂY IN VITRO VÀ KHẢO

SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN VÀO CÂY CÀ CHUA

(LYCOPERSICON ESCULENTUM) THÔNG QUA

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

ThS TRẦN THỊ THU HÀ

Tháng 07/2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, tôi xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường và tất cả các cán bộ của Viện đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cô Võ Thị Thúy Huệ và cô Trần Thị Thu Hà đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý báu

Thầy Bùi Minh Trí vì những hỗ trợ vật chất và tinh thần quý báu trong một thời gian dài

Con bày tỏ lòng biết ơn đối với Cha Mẹ về sự chăm sóc, động viên và lòng kiên nhẫn

Các bạn Thư, Hiền, Quyết, Tài, Trang, em Nhãn cùng các anh chị trong phòng Công nghệ Thực vật đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp

Cuối cùng tôi mong muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả các thành viên lớp DH08SH, những người đã cùng tôi chia sẻ những niềm vui và cả những khó khăn trong học tập

TÓM TẮT

Đề tài “Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và khảo sát khả năng chuyển nạp gen vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum) thông qua Agrobacterium

tumefaciens” được thực hiện nhằm tạo cơ sở cho việc chuyển gen về sau

Các thí nghiệm được tiến hành để xác định quy trình khử trùng mẫu hạt thích hợp, theo dõi khả năng tái sinh chồi và khả năng thu nạp gen ngoại lai của mẫu lá và đốt thân trên hai giống cà chua (F1Fn576 và Nicola F1NT538) được cung cấp bởi công

ty giống Trang Nông

Kết quả cho thấy quy trình khử trùng bề mặt bằng ethanol (700) trong thời gian

90 giây Ngâm hạt trong dung dịch sodium hypochlorite 5,25% trong 90 giây (lặp lại 3 lần) cho hiệu quả tốt nhất đạt 100% không bị nhiễm nấm khuẩn, 74,12% số hạt nảy mầm

Chồi tái sinh từ callus của đốt thân và lá được điều khiển bởi sự kết hợp giữa nồng độ kinetin và giống Quy trình tốt nhất để tái sinh chồi được ghi nhận trên giống

cà chua F1Fn576 và môi trường MS bổ sung 1 mg/l kinetin + 1 mg/l IAA Với mẫu lá

tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 78,87% và 4 chồi/mẫu, còn trên mẫu đốt thân tỉ lệ này đạt 37,77% và 0,24 chồi/mẫu (ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy) Môi trường hiệu quả cho việc nhân chồi ở đốt thân sau 4 tuần quan sát là MS + 1mg/l BA (2,2 chồi/cụm chồi, đạt chiều dài chồi là 3,13 cm) Các chồi khỏe mạnh được đem tạo rễ trên môi trường

MS đạt 27 rễ/mẫu và chiều dài rễ đạt 3,49 cm

Nồng độ PPT 0,3 mg/l dùng cho chọn lọc mẫu đốt thân, 0,4 mg/l dùng chọn lọc

mẫu lá cây cà chua chưa chuyển gen Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens GV3580 mang plasmid pGII0229 (gồm các gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin, gen chỉ thị gusA, promoterpoly–A và terminator CaMV 35S) được

sử dụng để chuyển vào cây cà chua Bước đầu ghi nhận kết quả biểu hiện của gen

gusA được chuyển vào genome của cây, hiệu quả chuyển gen đạt 100% ở lá và 71% ở

đốt thân khi ủ trong dịch khuẩn thời gian 15 phút, nồng độ acetosyringone là 100 µM

SUMMARY

The thesis "Establishment of in vitro regenneration and assessment for result gene transfer into Lycopersicon esculentum via Agrobacterium tumerfacient" was

carried out to provide the basis for transgenic research in the future

In this study, the internode and leaf explants from seeding of two commercially grown such as F1Fn576 and Nicola F1NT5385 obtained from Trang Nong seed company were used

For surface sterilization of L Esculentum seeds, ethanol 70% and NaOCl 5%

were used Seeds were surface-sterilized in ethanol 70% for 90 seconds and rinsed three times with autoclaved distilled water After that, seeds were treated in NaOCl 5% for 90 seconds (repeated three times) and rinsed three times with autoclaved distilled water With this sterilization protocol, the highest rate of aseptic cultures (100%) and sprouts (74%) were achived

Shoot regenration from internode and leaf-derived callus was genrally influenced by a combination of kinetin and variety After four weeks, the highest number of shoots from internode and leaf explants were obtained on MS medium supplemented with 1 mg/l IAA in combination with 1 mg/l kinetin using F1Fn576 variety (78.87% of regenra callus, 4 shoots/explant forinternode explants and 37.77%

of regenracallus, 0.24 shoots/explant for leaf explants) Effective adventitious shoot multilication rate of internode explants was achieved on MS medium supplemented with 2 mg/l BA (2.2 shoots/explant) Regenrated shoots were cut off and placed onto root induction media for rooting About 27 shoots with 3.49 cm in aproximate length were successfully produced on MS medium

We used 1 mg/l of PPT for selection of transformative internode and 1.5 mg/l

of PPT for selection of transformative leaf

Agrobacterium tumefaciens strain GV3580, harboring a binary vector

pGII0229 (containing Trgus cp148 luc carrying β-glucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos resistance (bar) gene with

nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator) was used to assess transformation

efficiency in L esculentum The result of expression of gusA gene was observed, the

internode and leaf explants produced the highest frequency of transformation (100%

in leaf explants and 71% in internode explants) when co-incubated in Agrobacterium

suspension for 15 minutes with 100 µM of acetosyringone

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT i

SUMMARY ii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ viii

DANH SÁCH BẢNG viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về cây cà chua 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc của cà chua 3

2.1.3 Đặc tính thực vật 3

2.1.4 Điều kiện sinh trưởng 4

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng cây cà chua 5

2.1.6 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và trong nước 6

2.2 Sự tái sinh in vitro 7

2.2.1 Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật 7

2.2.2 Ý nghĩa của sự tái sinh trong quy trình chuyển nạp gen 7

2.2.3 Môi trường nuôi cấy in vitro 8

2.3 Chuyển gen bằng vi khuẩn Argobacterium tummefaciens 11

2.3.1 Vi khuẩn Argobacterium tummefaciens 11

2.3.2 Thành phần của gen chuyển nạp 12

2.3.3 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến 13

2.4 Hiện trạng và xu hướng phát triển GMC trên thế giới và Việt Nam 14

2.4.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển GMC trên thế giới 14

2.4.2 Tình hình nghiên cứu GMC tại Việt Nam 16

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Vật liệu 18

3.2.1 Giống 18

3.2.2 Hoá chất 18

3.3 Phương pháp 19

3.3.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt 20

3.3.2 Phương pháp tái sinh cây in vitro 21

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến sự tái sinh của cây cà chua in vitro 22

3.3.4 Quy trình chuyển gen vào cây cà chua bằng vi khuẩn Agrobacterium GV3589 23

3.3.5 Kiểm tra mẫu chuyển gen bằng dung dịch X-Gluc 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt 27

4.2 Nhóm thí nghiệm tái sinh 27

4.2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của kinetin lên quá trình tái sinh chồi trên cây cà chua (Lycopersicon esculentum) từ mẫu lá và đốt thân 27

4.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của BA lên hệ số nhân chồi trên cây cà chua 31

4.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo rễ trên cây cà chua (Lycopersicon esculentum) 32

4.3 Nhóm thí nghiệm tiền chuyển gen 34

4.3.1 Ảnh hưởng của PPT đến tỷ lệ sống sót và khả năng tái sinh của mô cây cà chua (mô lá và đốt thân) chưa chuyển gen 34

4.3.2 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trên plasmid pGII0229 bằng phản ứng PCR 36 4.4 Xác định thời gian ủ với vi khuẩn và nồng độ acetosyringone cho hiệu quả chuyển gen cao nhất 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận: 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC

NAA α-naphthaleneacetic axit

nptII neomycin phospho transferase

DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Trang

Hình 2.1 Cây cà chua 3

Hình 2.2 Diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu 16

Hình 2.3 Các nước có diện tích trồng GMC lớn trên thế giới năm 2008 17

Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 20

Hình 4.1 Ảnh hưởng của giống và nồng độ kinetin lên sự tái sinh cây in vitro từ đốt thân 33

Hình 4.2 Ảnh hưởng của giống và nồng độ kinetin lên sự tái sinh cây in vitro từ lá 35

Hình 4.3 Ảnh hưởng nồng độ BA trong đến tốc độ nhân chồi 36

Hình 4.4 Ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo rễ trên cây cà chua 37

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến tỷ lệ sống và khả năng tái sinh của đốt thân cây cà chua 39

Hình 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến tỷ lệ sống và khả năng tái sinh của lá cây cà chua 40

Hình 4.7 Kết quả điện di plasmid tổng số và sản phẩm của phản ứng PCR 41

Hình 4.8 Kết quả 1 số hình nhuộm GUS tiêu biểu 43

Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích plasmid bằng kit QIAprep Spin Miniprep 25

Sơ đồ 3.2 Quy trình kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc 28

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Các quy trình thử nghiệm khử trùng hạt 23

Bảng 3.2 Các nghiệm thức của môi trường tái sinh chồi 24

Bảng 3.3 Các nghiệm thức của môi trường nhân chồi 25

Bảng 3.4 Các nghiệm thức của môi trường tạo rễ 25

Bảng 3.5 Các môi trường chọn lọc với PPT 26

Bảng 3.6 Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR 27

Bảng 3.7 Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR 28

Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu sống sót và sạch nấm khuẩn ở các qui trình khử trùng 31

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của giống và nồng độ kinetin đến sự tái sinh cây từ đốt thân 32

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của giống và nồng độ kinetin đến sự tái sinh cây từ lá 34

Bảng 4.4 Ảnh hưởng nồng độ BA trong đến tốc độ nhân chồi từ đốt thân 36

Bảng 4.5 Ảnh hưởng nồng độ NAAđến sự hình thành rễ cây cà chua 38

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến tỷ lệ sống sót và khả năng tái sinh của đốt thân cây cà chua chưa chuyển gen 39

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến tỷ lệ sống sót và khả năng tái sinh của lá cây cà chua chưa chuyển gen 40

Bảng 4.8 Nồng độ plasmid của dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 41

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu và nồng độ acetosyringone tới kết quả nhuộm GUS 42

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây cà chua (Lycopersicon esculentum) có nguồn gốc từ châu Mỹ và phổ biến ra

toàn thế giới từ sau thế kỷ 16 Hiện nay cà chua được trồng gần 4 triệu ha (James và ctv, 2004) Với khả năng thích ứng trong một phạm vi rộng trên mọi đất và khí hậu nên cà chua được trồng gần như tất cả các nơi trên thế giới

Cà chua có giá trị dinh dưỡng cao Hàm lượng vitamin A thiên nhiên trong cà chua lớn, trung bình chỉ cần 100 g cà chua chín còn tươi sẽ đáp ứng được 13% nhu cầu hằng ngày về vitamin A, cũng như các vitamin B6, vitamin C, ngoài ra trong cà chua còn có các vitamin B1, B2, PP Các chất khoáng vi lượng có trong cà chua như Ca, Fe,

K, P, Mg, S, Ni, Co, I, các axit hữu cơ dưới dạng muối citrate và tuỳ theo môi trường trồng, trong cà chua có thể có cả Cu, Mo Bởi các yếu tố này, cà chua được coi là một thức ăn giàu chất dinh dưỡng, dễ tiêu hoá, tăng cường sức đề kháng của cơ thể Vì vậy, cây cà chua là một đối tượng được quan tâm trong nông nghiệp

Ngoài ra, vấn đề dịch bệnh trên cây cà chua, cải thiện năng suất, chất lượng quả

cà chua là một vấn đề được quan tâm đặc biệt Vì thế, cà chua biến đổi gen in

vitro đã được sử dụng để cải thiện về mặt di truyền (Lindsay, 1992) Tăng khả năng đề

kháng thuốc diệt cỏ, sâu bệnh hay sản xuất vacxin ăn được là những mục tiêu quan trọng nhất của việc biến đổi di truyền thực vật ở cây cà chua

Hơn nữa, chuyển gen thông qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens đã trở thành

một phương pháp đựợc lựa chọn cho các nghiên cứu cơ bản về thực vật, cũng như là kĩ thuật chính để tạo ra cây chuyển gen cho ngành công nghiệp công nghệ sinh học nông nghiệp (Stafford, 2000; Gelvin, 2003) Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với

sự phát triển của các kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng, các kĩ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen Hơn nữa tại trường Đại học

Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh chưa có một quy trình tái sinh in vitro cây cà chua hoàn chỉnh và những công bố tại Việt Nam về sự tái sinh in vitro trên hai nguồn mẫu là lá

và đốt thân còn hạn chế

Chính vì những lí do trên mà chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Thiết lập quy

trình tái sinh cây in vitro và khảo sát khả năng chuyển nạp gen vào cây cà chua

(Lycopersicon esculentum) thông qua Agrobacterium tumefaciens” nhằm thiết lập quy trình tái sinh và chuyển gen cây cà chua Nghiên cứu này giúp tạo tiền đề cho các

nghiên cứu chuyển nạp gen tiếp sau nhằm mục đích cải thiện năng suất, tăng sản

lượng, tính chống chịu trên cây cà chua

1.2 Yêu cầu

Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hoàn chỉnh cho cây cà chua

Bước đầu đánh giá hiệu quả của quy trình lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens vào cây cà chua

1.3 Nội dung thực hiện

Thiết lập quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ nguồn mẫu ban đầu là lá và đốt thân của cây cà chua

Khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự tái sinh của mẫu đốt thân và mẫu lá cây cà chua Xác định nồng độ PPT tối thiểu gây chết 100% mẫu chưa chuyển gen, nhằm sử dụng cho việc chọn lọc thể chuyển gen về sau

Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn vào mẫu cây cà chua Bước đầu đánh giá khả năng lây nhiễm của vi khuẩn ở các thời gian ủ và với các nồng độ acetosyringone khác nhau

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây cà chua

Tên khoa học Lycopersicon esculentum Mill

2.1.2 Nguồn gốc của cà chua

Cà chua trồng có nguồn gốc ở vùng Trung và Nam châu Mỹ Hiện nay, các dạng

cà chua hoang dại vẫn còn tìm thấy ở Bolivia, Chile, Ecuador và Peru Cà chua được phổ biến trên thế giới khoảng sau thế kỷ thứ 16 (www.vi.wikipedia.org) và trở thành một trong những loại rau quan trọng ở nhiều nước Từ Châu Mỹ, cà chua được các thương gia Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha di chuyển sang trồng ở Châu Âu và Châu Á, sau đó từ Châu Âu nó được chuyển sang Châu Phi nhờ những người thực dân đi khai phá thuộc địa (Trần Khắc Thi và Mai Thị Phương Anh, 2003)

2.1.3 Đặc tính thực vật

Rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn Trong điều kiện tối ưu, những giống tăng trưởng mạnh có rễ ăn sâu 1 - 1,5 m và rộng 1,5 - 2,5 m vì vậy cà chua chịu hạn tốt Khi rễ chính bị đứt, bộ rễ phụ phát triển và phân bố rộng nên cây vẫn chịu đựng được điều kiện khô hạn Bộ rễ ăn sâu, cạn, mạnh hay yếu đều có liên quan đến mức độ phân cành và phát triển của bộ phận trên mặt đất, do đó khi tỉa cành, bấm ngọn cây cà chua thường có bộ rễ thường ăn nông và hẹp hơn so với điều kiện trồng tự nhiên.Thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân dần dần hóa gỗ Thân mang lá và phát hoa Ở nách lá là chồi nách Chồi nách ở các vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau, thường chồi nách ở ngay dưới chùm hoa thứ nhất có khả năng tăng trưởng mạnh và phát dục sớm

so với các chồi nách gần gốc Tùy khả năng sinh trưởng và phân nhánh các giống cà

Hình 2.1 Cây cà chua

(www.agroatlas.ru)

chua được chia làm 4 dạng hình: dạng sinh trưởng hữu hạn (determinate), dạng sinh trưởng vô hạn (indeterminate), dạng sinh trưởng bán hữu hạn (semideterminate) và dạng lùn (dwart)

Lá thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3 - 4 đôi lá chét, ngọn lá có 1 lá riêng gọi

là lá đỉnh Rìa lá chét đều có răng cưa nông hay sâu tùy giống Phiến lá thường phủ lông tơ Đặc tính lá của giống thể hiện đầy đủ sau khi cây có chùm hoa đầu tiên

Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Sự thụ phấn chéo ở cà chua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa các alkaloid độc nên không hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được Số lượng hoa trên chùm thay đổi tùy giống và thời tiết, thường từ 5 – 20 hoa

Trái thuộc loại mọng nước, có hình dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài Vỏ trái có thể nhẵn hay có khía Màu sắc của trái thay đổi tùy giống và điều kiện thời tiết Thường màu sắc trái là màu phối hợp giữa màu vỏ trái và thịt trái

Quá trình chín của trái chia làm 4 thời kỳ Trong thời kỳ trái xanh, trái và hạt phát triển chưa hoàn toàn, nếu đem ủ trái không chín, trái chưa có mùi vị, màu sắc đặc trưng của giống Thời kỳ chín xanh thì trái đã phát triển đầy đủ, trái có màu xanh sáng, keo xung quanh hạt được hình thành, trái chưa có màu hồng hay vàng nhưng nếu đem

ủ, trái thể hiện màu sắc vốn có Thời kỳ chín vàng, phần đỉnh trái xuất hiện màu hồng, xung quanh cuống trái vẫn còn xanh, nếu sản phẩm cần chuyên chở đi xa nên thu hoạch lúc này để trái chín từ từ khi chuyên chở Cuối cùng là thời kỳ chín đỏ, trái xuất hiện màu sắc vốn có của giống, màu sắc thể hiện hoàn toàn, có thể thu hoạch để ăn tươi Hạt trong trái lúc nay phát triển đầy đủ có thể làm giống

Hạt cà chua nhỏ, dẹp, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối Hạt nằm trong buồng chứa nhiều dịch bào kìm hãm sự nảy mầm của hạt Trung bình có 50 - 350 hạt trong trái Trọng lượng 1000 hạt là 2,5 - 3,5 g

2.1.4 Điều kiện sinh trưởng

2.1.4.1 Nhiệt độ

Cà chua là cây chịu ấm, một trong những điều kiện cơ bản để có được sản lượng cao và sớm ở cà chua là tạo chế độ nhiệt độ tối ưu cho cây 21 - 240C, nếu nhiệt độ ban đêm thấp hơn ngày 4 - 50C thì cây cho nhiều hoa Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển khác nhau của cây đòi hỏi nhiệt độ không khí và đất nhất định

2.1.4.2 Ánh sáng

Cà chua là cây ưa sáng, không nên gieo cây con ở nơi bóng râm, cường độ tối thiểu để cây tăng trưởng là 2.000 - 3.000 lux, không chịu ảnh hưởng quang kỳ Ở cường độ ánh sáng thấp hô hấp gia tăng trong khi quang hợp bị hạn chế, sự tiêu phí chất dinh dưỡng bởi hô hấp cao hơn lượng vật chất tạo ra được bởi quang hợp, do đó cây sinh trưởng kém

2.1.4.3 Nước

Nhu cầu nước của cây trong quá trình dinh dưỡng không giống nhau Khi cây ra hoa đậu trái và trái đang phát triển là lúc cây cần nhiều nước nhất, nếu đất quá khô, hoa và trái non dễ rụng; nếu đất thừa nước, hệ thống rễ cây bị tổn hại và cây trở nên mẫn cảm với sâu bệnh Nếu gặp mưa nhiều vào thời gian này trái chín chậm và bị nứt Lượng nước tưới còn thay đổi tùy thuộc vào liều lượng phân bón và mật độ trồng

2.1.4.4 Đất và chất dinh dưỡng

Cà chua có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau nhưng thích hợp nhất vẫn là đất thịt pha cát, nhiều mùn hay đất phù sa, đất bồi giữ ẩm và thoát nước tốt và chứa tối thiểu là 1,5% chất hữu cơ Cà chua phát triển tối ưu trên đất có pH từ 5,5 - 7,0

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng cây cà chua

Theo bảng phân tích thành phần hoá học của Viện vệ sinh dịch tễ (Bộ Y tế), trong 100 g cà chua có 94 g nước; 0,6 g protein; 4,2 g chất béo; 0,8 g cellulose; 0,4 g tro; 12 mg calci; 26 mg phospho; 1,4 mg Fe, các loại vitamin carotene, vitamin B1, B2 PP, C, cung cấp được 20 kcal

Quả cà chua chín có màu đỏ tươi tạo màu đẹp và sự ngon miệng cho các món ăn Màu đỏ này còn cho thấy hàm lượng vitamin A thiên nhiên trong cà chua cao, trung bình chỉ cần 100 g cà chua chín còn tươi sẽ đáp ứng được 13% nhu cầu hằng ngày về vitamin A, cũng như các vitamin B6, vitamin C, ngoài ra còn có các vitamin B1, B2,

PP Các chất khoáng vi lượng có trong cà chua như Ca, Fe, K, P, Mg, S, Ni, Co, I, các axit hữu cơ dưới dạng muối citrate và tuỳ theo môi trường trồng, trong cà chua có thể

có cả Cu, Mo Chính nhờ các yếu tố này, cà chua được coi là một thức ăn giàu chất dinh dưỡng, dễ tiêu hoá, tăng cường sức đề kháng của cơ thể (www.dinhduong.com.vn)

Sắc tố lycopen trong cà chua cùng với beta carotene hiện đang được đánh giá là những chất chống oxy hoá mạnh, vừa ngăn chặn tế bào ung thư, vừa chống sự hình

thành các cục máu đông trong thành mạch Cùng với tuổi tác, các gốc tự do nội sinh và ngoại sinh trong cơ thể sẽ phá huỷ các DNA và RNA là những phần tử di truyền của tế bào, tạo nên đột biến gen gây ung thư, đồng thời phá huỷ các tế bào, làm suy yếu các

cơ quan dẫn đến bệnh tật và già nua Vitamin A, nhất là vitamin A dưới dạng thiên nhiên beta carotene, có tác dụng tích cực trong phòng chống hiện tượng này Kết quả thống kê nghiên cứu cho thấy nguy cơ vỡ mạch máu não ở những người ăn nhiều rau quả chứa vitamin A thiên nhiên thấp hơn hẳn những người ít ăn những thực phẩm này

Đó là nhờ vitamin A giúp ngăn ngừa tích luỹ cholesterol trên thành mạch nên tránh được nguy cơ vỡ mạch máu não Như vậy, cà chua với beta carotene và lycopene sẽ góp phần làm chậm sự lão hoá và phòng ngừa ung thư (www.dinhduong.com.vn)

2.1.6 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và trong nước

2.1.6.1 Tình hình sản xuất cà chua trong nước

Theo số liệu thống kê năm 2005, diện tích trồng cà chua cả nước là 23.566 ha tăng 32% so với năm 2001 (17.834 ha) C

, khu vực tây nguyên

sông Cửu Long chủ yếu tập trung ở các tỉnh

Ninh Với năng suất trung bình 19,78 tấn/ha, sản lượng đạt 433.234 tấn cũng chỉ đảm bảo cho bình quân đầu người 5,5 kg quả/năm, bằng 35% so với mức trung bình toàn thế giới Năng suất cà chua ở nước ta mới chỉ bằng 62% so với năng suất chung toàn thế giới Những tỉnh có diện tích trồng cà chua lớn (trên 500 ha) đều là những nơi có năng suất cà chua khá cao (trên 20 tấn/ha) và chủ yếu tập trung ở khu vực đồng bằng Sông Hồng, đặc biệt như Hải Phòng với năng suất bình quân đạt 31,4 tấn/ha; Bắc Ninh 24,8 tấn/ha; Hải Dương 22,8 tấn/ha Đây là những địa phương có năng suất cà chua cao nhất miền Bắc Các địa phương có diện tích trồng cà chua lớn nhất cả nước bao gồm các tỉnh Nam Định (1.959 ha), Bắc Giang (1.300 ha), Hải Dương (1.180 ha) (Hoàng Bằng An, 2005)

2.1.6.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới

Ngày nay, cà chua được xếp vào loại rau có mức tiêu dùng nhiều thứ 2 trên thế giới sau khoai tây, chúng được sản xuất ở hầu hết các nước trên toàn thế giới với hàng

nghìn giống khác nhau, đa dạng về màu sắc, dạng quả Năm 2004, diện tích trồng cà chua của Mỹ ước đạt 170.808 ha, trong đó 50.560 ha cho ăn tươi, 120.248 ha cho chế biến với tổng giá trị 2,06 tỷ USD (trong đó khoảng 1,34 tỉ thu từ cà chua ăn tươi và 0,72 USD tỉ thu từ cà chua chế biến (www.nass.usda) Theo thống kê của Hiệp hội cà chua chế biến thế giới sản lượng cà chua chế biến hàng năm của thế giới năm 2010 đạt mức 37.392.000 tấn và ước tính đạt trên 38.237.000 tấn trong năm 2011

2.2 Sự tái sinh in vitro

2.2.1 Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật

Đặc tính vốn có của cây là khả năng khôi phục lại tính nguyên vẹn bằng sự tái sinh Khác với động vật, thực vật có khả năng tái sinh mạnh mẽ hơn nhiều, từ một bộ phận tách rời khỏi cây mẹ trong điều kiện nhất định nó có thể tái sinh để tạo thành một cây mới hoàn chỉnh Sự tái sinh ở thực vật có thể được chia thành 2 dạng là tái sinh sinh lý và tái sinh bệnh

Tái sinh sinh lý là sự thay thế những bộ phận đã mất đi và điều này cần thiết cho đời sống của chúng, chẳng hạn như cây rụng lá vào mùa thu, mùa đông, sang mùa xuân chúng lại tái sinh ra lá mới để đảm nhận chức năng quang hợp tốt hơn

Tái sinh bệnh là quá trình tái sinh do vết thương gây ra Khi cây bị tổn thương sẽ xuất hiện sự tái sinh để làm lành vết thương hoặc phục hồi các phần đã mất đi hay tái sinh cho ra cơ quan mới để khôi phục tính nguyên vẹn của cây

Khả năng tái sinh của thực vật rất khác nhau phụ thuộc vào đặc tính của loài, giống, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển, mùa vụ và điều kiện sinh thái Từ lâu con người đã biết sử dụng đặc tính tái sinh này để nhân giống vô tính cây trồng thông qua

biện pháp giâm cành, chiết cành, ghép mắt và nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro

2.2.2 Ý nghĩa của sự tái sinh trong quy trình chuyển nạp gen

Để tạo cây chuyển gen, trước hết phải tạo ra được cây tái sinh từ một bộ phận,

mô hoặc một tế bào duy nhất, phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro Đây là

bước rất quan trọng trong quy trình tạo ra cây trồng chuyển gen Nhờ con đường tái sinh này khi ta đưa một đoạn T-DNA mang gen có ích vào tế bào thực vật, ta có thể thu nhận cây tái sinh mang gen này Trong quá trình xây dựng hệ thống tái sinh cần xác định các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, nồng độ các chất này, vật liệu tái sinh

và giống phù hợp Khi đã xác định được giống, bộ phận nuôi cấy tốt nhất, môi trường nuôi cấy thích hợp nhất thì hầu hết các loài thực vật đều có khả năng tái sinh

2.2.3 Môi trường nuôi cấy in vitro

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro là thành phần môi

trường nuôi cấy Tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần môi trường sẽ thay đổi, nhưng nhìn chung đều có các thành phần khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường nguồn cung cấp carbonhydrate, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài ra người ta còn bổ sung các chất hữu cơ có thành phần xác định (amino axit, EDTA) và một số chất có thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men)

2.2.3.1 Khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng trong nuôi cấy in vitro không khác nhiều so với cây trồng trong

điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg, Fe

2.2.3.2 Khoáng vi lượng

Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên

cứu Có rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào như Mn, B, Zn, Cu, Co, I, Mo

2.2.3.3 Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào

và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát

triển Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là vitamin B1 (thiamine), axit nicotinic (PP), biotin, axit folic, axit ascorbic, axitpanthothenic, vitamin E (tocophenol), riboflavin và p-aminobenzoic axit

2.2.3.4 Carbonhydrate và nguồn năng lượng

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn cacbonhydrate giúp mô, các tế bào thực vật tổng

hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối và thường được bổ sung vào môi trường dưới dạng đường đa và đường đơn Hiện nay khi nuôi cấy người ta thường sử dụng đường sucrose

2.2.3.5 Các hợp chất hữu cơ không xác định

Bổ sung nhiều loại dịch chiết hữu cơ khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy như protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô Nước dừa là được dùng rộng rãi Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện nay đã được chứng minh là myo inositol và một số amino axit khác

2.2.3.6 Amino axit và các nguồn cung cấp nitrogen khác

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả amino axit cần thiết nhưng sự bổ sung các amino axit vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào đây là nguồn nitrogen hữu cơ và được hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ

ổn định trong tất cả điều kiện nhiệt độ môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy bởi các enzyme thực vật Độ cứng của agar được quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và

độ pH của môi trường nuôi cấy

2.2.3.9 Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormones)

Auxin ảnh hưởng đến khả năng kích thích sự kéo dài tế bào, tăng trưởng thân và

sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra Hơn nữa, auxin kích thích sự phân chia tế bào vùng tượng tầng, sự tái sinh của liber và mộc, sự phát triển chồi đỉnh, ức chế sự phát triển chồi bên, cản trở quá trình lão hóa ở

lá Ngoài ra auxin có thể ức chế hoặc thúc đẩy sự rụng lá và quả (thông qua ethylene), trì hoãn sự chín của quả, kích thích sự tăng trưởng các phần của hoa, gây ra hiện tượng

ưu thế ngọn Auxin kích thích sự hình thành rễ trên các đoạn cắt của thân, phát triển các nhánh rễ và sự phản biệt hóa các mô để tạo rễ trong nuôi cấy mô

Vai trò chính của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào và tạo thành cơ quan và ảnh hưởng lên sự mở rộng của tế bào Ngoài ra, cytokinin còn có khả năng kích thích hoặc ức chế sự khởi đầu và phát triển của rễ tùy nồng độ và thời gian xử lý, trì hoãn sự lão hóa tế bào, kích thích sự vận chuyển chất dinh dưỡng và các hợp chất hữu cơ Trong một vài trường hợp cytokinin còn ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và

củ Hơn nữa, cytokinin còn có mối quan hệ tương tác với auxin, cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều Cytokinin còn ảnh hưởng lên các quá trình trao đổi chất như quá trình tổng hợp axit nucleic, protein, chlorophin và vì vậy ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh lý khác của cây của cây

Nhìn chung nồng độ auxin cao và cytokinin thấp thích hợp cho sự ra rễ, ngược lại auxin thấp và cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành chồi Các đoạn cắt khi được xử lý ở nồng độ cytokinin cao khó ra rễ hơn các đoạn được xử lý ở nồng độ cytokinine thấp (Okoro và ctv, 1978) Cytokinin ở nồng độ rất thấp, dùng trong giai đoạn cắt của cây đậu (mung bean) và cây thu hải đường sẽ thúc đẩy sự hình thành rễ Các đoạn cắt từ lá thể hiện mối quan hệ giữa auxin và cytokinin vì các đoạn cắt hình thành cả chồi và rễ Ở nồng độ cao (13 mg/l), cytokinin thúc đẩy sự hình thành chồi và

ức chế sự hình thành rễ của các đoạn cắt từ lá cây begonia trong điều kiện vô trùng Trong khi đó, auxin ở nồng độ cao có tác động ngược lại Ở nồng độ thấp (2 mg/l), auxin thúc đẩy sự hình thành chồi Ngoài ra, ở nồng độ thấp (0,8 mg/l), cytokinin kích thích sự hình thành rễ Nồng độ cytokinin quá cao sẽ tạo ra một số lượng lớn chồi bất định nhưng giảm chất lượng của chồi mới Chất lượng chồi bất định rất quan trọng trong sự tái sinh cây mới từ các đoạn cắt

Theo Vũ Văn Vụ (1999), sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác

động qua lại giữa 2 nhóm chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích sự tạo chồi Đây

là nguyên tắc chung, còn nồng độ cụ thể sẽ phải phụ thuộc vào từng loài thực vật

3.2.3.10 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Yêu cầu về khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của từng loại

cây in vitro cũng khác nhau, thông thường từ 25 – 280C Theo Shigenobu và Sakamoto (1981), nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đổi trong suốt thời gian nuôi cấy (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999)

Ánh sáng (bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ) có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Read, 1990; Dooley, 1991) Cường độ ánh sáng từ 2.500 – 3.500 lux thường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy

mô Cường độ ánh sáng lớn hơn thì sự sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ (Murashige, 1977; trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999)

Thành phần quang phổ cũng có ảnh hưởng đáng kể đến mô nuôi cấy Ví dụ nuôi

cấy cây quỳ thiên trúc (Pelar gonium), ở ánh sáng đỏ sẽ làm tăng chiều cao chồi trong

khi ánh sáng xanh lại có biểu hiện ức chế (Appelgen, 1991) Sự thu nhận ánh sáng của

chồi in vitro phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất liệu của bình nuôi cấy

2.3 Chuyển gen bằng vi khuẩn Argobacterium tummefaciens

2.3.1 Vi khuẩn Argobacterium tummefaciens

Argobacterium tummefaciens là vi khuẩn Gram âm trong đất, có khả năng di

động, không sinh bào tử, có khoảng 5400 gen bao gồm Ti-plasmid kích thước trên 200kb (206479 nu; GC chiếm 58%) gồm 196 gen (chiếm 81% tổng chiều dài Ti-

plasmid) mã hóa 195 protein, gây khối u (bướu) trên thực vật (tác động lên trên 140 loài) sau khi lây nhiễm Theo Schell và Van Montagu (1974), nguồn gốc của những

gen tạo ra khối u là Ti – plasmid Sự gắn kết giữa Agrobacterium vào tế bào cây bị

thương được kiểm soát bởi hai gen chvA và chvB định vị trên nhiễm sắc thể của vi

khuẩn, hai gen này thể hiện rất ổn định trong tế bào vi khuẩn Gen chvA và chvB chỉ

có thể hoạt động khi Agrobacterium ở gần các tế bào bị thương do những tế bào này tiết ra các phân tử truyền tín hiệu làm cho gen ở vùng vir (virulence) của Ti–plasmid

hoạt động Các phân tử truyền tín hiệu đã được ghi nhận là những hợp chất phenolic như acetosyringone (AS) và α-hydro acetosyringone (OH-AS) (trích dẫn bởi Trần Thị

Lệ Minh, 2000)

Sau khi xâm nhập vào tế bào thực vật, một phần nhỏ của Ti-plasmid là T–DNA

sẽ xâm nhập vào bộ gen của tế bào và biểu hiện Các gen vir trên Ti-plasmid sẽ đóng vai trò điều khiển quá trình xâm nhiễm Có 6 loại gen vir là A, B, C, D, E và G Gen

virA có nhiệm vụ truyền phân tử tín hiệu AS (acetosyringone) từ mô thực vật bị

thương xuyên qua màng vào tế bào vi khuẩn AS sẽ hỗ trợ virG–protein để kích thích

sự thể hiện của các genvir B, C, D, E Sự thể hiện của các gen này giúp cắt T–DNA ra khỏi Ti–plasmid và chuyển nó vào tế bào thực vật Dựa vào đặc điểm này, người ta tiến hành cải tiến Ti-plasmid bằng cách loại bỏ các gen gây khối u (oncogen) và chèn

thêm vào đó các gen mang tính trạng mong muốn Tiến trình này được thực hiện bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) và enzyme nối (ligase)

Nuôi tế bào thực vật trong môi trường có vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

đã cải tiến sẽ thu được những tế bào chuyển gen Hiện nay, sử dụng Agrobacterium

tumefaciens là phương pháp phổ biến nhất trong chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao,

đặc biệt là cây 2 lá mầm Gen chuyển nạp bằng phương pháp này ổn định và thường di truyền các tính trạng theo định luật Mendel (De Block và ctv, 1984; Muller và ctv, 1987; Hiei và ctv, 1996)

Theo Fritsch và Kovalchuk (2000), phương pháp chuyển gen bằng

Agrobacterium tumefaciens không làm ảnh hưởng đến các bộ phận được chuyển gen

và các bộ phận này vẫn có thể sống và phát triển bình thường sau quá trình đồng nuôi cấy với vi khuẩn Quá trình chuyển nạp được xem là thành công khi có sự biểu hiện của các gen thông báo và chỉ thị chọn lọc trong các mô thực vật Tần số chuyển nạp từ

vi khuẩn vào tế bào thường phụ thuộc rất lớn vào loài thực vật, các điều kiện sinh trưởng, giai đoạn sinh trưởng của thực vật Tần số này còn phụ thuộc vào môi trường nuôi vi khuẩn và mật độ vi khuẩn trong môi trường xâm nhiễm (infiltration medium)

2.3.2 Thành phần của gen chuyển nạp

2.3.2.1 Promoter

Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình

tự thích hợp đi kèm theo nó Với mỗi promoter cần có các vector tương ứng Hiện nay,

promoter CAMV35S của vi rút gây bệnh khảm trên cải bông là promoter mạnh và được

sử dụng phổ biến nhất Theo Heldt (1997), promoter này gồm các enhancer có khả năng chuyển mã mức độ cao

2.3.2.2 Gen thông báo (reporter gen)

Theo Jacobsen (2007), bất cứ phương pháp chuyển gen nào dù là chuyển nạp

gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn

gen vẫn cần một phương pháp tin cậy để xác định các tế bào đã nhận gen ngoại lai Với mục đích đó khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông báo Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào

đó rất dễ phát hiện trong cây Người ta thường sử dụng gen gusA của vi khuẩn E coli làm gen thông báo Gen gusA mã hóa enzyme β–glucuronidase Enzyme này xúc tác

phản ứng phân giải cơ chất glucuronidase không màu để tạo thành sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng Glucuronidae thường dùng là 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide (X-gluc) Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase không tồn tại trong

thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật Mặt khác,

sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnh hưởng của pH môi trường nên rất thuận tiện cho việc theo dõi

2.3.2.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)

Sau quá trình chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng các tế bào

đã nhận gen mục tiêu và cho vào môi trường tái sinh Thông thường, một plasmid

được sử dụng trong chuyển nạp gen sẽ mang các thành phần gen thông báo, chỉ thị chọn lọc và gen mục tiêu Khi các chỉ thị chọn lọc thể hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục sinh trưởng trong môi trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng

sinh hay thuốc diệt cỏ Các chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay là gen nptII mã hóa

enzyme neomycin phospho transferase II Enzyme này sẽ xúc tác quá trình phosphoryl hóa kháng sinh kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này Một chỉ thị chọn lọc phổ

biến khác là gen hph mã hóa enzyme hygromycin phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng sinh hygromycin Gen hph tỏ ra rất thành công trên cây bắp (Walters và

ctv, 1992), cây lúa (Christon và ctv, 1991; Li và ctv, 1993)

Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể được sử dụng như gen mục tiêu nhưng đồng thời cũng là một chỉ thị chọn lọc Gen bar mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl

transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là thành phần chính trong

thuốc diệt cỏ Basta Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme phospho mannose isomerase đã

được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc Gen này hoạt động trên cơ sở phản ứng huỳnh quang trong môi trường có đường mannose Điều này đã mở ra một triển vọng lớn về

an toàn sinh học do không cần sử dụng chất kháng sinh hay hoạt chất diệt cỏ trong quá trình chọn lọc (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.3 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến

tế bào và ức chế sự hình thành diệp lục

2.3.3.2 Gen bar

Gen bar có nguồn gốc từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus (Thompson và

ctv, 1987) Vi khuẩn này có khả năng sản sinh ra một loại hợp chất thứ cấp là tripeptide bialaphos Bialaphos có chứa chất phosphinothricin, là một đồng dạng của glutamate Glutamate là chất gây ức chế enzyme glutamine synthetase Khi enzyme

này bị ức chế cây trồng sẽ không thể tổng hợp được glutamine dẫn đến sự tích lũy ammoniac trong cây làm cây chết nhanh chóng

Murakami và ctv (1986) đã tạo dòng gen bar và cho thử nghiệm tính kháng với

chất kháng sinh là bialaphos Bialaphos được sử dụng như một chất diệt cỏ không chọn lọc trong nông nghiệp Nó là một tripeptide với 2 gốc L-alanine và một đồng dạng của axit glutamic là phosphinothricin (PPT) (Ogawa và ctv, 1973; Kondo và ctv, 1973) Một tripeptide nguyên vẹn có rất ít hoặc không có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme glutamine synthetase (Bayer và ctv, 1972; Tachibana và ctv, 1986) nhưng khi vào trong cơ thể vi khuẩn hoặc cây trồng, enzyme peptidase trong tế bào sẽ loại bỏ

2 gốc alanine và giải phóng hoạt tính của PPT Đáp ứng của những cây trồng biến đổi

di truyền mang gen bar đối với PPT hay bialaphos đã cung cấp cho các nhà khoa học

một phương tiện chọn lọc rất hiệu quả trong quá trình tạo cây chuyển gen

2.4 Hiện trạng và xu hướng phát triển cây trồng biến đổi gen (GMC) trên thế giới và Việt Nam

2.4.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển GMC trên thế giới

Số lượng các nước trồng cây biến đổi gen liên tục tăng kể từ khi được đưa vào

tác, tới năm 2003 đã có 18 nước trồng GMC và tăng lên 25 nước vào năm 2009 (Clive, 2008) Làn sóng ứng dụng GMC vào nông nghiệp ngày càng tăng là do một số yếu tố thúc đẩy như số nước trồng cây GMC gia tăng (thêm 3 nước trong năm 2008); châu Phi đạt được những tiến bộ vượt bậc trong lĩnh vực GMC từ một nước năm 2007 lên tới 3 nước năm 2008 (Bên cạnh Nam phi có thêm Burkina Faso và Ai Cập đưa GMC vào canh tác); ở châu Mỹ, Bolivia lần đầu tiên trồng đậu tương chuyển gen; các nước

đã trồng GMC tiếp tục trồng thêm những giống cây mới (Braxin trồng ngô Bt,

Australia trồng cải canola chuyển gien, Mỹ và Canada cũng bắt đầu sử dụng củ cải đường GMC); gia tăng việc sử dụng tính trạng tổng hợp ở cây ngô và bông, đưa số nước triển khai tính trạng này lên 10 nước Làn sóng ứng dụng giống cây trồng đa tính trạng mới này nối tiếp với làn sóng trồng cây GMC đầu tiên, tạo nên sự phát triển nhanh chóng của GMC trên toàn thế giới

Hình 2.2 Diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu

Hình 2.3 Các nước có diện tích trồng GMC lớn trên thế giới năm 2008

( Jame, 2008 )

2.4.2 Tình hình nghiên cứu GMC tại Việt Nam

Hiện nay lĩnh vực nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang được tiếp cận, đầu

tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng với sự chú trọng đặc biệt Trong các nghiên cứu nhằm tạo các cây trồng biến đổi gen, bước quan trọng nhất được thực hiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý có giá trị ứng dụng cao tiến tới sử dụng

để chuyển vào cây trồng nhận nhằm tạo nên những giống lý tưởng Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao gồm gen chịu hạn, lạnh, kháng bệnh ở lúa;

gencry và vip mã hóa các protein độc tố có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn

Bacillus thuringiensis (Bt); gen mã hóa protein bất hoạt hóa ribosome ở cây mướp

đắng và genmã hóa α-amylase của cây đậu cô-ve có hoạt tính diệt côn trùng; gen mã hóa protein vỏ của virút gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ; gen mã hóa kháng nguyên

vỏ của các chủng vi rút dại Các gen có giá trị y dược phải kể đến các gen mã hóa cho một số kháng nguyên của vi rút và vi khuẩn như gen mã hóa kháng nguyên E của vi

rút Dengue typ I và typ II sử dụng trong chẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue Song song với những nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu thiết kế các vector mang gen có giá trị chủ yếu để biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm trên cả nước Trên đối tượng thực vật, hướng nghiên cứu hoàn thiện các phương pháp chuyển gen và các quy trình tái sinh cây khởi đầu cho những nghiên cứu chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng cũng nhận được

sự quan tâm của nhiều nhóm tác giả

Nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau như phương pháp bắn gen, sử dụng

vi khuẩn A tumefaciens đã được áp dụng thành công trên hàng loạt đối tượng cây

trồng quan trọng như lúa, cà chua, cà tím, đậu xanh, cà phê, thuốc lá, khoai lang

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 1/1/2012 đến 1/7/2012 Tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2.1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và các gen chuyển nạp

Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng GV3580 Vi khuẩn mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc có các gen gusA, gen nptII và gen bar với promoter là nos poly–A và terminator là CaMV 35S, được cung cấp bởi viện Nghiên

Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc

(Jacobsen, 2007)

3.2.2 Hoá chất

3.2.2.1 Hoá chất dùng trong hệ thống tái sinh (hóa chất công nghiệp)

Môi trường MS, đa lượng, vi lượng, FeEDTA

Chất kích thích sinh trưởng: BA, NAA, IAA, Kinetin

Đường sucrose, agar, dung dịch Javel của Công ty TNHH Mỹ Hảo (5,25% NaCl

và NaClO nguyên chất)

3.2.2.2 Hoá chất dùng trong quy trình chuyển gen (hóa chất Sinh học phân tử)

Môi trường LB (Luria Bertani); Acetosyringone; Phosphinothricin (PPT); X-gluc Các loại kháng sinh: Cefotaxime, Kanamycin sulphate

3.2.2.3 Hoá chất dùng trong phản ứng PCR (hóa chất Sinh học phân tử)

PCR buffer 10X ; MgCl2; Taq polymerase; dNTPs;

Primer đặc hiệu cho gen bar

F: 5' -GTC TGC ACC ATC GTC AAC C- 3'

R: 5' -GAA GTC CAG CTG CC AGA AAC- 3'

(Jacobsen, 2007)

Trình tự gen bar được khuếch đại với cặp mồi F và R Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch band kích thước 748 bp Các hóa chất

sử dụng ở mục 3.2.3.3 là hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn hóa chất sinh học phân tử

3.2.2.4 Thiết bị dùng trong thí nghiệm

Tủ cấy vô trùng (Microflow Advanced Bio Safety Cabinet-Class II)

Tủ nuôi cây Versatile Environmental Test Chamber (Sanyo)

Pipette

3.3 Phương pháp

Môi trường khoáng MS cơ bản bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH 5,7- 5,8

được dùng làm môi trường nuôi cấy cơ bản cho các thí nghiệm nuôi cấy in vitro Môi

trường được đạt trong các chai thủy tinh 300 ml, mỗi chai chứa 50 ml Hấp khử trùng trong autoclaver ở 1210 C trong 20 phút

Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện về nhiệt độ 25 ± 20C Thời gian chiếu sáng 16 giờ cường, độ 30-40 μM/m2/giây, ẩm độ tương đối trung bình 70 – 75% Các điều kiện về nhiệt độ, ẩm độ, cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng và độ ẩm tương đối trung bình sẽ được giữ ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần lặp lại Số liệu trong đề tài sẽ được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2007 và MSTATC

3.3.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt

Công việc đầu tiên của quy trình nuôi cấy mô là khử trùng vật liệu nuôi cấy Vô trùng mẫu là một bước làm rất quan trọng, quá trình này quyết định chất lượng nguồn

nguyên liệu ban đầu của quá trình nhân giống in vitro

Do tốc độ phát triển của nấm và vi khuẩn nhanh hơn rất nhiều so với tế bào thực vật Nếu vật liệu nuôi cấy bị nhiễm vi khuẩn hoặc bào tử nấm thì sau một thời gian ngắn toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ bị vi khuẩn hoặc nấm tấn công và làm cho mẫu bị chết Vì thế chúng tôi tiến hành khử trùng hạt cà chua theo ba quy trình sau nhằm tìm ra quy trình khử trùng hiệu quả nhất

Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần

Ngâm hạt trong dung dịch sodium hypochlorite 5,25%

trong 15 phút Rửa sạch bằng nước cất vô trùng 4 – 5 lần

Khử trùng bề mặt bằng ethanol (700) trong thời gian 90 giây

Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần

Ngâm hạt trong dung dịch sodium hypochlorite 5,25% trong 90 giây, lặp lại bước này 3 lần

Rửa sạch bằng nước cất vô trùng 4 – 5 lần

Quy trình 3* theo Chaudhry và ctv (2007)

Tiến hành cấy hạt của hai giống cà chua đã được nêu ở trên vào trong các chai thủy tinh nuôi cấy đã hấp khử trùng, mật độ cấy 6 hạt/chai, 3 chai/NT

Chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi kết quả tỷ lệ (%) hạt nảy mầm sạch mầm bệnh sau 2 tuần nuôi cấy

Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) = x 100

3.3.2 Phương pháp tái sinh cây in vitro

Việc thiết lập quy trình tái sinh thích hợp cho cây cà chua sẽ là điều kiện tiên quyết trước khi tiến hành chuyển gen Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các môi trường tái sinh từ các vật liệu khác nhau là lá và đốt thân

3.3.2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của kinetin đến quá trình tái sinh chồi trên cây cà

chua (Lycopersicon esculentum)

Hạt cà chua sau khi khử trùng cho nảy mầm trên môi trường MS, không bồ sung chất điều hòa sinh trưởng Sau khi nảy mầm được 2 tuần, do cây cà chua phát triển nhanh, thân cây cao nhưng chưa xuất hiện lá nên tiến hành cắt lấy phần trụ trên lá mầm và cấy chuyển qua cùng môi trường Sau 2 tuần tiến hành thu lá và đốt thân

Mẫu lá và đốt thân được cắt và cấy môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ như sau: 1 mg/l NAA + kinetin (0,5; 1 và 1,5 mg/l) Mẫu được cấy với số lượng 5 mẫu/chai, mẫu lá có kích thước khoảng 5 x 5 mm và mặt trên của mẫu lá được đặt tiếp xúc với môi trường, mẫu đốt thân kích thước khoảng 2 cm và được cắm xéo lên môi trường Các mẫu được đặt trong phòng nuôi cây với các điều kiện nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng và thời gian chiếu sáng như đã nêu Thí nghiệm được

bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trên 2 giống cà chua F1Fn576 và Nicola

Chỉ tiêu theo dõi

Quan sát và ghi chép số mẫu tạo callus và đặc điểm callus tạo thành, số mẫu tạo chồi và tồng số cụm chồi hình thành trên từng callus

3.3.2.2 Xác định môi trường nhân chồi

Sau 4 tuần nuôi cấy, chuyển số cụm chồi lên môi trường nhân chồi là môi trường MS bổ sung BA với các nồng độ 1; 2 mg/l, nhằm tìm ra môi trường nhân chồi phù hợp nhất Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên có 3 nghiệm thức, 3 chai/NT và được lặp lại 3 lần

Bảng 3.3 Các nghiệm thức của môi trường nhân chồi

Chỉ tiêu theo dõi

Tiến hành theo dõi chiều cao của chồi tái sinh được đo từ bề mặt thạch đến đỉnh chồi (cm) và chồi tái sinh trên tổng số cụm chồi nuôi cấy theo công thức:

Số chồi =

3.3.2.3 Tạo rễ cho cây cà chua in vitro

Sau 3 - 4 tuần nuôi cấy, chồi cao 2-3 cm thì chuyển lên môi trường tạo rễ là môi trường MS bổ sung nồng độ NAA 0,5 ; 1 mg/l Nhằm tìm ra môi trường tạo rễ phù hợp nhất Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần ( 3 chai/NT)

Bảng 3.4 Các nghiệm thức của môi trường tạo rễ

Chỉ tiêu theo dõi Quan sát và ghi chép thời gian ra rễ và chiều dài rễ, số rễ/chồi

Thời gian ra rễ được tính từ ngày cấy mẫu cho tới thời điễm mẫu bắt đầu xuất hiện rễ Chiều cao rễ được đo từ gốc đến chóp rễ (cm)

Số rễ/chồi =

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của hoạt chất diệt cỏ phosphinothricin (PPT) đến sự tái

sinh của cây cà chua in vitro

Nhằm xác định ngưỡng gây chết của PPT đối với cây cà chua in vitro để phục vụ

cho công tác chọn lọc cây chuyển gen về sau, chúng tôi tiến hành cấy lá và đốt thân

Bước

1

• Nuôi vi khuẩn qua đêm trong môi trường LB

• Chuyển dịch vi khuẩn vào ống Eppendorf, ly lâm 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối

Bước

2

• Cho 250 µl Buffer P1 vào Eppendorf, vortex kĩ cho tan hết sinh khối

• Bổ sung 250 µl Buffer P2 vào ống, đảo ống nhẹ nhàng để tránh làm gãy DNA

• Thêm vào 350 µl Buffer N3, trộn đều bằng cách đảo ống nhẹ 4-6 lần

Bước

3

• Ly tâm trong 10 phút với vận tốc 13000 vòng/phút

• Hút phần dịch nổi cho vào cột QIAprep spin (QIAprep spin column)

• Ly tâm cột 13000 vòng trong 1 phút cho dung dịch đi qua cột

Bước

4

• Rửa cột bằng cách bổ sung 750µl Buffer PE và ly tâm 13000 vòng trong 1 phút

• Ly tâm tiếp 1 lần nữa để loại bỏ hoàn toàn Buffer PE

Bước 5

• Đặt cột QIAprep vào trong ống Eppendorf mới, để tách chiết DNA, cho vào cột 50 µl Buffer

EB, chờ 2 phút và tiến hành ly tâm thu plasmid

bốn tuần tuổi vào các môi trường tạo callus và chồi có bổ sung PPT với các nồng độ

Điều kiện nuôi cấy được thiết lập như trên với 5 nghiệm thức Chúng tôi tiến

hành cấy 5 mẫu/chai, 3 chai/NT

Chỉ tiêu theo dõi

Quan sát sự sinh trưởng và phát triển của callus trong 4 tuần và tính tỉ lệ (%) số

chồi tái sinh

3.3.4 Quy trình chuyển gen vào cây cà chuabằng Agrobacterium GV3580

3.3.4.1 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trên plasmid bằng phản ứng PCR

Quy trình ly trích plasmid pGII0229

Nguồn vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp qua quá trình tồn

trữ lâu dài có thể sẽ loại thải plasmid ra khỏi tế bào cơ thể Vì vậy, trước khi bắt đầu

thí nghiệm chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra sự hiện diện của plasmid cũng

như sự hiện diện của gen bar trên plasmid của vi khuẩn Quy trình li trích như sau:

Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích plasmid bằng kit QIAprep Spin Miniprep

Thực hiện phản ứng PCR

Để khuếch đại vùng mã hóa gen bar trên plasmid pGII0229, chúng tôi sử dụng

các primer được thiết kế với trình tự sau:

F: 5’ -GTC TGC ACC ATC GTC AAC C- 3’

R: 5’ -GAA GTC CAG CTG CC AGA AAC- 3’

Nồng độ cuối

Tổng thể tích cho 1 phản ứng PCR là 25 µl

Bảng 3.7 Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian (giây) Chu kỳ

Điện di kiểm tra kết quả

Chuẩn bị gel agarose nồng độ 0,8% bằng cách cân 0,32 g agarose cho vào 40

ml dung dịch TBE 0,5 X Đun sôi dung dịch agarose trong lò viba ở bước sóng 650 W cho đến khi tan hoàn toàn Để nguội dung dịch agarose đến nhiệt độ khoảng 550

C và rót nhẹ nhàng vào khay điện di Load mẫu với thể tích 5 µl sản phẩm DNA và 1 µl loading dye 6X Sau đó chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA trong 30 phút Sau đó ngâm gel trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút Sau khi ngâm