XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG FRUCTOSE, GLUCOSE, SACCHAROSE TRONG THỰC PHẨM BẰNG High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector

Phương pháp phân tích đường sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò chỉ số khúc xạ High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector - HPLC – RI Waters vớ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG FRUCTOSE, GLUCOSE, SACCHAROSE TRONG THỰC PHẨM BẰNG

High Performance Liquid Chromatography

– Refractive Index Detector

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM THOA Niên khóa: 2008 - 2012

Tháng 7 năm 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG FRUCTOSE, GLUCOSE,

SACCHAROSE TRONG THỰC PHẨM BẰNG

High Performance Liquid Chromatography

– Refractive Index Detector r

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS NGUYỄN VĂN SANG

Tháng 7 năm 2012

LỜI CÁM ƠN

Xin chân thành cám ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Toàn thể quý Thầy Cô của Bộ môn Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học

ThS Phùng Võ Cẩm Hồng, ThS Nguyễn Văn Sang và ThS Ngô Quốc Việt đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện

đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Các anh chị trong Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 đã tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian phân tích mẫu bằng phương pháp HPLC – RI

Toàn thể lớp DH08SH đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt 4 năm học Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc, động viên, khuyến khích tạo điều kiện để con học tập tốt

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kim Thoa

TÓM TẮT

Trong cơ thể con người, đường đóng vai trò rất quan trọng Tuy nhiên, việc sử dụng đường không hợp lý là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh nguy hiểm như tiểu đường tuýp 2, tim mạch, béo phì Do đó, việc phân tích đường trong thực phẩm trở nên cấp thiết cho người sử dụng

Phương pháp phân tích đường sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò chỉ số khúc xạ (High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector - HPLC – RI) (Waters) với cột LiChrospher® NH2 (Merck), chiết đường bằng nước nóng và xử lý mẫu theo quy trình của AOAC Official Method 980.13 được thực hiện để góp phần xác định hàm lượng ba loại đường fructose, glucose, saccharose trong các mẫu thực phẩm

Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng tổng ba loại đường fructose, glucose, saccharose trên mẫu thử là 8,1 g/100 mL (mẫu nước giải khát), 17,9 g/100 g (mẫu bánh quy) Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các loại đường của phương pháp trên nền mẫu bánh và mẫu nước giải khát tương đối thấp Đối với mẫu nước giải khát, giới hạn phát hiện trung bình là 0,09 g/100 mL và mẫu bánh là 0,47 g/100 g, hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích trên các nền mẫu bánh và mẫu nước giải khát khá cao, trung bình từ 103% đến 105% (mẫu nước giải khát), từ 90% đến 99% (mẫu bánh quy) Kết quả định lượng ba loại đường fructose, glucose, saccharose trên các mẫu thực tế cho thấy hàm lượng đường trong mẫu bánh từ 4,07 g/100 g đến 16,44 g/100 g, mẫu nước giải khát từ 7,68 g/100 mL đến 18,37 g/100 mL Như vậy, phương pháp HPLC – RI có thể được dùng để phân tích định lượng đường có trong mẫu bánh, mẫu nước giải khát và một số mẫu thực phẩm khác

The analysis of sugar used the High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector - HPLC - RI ) (Waters) system with its LiChrospher® NH2

(Merck), extracted sugar by hot water at 70oC in 30 minutes, applied according to the AOAC Official Method 980.13 procedure The content of fructose, glucose, and saccharose on beverage and biscuit samples are 8.1 g/100 mL, 17.9 g/100 g, respectively The recovery of the method is high They are average in range 103% to 105% for beverage sample, and from 90% to 99% for biscuit sample Detection limit and limit quantitation of the method is relatively low Detection limit was 0.09 g/100

mL for beverage sample, and 0.47 g/100 g for biscuit sample Quantitation results of fructose, glucose, saccharose on food sample were from 4.07 g/100 g to 16.44 g/100g for cake sample, from 7.68 g/100 mL to 18.37 g/100 mL for beverage sample Therefore, the HPLC - RI can be used for analysis of sugar content in cake, and beverage sample as well as other food samples

Key word: Sugar, HPLC – RI, AOAC 980.13

MỤC LỤC

Trang

LỜI CÁM ƠN 0

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viiii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về các loại đường đường sử dụng trong thực phẩm 3

2.1.1 Đường glucose sử dụng trong thực phẩm 3

2.1.2 Đường fructose sử dụng trong thực phẩm 6

2.1.3 Đường saccharose sử dụng trong thực phẩm 7

2.2 Tác động của đường (fructose, glucose, saccharose) lên cơ thể 9

2.3 Phương pháp HPLC – RI 10

2.3.1 Khái quát về phương pháp HPLC 10

2.3.2 Cấu tạo và các bộ phận của HPLC 11

2.4 Các phương pháp có thể xác định hàm lượng đường 12

2.4.1 Phương pháp hóa học 12

2.4.2 Phương pháp vật lý 13

2.4.3 Phương pháp enzyme 13

2.4.4 Phương pháp sắc ký 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Phương pháp phân tích đường 20

3.3.2 Khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích 23

3.3.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) đường của phương pháp 24

3.3.4 Khảo sát trên một số mẫu thật 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Dựng đường chuẩn các loại đường để phân tích mẫu NGK và mẫu bánh 26

4.2 Xác định hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích mẫu NGK và bánh 27

4.3 Khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp HPLC – RI 29

4.4 Kết quả khảo sát trên một số mẫu thật 31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN: Acetonnitrile

AOAC: Association of Official Analytical Chemists

FDA: Food and Drug Administration

HDL: High density lipoprotein

HFCS: High Fructose Corn Syrup

HPAEC: High Performance Anion Exchange Chromatography

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

HPTLC: High Performance Thin – Layer Chromatography

ISO: International Standard Organization

IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry

LOD: Limit of Detection

LOQ: Limit of Quatitation

NGK: Nước giải khát

RI: Refrative Index Detector

S/N: Signal to noise (ratio)

SK – QP: Sắc ký – Quang phổ

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

UV – vis: Ultra Violet – vissible

VLDL: Very low density lipoprotein

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Các dạng tồn tại chính của D – glucose 5

Bảng 2.2 Bảng tóm tắt ưu nhược điểm của các phương pháp phân tích đường 16

Bảng 4.1 Đường chuẩn các loại đường để phân tích mẫu nước giải khát 26

Bảng 4.2 Đường chuẩn các loại đường để phân tích mẫu bánh 26

Bảng 4.3 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích mẫu nước giải khát 28

Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi và độ tái lặp của quy trình phân tích trên mẫu bánh 28

Bảng 4.5 Khảo sát LOD, LOQ của phương pháp trên nền mẫu nước giải khát 29

Bảng 4.6 Khảo sát LOD, LOQ của phương pháp trên nền mẫu bánh 30

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát hàm lượng đường trong một số mẫu thực phẩm 31

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Mô hình phân tử D – Glucose 4

Hình 2.2 Các dạng tồn tại của D - Glucose trong dung dịch 4

Hình 2.3 Mô hình phân tử D – Fructose 6

Hình 2.4 Các dạng tồn tại của D - Fructose trong dung dịch 6

Hình 2.5 Sự chuyển hóa của fructose trong môi trường kiềm 7

Hình 2.6 Mô hình phân tử Saccharrose 7

Hình 2.7 Công thức cấu tạo của Saccharose 8

Hình 2.8 Phản ứng thủy phân Saccharose 8

Hình 2.9 Sơ đồ hệ thống HPLC 11

Hình 3.1 Mẫu thực phẩm để phân tích 18

Hình 3.2 Hệ thống HPLC - RI tại phòng Sắc ký - Quang phổ 19

Hình 3.3 Sơ đồ tóm tắt các bước thực nghiệm 20

Hình 3.4 Một số giai đoạn xử lý trên nền mẫu bánh 21

Hình 4.1 Đồ thị đường chuẩn các loại đường để phân tích mẫu nước giải khát 27

Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn các loại đường để phân tích mẫu bánh 27

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Đường là một trong những thành phần được chúng ta sử dụng trong đời sống hằng ngày, chúng có ở tự nhiên hoặc được thêm vào sản phẩm Trong công nghệ chế biến thực phẩm, đường chủ yếu dùng làm chất tạo ngọt Đối với cơ thể con người, đường có vai trò rất quan trọng trong hoạt động sống Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng đường không hợp lý là nguyên nhân gây ra các căn bệnh nguy hiểm như tiểu đường tuýp 2, tim mạch, béo phì Đặc biệt, với nền kinh tế xã hội ngày càng phát triển, con người lại càng có xu hướng sử dụng các thực phẩm đã qua chế biến Do vậy, vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm và việc phân tích đường trong thực phẩm trở nên cấp thiết cho người sử dụng

Để đánh giá chất lượng thực phẩm, bảo vệ người tiêu dùng và giữ uy tín cho nhà sản xuất thì việc lựa chọn một phương pháp phân tích đường là vô cùng quan trọng Các báo cáo trước đây về phân tích đường cho thấy phương pháp đo màu và phương pháp i-ốt đã không thể định lượng được từng loại đường Phương pháp sắc ký khí đã thành công trong việc xác định các loại đường nhưng yêu cầu tạo hợp chất dẫn xuất Gần đây, sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò chỉ số khúc xạ (HPLC – RI) đã trở thành phương pháp ưu tiên để xác định các loại đường fructose, glucose và saccharose trong hầu hết các loại thực phẩm Đây là một phương pháp đơn giản, đảm bảo đủ độ nhạy, khả năng thu hồi hàm lượng cao, không bị nhiễu nền mẫu, độ lặp lại tốt, đặc biệt không yêu cầu các bước làm sạch và tạo dẫn xuất phức tạp và có thể thay thế cho phương pháp sắc ký khí (Sesta, 2005) Chính vì vậy, phương pháp HPLC - RI

đã sớm được sử dụng vào những năm 1970 để phân tích đường và ngày càng trở nên phổ biến Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu về phân tích đường sử dụng phương pháp HPLC - RI Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam, phân tích đường bằng phương pháp HPLC - RI vẫn chưa được sử dụng phổ biến, hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước vẫn chủ yếu dùng các phương pháp truyền thống để xác định hàm lượng đường Do đó, việc tìm ra một phương pháp phân tích đường chính xác với các

ưu điểm nhanh, đơn giản, chi phí thấp, có thể khắc phục nhược điểm của phương pháp truyền thống và phù hợp với điều kiện phân tích của từng phòng thí nghiệm là vô cùng

có ý nghĩa Vì những lý do trên, đề tài “Xác định hàm lượng đường fructose, glucose, saccharose trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC – RI” được thực hiện

1.2 Yêu cầu của đề tài

Để tiến hành phân tích, định lượng đường trên các nền mẫu thực phẩm nghiên cứu đạt kết quả chính xác thì quá trình chiết đường và xử lý mẫu đưa vào phân tích phải có độ tinh sạch cao, các thao tác thực hiện thí nghiệm cần chuẩn xác Quy trình phân tích đường sử dụng hệ thống HPLC – RI (Waters) với cột LiChrospher® NH2

(Merck) của phòng Sắc ký – Quang phổ - Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 5 điểm của các loại đường glucose, fructose, saccharose ở các nồng độ khác nhau cho độ tuyến tính cao để quá trình định lượng đường fructose, glucose, saccharose trong các mẫu được phân tích bằng thiết bị HPLC – RI đạt kết quả chính xác và sai số trong mức cho phép

Định lượng đường có trong các mẫu thử để xác định hiệu suất thu hồi nhằm đánh giá độ đúng, độ lặp lại và độ tái lặp của quy trình phân tích

Nhằm đánh giá độ nhạy của phương pháp, đề tài khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Khảo sát trên một số nền mẫu thực tế sau khi các điều kiện phân tích đã tối ưu

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về các loại đường đường sử dụng trong thực phẩm

Đường là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm carbohydrate đơn, hòa tan trong nước,

có nhiều trong thực vật, được tạo nên bởi sự liên kết các nguyên tố: C, H, O

Công thức phân tử chung: (CH2O)n (n >= 3)

Trong công nghệ sản xuất thực phẩm (bánh kẹo, rượu bia, nước giải khát, đồ hộp, đóng gói) Ngoài vai trò chính là chất tạo ngọt, đường còn có các chức năng: Đường là nguyên liệu quan trọng của ngành sản xuất lên men (rượu, bia, nước giải khát, mì chính, acid amin, vitamin, kháng sinh), cung cấp nguyên liệu cho phản ứng Maillard, phản ứng Caramen, là nguồn dưỡng chất và cơ chất cho nấm men và enzym lên men tạo khí CO2 Ngoài ra, đường còn đóng vai trò là chất bảo quản trong các sản phẩm đóng gói

2.1.1 Đường glucose sử dụng trong thực phẩm

Tên khoa học: Glucose

Danh pháp theo IUPAC: Glucopyranose

Glucose là một loại glucid đơn giản nhất, là loại đường đơn tiêu biểu nhất Chúng là đường aldose, chứa nhiều nhóm rượu và một nhóm chức aldehyde

Công thức phân tử: C6H12O6 (∆ = 1 => có 1 liên kết đôi hoặc 1 vòng)

Glucose được Andreas Marggraf ly trích đầu tiên từ trái nho khô vào năm 1747 Tên glucose được Jean Dumas đặt vào năm 1838, xuất phát từ tiếng Hy Lạp là glycos,

có nghĩa là đường hay ngọt Cấu tạo của glucose được Emil Fisher khám phá vào khoảng thời gian từ cuối thế kỷ 19 đến đầu thế kỷ 20

Glucose có hầu hết trong các bộ phận của cây như lá, hoa, rễ, các loại trái cây chín, đặc biệt là nho nên còn được gọi là đường nho Glucose cũng có trong cơ thể người, động vật Trong máu người, chúng chiếm khoảng 0,1% so với khối lượng cơ thể, trong mật ong có khoảng 30% glucose Ngoài ra, chúng còn là thành phần của polysaccharide, đường sữa, mạch nha

Khi hòa tan trong nước tạo dung dịch, glucose có sự cân bằng, chuyển hóa qua lại và tồn tại cả ba dạng cấu tạo mạch hở và mạch vòng , trong đó dạng vòng hiện diện nhiều hơn

2.1.1.1 Tính chất lý hóa của đường glucose

Glucose là chất rắn, kết tinh, không màu, có phân tử lượng là 180,16 g/mol, tỷ trọng là 1,54 g/cm3, tan nhiều trong nước, không tan trong các dung môi hữu cơ, có vị ngọt (độ ngọt bằng 0,6 lần so với saccharose), không bay hơi, có tính hoạt quang là làm lệch mặt phẳng của ánh sáng phân cực khi cho ánh sáng đi qua dung dịch đường

Từ dung dịch nước loãng, glucose tạo tinh thể với một phân tử nước (C6H12O6.H2O)

trong nhiệt độ từ 5,3o đến 50oC Từ dung dịch nước đặc hoặc rượu etylic, chúng kết

tinh không ngậm nước Hệ cân bằng trong nước của D – glucose là [α]D20 = + 52,5o

Bảng 2.1 Các dạng tồn tại chính của D – glucose (Từ Văn Mặc, 2002)

tnc Trị số [α]D20 trong nước

α - D – glucopyranose 146oC + 112,2o Nước

β – D - glucopyranose 148o - 150oC + 18,9o Pyridin

Trong môi trường kiềm, glucose khử các ion kim loại nặng có hoá trị cao thành

ion có hóa trị thấp hay các ion kim loại thành kim loại, tạo kết tủa đỏ gạch với dung

dịch CuSO4 (ứng dụng để định lượng đường khử theo phương pháp Bectrand)

Dưới tác dụng của acid đậm đặc, glucose biến thành hydroxymethylfurfural

Sản phẩm này khi cho tác dụng với phenol cho màu đặc trưng như: α naphthol cho

vòng màu tím (Molisch) Đây là phản ứng để phân biệt đường với các chất khác

2.1.1.2 Điều chế và ứng dụng của đường glucose

Trong công nghiệp, glucose được điều chế bằng cách thủy phân tinh bột nhờ

xúc tác là acid chlohydride loãng hay enzyme Ngoài ra, glucose cũng có thể được

điều chế từ cellulose (ví dụ cellulose có trong vỏ bào, mùn cưa nhờ xúc tác của acid

chlohydride đặc)

Trong công nghệ thực phẩm (lên men bia, đồ uống có cồn, sản xuất bánh kẹo,

đồ hộp) glucose mang lại cấu trúc mềm mại, vị ngọt dịu cho thực phẩm Trong lên

men bia, chúng được sử dụng như cơ chất có khả năng lên men bổ sung để làm giảm

lượng carbohydrate và lượng calo trong các loại bia năng lượng thấp

Đặc biệt trong lĩnh vực y học, glucose làm thuốc bổ tăng lực, chúng được dùng

như đồ uống hoặc tiêm tĩnh mạch để điều trị thiếu hụt đường Glucose được ứng dụng

để điều trị chứng hạ đường huyết, làm chất vận chuyển các thuốc khác qua đường

truyền dịch nhưng lượng glucose trong dịch truyền không vượt quá 10%, nếu không sẽ

gây sốc cho bệnh nhân

Ngoài ra, trong công nghiệp, glucose được chuyển hóa từ saccharose dùng để

điều chế sorbitol, acid gluconic, tham gia phản ứng tráng gương (gắn lớp kim loại bạc

lên thủy tinh tạo gương soi, bình thủy giữ nhiệt, linh kiện điện tử)

2.1.2 Đường fructose sử dụng trong thực phẩm

Tên khoa hoc: Fructose

Danh pháp theo IUPAC: Fructofuranose

Fructose là một loại đường đơn, đồng phân với glucose, là đường ketose, chứa nhiều nhóm rượu và một nhóm chức là ketone Fructose có cấu tạo mạch hở và mạch vòng, trong dung dịch có sự cân bằng tồn tại cả dạng mạch hở lẫn mạch vòng

Công thức phân tử: C6H12O6 (∆ = 1=> có 1 liên kết đôi hoặc 1 vòng)

Fructose là thành phần của saccharose, chúng còn gọi là đường quả, có ở trạng thái tự do trong trái cây chín và mật ong (khoảng 40%).Trong cơ thể, chúng ở dạng ester với acid phosphoric đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất

b) a)

Hình 2.3 Mô hình phân tử D – Fructose (a) Dạng thẳng; (b) Dạng vòng

(en.wikipedia.org)

Hình 2.4 Các dạng tồn tại của D - Fructose trong dung dịch (www.jagemann-net)

Fructose là chất rắn kết tinh, có phân tử lượng là 180,16 g/mol, tỷ trọng là 1,694 g/cm3, nóng chảy ở khoảng nhiệt độ 102o – 104oC, dễ hòa tan trong nước, có vị ngọt (gấp 1,5 lần saccharose, gấp 2,5 lần glucose, và dạng α có độ ngọt bằng 1/3 dạng β), không bay hơi, có tính hoạt quang: Làm lệch mặt phẳng của ánh sáng phân cực khi cho ánh sáng đi qua dung dịch đường Từ dung dịch nước đặc, fructose kết tinh ngậm 0,5 phân tử nước (C6H12O6.0,5 H2O) Trị số ban đầu của fructose là [α]D20 = - 133o.và trị số cuối cùng là [α]D20 = - 91,3o trong dung dịch nước 10%

Fructose cũng có một số hóa tính tương tự glucose: Tính chất của một rượu đa chức và của một aldehyde (trong môi trường kiềm khi có sự chuyển hóa giữa fructose thành glucose)

Hình 2.5 Sự chuyển hóa của fructose trong môi trường kiềm (http://en.wikipedia.org)

2.1.3 Đường saccharose sử dụng trong thực phẩm

Tên khoa học: Saccharose

Danh pháp theo IUPAC: O-α-D-glucopyranosyl-(1 2)-D – fructofuranoside

Saccharose có nhiều trong mía, thốt nốt, củ cải đường Chúng là disaccharide thường gặp nhất, được tạo ra nhờ hai monosaccharide là α-glucose và β-fructose liên kết với nhau bằng liên kết 1,2 α – glycoside nên không có tính khử

Công thức phân tử: C12H22O11 (Δ = 2 => Có 2 vòng no)

Hình 2.6 Mô hình phân tử Saccharrose (chemistry.about.com)

Hình 2.7 Công thức cấu tạo của Saccharose (www.chm.bris)

2.1.3.1 Tính chất lý hóa của đường saccharose

Saccharose hiện diện dạng rắn ở điều kiện thường, không màu, không mùi, có phân tử lượng là 342,3 g/mol, tỷ trọng là 1,587 g/cm3, nóng chảy ở 186oC, có vị ngọt, tan nhiều trong nước, ít tan trong rượu, không bay hơi, có tính hoạt quang: Làm lệch mặt phẳng của ánh sáng phân cực khi cho ánh sáng đi qua dung dịch đường Độ quang hoạt của saccharose [α]D20 = + 66,5o Khi đun nóng đến 170oC, chúng chuyển thành dạng caramen Trong môi trường acid loãng, đặc biệt là ở nhiệt độ cao, chúng bị thủy phân thành hỗn hợp (glucose + fructose), và chuyển từ cực quay phải sang cực quay trái (hiện tượng nghịch đảo đường)

Hình 2.8 Phản ứng thủy phân Saccharose

2.1.3.2 Sản xuất và ứng dụng của đường saccharose

Saccharose được sản xuất từ cây mía, củ cải đường hoặc hoa thốt nốt

Trong công nghiệp thực phẩm, saccharose dùng làm chất tạo ngọt, đồng thời là chất bảo quản trong nhiều loại thực phẩm Trong công nghiệp dược phẩm, saccharose được dùng để pha chế thuốc Ngoài ra, chúng là nguyên liệu để thủy phân thành glucose và fructose dùng trong kỹ thuật tráng gương và tráng ruột phích

2.2 Tác động của đường fructose, glucose, saccharose lên cơ thể

Bên cạnh những lợi ích của đường như cung cấp năng lượng cho các tế bào và giúp cơ thể khỏe mạnh, các nghiên cứu về đường cho thấy việc dùng đường quá mức

là nguyên nhân gây ra bệnh béo phì, tim mạch, tiểu đường, răng miệng Đặc biệt, theo Văn phòng Nghiên cứu Kinh tế của Bộ Nông nghiệp Mỹ (2011) cho thấy tỷ lệ các bệnh này gia tăng cùng với sự ra đời của High Fructose Corn Syrup (HFCS)

Về khía cạnh ảnh hưởng của đường đến hoạt động của não bộ, theo nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc trường Đại học Y Ucla (Mỹ) cho biết bộ não cần phải tiếp nhận tín hiệu từ một protein tên là Leptin để kiểm soát việc hấp thu và giải phóng năng lượng Trong khi đó, fructose lại cắt đứt mối liên lạc giữa não bộ và protein này làm

cơ thể có cảm giác đói liên tục và quá trình trao đổi chất trong cơ thể bị rối loạn Do

đó, cơ thể tiêu thụ một lượng đường fructose cao dễ gây tổn hại cho cơ thể và não bộ

Ảnh hưởng của đường đến tim mạch là do đường chuyển hóa vào trong cơ thể được xử lý bởi gan Quá trình này làm sản sinh ra một chất gọi là Lipoprotein tỷ trọng thấp (Very low density lipoprotein - VLDL), một loại cholesterol gây ra bệnh tim mạch Một nghiên cứu được thực hiện tại trường Đại học Emory ở Atlanta cho thấy chế độ ăn nhiều đường liên quan tới việc làm tăng nồng độ triglyceride và giảm Lipoprotein tỷ trọng cao (High density lipoprotein – HDL), loại cholesterol có lợi cho

cơ thể Hơn nữa, theo tuyên bố khoa học của Hiệp hội Tim mạch Mỹ, nếu lượng đường đưa vào cơ thể quá lớn làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, đột quỵ, tăng nồng độ acid Uric trong máu dẫn đến bệnh tăng huyết áp

Đường có thể gây ra bệnh tiểu đường tuýp 2 do chỉ ít hơn 1% tuyến tụy trong

cơ thể được dùng cho việc sản xuất insulin Nếu ăn quá nhiều đường trong một lúc, đường trong máu tăng lên đột ngột đến 200 – 400 mg/L ( giới hạn là 80 – 120 mg/L),

tế bào tụy không đủ tạo insulin làm cho việc chuyển hóa glucose thành glucopen ở gan

và cơ bị giảm, thận làm việc quá tải và đường theo nước tiểu ra ngoài Hơn nữa, lượng

đường đưa vào cơ thể vượt mức cho phép, nhu cầu insulin tăng lên có thể dẫn đến độ nhạy của các thụ cảm insulin giảm đi, và cần nhiều insulin hơn để làm cùng một việc dẫn đến hiện tượng kháng insulin Đây là nguyên nhân gây bệnh tiểu đường tuýp 2

Đường làm giảm khả năng hấp thu chất dinh dưỡng: do ăn quá nhiều đường làm giảm khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng thiết yếu, đặc biệt là vitamin A, C,

B12, Ca, P, Mg và Fe Từ đó, gây ảnh hưởng không tốt đến chức năng miễn dịch của cơ thể, tăng nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, tiểu đường, và ung thư Thí nghiệm cho thấy saccharose có tính ức chế rất mạnh việc tổng hợp vitamin B1 trong cơ thể Nếu bổ sung vitamin B1 không đủ khi chuyển hóa đường sẽ sinh ra urê Mặt khác, loại thực phẩm chứa đường cung cấp nhiều calo mà không chứa nhiều chất dinh dưỡng nên thường dẫn đến tăng cân và béo phì Ngoài ra, lượng đường trong máu tăng cao có thể kích thích hormone gây tình trạng cáu kỉnh, bực bội

Đường thúc đẩy quá trình lão hóa do một phần đường hấp thụ sau khi vào máu

sẽ trở thành protein Những phân tử protein mới này góp phần làm mất đi tính đàn hồi của các mô, dẫn đến lão hoá ở da và các bộ phận khác Lượng đường lưu thông trong máu càng nhiều càng đẩy nhanh quá trình lão hoá

Đường gián tiếp gây hại cho răng là do một số loại vi khuẩn tạo acid lactic trên môi trường có carbohydrate (frucose, glucose, saccharose) lên men gây ra như các loài

Lactobacillus, Streptococcus mutan, Actinomyces.) Theo Hiệp Hội Nha Khoa Hoa

Kỳ, thực phẩm và đồ uống chứa nhiều đường là môi trường tốt cho các vi khuẩn này phá hủy men răng, thúc đẩy sâu răng (vinmec.com)

2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò chỉ số khúc xạ

2.3.2 Khái quát về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nguyên tắc: là một kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử trong một hỗn hợp, có thể dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ Kỹ thuật bao gồm một pha rắn cố định (pha tĩnh) được nhồi vào một cột thép không rỉ và một pha lỏng di động (pha động) chạy qua Việc phân tách các cấu tử trong dung dịch được thực hiện là nhờ

sự khác nhau về tỷ số phân bố của các chất tan giữa hai pha dựa trên các cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc kích cỡ tuỳ thuộc vào kiểu pha tĩnh đem sử dụng

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chất sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), HPLC được chia thành 4 loại sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel

2.3.3 Cấu tạo và các bộ phận của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hệ thống HPLC gồm có các bộ phận cơ bản như sau:

Hình 2.9 Sơ đồ hệ thống HPLC (www.case.vn)

1: Bình chứa pha động 6: Đầu dò

2: Bộ phận khử khí 7: Hệ thống máy tính

4: Bộ phận tiêm mẫu 9: Bình chứa nước thải

5: Cột sắc ký

Bình chứa pha động dùng để chứa pha động, tùy vào mô hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi Đối với pha thuận, dung môi thường không phân cực Đối với pha đảo, sử dụng pha trộn giữa nước và dung môi hữu cơ phân cực như acetonitrile (CH3CN), methanol (CH3OH)

Bơm cao áp là thành phần rất quan trọng trong hệ thống sắc ký lỏng Mục đích

là bơm pha động vào cột để thực hiện quá trình tách các hợp chất có tính chất khác nhau trên cột sắc ký Bơm thông thường có thể đạt được áp suất cao tới 600 bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10 mL/ phút Bơm gồm hai chế độ đẳng dòng (thành phần pha động không thay đổi) và gradient dòng (thành phần pha động thay đổi) trong quá trình phân tích

Bộ phận tiêm mẫu để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi Có 2 cách đưa mẫu vào cột là tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động

Cột sắc ký được xem là trái tim của của hệ thống HPLC Thông thường, chúng được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25 cm, đường kính trong 1-10

mm, hạt nhồi cỡ 0,3-5 µm Vật liệu chế tạo pha tĩnh thường được làm bằng silica gel hoặc slica có gắn nhóm hữu cơ hay polyme

Đầu dò là bộ phận phát hiện các hỗn hợp các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Có nhiều loại đầu dò khác nhau được sử dụng ( UV, UV – vis, điện hóa, khối phổ, khúc xạ, huỳnh quang) dựa vào sự thay đổi tính chất của pha động ( chỉ số khúc xạ, độ dẫn, chất phân tích) hay đặc tính của chất phân tích (độ hấp thu, sự phát huỳnh quang)

2.4 Các phương pháp có thể xác định hàm lượng đường

2.4.1 Phương pháp hóa học

Đây là phương pháp truyền thống dùng để xác định hàm lượng đường trong mẫu thực phẩm Dựa trên nguyên tắc các đường có các tác nhân khử có thể phản ứng lại với các thành phần khác để tạo ra các kết tủa hoặc phức hợp màu Đối với các đường không khử có thể xác định hàm lượng sau phản ứng thủy phân

2.4.1.1 Phương pháp chuẩn độ

Định lượng đường tổng số theo phương pháp Bectorang: Chiết đường tổng số

từ mẫu bằng nước nóng, dùng acid chlohydric thủy phân thành đường glucose, lượng glucose được xác định qua các phản ứng với dung dịch Felling, sắt (III) sunfat, kali pemanganat

Định lượng đường khử bằng phương pháp Lane – Eynon: Dựa trên khả năng làm mất màu của đường khử trong phản ứng oxy hóa đường khử bằng dung dịch Fehling dùng methyl xanh làm chất chỉ thị Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nghành sản xuất mía đường , đường glucose, sản xuất bánh kẹo Tuy nhiên, để phân tích hàm lượng đường trong dung dịch đường hóa và đường sót trong dung dịch lên men thường dùng phương pháp Graxinop thay cho phương pháp này

2.4.1.2 Phương pháp đo màu

Đo mật độ quang của dung dịch rồi suy ra nồng độ đường dựa vào định luật hấp phụ ánh sáng của Lambert – Beer

Định lượng đường tổng số bằng phương pháp Phenol – acid sunfuric: Phương pháp sử dụng phenol – acid sunfuric đậm đặc dùng để xác định nồng độ đường trong một dung dịch Acid sunfuric đậm đặc sẽ cắt các polysaccharide thành các

monosaccharide, các monosaccharide này sẽ bị khử thành các chất trung gian, và dưới

sự hiện diện của phenol, những chất trung gian này sẽ tạo thành những sản phẩm màu vàng và hấp phụ ở bước sóng 490 nm

Định lượng các hexsose bằng phương pháp Anthrone: Phương pháp sử dụng thuốc thử anthrone 0,2% và acid sunfuric đậm đặc dùng để xác định nồng độ đường trong một dung dịch Acid sunfuric đậm đặc sẽ cắt các polysaccharide thành các monosaccharide, các monosaccharide này sẽ bị khử thành các chất trung gian, và dưới

sự hiện diện của thuốc thử , những chất trung gian này sẽ tạo thành những sản phẩm màu xanh lá cây hơi đậm và hấp phụ ở bước sóng 620 nm (nhưng thường đo ở bước sóng 585 nm để tránh ảnh hưởng của protein)(Nguyễn Xuân Phương, 2005)

Với phương pháp hóa học, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện để xác định đường có trong các mẫu phân tích Tiêu biểu năm 2005, Plonjarean đã phân tích và định lượng được đường trên 13 giống đậu tương Gần đây, Okoye (2008) đã đánh giá 3 phương pháp hóa học phân tích đường khử để xác định đường trong 8 mẫu trái cây Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa 3 phương pháp phân tích và các phương pháp này có thể dùng để xác định hàm lượng đường trong các nguyên liệu thực phẩm chứa ít hàm lượng đường

2.4.2 Phương pháp vật lý

Xác định đường bằng phương pháp phân cực dựa trên tính chất cơ bản của đường là khả năng phân cực ánh sáng Khi ánh sáng đi qua dung dịch chứa đường sẽ tạo thành một góc quay cực Trị số góc quay cực phụ thuộc vào nồng độ của chúng trong dung dịch, có thể sử dụng phân cực kế hoặc đường kế để phân tích

2.4.3 Phương pháp enzyme

Dựa trên khả năng của enzyme xúc tác các phản ứng đặc hiệu trong dung dịch Glucose được chuyển thành glucose – 6 – phosphate (G6P) và ADP nhờ sự xúc tác của enzyme hexakinase và ATP Tiếp theo, trong sự hiện diện của G6P – dehydrogenase (G6P – DH) và NADP, G6P bị oxi hóa thành gluconate – 6 – phosphate và NADPH Lượng NADPH tạo thành trong phản ứng tỉ lệ thuận với hàm lượng glucose Đo mật độ quang ở bước sóng 340 nm

Fructose được phân tích tương tự như glucose, nhưng trước tiên fructose cần được chuyển hóa thành glucose nhờ enzyme Phospho – Glucose isomerase

Trước khi phân tích, saccharose được thủy phân thành các thành phần glucose

và fructose Nồng độ glucose và fructose được xác định theo phương pháp trên

D – Fructose + ATP Fructose – 6 – phosphate + ADP

Phospho – Glucose isomeras F6P G6P G6P dehydrogenase

G6P + NADP+ Gluconate – 6 – phosphate + NADPH + H+

2.4.4 Phương pháp sắc ký

Là phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với hệ thống (hệ thống gồm 2 pha tĩnh và pha động) Hiệu quả của từng phương pháp sắc ký phụ thuộc vào sự lựa chọn giữa pha động và pha tĩnh

Sắc ký giấy: Hệ thống dung môi dùng để phân tách đường: N1: Butanol:acid acetic:nước (4:1:5), dùng cho giấy sắc ký N3, chạy 2 lần (2 ngày); N2: Pyridin:acetate:nước (1:2:2), dùng cho giấy sắc ký N1, chạy 18 giờ đối với monosaccharide, hoặc giấy N3 (chạy 2-6 ngày cho oligosaccharide); N3: Pyridin:acetate etyl:acid acetic:nước (5:5:1:3), dùng cho giấy sắc ký N1 hoặc N3 Tuy nhiên, hỗn hợp phân tách đường sử dụng dung môi N1 và hỗn hợp hiện hình N3 cho kết quả tốt nhất (Hà Duyên Tư, 2009) Tiếp theo, đường có thể định lượng bằng phương pháp so màu hoặc đo mật độ quang Đây là phương pháp rất đơn giản, cho độ nhạy cao, có ý nghĩa trong phân tích hữu cơ và hóa sinh

Sắc ký lớp mỏng: Các đường hexose được tách tốt khi dùng silica gel 60 và hệ thống dung môi: isopropanol:acetate etyl:nước (4:3:1 hoặc 5:4:1) Hiện hình bằng các hóa chất giống sắc ký giấy, hoặc có thể sử dụng dung dịch acid sunfuric 5%, sấy 100 –

105oC trong 20 phút hoặc 150oC trong 10 phút Phương pháp đã được Farag (1978) dùng để tách và phân tích một số loại đường trong củ cải và nước ép trái cây Năm

1990, Fell đã phân tích định lượng đường trong huyết tương sâu bọ bằng phương pháp

cải tiến hơn là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) sử dụng dung môi ACN:H2O (85:15; v/v) và phát hiện bằng thuốc thử Ceric sulphate Kết quả cho độ phân tách tốt, hiệu suất thu hồi cao, và phân tách đồng thời nhiều mẫu, độ chính xác của phân tích cao, tiết kiệm thời gian phân tích mẫu

Sắc ký cột: Có nhiều phương pháp định lượng glucid bằng sắc ký cột dựa trên

cơ sở khác nhau về cách dùng các chất mang khác nhau Để phân tách các monosaccharide thường dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion dưới dạng borat hóa Các monosaccharide tác dụng với borat cho một phức acid có thể tách được bằng cột resin kiềm mạnh Khả năng gắn của phức borat trên resin phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, số gốc hydroxyl và sự liên kết không gian của phân tử Phương pháp này rất nhạy với hàm lượng monosaccharide trong khoảng từ 0,7 – 4 g Sau khi tách bằng cột sắc ký, các monosaccharide được xác định bằng phương pháp sắc kế

Sắc ký khí: Trước khi phân tích, đường phải cắt các mạch glycoside bằng cách thủy phân hoặc methanol hóa Sau đó, biến tính các monosaccharide để tạo hợp chất bay hơi như metyl hóa, acyl hóa, trimethylsilyl hóa hoặc dưới dạng butylloboronat Tuy nhiên, các monosaccharide thường cho nhiều peak nên phần lớn chúng được khử thành các polyol hoặc chuyển chúng thành oxim trước khi chuyển sang hỗn hợp bay hơi Năm 1975, Nurok và Reardon đã sử dụng phương pháp này với cột mao quản hở

để phân tích định lượng đường trong các sản phẩm công nghiệp khác nhau Đây là báo cáo đầu tiên về định lượng đường sử dụng cột sắc ký mao quản hở, tạo dẫn xuất trimethylsilyl Kết quả cho thấy phương pháp này ít tốn thời gian, các đỉnh phân tách sắc nét hơn cho phép định lượng đường chính xác hơn sử dụng với cột mao quản nhồi Lehrfeld (1987) cũng đã xác định đồng thời hỗn hợp chứa các aldose và các acid alduronic bằng phương pháp sắc ký khí Phương pháp phân tích đã được tác giả báo cáo vào 1984 Tuy nhiên, nó được cải thiện rõ rệt bằng cách sử dụng cột mao quản lỗ rộng và đã cho phép xác định chính xác hàm lượng aldose và acid alduronic trong hỗn hợp carbohydrate phức tạp Vào năm 1997, Feller và cộng sự đã xác định carbohydrate trong hai mẫu đất ở Ferrara (miền Bắc nước Ý) bằng sắc ký khí mao quản sử dụng đầu

dò ion hóa ngọn lửa Kết quả cho thấy tạo dẫn xuất trimethylsilyl (TMS) nhanh, hiệu quả và chính xác, hàm lượng đường tổng trong mẫu không có sự khác biệt đáng kể so với tạo dẫn xuất alditol acetate Tuy nhiên, dẫn xuất TMS có những bất lợi là không

bền so với alditol acetate và xảy ra hiện tượng đa peak do sự hình thành các anomer (Nguyễn Xuân Phương, 2005)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao: Năm 1967, Harvath C, là tác giả đầu tiên đã tạo ra máy HPLC để nghiên cứu nucleotide Ngày nay, với các ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, phân tích nhanh, khắc phục được các nhược điểm của sắc ký khí, phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi trong việc tách hỗn hợp các chất và phù hợp để phân tích đường

Bảng 2.2 Bảng tóm tắt ưu nhược điểm của các phương pháp phân tích đường

Kết quả phụ thuộc vào thời gian phản ứng, nồng độ thuốc thử, không phân biệt được các loại đường

Vật lý Đơn giản, nhanh Dễ ảnh hưởng bởi nhiệt độ

nhanh, nhạy với nồng độ đường thấp

Oligosaccharide cũng có thể chuyển hóa thành monosaccharide

Điều kiện tạo dẫn xuất khó khăn, không ổn định theo thời gian, hiệu suất thu hồi không cao, không phù hợp với tính chất của đường

Sắc ký HPLC

Phù hợp để phân tích hợp chất đường Độ phân giải cao, phân tích nhanh, khắc phục các nhược điểm của sắc ký khí

Thiết bị đắt tiền, đòi hỏi tay nghề cao

Qua các phương pháp có thể dùng để phân tích đường cho thấy mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng nên tùy vào từng mục đích mà chọn lựa phương pháp phân tích cho phù hợp Với mục đích phân tích hợp chất đường, dựa vào đặc tính khó bay hơi, dễ bị phân hủy bởi nhiệt, nếu dùng phương pháp sắc ký khí thì định lượng đường thiếu chính xác, hiệu suất thu hồi thấp, đem lại hiệu quả không cao Mặt khác, đường không có cấu trúc hấp thụ tia UV hay cấu trúc phát huỳnh quang nên sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò UV – vis hay đầu dò huỳnh quang sẽ gây khó khăn trong việc xác định hàm lượng đường Tuy nhiên, dựa vào khả năng phân cực ánh sáng của chúng, phương pháp HPLC sử dụng đầu dò chỉ số khúc xạ được ưu tiên, với nhiều thuận lợi trong quá trình xử lý mẫu, không cần phải tạo dẫn xuất bay hơi, bền nhiệt, tạo cấu trúc hấp thụ tia UV hay cấu trúc phát huỳnh quang

Với những ưu điểm vượt bật đó, phương pháp HPLC - RI đã sớm được sử dụng vào những năm 1970 để phân tích hỗn hợp các chất và ngày càng trở nên phổ biến Trên thế giới, có rất nhiều nghiên cứu về phân tích đường như Langemeier và Rogers (1995) đã dùng phương pháp này để xác định hàm lượng đường trong một số mẫu thực phẩm và Sesta (2005) đã phân tích đường trong 97 mẫu mật ong khác nhau Năm

2003, Karkacier và cộng sự đã so sánh sự khác biệt giữa chiết xuất đường bằng nước

và methanol, sử dụng đầu dò chỉ số khúc xạ và đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến Gần đây, Lateef (2011) đã xác định hàm lượng đường tổng có trong syrô cây thích để đáp ứng yêu cầu ghi nhãn của FDA

Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam, phân tích đường bằng phương pháp HPLC -

RI vẫn chưa được sử dụng phổ biến, hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước vẫn chủ yếu dùng các phương pháp truyền thống để xác định hàm lượng đường có trong mẫu phân tích Do đó, việc tìm ra một phương pháp phân tích đường chính xác với các ưu điểm nhanh, đơn giản, chi phí thấp, có thể khắc phục một số nhược điểm của phương pháp truyền thống và phù hợp với điều kiện phân tích của từng phòng thí nghiệm là vô cùng có ý nghĩa

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ 15/02/2012 đến 15/06/2012 tại phòng Sắc ký – Quang phổ thuộc Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3, Biên Hòa, Đồng Nai

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu thực phẩm do Trung tâm cung cấp: Một số mẫu bánh quy và mẫu nước giải khát

Hình 3.1 Mẫu thực phẩm để phân tích (a) Mẫu bánh; (b) Mẫu nước giải khát;(c) Các chuẩn đường (d): Mẫu bánh sau khi nghiền

Hình 3.2 Hệ thống HPLC - RI tại phòng Sắc ký - Quang phổ

Cân phân tích (sai số 0.01mg) Bình định mức các loại

Hệ thống lọc dung môi Chuẩn đường fructose, glucose,

saccharose (Sigma) Máy ly tâm

Methanol (Merck) Máy lắc (vortex)

Acetonitrile (ACN)(Merck) Ống ly tâm nhựa

Acid acetic(Merck) Giấy lọc băng xanh

Petroleum ether (Trung Quốc)

Pipet tự động các loại

Chỉ sử dụng hóa chất được công nhận đạt chuẩn chất lượng tinh khiết phân tích

và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696) Các dung môi phải đạt chất lượng (độ tinh khiết >= 99) dùng cho phân tích HPLC

Dung dịch pha động: Sau khi khảo sát dung dịch ACN:H2O với những tỷ lệ khác nhau (v/v), đề tài đã chọn được pha động thích hợp để phân tích ba loại đường (fructose, glucose, saccharose).là ACN:H2O với tỷ lệ 80:20 (v/v) Hút 200 mL H2O vào ống đong 1 lít và định mức bằng ACN

Dung dịch chuẩn gốc đường (1000 mg/L): Cân 10 mg chuẩn gốc đường vào bình định mức 10 mL và định mức tới vạch bằng nước cất

Dung dịch chuẩn làm việc đường: Được hút từ dung dịch chuẩn gốc đường

1000 mg/L với những nồng độ khác nhau vào bình định mức 10 mL và định mức tới vạch bằng dung dịch hòa tan đường ACN:H2O (80:20, v/v)

Sau khi khảo sát khoảng tuyến tính, đề tài đã dựng được đường chuẩn để phân tích đường trong khoảng nồng độ (20; 50; 100; 200; 400) mg/L Hút (0,2; 0,5; 1; 2; 4)

mL dung dịch chuẩn gốc đường 1000 mg/L vào bình định mức 10 mL và định mức tới vạch bằng dung dịch hòa tan đường ACN:H2O (80:20, v/v)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Tóm tắt các bước thực nghiệm

Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn 5 điểm của đường (fructose, glucose, saccharose) ở các nồng độ khác nhau

Xác định hàm lượng 3 loại đường trên mẫu thử bằng phương pháp

HPLC – RI, chiết đường bằng nước nóng, xử lý mẫu theo AOAC

Xác định hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích

Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp

Khảo sát trên một số mẫu thật

Hình 3.3 Sơ đồ tóm tắt các bước thực nghiệm

3.3.1 Phương pháp phân tích đường

Dựa trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu đã được công bố và một số kinh nghiệm thực tế trong quá trình xử lý mẫu kết hợp với tính chất lý hóa của đường,

đề tài thực hiện chiết tách đường trong mẫu theo phương pháp chiết bằng nước nóng,

áp dụng quy trình xử lý mẫu theo AOAC Official Method 980.13

Chuẩn bị mẫu: Quá trình này đóng vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng đến kết quả phân tích.Trước khi phân tích đường, cần chuẩn bị các mẫu phân tích và dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn

20

21

Mẫu NGK: Lấy khoảng 100 mL mẫu đem siêu âm trong 10 phút Sau đó, hút 10

mL mẫu vào bình 100 mL và định mức bằng nước cất Hút chính xác 0,5 mL dịch mẫu vào bình định mức 10 mL và định mức tới vạch bằng dung dịch pha động

Mẫu bánh: Cân chính xác khoảng 5 g mẫu vào bình định mức 100 mL.Thêm từ

từ khoảng 70 mL nước cất, lắc nhẹ, đặt trong bếp cách thủy ở 70oC trong 30 phút Lấy

ra, để nguội về nhiệt độ phòng và định mức tới vạch bằng nước cất Tiếp đó, lấy khoảng 40 mL dung dịch mẫu vào ống nhựa có dung tích 50 mL đem ly tâm 10 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút Sau ly tâm, lọc mẫu qua giấy lọc băng xanh, lấy khoảng 20 mL dịch lọc cho vào ống nhựa dung tích 50 mL, thêm 20 mL ether dầu hỏa, lắc đều, ly tâm

10 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút Sau đó, loại bỏ lớp ether dầu hỏa phía trên, hút chính xác 1 mL dịch mẫu vào bình định mức 50 mL và định mức tới vạch bằng dung dịch pha động, lọc qua giấy lọc 0,45 µm Dung dịch sau khi lọc đã sẵn sàng tiêm vào hệ thống HPLC-RI

Các điều kiện tối ưu của sắc ký:

Đầu tiên, cân bằng cột bằng pha động trong 30 phút trước khi tiêm chuẩn hay tiêm mẫu Sau khi phân tích, phải rửa cột hơn 30 phút

Phân tích đường chuẩn và mẫu bằng hệ thống HPLC với đầu dò chỉ số khúc xạ (RID) sử dụng các điều kiện sau:

Cột phân tích sắc ký LiChrospher® NH2 (Merck): kích thước 250 mm x 4,6

mm, kích thước hạt 5 µm

Thông số của đầu dò RI:

Nhiệt độ đầu dò RI: 35oC

Độ nhạy: 16 Cực: Dương (+) Đơn vị đo: mV

3.3.1.1 Phân tích dữ liệu và tính toán kết quả

Sau khi bơm chuẩn, sẽ có những dữ liệu thu từ máy tính như thời gian lưu của peak, diện tích của peak thể hiện trên sắc ký đồ Các thông số này được dùng để định tính hay định lượng mẫu phân tích

Theo nguyên tắc, đường chuẩn được phân tách trước với các nồng độ khác nhau

để làm dữ liệu cho công việc tính toán mẫu bằng phương pháp ngoại chuẩn

Định tính: Để phát hiện được các loại đường, phương pháp thông thường là dựa vào thời gian lưu của mẫu chuẩn đã được thực hiện chạy sắc ký trước Sau đó, thời gian lưu của mẫu được so sánh với chuẩn và dựa vào đó ta có thể xác định được từng loại đường tương ứng với từng diện tích peak

Định lượng: Dùng chuẩn với các nồng độ khác nhau, lập phương trình hồi quy giữa diện tích peak và nồng độ với hệ số tương quan xác định Từ diện tích peak của mẫu đã biết qua quá trình chạy, có thể tính nồng độ cho từng loại đường

Tính toán kết quả phân tích mẫu khảo sát:

Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích peak thu được của dung dịch chuẩn và nồng độ của từng loại theo quan hệ tuyến tính bậc 1:

y = ax +b Trong đó:

Trong đó:

C: Hàm lượng đường thực chất cần phân tích có trong mẫu (g/100 g) hoặc (g/100 mL)

C0: Hàm lượng đường cần phân tích từ đường chuẩn (mg/L)

m: Khối lượng mẫu bánh đem phân tích (g)

V0: Thể tích mẫu NGK đem phân tích (mL)

f: Hệ số pha loãng mẫu

CF: Hàm lượng đường fructose có trong 100 g (hay 100 mL) mẫu phân tích

CG: Hàm lượng đường glucose có trong 100 g (hay 100 mL) mẫu phân tích

CS: Hàm lượng đường saccharose có trong 100 g (hay 100 mL) mẫu phân tích

3.3.2 Khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích

Nhằm đánh giá độ chính xác của quy trình phân tích, đề tài tiến hành xác định hiệu suất thu hồi như sau:

Trước khi xác định hiệu suất thu hồi, cần tiến hành định lượng đường có trong các mẫu thử Sau khi chiết đường bằng nước nóng ở các nhiệt độ khác nhau để xác định hàm lượng ba loại đường chính có trong mẫu phân tích Kết quả cho thấy thời gian ảnh hưởng không đáng kể đến sự thủy phân của đường khi chiết cùng ở nhiệt độ

là 70oC Do đó, đề tài quyết định chọn chiết đường bằng nước nóng ở 70oC trong 30 phút, xử lý mẫu theo quy trình AOAC Official Method 980.13 và được phân tích trên

hệ thống HPLC – RI với các điều kiện sắc ký đã tối ưu để tiến hành xác định hiệu suất thu hồi

Đối với dung dịch nền của mẫu NGK được xác định bằng cách hút chính xác 10

mL mẫu vào bình định mức 100 mL Dung dịch nền được chuẩn bị tương tự mẫu thử Dung dịch thêm chuẩn của mẫu NGK được xác định bằng cách cân chính xác khối

23

lượng các chuẩn đường cần thêm vào bình định mức có chứa sẵn 10 mL mẫu Tiếp tục thực hiện các bước chuẩn bị mẫu thêm chuẩn tương tự mẫu thử (sơ đồ quy trình)

Dung dịch nền của mẫu bánh được xác định bằng cách cân chính xác khoảng 5

g mẫu đã nghiền mịn vào bình định mức 100 mL Dung dịch nền được chuẩn bị tương

tự mẫu thử Dung dịch thêm chuẩn của mẫu bánh được xác định bằng cách cân chính xác khối lượng các chuẩn đường cần thêm vào bình định mức có chứa sẵn 5 g mẫu Tiếp tục thực hiện các bước chuẩn bị mẫu thêm chuẩn tương tự mẫu thử

Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức:

Trong đó:

R: Hiệu suất thu hồi (%)

Cm+c: Hàm lượng đường có trong mẫu thêm chuẩn xác định được theo quy trình phân tích

Cm: Hàm lượng đường có trong mẫu phân tích

Cc: Hàm lượng đường được thêm vào mẫu

3.3.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) đường của phương pháp

3.3.3.1 Định nghĩa LOD, LOQ

Giới hạn phát hiện (LOD) là cực tiểu phát hiện được của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong nền mẫu xác định mà thiết bị có thể phát hiện định tính được

Giới hạn định lượng (LOQ) là cực tiểu đo được của phương pháp, đó là nồng

độ tối thiểu của một chất trong nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng được trong mức sai số cho phép

3.3.3.2 Cách xác định giới hạn phát hiện (LOD)

Thêm các dung dịch chuẩn đường vào mẫu thực phẩm không phát hiện đường sao cho hàm lượng các chất này có trong mẫu khá nhỏ

LOD và LOQ được tính toán thông qua so sánh cường độ tín hiệu (chiều cao) peak của chất phân tích với đường nền mẫu tại nồng độ Cmin Nồng độ Cmin được chọn

và đưa vào hệ thống phân tích sao cho tỉ số tín hiệu (S) và nhiễu (N) thỏa điều kiện:

10

N

S T

24

Giới hạn phát hiện của phương pháp được tính theo công thức(1) đối với mẫu nước giải khát và (2) đối với mẫu bánh

Trong đó:

Cmin : Nồng độ nhỏ nhất cho vào mẫu trắng

m : Khối lượng mẫu (g)

3.3.4 Khảo sát trên một số mẫu thực tế

Dựa vào các điều kiện đã tối ưu được khảo sát trên mẫu thử, áp dụng quy trình này để tiến hành phân tích một số mẫu thật Định tính các loại đường có trong nền mẫu được dựa trên thời gian lưu của sắc ký đồ, hàm lượng đường trong các mẫu được xác định theo phương pháp ngoại chuẩn

Các mẫu bánh và mẫu NGK được Trung tâm cung cấp

Phân tích mẫu bằng phần mềm Breeze 3.3, tính toán và xử lý số liệu bằng chương trình Microsoft Office Excel 2007

25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn các loại đường fructose, glucose và saccharose để phân tích mẫu nước giải khát và mẫu bánh

Việc xác định khoảng tuyến tính của dãy chuẩn có ý nghĩa rất quan trọng đối với một phương pháp phân tích Việc khảo sát sẽ giúp biết được khoảng nồng độ để lặp dãy chuẩn sao cho ít điểm chuẩn và khoảng tuyến tính rộng Chuẩn bị các dung dịch chuẩn đường fructose, glucose, saccharose có nồng độ từ thấp tới cao để phân tích trên hệ thống HPLC – RI Sau đó, vẽ biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích peak của các chuẩn đường Qua quá trình khảo sát cho thấy đường chuẩn của các loại đường fructose, glucose và saccharose đạt độ tuyến tính cao nhất ở khoảng nồng độ (20; 50; 100; 200; 400) mg/L Kết quả dựng đường chuẩn các loại đường để phân tích mẫu nước giải khát và mẫu bánh được thể hiện trong bảng 4.1 và bảng 4.2

Bảng 4.1 Đường chuẩn các loại đường để phân tích mẫu nước giải khát