XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN (GMF – GENETICALLY MODIFIED FOOD) BẰNG KỸ THUẬT DUPLEX REAL – TIME PCR

Đối với thực vật, thuật ngữ này được dùng để chỉ các loại cây trồng mà bộ gen của chúng đã được chuyển nạp ổn định những gen hữu ích mới bằng các kỹ thuật chuyển nạp gen và trong đa số t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN (GMF – GENETICALLY MODIFIED FOOD)

BẰNG KỸ THUẬT DUPLEX REAL – TIME PCR

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN QUỐC HUY Niên khóa : 2008 – 2012

Tháng 07/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN (GMF – GENETICALLY MODIFIED FOOD)

BẰNG KỸ THUẬT DUPLEX REAL – TIME PCR

TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN QUỐC HUY ThS TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT

Tháng 07/2012

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố

Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Ban Lãnh Đạo Trung Tâm

Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3, Phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài và luận văn tốt nghiệp

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Văn Biết, ThS Phạm Vân An, ThS Trần Thị Ánh Nguyệt, CN Chu Nguyên Thanh cùng các chị trong phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi chu đáo trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các quý Thầy, Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường, cảm ơn tập thể lớp DH08SH đã luôn chia sẻ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp

Và sau cùng, con xin cảm ơn Ba, Mẹ đã luôn khuyến khích, tạo mọi điều kiện cho con được học tập Cám ơn gia đình thân yêu đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho con vững bước qua mọi khó khăn

Xin chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 07 năm 2012

Nguyễn Quốc Huy

ii

TÓM TẮT

Ngày nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen đang được thương mại hóa ngày càng nhiều trên thị trường, trong khi những lợi ích và tác hại của chúng vẫn chưa được xác định rõ Do đó, vấn đề quản lý và kiểm soát đối với các sản phẩm này trở nên rất cần thiết Xuất phát từ thực tế đó, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sàng lọc thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen bằng kỹ thuật Duplex Real-time PCR”, nhằm thiết lập một quy trình thử nghiệm phát hiện đồng thời các trình tự promoter 35S và terminator nos trên một phản ứng, có khả năng áp dụng tại các phòng thí nghiệm về GMO

ở Việt Nam

Đề tài gồm ba nội dung chính, khảo sát các phương pháp tách chiết DNA trên các loại nền mẫu khác nhau, tối ưu hóa phương pháp Duplex Real-time PCR và đánh giá khả năng hoạt động của phương pháp này thông qua việc xác định độ đặc hiệu và độ nhạy

Các kết quả ghi nhận cho thấy phương pháp tách chiết DNA sử dụng CTAB cho hiệu quả tốt hơn nhiều so với phương pháp phenol/chloroform căn bản, tuy nhiên cũng không phát hiện DNA trong các mẫu nước tương, dầu ăn Trong một phản ứng Duplex Real-time PCR, nồng độ primer tối ưu để khuếch đại vùng promoter 35S và terminator nos là 0,3 µM; nồng độ probe tối ưu để phát hiện vùng promoter 35S và terminator nos lần lượt là 0,1 µM và 0,3 µM; nồng độ MgCl2 tối ưu là 1,5 mM Phương pháp Duplex Real-time PCR đã xây dựng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá trị LOD thu được ≤ 0,05%, không xuất hiện hiện tượng dương tính giả hay âm tính giả

The thesis includes three main contents, which are survey of the different DNA extraction methods on many sample matrices, optimization of the Duplex Real-time PCR condition and evaluation of the performance of this method through determining the sensitivity and specifictity

The results indicated that the DNA extraction method using CTAB was better than the phenol/chloroform basis method, but it also could not detect DNA in samples of soy sauce and cooking oil For one optimized Duplex Real-time PCR reaction, the primer concentrations were 0.3 µM for amplification of 35S promoter and nos terminator sequences; the probe concentrations were 0.1 µM and 0.3 µM respectively for detection of 35S promoter and nos terminator sequences; and the MgCl2 concentration was 1.5 mM The designed Duplex Real-time PCR method showed good sensitivity and specificity, LOD value was less than or equal to 0.05%, and there was no case of the false positive as well as false negative result

Key words: DNA extraction, Duplex Real-time PCR, GMF, GMO, 35S promoter, nos terminator

iv

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen 3

2.1.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gen 3

2.1.2 Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen 4

2.2 Quá trình tạo sinh vật biến đổi gen 4

2.2.1 Quá trình cơ bản 4

2.2.2 Cấu trúc cơ bản của một gen chuyển vào thực vật 5

2.2.2.1 Promoter 5

2.2.2.2 Terminator 5

2.2.2.3 Marker chọn lọc 6

2.2.2.4 Gen mục tiêu chuyển vào thực vật 6

2.2.3 Thành tựu chuyển nạp gen vào cây trồng 7

2.2.3.1 Các đặc tính nông nghiệp của cây trồng biến đổi gen 7

2.2.3.2 Các đặc tính chất lượng của cây trồng biến đổi gen 8

2.3 Lợi ích và tác hại của cây trồng biến đổi gen 9

2.3.1 Lợi ích của cây trồng biến đổi gen 9

v

2.3.2 Tác hại của cây trồng biến đổi gen 9

2.3.2.1 Các rủi ro có thể gặp 9

2.3.2.2 Tác hại đối với môi trường 10

2.3.2.3 Tác hại đối với sức khỏe người tiêu dùng 10

2.3.2.4 Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể 11

2.4 Hiện trạng cây trồng biến đổi gen 12

2.4.1 Hiện trạng cây trồng biến đổi gen trên thế giới 12

2.4.2 Hiện trạng cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam 13

2.5 Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 14

2.6 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen 15

2.6.1 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới 15

2.6.2 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen ở Việt Nam 16

2.7 Các phương pháp kiểm định sinh vật biến đổi gen 16

2.7.1 Phương pháp kiểm định dựa vào protein 17

2.7.1.1 Phương pháp ELISA 17

2.7.1.2 Phương pháp Western Blot 17

2.7.1.3 Phương pháp Lateral flow strip 18

2.7.2 Phương pháp kiểm định dựa vào DNA 18

2.7.2.1 Phương pháp PCR căn bản 19

2.7.2.2 Phương pháp PCR đa thành phần 19

2.7.2.3 Phương pháp PCR định lượng cạnh tranh 19

2.7.2.4 Phương pháp Real-time PCR 19

2.7.3 Mức độ chuyên biệt trong kiểm định sinh vật biến đổi gen 21

2.7.3.1 Phương pháp sàng lọc (Screening methods) 21

2.7.3.2 Phương pháp chuyên biệt gen (Gene-specific methods) 22

2.7.3.3 Phương pháp chuyên biệt cấu trúc (construct-specific methods) 22

2.7.3.4 Phương pháp chuyên biệt sự kiện (event-specific methods) 22

2.8 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về kiểm định GMO bằng kỹ thuật PCR 23

2.8.1 Các nghiên cứu ngoài nước về kiểm định GMO bằng kỹ thuật PCR 23

vi

2.8.2 Các nghiên cứu trong nước về kiểm định GMO bằng Real-time PCR 23

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.2 Vật liệu thí nghiệm 24

3.2.1 Hóa chất 24

3.2.1.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA 24

3.2.1.2 Hóa chất dùng trong điện di 24

3.2.1.3 Hóa chất dùng trong phản ứng Real-time PCR 25

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 25

3.2.3 Mẫu thí nghiệm 25

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA 26

3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu 26

3.3.1.2 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA 27

3.3.1.3 Phân tích sản phẩm DNA sau tách chiết 29

3.3.2 Tối ưu phương pháp Duplex Real-time PCR 29

3.3.2.1 Tối ưu nồng độ primer 30

3.3.2.2 Tối ưu nồng độ probe 31

3.3.2.3 Tối ưu nồng độ MgCl2 32

3.3.3 Đánh giá phương pháp Duplex Real-time PCR 32

3.3.3.1 Xác định độ đặc hiệu của phương pháp 32

3.3.3.2 Xác định độ nhạy của phương pháp 34

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA 35

4.2 Tối ưu hóa phương pháp Duplex Real-time PCR 37

4.2.1 Tối ưu hóa nồng độ primer 37

4.2.1.1 Tối ưu hóa nồng độ primer cho promoter 35S 37

4.2.1.2 Tối ưu hóa nồng độ primer cho terminator nos 38

4.2.2 Tối ưu hóa nồng độ probe 39

vii

4.2.2.1 Tối ưu hóa nồng độ probe cho promoter 35S 39

4.2.2.2 Tối ưu hóa nồng độ probe cho terminator nos 40

4.2.3 Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 41

4.3 Đánh giá phản ứng Duplex Real-time PCR 42

4.3.1 Xác định độ đặc hiệu của phương pháp 43

4.3.2 Xác định độ nhạy của phương pháp 44

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 53

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABI: Applied Biosystem

CaMV: Cauliflower mosaic virus (virus khảm súp lơ)

CRM: Certified reference material (Vật liệu chuẩn chứng nhận) Ct: Threshold cycle (Chu kỳ ngưỡng)

CTAB: Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide

ctv: Cộng tác viên

DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates

EC: European Community (Cộng đồng châu Âu)

EEA: European Environment Agency (Cơ quan môi trường châu Âu) ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay

EU: European Union (Liên minh châu Âu)

FN: False negative (Âm tính giả)

FP: False positive (Dương tính giả)

GMC: Genetically modified crop (Cây trồng biến đổi gen)

GMF: Genetically modified food (Thực phẩm biến đổi gen)

GMO: Genetically modified organism (Sinh vật biến đổi gen)

ISO: International Organization for Standardization (Tổ chức tiêu

chuẩn hóa quốc tế) LOD: Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

No.: Number (số)

Nos: Nopaline synthetase

NT: Nghiệm thức

ix

OD: Optical density (mật độ quang)

PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Plasmid Ti: Tumor-inducing plasmid (plasmid gây khối u)

PPT: Phosphinothricin

ppt: Parts per thousand (phần nghìn)

PR: Pathogenesis–related protein (protein liên quan mầm bệnh)

PRSV: Papaya Ring Spot Virus

QC-PCR: Quantitative competitive PCR (PCR cạnh tranh định lượng) Rn: Normalized reporter

RNA: Ribonucleic acid

RRS: Roundup Ready Soya

SD: Standard Deviation (độ lệnh chuẩn)

SDS: Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis SSU: Small subunit

Taq: Thermus aquaticus

TBE: Tris-HCl, acid boric, EDTA

TE: Tris EDTA

TN: True negative (Âm tính thật)

TP: True positive (Dương tính thật)

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Các loại nền mẫu sử dụng trong thí nghiệm 26

Bảng 3.2 Các yếu tố khảo sát ảnh hưởng đến phản ứng Duplex Real-time PCR 30

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng Single Real-time PCR 30

Bảng 3.4 Chương trình nhiệt của phản ứng Single và Duplex Real-time PCR 31

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng Single Real-time PCR 31

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng Duplex Real-time PCR 32

Bảng 3.7 Thành phần phản ứng Duplex Real-time PCR tối ưu 33

Bảng 3.8 Phân tích kết quả xác định độ nhạy của phương pháp 33

Bảng 3.9 Pha loãng chuẩn GMO xác định giá trị LOD 34

Bảng 4.1 Kết quả đo DNA các mẫu ly trích của 2 phương pháp tách chiết 35

Bảng 4.2 Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho promoter 35S 38

Bảng 4.3 Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho terminator nos 39

Bảng 4.4 Kết quả tối ưu hóa nồng độ probe cho promoter 35S 40

Bảng 4.5 Kết quả tối ưu hóa nồng độ probe cho terminator nos 41

Bảng 4.6 Kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 42

Bảng 4.7 Danh sách các mẫu chuẩn chứng nhận 42

Bảng 4.8 Kết quả phân tích các mẫu CRM 43

Bảng 4.9 Kết quả phân tích các nồng độ phần trăm GMO khác nhau 45

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Quy trình chuyển gen 4

Hình 2.2 Cấu trúc cơ bản của gen chuyển vào thực vật 5

Hình 2.3 Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu 13

Hình 2.4 Thử nghiệm Lateral flow strip 18

Hình 2.5 Đồ thị phản ứng Real-time PCR 20

Hình 2.6 Mức độ chuyên biệt trong kiểm định GMO bằng phương pháp PCR 21

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA các mẫu ly trích 36

Hình 4.2 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ primer khác nhau cho promoter 35S 37

Hình 4.3 Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho terminator nos 38

Hình 4.4 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ probe khác nhau cho promoter 35S 39

Hình 4.5 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ probe khác nhau cho terminator nos 40

Hình 4.6 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ MgCl2 khác nhau 41

Hình 4.7 Đồ thị khuếch đại của các mẫu CRM 43

Hình 4.8 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ phần trăm GMO khác nhau 44

1

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Theo thống kê của Quỹ Hannover năm 2010, dân số trên thế giới vào khoảng 6,89

tỷ người và dự kiến sẽ vượt quá 12 tỷ người sau 50 năm tới Vấn đề cung cấp đủ lương thực, thực phẩm cho nhân loại là một vấn đề rất lớn Do đó, việc mở rộng nghiên cứu và triển khai các loại thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen là giải pháp được nhiều nước quan tâm

Thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen (Genetically modified foods – GMF) là những thực phẩm có chứa sinh vật biến đổi gen (Genetically modified organisms – GMO) hoặc được sản xuất từ chúng Theo Cục Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Mỹ (FDA) và

Bộ Nông nghiệp Mỹ, hiện có hơn 40 loại GMF được công nhận thoả mãn tiêu chuẩn thực phẩm và y tế Đó là các giống cà chua biến đổi gen điều khiển độ chín; giống đậu tương chống cỏ dại; giống bông và ngô chống sâu bệnh… Những lợi ích từ GMF có thể được thể hiện ở nhiều khía cạch khác nhau như giàu dưỡng chất; dược phẩm Tuy nhiên, các nhà bảo vệ môi trường, các nhà khoa học và chính phủ bày tỏ lo ngại đối với GMO vì cho rằng chúng có thể đem đến những hiểm họa tiềm tàng Vì vậy việc kiểm soát GMF trên thị trường hiện nay là việc làm cấp thiết

Theo một điều tra mới đây của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, hầu hết các mẫu thức ăn chăn nuôi trên thị trường Việt Nam hiện đều chứa sản phẩm biến đổi gen (như ngô và đậu tương) với một tỷ lệ nhất định Đa số các sản phẩm này (kể cả 1 số loại cây giống, con giống) được nhập khẩu chính thức qua các Công ty liên doanh với nước ngoài Việc này hầu như chưa được kiểm soát và vẫn còn khá nhiều ý kiến chưa thống nhất từ phía

cơ quan chuyên môn Hơn nữa tại Việt Nam số lượng các cơ quan chuyên môn có khả năng phân tích GMO tương đối ít, chỉ có một số cơ quan như Trung tâm kỹ thuật 3, Viện

Di truyền Nông nghiệp Việt Nam, Đại học Nông Lâm Tp HCM

Nhiều nghiên cứu khảo sát đã chỉ ra rằng nếu có sự hiện diện của promoter CaMV và terminator nos trong sản phẩm thì 95% đó là sản phẩm chuyển gen Do đó, việc tầm soát GMF là phải tầm soát promoter 35S-CaMV và terminator nos Hiện nay có rất

35S-2

nhiều phương pháp kiểm tra, sàng lọc GMF, tuy nhiên chủ yếu là phương pháp PCR Phương pháp này tốn nhiều thời gian, chi phí và công sức do phải sử dụng hai chương trình luân nhiệt riêng biệt cho hai phản ứng Do đó, nghiên cứu để xây dựng một quy trình sàng lọc GMF khắc phục những hạn chế trên là việc làm rất cần thiết Trên cơ

single-sở đó tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sàng lọc thực phẩm biến đổi gen bằng kỹ thuật Duplex Real-time PCR” nhằm đưa ra quy trình phát hiện GMF thông qua việc phát hiện đồng thời hai gen mục tiêu promoter 35S và terminator nos trên cùng một phản ứng

1.2 Yêu cầu

Xây dựng một quy trình thử nghiệm bằng kỹ thuật Duplex Real-time PCR phát hiện đồng thời promoter 35S và terminator nos trên một phản ứng, có khả năng áp dụng tại phòng thí nghiệm

1.3 Nội dung thực hiện

Tiến hành khảo sát các phương pháp tách chiết DNA, tối ưu hóa phương pháp Duplex Real-time PCR và đánh giá khả năng hoạt động của phương pháp này

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen (Genetically Modified

Food – GMF)

2.1.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organisms – GMO)

Các kỹ thuật công nghệ sinh học thông thường (lai chéo, tái tổ hợp tự nhiên…) đã được sử dụng hàng trăm năm qua để tạo ra những sản phẩm có đặc tính riêng biệt Tuy nhiên, chúng đòi hỏi trải qua nhiều thời gian, nhiều thế hệ mới có được những tính trạng mong muốn và loại bỏ những đặc tính không cần thiết Vào thế kỷ 20, sinh học đã có những bước tiến vượt bậc trong việc nghiên cứu sinh học phân tử ở mức độ DNA và protein Các tiến bộ này đã được ứng dụng vào thực tiễn và phát triển thành một công nghệ mới, đó là công nghệ gen, bao gồm các kỹ thuật tái tổ hợp DNA và chuyển nạp gen Chúng thật sự là những bước đột phá của nhân loại trong lĩnh vực sinh học hiện đại, mở

ra những chân trời mới với những khám phá và ứng dụng vô tận cho cuộc sống và lợi ích

của con người

Một trong những ứng dụng đó chính là việc tạo ra các sinh vật biến đổi gen, đặc biệt là cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crops – GMC) Với các ưu điểm nổi bật, các giống thực vật này khi ra đời đã góp phần nâng cao chất lượng và sản lượng lương thực, thực phẩm, một vấn đề cấp bách của nhân loại

Hiện nay, trên thế giới có nhiều định nghĩa khác nhau về sinh vật biến đổi gen Theo European Union (2001), sinh vật biến đổi gen là một sinh vật, ngoại trừ con người, mà vật liệu di truyền của nó được thay đổi theo một cách nào đó mà điều này không xảy ra trong điều kiện tự nhiên do quá trình lai truyền thống hoặc tái tổ hợp tự nhiên hoặc cả hai Đối với thực vật, thuật ngữ này được dùng để chỉ các loại cây trồng mà bộ gen của chúng đã được chuyển nạp ổn định những gen hữu ích mới bằng các kỹ thuật chuyển nạp gen và trong đa số trường hợp các gen này được biểu hiện và tổng hợp ra các sản phẩm của chúng (protein) (Nguyễn Hữu Trưởng, 2005)

4

2.1.2 Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen

Thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen là thực phẩm mà bản thân chúng hoặc chế biến từ các cơ thể động, thực vật mang các gen tái tổ hợp được chuyển vào một cách nhân tạo nhằm phục vụ các lợi ích kinh tế (Nguyễn Lân Dũng, 2008) Hay nói đơn giản hơn, thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen là những thực phẩm được sinh ra hay chế biến từ các sinh vật biến đổi gen

2.2 Quá trình tạo sinh vật biến đổi gen

2.2.1 Quá trình cơ bản

Sinh vật biến đổi gen là sản phẩm của những tiến bộ khoa học kỹ thuật tiên tiến nhất của con người trong công nghệ sinh học thực vật Mặc dù các kỹ thuật tạo ra chúng khá đa dạng và phức tạp, quá trình vẫn có những bước tiến hành chung để đạt được kết quả cuối cùng Để thực hiện quá trình này, những vấn đề quan trọng về cơ chế sinh lý, sinh hóa, sự điều hòa và biểu hiện gen cũng như những sản phẩm do gen đó tạo ra cần phải được chú ý và nghiên cứu nhằm đảm bảo cho sự thành công của quá trình

Hình 2.1 Quy trình chuyển gen (Choi và Cheong, 2004)

Các bước cơ bản bao gồm: Ly trích acid nucleic (DNA/RNA), dòng hóa gen, thiết

kế gen cho quá trình chuyển gen, chuyển gen và lai backcross

5

Đây thật sự là một quá trình khá phức tạp và tốn kém Thời gian cần thiết cho việc phát triển một giống cây trồng biến đổi gen mới phụ thuộc vào gen mong muốn, giống thực vật, nguồn gen và sự phê chuẩn của cơ quan quản lý Nó kéo dài khoảng từ 6 – 15 năm trước khi một dòng lai chuyển gen mới được phép thương mại hóa trên thị trường (Choi và Cheong, 2004)

2.2.2 Cấu trúc cơ bản của một gen chuyển vào thực vật

Hình 2.2 Cấu trúc cơ bản của gen chuyển vào thực vật

(Hoàng Thị Bích Thủy, 2010)

2.2.2.1 Promoter

Promoter là vùng điều khiển sự biểu hiện gen, nơi nhận dạng và kéo dài của RNA polymerase II trong phiên mã Do đó, để tạo cây chuyển gen có hiệu quả cao trong sản xuất và thương mại, các gen chuyển vào thực vật phải mang một promoter tương ứng Hiện nay, có rất nhiều promoter được sử dụng như promoter 35S (Cauliflower Mosaic Virus promoter), promoter FBP1 (Floral Binding Protein 1), promoter SSU (small subunit)… Trong đó, promoter 35S được sử dụng phổ biến và khai thác một cách có hiệu quả do có khả năng chuyển mã ở mức độ cao trong mô của nhiều loài cây khác nhau, đặc biệt ở cây hai lá mầm (Anklam và ctv, 2002; Rodríguez, 2003) Tuy nhiên, nó kém hiệu quả trong cây một lá mầm, đặc biệt là trong ngũ cốc Sự khác biệt này có thể do những khác biệt về chất lượng hoặc số lượng các yếu tố điều hòa hoặc cả hai Nhằm khắc phục khuyết điểm này, promoter 35S đã được cải tiến, nâng cao hiệu quả hoạt động bằng cách thêm vào các trình tự enhancer Các nghiên cứu cho thấy hiệu quả hoạt động phiên mã gia tăng từ 3 đến 6 lần trên cây một lá mầm được chuyển nạp nhiều bản sao vùng enhancer (Rodríguez, 2003)

2.2.2.2 Terminator

Terminator là vùng đóng vai trò dấu hiệu dừng của quá trình phiên mã, điểm nhận dạng và ngưng hoạt động của RNA polymerase II Các terminator hiện nay được sử dụng như terminator PinII (potato proteinase inhibitor II), terminator 35S (terminator CaMV),

Marker

6

terminator ORF25PolyA (Agrobacterium tumefaciens pTi15955), terminator OCSt (the octopine synthase gene), terminator nos (Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase terminator) Trong đó, terminator nos từ plasmid Ti trong Agrobacterium tumefaciens là

terminator phổ biến nhất (Brandner, 2002)

Theo GS TS Phạm Thị Anh Thư, tại hội thảo “Giới thiệu về sinh vật chuyển đổi gen” do hội các phòng thí nghiệm Việt Nam (VINATEST) tổ chức ngày 05/05/2005, cho biết 95% cây chuyển gen ở Châu Âu mang promoter 35S và/hoặc terminator nos kiểm soát trình tự gen được chuyển vào cây trồng biến đổi gen Khi mẫu phân tích có một trong hai trình tự này thì mẫu đó 95% là có chuyển gen, ngược lại khi kết quả mẫu phân tích không có cả hai trình tự này thì ta cũng có thể kết luận mẫu 95% không có chuyển gen

2.2.2.3 Marker chọn lọc

Các plasmid sử dụng trong chuyển nạp gen chứa gen thông báo và những gen mang mã di truyền của các marker có tính chọn lọc nhằm xác định những tế bào đã chuyển nạp trên cơ sở tăng trưởng của chúng trong môi trường chọn lọc Marker có tính

chọn lọc thông dụng là tính kháng kháng sinh như gen hph (kháng hygromycin), aadA (kháng streptomycin, spectinomycin), nptII (kháng kanamycin, neomycin), nptIII (kháng kanamycin, neomycin, amikacin) và kháng thuốc diệt cỏ như bar (kháng phosphinothricin

(PPT)) Các gen này thường được kiểm soát bởi các yếu tố điều hòa như promoter 35S và terminator nos (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000)

2.2.2.4 Gen mục tiêu chuyển vào thực vật

Gen Bt được phân lập từ tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis, được cải biến lại trước khi sử dụng cho cây trồng Cây chuyển nạp gen Bt có thể tạo ra protein độc dạng

tinh thể trong thân cây Những protein này được sản xuất liên tục, ít bị phân giải và có mặt ở các mô cần thiết (Vaeck và ctv, 1987; Steward và ctv, 1996; trích dẫn bởi Bùi Minh

Trí, 2011) Gen gna: hợp chất lectin có nguồn gốc từ thực vật có thể gây độc đối với các

côn trùng thuộc bộ cánh nửa Homoptera, trong đó nhóm lectin có tên “snowdrop lectin”

(Galantus nivalis agglutinin) có độc tính mạnh nhất (Powel và ctv, 1993; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011) Nhóm gen PR: khi có sự xâm nhiễm của nấm, vi khuẩn, virus, thực vật sẽ

sản sinh ra một protein mới giúp chúng tự bảo vệ là pathogenesis–related protein (PR) Các

7

nhóm protein đã được ghi nhận gồm PR–1, PR–2 (β–1,3 glucunase), PR–3 (chitinase), PR–

4, PR–5 (thaumatine–like protein) và PR–6 (ức chế protease) Gen Xa–21 được tìm thấy ở loài lúa hoang châu Phi Oryza longistaminata có phổ kháng rất rộng đối với nhiều nòi vi khuẩn gây bệnh (Linhorse, 1991; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011) Gen CP: tính kháng

virus của “coat protein” (CP) đã được đề cập rất sớm và từ đó người ta muốn đưa tính trạng này vào cây trồng để giúp cây kháng lại các bệnh do virus gây ra (Powell và ctv,

1986 ; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011)

Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến là gen bxn có nguồn gốc từ vi khuẩn Klebsiella pneumoniae mã hóa enzyme Bromoxynil nitrilase có khả năng làm mất hoạt

tính của bromoxynil Cơ chế kháng bromoxynil là do khả năng chuyển hóa nhanh bromoxynil sang dạng 3,5–dibromo–4–hydroxybenzoic acid không độc (Eberlein và ctv,

2000; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011); gen bar có nguồn gốc từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus có khả năng sản sinh ra một loại hợp chất thứ cấp là tripeptide bialaphos

Bialaphos có chứa phosphinothricin, là một đồng dạng của glutamate Glutamate là chất gây ức chế enzyme glutamine synthetase Khi enzyme này bị ức chế cây trồng sẽ không thể tổng hợp được glutamine dẫn đến sự tích lũy ammonia trong cây làm cây chết nhanh chóng (Thompson và ctv, 1987; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011)

2.2.3 Thành tựu chuyển nạp gen vào cây trồng

Các ứng dụng ban đầu của cây trồng biến đổi gen chủ yếu tập trung vào các đặc tính phù hợp với quá trình sản xuất nông nghiệp như kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh do côn trùng Về sau, các kỹ thuật di truyền chú trọng hơn vào các đặc tính chất lượng cây trồng biến đổi gen, tạo nên sự đa dạng trong thành tựu chuyển nạp gen vào cây trồng

2.2.3.1 Các đặc tính nông nghiệp của cây trồng biến đổi gen

Đặc tính kháng thuốc diệt cỏ là đặc tính phổ biến nhất, giúp giảm lượng thuốc diệt

cỏ sử dụng và tồn dư thuốc trong cây và môi trường với các gen kháng như gen CP4 EPSPS (kháng glyphosate), gen bar hoặc pat (kháng glufosinate ammonium) được chuyển

vào thực vật như bắp, đậu nành, bông vải và cải dầu (Gianessi và Carpenter, 2000; Funk và ctv, 2006; Trích dẫn bởi Hoàng Thị Bích Thủy, 2010)

Ngoài kháng bệnh do côn trùng, cây trồng biến đổi gen còn ngăn chặn sự phát sinh

bệnh do virus, nấm, vi khuẩn trên cây trồng như gen CP (coat protein) chống virus gây

bệnh đốm ở đu đủ - PRSV (Papaya Ring Spot Virus) (Bau và ctv, 2002; Trích dẫn bởi

Hoàng Thị Bích Thủy, 2010), yếu tố Nod Bj-V ở đậu tương kháng nấm gây bệnh mốc sương (Prithiviraj và ctv, 2003; Trích dẫn bởi Hoàng Thị Bích Thủy, 2010), gen Xa-21

chống bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn gây ra (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000)

Cây trồng kháng các yếu tố môi trường: cây trồng kháng các tác nhân gây stress của môi trường như: chịu lạnh, chịu hạn, chịu muối và các ion kim loại nặng như gen CSb (bacterial citrate synthase) tiết ra citrate nối aluminum, là kim loại độc gây dị hình rễ, giảm năng suất (James và ctv, 2003; Trích dẫn bởi Hoàng Thị Bích Thủy, 2010)

2.2.3.2 Các đặc tính chất lượng của cây trồng biến đổi gen

Đặc tính bất thụ đực giúp sản xuất các giống nông sản lai năng suất cao; đặc tính ngăn chặn sự chín sớm của quả giúp kéo dài thời gian tồn trữ và phù hợp cho sản xuất thực phẩm; đặc tính thay đổi hàm lượng chất béo nhằm tăng hàm lượng các loại acid béo không bão hòa đơn và giảm acid béo không bão hòa đa trong các loại cây lấy dầu như đậu nành, hoa hướng dương; đặc tính nâng cao giá trị dinh dưỡng nhằm chuyển nạp các gen

mã hóa các protein có chứa hàm lượng cao các amino acid thiết yếu như lysine, tyrosine, tryptophan vào cây trồng Ngoài ra, một hướng nghiên cứu tuy còn khá mới mẻ nhưng đã hứa hẹn thành công rực rỡ trong tương lai đó là đặc tính thực phẩm chức năng nhằm chuyển nạp gen biểu hiện các protein kháng nguyên chống lại một số bệnh như bệnh tiêu chảy (Diarrhea), bệnh sởi (Measles), viêm gan B (Hepatitis B) tạo ra các loại vaccine ăn được (edible vaccine) ở thực vật như chuối, khoai tây hoặc gen sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp quý như dược phẩm, chất dẻo Một ví dụ nổi tiếng của thực phẩm chức năng

đó là gạo vàng (Golden rice) Đây là loại gạo có hàm lượng vitamin A được tăng cao bằng cách chuyển nạp 3 gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp carotene Các nhà khoa học hy

9

vọng gạo vàng sẽ góp phần xoá bỏ các chứng bệnh mù do thiếu vitamin A gây ra tại các nước đang phát triển (Choi và Cheong, 2004)

2.3 Lợi ích và tác hại của cây trồng biến đổi gen

2.3.1 Lợi ích của cây trồng biến đổi gen

Với những ưu điểm nổi bật và ứng dụng khá đa dạng, cây trồng biến đổi gen đã đem lại một số lợi ích đối với nông nghiệp và đời sống con người

Đối với kinh tế, cây trồng biến đổi gen giúp nâng cao hiệu quả lao động, giảm chi phí trong việc phun xịt các loại thuốc diệt cỏ, trừ sâu và cày cấy; nâng cao năng suất nhờ giảm được thất thoát do côn trùng và bệnh tật, giảm áp lực cho đất trồng; tạo ra các đặc tính biến đổi phù hợp với quá trình sản xuất, ví dụ: cà chua không bị mềm quá sớm, do đó giảm lượng nước cần trong quá trình sản xuất thực phẩm; làm chủ năng suất như nâng cao

độ tinh sạch của hạt giống giúp nâng cao năng suất; cho phép canh tác trên những vùng đất trước đây không thể sử dụng; tăng sản lượng và lợi nhuận nông nghiệp

Đối với môi trường, cây trồng biến đổi gen giúp giảm dư lượng phân bón nhờ cố định đạm, giảm áp lực đất trồng, giảm sử dụng thuốc trừ sâu, diệt cỏ

Đối với sức khỏe con người, cây trồng biến đổi gen giúp giảm các tác động độc hại

do thuốc diệt côn trùng gây ra với sức khỏe, tạo ra được các loại thực phẩm mới có chất lượng tốt hơn, có khả năng chữa bệnh phục vụ cho người và nâng cao dinh dưỡng cho con người Những tác động có lợi này giúp cây trồng biến đổi gen được sản xuất và thương mại hóa ngày càng rộng rãi trên khắp thế giới (Choi và Cheong, 2004)

2.3.2 Tác hại của cây trồng biến đổi gen

2.3.2.1 Các rủi ro có thể gặp

Việc trồng và thương mại hóa cây trồng biến đổi gen ngày càng tăng tại nhiều quốc gia trên thế giới không có nghĩa là cây trồng biến đổi gen hoàn toàn không có rủi ro hay tác hại nào đối với môi trường và sức khỏe con người Theo nhiều nhà khoa học trên thế giới, những rủi ro và tác hại này có thể do nhiều nguyên nhân: (1) gen chuyển nạp chèn vào vị trí ngẫu nhiên, phá vỡ trình tự gen hiện hữu; (2) thiếu kiểm soát thông thường đối với gen chuyển nạp dẫn đến các gen chuyển nạp thường biểu hiện liên tục trong mọi tế bào, kể cả sau khi được mua bán và tiêu dùng; (3) hầu hết gen có nhiều chức năng và

10

tương tác chặt chẽ Vì vậy, làm sao có thể kiểm soát hết tất cả các tác dụng do gen chuyển nạp tạo ra; (4) sự chuyển gen ngang, nghĩa là các gen hữu ích chuyển nạp vào cây trồng thường kèm với các vật liệu di truyền có nguồn gốc từ vi khuẩn hay virus: vector, promoter, marker Điều này gây lo ngại, khi các gen thoát khỏi sinh vật biến đổi gen vào các vi sinh vật, thậm chí tế bào động vật có vú thì tác hại như thế nào, đặc biệt đối với sức khỏe con người (Querci và Mazzara, 2004)

2.3.2.2 Tác hại đối với môi trường

Sự chuyển gen từ thực vật biến đổi gen cho các loài thực vật tự nhiên khác gây ra các biến đổi di truyền bất thường trên các loài này Thực vật chuyển gen kháng côn trùng

có thể tác động xấu đến các loài sinh vật và côn trùng có lợi khác Cây trồng biến đổi gen gia tăng việc sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp Báo cáo năm 1999 tại Mỹ cho thấy nông dân trồng đậu nành biến đổi gen Roudup Ready gia tăng sử dụng thuốc hóa học từ 2 đến 5 lần so với nông dân trồng đậu nành thông thường Trong năm 2001-2002, lượng thuốc hóa học sử dụng đã tăng 70 tỷ pound tại Mỹ Điều này gây ra lo ngại về dư lượng thuốc hóa học trong các sản phẩm nông nghiệp (Benbrook, 2003)

Các gen kháng thuốc diệt cỏ có thể phóng thích khỏi cây trồng biến đổi gen và chuyển vào các loại cây trồng, cỏ dại khác tạo nên loại “siêu cỏ dại” có khả năng kháng một hay nhiều loại thuốc diệt cỏ Điều này sẽ gây nhiều khó khăn trong việc phòng trừ cỏ dại trong thời gian tới (Querci và ctv, 2004)

Sự hình thành “siêu côn trùng” kháng lại các tác nhân gây độc Bt gây khó khăn trong việc phòng trừ sâu hại (EEA, 1999)

2.3.2.3 Tác hại đối với sức khỏe người tiêu dùng

Cây trồng biến đổi gen tạo ra các tác nhân dị ứng mới: công nghệ gen cho phép biểu hiện gen chuyển nạp bắt nguồn từ nhiều loại sinh vật khác loài như virus, vi khuẩn Các loại protein mới này có thể gây ra triệu chứng dị ứng trên người

Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: việc tạo ra cây trồng kháng thuốc diệt cỏ cho phép

sử dụng thuốc diệt cỏ trên cây đang trong giai đoạn phát triển Điều này vốn bị cấm trước đây do người tiêu dùng có thể bị ảnh hưởng bởi dư lượng thuốc diệt cỏ trong thực phẩm

họ sử dụng Ngoài ra, các gen kháng kháng sinh làm marker trong thực phẩm có nguồn

11

gốc biến đổi gen có thể chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột gây ra tính kháng kháng sinh Cây biến đổi gen cũng có thể tạo ra chất độc mới do tương tác không kiểm soát giữa sản phẩm biến đổi gen và các phần tử khác (Eyquem, 2004)

2.3.2.4 Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể

Cà chua Flavr Savr gây ra nhiều thương tổn cho chuột (7 trong số 40 con chuột thí nghiệm đã chết sau 15 ngày), đã bị cấm bán trên thị trường (Soil Association, 2004) Trong thí nghiệm của tiến sĩ Arpad Pusztai (Viện nghiên cứu Rowett) cho thấy thương tổn trong hệ tiêu hóa chuột khi ăn khoai tây biến đổi gen chứa gen sản xuất lectin Các con chuột này không bị ảnh hưởng khi chỉ ăn khoai tây không biến đổi gen hay ăn lectin (Soil Association, 2004)

Nghiên cứu của Đại học Newcastle về chuyển nạp gen cho thấy khi ăn thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen có hiện tượng gen chuyển nạp thoát ra và chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột (Soil Association, 2004)

Nghiên cứu của Anh về sự chuyển gen ở cừu cho thấy sau khi cừu ăn bắp chuyển gen khoảng 8 phút, một số gen chuyển đã di chuyển khỏi bắp và “chuyển gen ngang” vào

vi khuẩn ở miệng Một trong số các gen được chèn mã hóa cho sự đề kháng đối với kháng

sinh kanamycin Sau đó, vi khuẩn E coli được tìm thấy có tính kháng đối với kháng sinh,

chứng tỏ gen chuyển đã cài nhập vào DNA của vi khuẩn Điều này chứng minh sự “chuyển gen ngang” của gen chèn có thể xảy ra tương đối dễ dàng (Duggan và ctv, 2003)

Thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen bổ sung L-tryptophan đã gây ra 37 trường hợp tử vong và ít nhất 1500 trường hợp tàn tật tại Mỹ do một chất độc không xác định Công ty đã bồi thường 2 tỷ USD cho trên 2000 nạn nhân (Soil Association, 2003 và 2004)

Nhóm các nhà khoa học Anh, do tiến sĩ Anh David Bohan (2005) đứng đầu, khẳng định cây trồng biến đổi gen gây hại cho môi trường Kết quả từ cuộc nghiên cứu lớn nhất thế giới (trong bốn năm với kinh phí lên tới 9,5 triệu USD) cho thấy các cánh đồng trồng GMO có rất ít chim, ong, bướm và các côn trùng khác, so với các cánh đồng trồng cây bình thường Các GMO kiềm chế quá trình ra hoa và kết quả của cây hoang dại có lợi cho môi trường và đời sống hoang dã, trong khi lại kích thích phát triển các cây hoang dại có hại cho môi trường Do đó GMO không chỉ tác động trực tiếp mà còn tác động gián tiếp

12

đến môi trường Nghiên cứu cũng cảnh báo rằng GMO sẽ tạo ra thế độc canh trong nông nghiệp và gây hại cho sự đa dạng sinh học Nhóm nghiên cứu đề nghị các nước phải thật thận trọng khi cho phép phát triển các loại GMO (Trích dẫn bởi Viện Chăn Nuôi, 2005)

2.4 Hiện trạng cây trồng biến đổi gen

2.4.1 Hiện trạng cây trồng biến đổi gen trên thế giới

Theo số liệu mới nhất năm 2011, diện tích trồng cây chuyển gen trên thế giới đạt khoảng 160 triệu ha, tăng 12 triệu ha tương đương 8% so với năm 2010 Với mức tăng trên 94 lần từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên 160 triệu ha năm 2011, cây chuyển gen đã trở thành công nghệ cây trồng được đưa vào ứng dụng nhanh nhất trong lịch sử nền nông nghiệp hiện đại (James, 2011)

Năm 2011 đã xác lập mức kỷ lục với 16,7 triệu nông dân ở 29 quốc gia trồng cây chuyển gen Trong số đó, có 19 nước đang phát triển và 10 nước công nghiệp, với diện tích trồng cây chuyển gen ở các nước đang phát triển chiếm khoảng 50% diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu trong năm 2011 và dự kiến sẽ vượt diện tích trồng của các nước công nghiệp vào năm 2012 Năm 2011, tốc độ trồng cây chuyển gen ở các nước đang phát triển nhanh gấp đôi và lớn gấp hai lần so với các nước công nghiệp, ở mức 11% hay 8,2 triệu ha, so với 5% hoặc 3,8 triệu ha ở các nước công nghiệp (James, 2011)

Năm nước đang phát triển đứng đầu về diện tích trồng cây chuyển gen là Ấn Độ và Trung Quốc ở châu Á, Brazil và Argentina ở châu Mỹ Latinh và Nam Phi trên lục địa châu Phi, cùng đại diện cho 40% dân số toàn cầu Hoa Kỳ tiếp tục là nước có diện tích trồng cây chuyển gen lớn nhất trên toàn cầu với 69 triệu ha, chiếm hơn 43 % diện tích trồng cây chuyển gen toàn cầu, tiếp theo là Brazil (30,3 triệu ha), Argentina (23,7 triệu ha), Ấn độ (10,6 triệu ha) và Canada (10,4 triệu ha) (James, 2011)

13

Hình 2.3 Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu (James, 2011)

2.4.2 Hiện trạng cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam

Hiện tại, Việt Nam chưa có một loại cây trồng biến đổi gen nào được thương mại hóa (Đài truyền hình Việt Nam, 2012) Theo chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm

2020, được Thủ tướng Chính phủ quyết định ngày 12/01/2006, Việt Nam sẽ sản xuất cây trồng biến đổi gen vào 2011-2015 Tính đến thời điểm năm 2011, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chỉ cho phép khảo nghiệm ba loại cây là ngô, đậu và bông vải Đây

là ba loại cây biến đổi gen trên thế giới trồng nhiều và cũng là sản phẩm mà Việt Nam phải nhập khẩu số lượng lớn (Hội lương thực thực phẩm Tp HCM, 2011).Riêng ngô biến đổi gen bắt đầu được khảo nghiệm diện hẹp từ giữa năm 2010 tại Văn Giang (Hưng Yên)

và Tân Thành (Bà Rịa – Vũng Tàu), đến năm 2011 tiếp tục được khảo nghiệm trên diện rộng tại các tỉnh Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Nghệ An, Dak Lak, Sơn La và Bà Rịa – Vũng Tàu Các giống ngô biến đổi gen được đưa vào khảo nghiệm gồm TC1507 của Công ty TNHH Pioneer Hi – Bred Việt Nam; MON89034 và NK603 của Công ty TNHH Dekalb

Tuy nhiên, các giống nông sản hiện nay như đậu nành, bắp, gạo ở nước ta đa phần nhập từ nước ngoài, hầu hết chúng đều có năng suất cao, chất lượng tốt đồng thời mang một số đặc tính nghi ngờ là chuyển gen như kháng thuốc diệt cỏ, côn trùng Theo PGS.TS Vũ Đức Quang, trong quá trình thực hiện đề tài cấp bộ “Xác định cây trồng biến đổi gen và sản phẩm của chúng” (giai đoạn 2001-2005), đã phát hiện bắp, đậu nành, bông vải cùng một số cây chuyển gen khác đang được trồng và lưu hành tại nhiều nơi trong cả nước gồm Hà Tây, Nam Định, Ninh Thuận, Dak Lak, Bình Dương, Đồng Nai và Tp HCM (Vietnamnet, 2005)

2.5 Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen

GMO có tác động lên con người cả hai mặt tích cực và tiêu cực, sản phẩm của GMO ngày càng phát triển đa dạng (trong thực phẩm chế biến, hạt giống, thức ăn gia súc, dược phẩm) Nhu cầu về GMO là kết quả của tiến bộ khoa học mà con người đạt được và liên tục phát triển Tuy nhiên, các hậu quả tiêu cực của GMO chúng ta vẫn chưa đánh giá hết được Do đó, GMO là đề tài tranh cãi hết sức phức tạp của dư luận xã hội và các nhà khoa học, có ý kiến ủng hộ nhưng cũng không thiếu những ý kiến phản đối hết sức gay gắt (Hoàng Thị Bích Thủy, 2010)

Theo một cuộc thăm dò ý kiến của các nước EU về việc sử dụng sản phẩm GMO được tiến hành vào tháng 11-12/2007cho thấy phần lớn người châu Âu tuyên bố phản đối việc sử dụng GMO (58%), trong khi có khoảng 21% ủng hộ, còn khoảng trên 9% nói rằng

họ chưa bao giờ nghe nói về GMO Mức độ phản đối GMO khác nhau ở các nước Nước phản đối mạnh mẽ nhất là Slovenia (82%), Cyprus (81%) Nước ủng hộ cao nhất là Malta

và Bồ Đào Nha (28%) (Huỳnh Thị Mai, 2009)

15

Qua nhiều nghiên cứu cho thấy người dân tại Châu Âu và nhiều quốc gia trên thế giới đòi hỏi chính phủ phải có các biện pháp quản lý thích hợp các sản phẩm biến đổi gen

vì lợi ích của cộng đồng (Friends of the Earth International, 2004).

2.6 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen

2.6.1 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới

Sự quản lý, phóng thích vào môi trường và thương mại hóa các sinh vật biến đổi gen trên toàn cầu được quy định bởi Nghị định thư An toàn sinh học Cartagena (Liên Hiệp Quốc ban hành và có hiệu lực từ ngày 11/09/2003) Đây là văn bản đầu tiên trên thế giới xác định sinh vật biến đổi gen là khác biệt so với các sinh vật thông thường khác, vì vậy cần có các biện pháp quản lý riêng biệt; đồng thời thể hiện sự tiến bộ của thế giới trong việc đạt sự đồng thuận về vấn đề sinh vật biến đổi gen (Friends of the Earth International, 2003)

Bên cạnh nghị định thư, hầu hết các quốc gia trên thế giới tùy thuộc tình hình thực

tế của nước mình mà ban hành những văn bản quy định cụ thể về việc xuất nhập khẩu, thương mại hóa và dán nhãn các sản phẩm biến đổi gen (Agrifood Awareness Australia Limited, 2004)

Châu Âu là nơi ban hành những quy định sớm và chặt chẽ nhất về sinh vật biến đổi gen (từ năm 1990) nhằm bảo vệ người tiêu dùng và môi trường Hiện nay, các văn bản quy định chính bao gồm Quy định 1829/2003 (EC) (Regulation (EC) No 1829/2003), Quy định 1830/2003 (EC) (Regulation (EC) No 1830/2003), Quy định 641/2004 (EC) (Regulation (EC) No 641/2004), Quy định 882/2004 (EC) (Regulation (EC) No 882/2004), Quy định 1981/2006 (EC) (Regulation (EC) No 1981/2006), Quy định 619/2011 (EU) (Regulation (EU) No 619/2011) (Žel và ctv, 2012)

Các văn bản này quản lý và quy định việc thử nghiệm, cấp phép thương mại các sinh vật biến đổi gen rất chặt chẽ Đặc biệt, mức ngưỡng mới 0,9% thay vì 1% cho việc dán nhãn sản phẩm biến đổi gen Cộng đồng châu Âu xác định người tiêu dùng có quyền được thông tin và việc dán nhãn được xem như là công cụ để có sự lựa chọn chính xác

(Querci và ctv, 2004)

16

2.6.2 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen ở Việt Nam

Ngày 10/7/2007, Thủ tướng Chính phủ đã ký quyết định phê duyệt “Đề án tổng thể tăng cường năng lực quản lý an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen và sản phẩm hàng hóa có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen” Đề án tổng thể tập trung vào nhiệm vụ: Xây dựng và hoàn thiện hệ thống văn bản quy phạm pháp luật, cơ chế, chính sách về quản

lý an toàn sinh học cây trồng biến đổi gen, nâng cao nhận thức của cộng đồng về an toàn sinh học (VTV Đà Nẵng, 2012) Tiếp đó, đến ngày 21/6/2010, Thủ tướng Chính phủ ký Nghị định số 69/2010/NĐ-CP về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật

di truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen Theo đó, các tổ chức, cá nhân lưu thông hàng hoá có chứa sinh vật biến đổi gen, sản phẩm của sinh vật biến đổi gen trên thị trường với tỷ lệ lớn hơn 5% mỗi thành phần thì ngoài việc phải tuân thủ các quy định của pháp luật về ghi nhãn hàng hóa còn phải thể hiện các thông tin liên quan đến sinh vật biến đổi gen trên nhãn hàng hóa Đây được xem là quy định mới nhất của nước ta về vấn đề quản

lý sinh vật biến đổi gen

Trên tầm quốc tế, Việt Nam đã ký tham gia Công ước Cartagena vào năm 2003 quy định về vận chuyển qua biên giới các loại sinh vật biến đổi gen và tham gia “Sáng kiến Singapore nhất thể hóa Quy chế an toàn sinh học” trong khu vực Đông Nam Á Bên cạnh đó, một số trung tâm nghiên cứu cũng trang bị các loại máy móc, thiết bị hiện đại nhằm phục vụ cho nhu cầu kiểm tra các sản phẩm biến đổi gen sản xuất và xuất khẩu như Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 (Quatest 3), Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, ĐH Nông Lâm Tp HCM, ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM (Hoàng Thị Bích Thủy, 2010)

2.7 Các phương pháp kiểm định sinh vật biến đổi gen

Có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để kiểm tra thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen Tuy nhiên có hai phương pháp cơ bản được sử dụng để phát hiện sự biến đổi gen, một phương pháp kiểm tra sản phẩm của gen chuyển, thường là protein và một phương pháp khác kiểm tra sự hiện diện của DNA từ gen chuyển hoặc một phần khác của cassette gen (Brandner, 2002)

17

2.7.1 Phương pháp kiểm định dựa vào protein

Thử nghiệm miễn dịch là phương pháp phổ biến để phát hiện và định lượng những protein mới (ngoại lai) được đưa vào thông qua sự chuyển gen thực vật Thử nghiệm miễn dịch dựa vào sự gắn kết đặc hiệu giữa một kháng nguyên và một kháng thể Như vậy, hiệu lực của kháng thể với độ đặc hiệu và tính ái lực mong muốn là nhân tố quan trọng nhất cho việc thiết lập các hệ thống thử nghiệm miễn dịch Phản ứng miễn dịch có thể có độ đặc hiệu cao và mẫu thường chỉ cần một sự chuẩn bị đơn giản trước khi được phân tích Hơn nữa thử nghiệm miễn dịch có thể được sử dụng để định tính hoặc định lượng trên một khoảng nồng độ rộng Trên cơ sở nồng độ vật liệu di truyền đặc trưng trong mô thực vật (hơn 10 µg/mô), giới hạn phát hiện của các thử nghiệm miễn dịch có thể phát hiện sự hiện diện của protein mới trong phạm vi 1% GMO (Stave, 1999) Western blot, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) và lateral flow strip là những phương pháp thử nghiệm dựa vào protein tiêu biểu (Tripathi, 2005)

2.7.1.1 Phương pháp ELISA

Phương pháp này sử dụng kháng thể để phát hiện các protein mục tiêu Thuận lợi của phương pháp là có khả năng phân tích định lượng dựa vào đường chuẩn Tuy nhiên, ở các cây trồng biến đổi gen, lượng protein tái tổ hợp được biểu hiện chuyên biệt và mức độ khác nhau ở từng mô hoặc các giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật khoảng 0 đến 2% so với tổng protein hòa tan (Longstaff và ctv, 1995) hoặc lượng protein trong các sản phẩm chế biến từ cây trồng biến đổi gen bị biến tính, tiêu biến có thể cho kết quả âm tính giả khi phát hiện và định lượng bằng kỹ thuật này (Anklam và ctv, 2002)

2.7.1.2 Phương pháp Western Blot

Protein từ các mẫu kiểm nghiệm được thu nhận, phân tách bằng SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) và chuyển lên màng nitrocellulose, ở vị trí nối kháng thể trên màng Kháng thể sau đó được nhuộm với Ponceau, Coomassie hoặc chất miễn dịch thứ cấp từ đó ta có thể xác định được protein mục tiêu (Yang và ctv, 2005) Kỹ thuật này sử dụng chuyên biệt phân tích các protein không hòa tan (Chowdhury và Vasil, 1992) Giới hạn phát hiện khoảng 0,25% (đối với mẫu hạt) đến 1% (đối với mẫu chế biến) (Choi và Cheong, 2004)

18

2.7.1.3 Phương pháp Lateral flow strip

Sử dụng hệ thống phát hiện màng căn bản nitrocellulose Màng này chứa hai vùng bắt giữ, một vùng chuyên biệt với protein sandwich (protein mục tiêu gắn với kháng thể

có đuôi gắn chất phát màu hoặc huỳnh quang (antibody sandwich)), vùng còn lại với antibody sandwich (vùng đối chứng) Phương pháp này sử dụng mẫu đã chuẩn bị ngâm trong đệm trích và dựa vào lực mao dẫn Sự hiện diện chỉ một đường trên màng thể hiện kết quả âm tính, hai đường là kết quả dương tính Phương pháp này nhìn chung có khả năng định tính và bán định lượng được các mẫu thực phẩm chứa GMO (Shehata, 2005)

Hình 2.4 Thử nghiệm Lateral flow strip (a) Nguyên tắc và vị trí tương đối của vạch đối chứng, vạch thử nghiệm trên que Lateral flow strip; (b) Kết quả thử nghiệm khi que Lateral flow strip được nhúng trong eppendorf chứa vật liệu chuyển gen (Ahmed, 2002)

2.7.2 Phương pháp kiểm định dựa vào DNA

Rất nhiều phương pháp có sẵn để tách chiết DNA, trong đó có nhiều phương pháp được đánh giá là có khả năng áp dụng cho việc phát hiện GMO ở thực vật và những thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật Hiện nay, ba phương pháp tách chiết DNA từ thực vật và những thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật được sử dụng phổ biến là phương pháp CTAB, phương pháp tách chiết qua cột silica và sự kết hợp cả hai phương pháp này (Pan, 2002) Tuy nhiên, việc ly trích DNA từ các mẫu hỗn hợp thực phẩm hoặc các sản phẩm đã qua tinh chế thì luôn không thành công như ở dầu tinh luyện, sốt đậu nành Đây là điểm hạn chế trong việc phát hiện và định lượng GMO trong các mẫu thực phẩm và sản phẩm chế biến khi dựa vào DNA (Meyer và Jaccaud, 1997)

19

2.7.2.1 Phương pháp PCR căn bản

Kỹ thuật thông dụng và đang phát triển hiện nay chủ yếu dựa vào khả năng khuếch đại một đoạn DNA cụ thể có trong mẫu cần kiểm tra bằng kỹ thuật PCR Dựa vào kỹ thuật này người ta đã phát triển thêm ba phương pháp khác dùng để phát hiện GMO là PCR đa thành phần (multiplex PCR), PCR cạnh tranh (quantitive competitive PCR) và Real-Time PCR (Kim và Kim, 2004)

2.7.2.2 Phương pháp PCR đa thành phần (Multiplex PCR)

Thuận lợi của phương pháp là nhiều trình tự DNA đích khác nhau đều có thể được kiểm tra và phát hiện trong cùng một phản ứng, tiết kiệm thời gian đáng kể cho việc kiểm tra Độ chính xác của phương pháp này không phụ thuộc vào mức độ tinh sạch của vật liệu cần kiểm tra nên có thể phát hiện các mẫu biến đổi gen từ vật liệu thô đến các vật liệu đã chế biến Tuy nhiên, mỗi primer được thiết kế cho mỗi DNA mục tiêu đặc trưng khác nhau,

có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ cuối cùng của sản phẩm PCR Do đó, việc phát hiện GMO bằng phương pháp PCR đa thành phần cần phải cẩn thận (Kim và Kim, 2004)

2.7.2.3 Phương pháp PCR định lượng cạnh tranh (Quantitive competitive

PCR – QC-PCR)

Phương pháp này dựa trên sự đồng khuếch đại của gen mục tiêu và số lượng đã biết của một chuẩn DNA ban đầu (tác nhân cạnh tranh) với vị trí gắn kết primer giống nhau Sản phẩm khuếch đại sẽ có cường độ phát quang tương ứng với số lượng DNA được khuếch đại và chúng sẽ xuất hiện hai dãy khác nhau trên gel agarose với cường độ khác nhau Vì thế, các dãy thu được có thể xác định được số lượng ban đầu của DNA mục tiêu Phương pháp này có khả năng phát hiện một cách đơn giản và bán định lượng được sản phẩm biến đổi gen trong thực phẩm (Weighardt, 2004)

20

mỗi chu kì khuếch đại thành công Như vậy, bằng cách ghi nhận lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kì, ta có thể kiểm soát phản ứng PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng Sự gia tăng đầu tiên của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu (Ahmed, 2002)

Tính chuyên biệt của Real-time PCR dựa trên cả hóa chất được dùng để tạo và giám sát phản ứng khuếch đại và công cụ để giám sát các tín hiệu huỳnh quang Có nhiều hóa chất được sử dụng cho mục đích này, bao gồm thuốc nhuộm xen giữa DNA (ethidium bromide, SYBR Green I) và mẫu dò lai (TaqMan probes, Fluorescence Resonance Energy Transfer probes, Molecular Beacons, Scorpions và TaqMan Minor Groove Binder probes) (Weighardt, 2004)

 Phân tích dữ liệu Real-time PCR

Khi phản ứng Real-time PCR hoạt động, tín hiệu huỳnh quang (giá trị Rn) được thu nhận thể hiện qua đồ thị các tín hiệu tương ứng số chu kì Đồ thị có dạng bán logarit, gồm 3 giai đoạn: pha lag với những dao động nhỏ tương ứng với tín hiệu nền, pha hàm mũ với các đường biểu đồ song song, cuối cùng là giai đoạn bão hòa

Hình 2.5 Đồ thị phản ứng Real-time PCR (Bio-Rad, 2005)

Khả năng của phản ứng Real-Time PCR cho phép định lượng ngay trong giai đoạn DNA khuếch đại gia tăng theo hàm mũ, mà không ở giai đoạn cuối cùng khi lượng DNA bão hòa, giúp nâng cao độ chính xác của việc định lượng Trong phản ứng Real-Time

21

PCR, chu kì ngưỡng (threshold cycle, Ct) là chu kì mà tại đó tín hiệu huỳnh quang có giá trị cao hơn đáng kể so với tín hiệu nền nhưng vẫn nằm trong giai đoạn log tuyến tính Lượng DNA ban đầu càng nhiều thì lượng DNA khuếch đại được phát hiện càng sớm và giá trị Ct càng thấp Do vậy, Ct được sử dụng làm công cụ để tính toán lượng DNA ban đầu trong mỗi phản ứng (Weighardt, 2004)

2.7.3 Mức độ chuyên biệt trong kiểm định sinh vật biến đổi gen

Dựa vào cấu trúc cơ bản của gen chuyển vào thực vật có thể chia thành các mức độ chuyên biệt để kiểm định cây trồng biến đổi gen như sau

Hình 2.6 Mức độ chuyên biệt trong kiểm định GMO bằng phương pháp

PCR (Choi và Cheong, 2004)

2.7.3.1 Phương pháp sàng lọc (Screening methods)

Phương pháp này có tính sàng lọc dựa vào các trình tự chuyên biệt chỉ có ở cây trồng biến đổi gen như promoter 35S, terminator 35S và terminator nos (hiện diện phần lớn

ở thực vật biến đổi gen trên thị trường hiện nay) (Hemmer, 1997) Ngoài ra, vector tạo dòng thường sử dụng là plasmid pBR322 và pUC19 chứa gen mã hóa tính kháng ampicillin

(bla), neomycin/ kanamycin (nptII) Do đó, phương pháp PCR dựa trên các trình tự promoter 35S, terminator 35S, terminator nos, bla hoặc nptII không những ứng dụng rộng

rãi trong sàng lọc sản phẩm biến đổi gen mà còn trong định lượng tổng thành phần biến đổi gen trong mẫu thực phẩm đơn hoặc hỗn hợp (Gonsalves, 2004) Tuy nhiên, sự hiện diện của những trình tự này không có nghĩa là có sự hiện diện của GMO (hiện tượng dương tính

22

giả) vì chúng có thể xuất hiện ở CaMV tự nhiên, Agrobacterium và các vi khuẩn đất khác

(hiện diện trong ngũ cốc, khu vực đất trồng trọt) (Hemmer, 1997) Ngoài ra, phương pháp này không chỉ chính xác thành phần biến đổi gen nào có trong mẫu thực phẩm đơn hoặc hỗn hợp khi phát hiện và định lượng GMO

2.7.3.2 Phương pháp chuyên biệt gen (Gene-specific methods)

Phương pháp này tập trung vào gen mục tiêu chuyển vào thực vật Đa số các gen chuyển vào thực vật đều có nguồn gốc từ tự nhiên nhưng để biểu hiện cao trong thực vật, ngoài được kiểm soát bởi một promoter mạnh, nó còn được biến đổi các trình tự nucleotide để thích hợp trong sử dụng bộ mã di truyền thực vật nên tính chuyên biệt trong phát hiện và định lượng GMO bằng phương pháp này sẽ cao hơn so với phương pháp sang lọc Kết quả dương tính sẽ cho ta kết luận chính xác có sự hiện diện GMO và nhận

diện trình tự DNA của GMOs này, ví dụ: nhận diện gen cryIAb, gen pat, gen EPSPS

(Hemmer, 1997) Tuy nhiên, phương pháp này không phân biệt chính xác giữa các cây trồng khi chúng mang cùng gen mục tiêu, ví dụ các giống đậu nành, bắp, cải dầu, và gạo

đều mang gen tái tổ hợp pat liên quan tính kháng thuốc diệt cỏ (Shehata, 2005)

2.7.3.3 Phương pháp chuyên biệt cấu trúc (construct-specific methods)

Phương pháp này dựa vào trình tự giữa vùng promoter với vùng enhancer, vùng enhancer với vùng gen mục tiêu hay giữa vùng gen mục tiêu với vùng terminator Với phương pháp này, kết quả dương tính sẽ cho ta kết luận chính xác gen mục tiêu được chuyển gen vào Tuy nhiên, trong tương lai, nếu cấu trúc của gen chuyển nạp (gồm promoter, enhancer, gen mục tiêu, terminator) được sử dụng cho nhiều đối tượng khác nhau thì phương pháp này không còn chính xác nữa (Hemmer, 1997)

2.7.3.4 Phương pháp chuyên biệt sự kiện (event-specific methods)

Đối tượng của phương pháp này là đoạn trình tự giữa vùng promoter (hoặc terminator) và gen thực vật Do đoạn trình tự này là độc nhất cho mỗi sự kiện chuyển gen nên chúng không chỉ cho phép xác định chính xác thành phần biến đổi gen nào trong mẫu hỗn hợp mà còn chính xác trong từng sự kiện chuyển gen khi một cấu trúc được chuyển nạp vào nhiều lần trong cùng một đối tượng Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn trong giai đọan phát triển và chưa được ứng dụng rộng rãi (Hemmer, 1997)

Akiyama và ctv (2009) nghiên cứu phương pháp sàng lọc phát hiện promoter 35S

và terminator nos ở sinh vật biến đổi gen trong phản ứng Multiplex Real-time PCR sử dụng phép phân tích biểu đồ đỉnh chảy với độ phân giải cao Akiyama và ctv sử dụng Master mix cho Real-time PCR là Multiplex PCR Mix (Qiagen) với thuốc nhuộm Eva-Green (Wako) Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhạy của phương pháp cho phép phát hiện ở nồng độ GMO 0,1% đối với các mẫu bắp Tuy nhiên phương pháp này có thể được

áp dụng đối với các mẫu thực phẩm và những cây trồng khác

Vidhya và ctv (2010) nghiên cứu phát hiện các hạt bông vải biến đổi gen sử dụng PCR và real-time PCR Vidhya và ctv sử dụng Supermix SYBR Green iQ Kết quả nghiên cứu cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp Real-time PCR là 0,1%

Tian và ctv (2011) nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp multiplex PCR cho phát hiện các thành phần đậu nành chuyển gen trong các sản phẩm thức ăn chăn nuôi Nghiên cứu này sử dụng hai bộ primer (I, lectin1/35S/CP4; II, lectin2/35S/CP4) Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhạy của phương pháp đối với bộ primer I và II lần lượt là 0,25% và 0,5%

2.8.2 Các nghiên cứu trong nước về kiểm định GMO bằng Real-time PCR

Nguyễn Hữu Trưởng (2004) nghiên cứu bước đầu xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-Time PCR Nghiên cứu này sử dụng bộ Kit Quant 35S Screen Corn (GeneScan), probe Taqman cho promoter 35S Kết quả cho thấy khả năng định lượng của phương pháp là 1 bản sao

Hoàng Thị Bích Thủy (2010) nghiên cứu quy trình nhận diện một số sản phẩm lúa gạo biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR và real-time PCR Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp có khả năng định lượng được các sản phẩm gạo ở nồng độ GMO là 0,075%

24

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày 15/01/2012 đến 15/06/2012 tại phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO, Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường chất lượng 3 (Quatest 3), số 7 Đường số 1, Khu Công Nghiệp Biên Hòa 1, Đồng Nai

Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (trộn

1 phần thể tích phenol với 1 phần thể tích chloroform/isoamyl alcohol)

Potassium acetate 3 M, pH 5,2 (CH3COOK)

3.2.1.2 Hóa chất dùng trong điện di

Agarose, dung dịch Ethidium bromide 10 mg/mL

Dung dịch nạp mẫu điện di (loading dye): glycerol 30% trong nước cất, xylen cyanol 0,25%, bromophenol blue 0,25%

TBE (Tris-HCl, acid boric, EDTA) 0,5X, DNA marker 100bp

25

3.2.1.3 Hóa chất dùng trong phản ứng Real-time PCR

Hotstart Taq DNA polymerase 2,5 U/µL (Sigma)

Đệm PCR 10X (15 mM MgCl2) (Sigma)

dNTPs 10 mM (Sigma)

MgCl2 25 mM (Promega)

Nước cất siêu sạch

Thuốc nhuộm tham chiếu ROX 50X (Invitrogen)

Primer cho promoter 35S (10 mM) và terminator Nos (10 mM) (Sigma) (Phụ lục 4) Probe Taqman cho promoter 35S (10 mM) và terminator nos (10 mM) (Sigma) (Phụ lục 5)

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Bộ điện di (Nyxtechnik)

Cân phân tích (A&D)

Đầu tip có lọc dùng trong sinh học

Tủ lạnh, tủ đông

3.2.3 Mẫu thí nghiệm

Mẫu thí nghiệm trong đề tài này được chọn như sau:

Vật liệu chuẩn có chứng nhận (CRM): đối chứng dương gồm các hạt giống bắp Bt11, Bt176, GA21, MON810, TC1507, NK603, Roundup Ready® Soya (RRS), RiceLL62, MON863, MON89034, MON531; đối chứng âm gồm nước cất siêu sạch, mẫu NON-GMO [Bắp LY038 (0%)]

Các loại nền mẫu khác nhau có sẵn tại phòng thí nghiệm

26

Bảng 3.1 Các loại nền mẫu sử dụng trong thí nghiệm

Kí hiệu mẫu Tên mẫu Nền mẫu

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA

Mục đích: nhằm đưa ra được phương pháp tách chiết DNA tối ưu, phù hợp với từng loại nền mẫu sử dụng

Bố trí thí nghiệm: tiến hành khảo sát 2 phương pháp tách chiết DNA khác nhau nhằm đưa ra phương pháp thích hợp Mỗi phương pháp sử dụng 8 loại mẫu khác nhau, mỗi loại mẫu được lặp lại 2 lần và được thực hiện trong 3 ngày khác nhau, với tổng số nghiệm thức (NT) là 48 (8 x 2 x 3 = 48 NT)

3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu

Đối với mẫu thô: bắp hạt (khô) được xay thành dạng bột mịn, sau đó cân cho vào ống eppendorf 2 mL; cà chua (tươi) được xay nhuyễn, hút dịch cho vào ống eppendorf 2

mL và ly tâm thu cặn (lặp lại 2 – 3 lần cho đến khi thu được lượng cặn cần thiết cho việc

xử lý tiếp theo); khoai tây (tươi) được nghiền trong cối sứ ở -700 cho đến khi thành dạng bột, sau đó cân cho vào ống eppendorf 2 mL

Đối với mẫu đã qua chế biến: đậu hũ được nghiền và cân vào ống eppendorf 2 mL; ngũ cốc được cân cho vào ống eppendorf 2 mL; bún khô được xay thành dạng bột mịn, sau đó cân cho vào ống eppendorf 2 mL

Đối với mẫu lỏng, hút 1 mL dịch cho vào ống eppendorf 2 mL

27

3.3.1.2 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA

Phương pháp 1: Tách chiết DNA bằng phương pháp phenol/chloroform căn bản (ISO

21571, 2005)

- Cân 0,25 g mẫu đã đồng nhất vào ống eppendorf 2 mL đã tiệt trùng

- Thêm vào 1,6 mL dung dịch đệm trích SDS

- Thêm 50 µL dung dịch protease K (trong trường hợp mẫu giàu protein), ủ ở 600C –

700C trong 30 phút đến 2 giờ (hay ủ qua đêm)

- Thêm RNase A đến nồng độ cuối cùng là 0,1 µg/mL

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút

- Chuyển pha lỏng phía trên sang ống 2mL mới

- Thêm 1 lần thể tích phenol, trộn đều

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút

- Chuyển pha nước phía trên sang ống 2 mL mới

- Thêm 1 lần thể tích phenol:chloroform/isoamyl alcohol, trộn đều

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút

- Chuyển dịch nổi sang ống 2mL mới

- Thêm 1 lần thể tích chloroform/isoamyl alcohol, trộn đều

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút

- Chuyển dịch nổi sang ống 1,5 mL mới

- Thêm 0,1 lần thể tích potassium acetate 3 M và 2,5 lần thể tích ethanol 96%, đảo đều

- Ủ 1 giờ ở -700C hoặc qua đêm ở -200C

- Ly tâm 10000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút

- Bỏ pha lỏng phía trên

- Rửa tủa với 500 µL ethanol 70%

- Ly tâm 10000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút

- Bỏ pha lỏng phía trên

- Để khô DNA và làm tan lại trong 100 µL TE hoặc nước cất siêu sạch

- Bảo quản DNA ở -200C