NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME CHOLESTEROL OXYDASE TRÊN CẢM BIẾN NANO SINH HỌC DỰA TRÊN CẤU TRÚC SỢI NANO PLATIN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG DUNG DỊCH

TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu cố định enzyme cholesterol oxydase trên cảm biến nano sinh học dựa trên cấu trúc sợi nano Platin để định lượng cholesterol trong dung dịch” được thực hiện từ t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME CHOLESTEROL OXYDASE TRÊN CẢM BIẾN NANO SINH HỌC DỰA TRÊN CẤU TRÚC SỢI NANO PLATIN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CHOLESTEROL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME CHOLESTEROL OXYDASE TRÊN CẢM BIẾN NANO SINH HỌC DỰA TRÊN CẤU TRÚC SỢI NANO PLATIN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CHOLESTEROL

TRONG DUNG DỊCH

ThS ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG

Tháng 7/2012

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

 Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi học tập tại trường

 Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

 Ban giám đốc Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano – Đại Học Quốc Gia TP

Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

 Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia – Nafosted đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện đề tài Mã số đề tài 106.99-2010.52

 TS Tống Duy Hiển, ThS Đặng Ngọc Thùy Dương, chị Phan Thị Hồng Thủy và anh Phạm Xuân Thanh Tùng đã tận tình hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

 Tất cả các Anh, Chị tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Đặc biệt, con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ, động viên tinh thần cho con và luôn luôn bên con Em xin cảm ơn anh Hai, chị Ba, anh Tuyên cùng những người thân trong gia đình đã luôn luôn động viên và giúp đỡ em

Cảm ơn tất cả các bạn lớp DH08SH đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

TP Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2012

Nguyễn Hữu Tuyển

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu cố định enzyme cholesterol oxydase trên cảm biến nano sinh học dựa trên cấu trúc sợi nano Platin để định lượng cholesterol trong dung dịch” được thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 07/2012 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh với vật liệu nghiên cứu là cảm biến sinh học sợi nano Platin và enzyme cholesterol oxydase

Khóa luận gồm hai nội dung nghiên cứu chính Nội dung đầu tiên là cố định enzyme lên sợi nano Platin Trong nội dung này, quá trình làm sạch bề mặt cảm biến

và quy trình biến đổi bề mặt cảm biến với trình tự lớp đơn tự ghép cysteamine, chất hữu cơ trung gian glutaraldehyde, enzyme cholesterol oxydase sẽ được khảo sát Nội dung nghiên cứu tiếp theo là ứng dụng các cảm biến đã được cố định enzyme để kiểm tra định lượng các nồng độ cholesterol từ 0,8 – 8 mM trong dung dịch PBS bằng phương pháp quét thế dòng tuần hoàn (cyclic voltammetry - CV)

Kết quả quá trình xây dựng quy trình biến đổi bề mặt chip và cố định enzyme cho thấy nồng độ dung dịch cysteamine tối ưu là 0,5 M; thời gian phản ứng trong 2 giờ ở 40C và nồng độ dung dịch glutaraldehyde tối ưu là 1%; thời gian phản ứng trong 2 giờ ở 40C Cố định thành công enzyme cholesterol oxydase lên cảm biến sau khi đã được biến đổi bề mặt và enzyme vẫn giữ được hoạt tính sau khi cố định

Kết quả quá trình kiểm tra định lượng cholesterol các nồng độ khác nhau trong dung dịch PBS của cảm biến sau khi cố định enzyme cho thấy ngưỡng phát hiện cholesterol là 0,8 mM, xác định được đỉnh oxy hóa – khử tại thế +0,625 V Quá trình kiểm tra định lượng cholesterol cho thấy có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa cường độ dòng thu được ở các nồng độ cholesterol khác nhau theo phương trình

Ipeak = 13,97*Ccholesterol + 221 với hệ số tương quan R2 = 0,974

Với những kết quả đạt được, đề tài “Nghiên cứu cố định enzyme cholesterol oxydase trên cảm biến nano sinh học dựa trên cấu trúc sợi nano Platin để định lượng cholesterol trong dung dịch” là bước khởi đầu cho quá trình chế tạo thiết bị cảm biến định lượng cholesterol trong máu người

SUMMARY

The thesis “Study on the immobilization of cholesterol oxydase on nanosensor structure based on Platinum nanowires to quantify cholesterol in solution” was carried out at laboratory for Nanotechnology National University Ho Chi Minh city from January 2012 to Junly 2012 with the main materials are Platinum nanowires and cholesterol oxydase

bio-The thesis has two main subjects bio-The first, immobilization of enzyme on Platinum nanowires In this part, the process of cleaning sensor suface and process modified electrodes suface with cysteamine self-assembled monolayer, the intermediates organic glutaraldehyde and enzyme cholesterol oxydase will be investigated In the next part, use sensors applications have been fixed with enzyme cholesterol oxydase to check, quantify the cholesterol has concentration from 0,8 to

8 mM in PBS solution by using Cyclic Voltammetry mode in Autolab machine The resulfs were summarized as follows:

 Complete the process modified electrodes suface through cysteamine assembled monolayer and organic glutaraldehyde with the best solution concentration cysteamine is 0,5 M, it react in two hours at 40C The best solution concentration glutaraldehyde is one percent, it react in two hours at 40C

self- The cholesterol oxydase enzyme was immobilized successfully on the modified surface of Platinum nanowires electrode

 Checking and building successfully standard equation The regression equation for cholesterol concentrations and its relevant oxydation current reponse was

Ipeak = 13,97*Ccholesterol + 221 with an approximate correlation of R2 = 0,974 and sensor sensitivity of 0,8 mM The experiment results also express the specific oxidation peak at +0,625 V

The thesis “Study on the immobilization of cholesterol oxydase on nanosensor structure based on Platinum nanowires to quantify cholesterol in solution”

bio-is the beginning in a whole process of studying about cholesterol meter for cholesterol detection in Human blood

Keywords: Biosensor, cholesterol oxydase, Self-assembled monolayer (SAM), cysteamine, glutaraldehyde

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cholesterol và ảnh hưởng của cholesterol đến sức khỏe 3

2.2 Một số phương pháp cố định enzyme trong sinh học 4

2.2.1 Phương pháp nhốt enzyme 5

2.2.1.1 Phương pháp nhốt enzyme trong gel 5

2.2.1.2 Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi 6

2.2.1.3 Phương pháp tạo màng bọc nhốt enzyme 6

2.2.2 Phương pháp tạo liên kết 7

2.2.2.1 Phương pháp tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme 7

2.2.2.2 Phương pháp tạo liên kết giữa enzyme và chất mang 8

2.3 Giới thiệu cảm biến sinh học cholesterol 9

2.3.1 Cảm biến sinh học (Biosensor) 9

2.3.1.1 Tổng quan về cảm biến sinh học 9

2.3.1.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của một cảm biến sinh học 9

2.3.2 Cảm biến sinh học cholesterol 10

2.3.2.1 Giới thiệu sợi nano Platin 11

2.3.2.2 Giới thiệu enzyme cholesterol oxydase 11

2.3.3 Một số nghiên cứu ứng dụng cảm biến sinh học để định lượng cholesterol 13

2.3.4 Cố định enzyme COx vào sợi nano Pt trong cảm biến sinh học cholesterol 14

2.3.4.1 Kỹ thuật tạo lớp đơn tự ghép (self-assembled monolayer - SAM) 14

2.3.4.2 Nguyên lý hình thành lớp đơn tự ghép 14

2.3.4.3 Đặc tính của lớp đơn tự ghép 15

2.3.5 Kỹ thuật quét thế dòng tuần hoàn (CV – cyclic voltammetry) 16

2.3.5.1 Giới thiệu về kỹ thuật quét thế dòng tuần hoàn 16

2.3.5.2 Nguyên lý tiến hành 17

2.3.5.3 Đồ thị quét thế dòng tuần hoàn 18

2.3.5.4 Đặc điểm của quét thế dòng tuần hoàn và các tham số đặc trưng 19

2.3.6 Hệ thiết bị phân tích điện hóa đa năng Autolab 19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

3.2 Vật liệu và hóa chất nghiên cứu 21

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 21

3.2.2 Hóa chất 21

3.2.3 Thiết bị 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 22

3.3.1 Chuẩn bị hóa chất và vật liệu thí nghiệm 22

3.3.1.1 Chuẩn bị hóa chất thí nghiệm 22

3.3.1.2 Làm sạch bề mặt chip 23

3.3.2 Quá trình cố định enzyme cholesterol oxydase 23

3.3.3 Quá trình phân tích và xử lý số liệu 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả quá trình làm sạch bề mặt chip 26

4.1.1 Kết quả quá trình khử bề mặt chip trong dung dịch H2SO4 26

4.1.2 Kết quả quá trình khảo sát chip trong dung dịch K3Fe(CN)6 26

4.2 Kết quả quá trình biến đổi bề mặt chip và gắn enzyme 27

4.2.1 Khảo sát quá trình gắn cysteamine 27

4.2.2 Khảo sát quá trình gắn glutaraldehyde 30

4.2.3 Quá trình gắn enzyme cholesterol oxydase lên sợi nano Pt 33

4.2.4 Kết quả định lượng cholesterol trong dung dịch PBS 35

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC

SEM Scanning Electron Microscope

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thông số kỹ thuật chip sinh học sợi nano Platin 21 Bảng 3.2 Các loại dung môi dùng để pha hóa chất trong các thí nghiệm 22 Bảng 4.3 Cường độ peak tổng hợp theo nồng độ cholesterol trong dung dịch

cholesterol nồng độ 0,8 – 8 mM, tại thế quét +0,625 V, tốc độ quét thế 0,1 V/s, điện thế khảo sát từ -0,1 đến +0,6 V 36

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử cholesterol 3

Hình 2.2 Thang nồng độ cholesterol trong cơ thể 4

Hình 2.3 Các phương pháp cố định enzyme 5

Hình 2.4 Enzyme được nhốt trong gel 6

Hình 2.5 Enzyme được nhốt trong hệ sợi 6

Hình 2.6 Enzyme được nhốt trong vi nang 7

Hình 2.7 Sử dụng glutaraldehyde để tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme 7

Hình 2.8 Sơ đồ gắn enzyme với chất mang 8

Hình 2.9 Sơ đồ cấu trúc và nguyên lý hoạt động của một cảm biến sinh học 9

Hình 2.10 Ảnh SEM của sợi nano Platin 11

Hình 2.11 Cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử COx 12

Hình 2.12 Sơ đồ phản ứng thủy phân cholesterol được xúc tác bởi COx 13

Hình 2.13 Sơ đồ sự gắn kết các phối tử tạo thành lớp đơn tự ghép - SAM 16

Hình 2.14 Đồ thị quét thế theo thời gian trong kỹ thuật CV 17

Hình 2.15 Quan hệ giữa dòng và điện thế trong quét thế dòng thuận nghịch 18

Hình 2.16 Đồ thị CV của quá trình oxy hóa 19

Hình 2.17 Hệ điện cực của máy điện hóa đa năng Autolab 20

Hình 2.18 Hệ đo điện hóa Autolab 20

Hình 3.1 Chip sinh học sợi nano Platin 21

Hình 4.1 Đồ thị khử chip Pt trong dung dịch H2SO4 0,01 M 26

Hình 4.2 Đồ thị oxy hóa - khử chip Pt trong dung dịch K3Fe(CN)6 5 mM 27

Hình 4.3 Quá trình gắn kết giữa glutaraldehyde, cysteamine và bề mặt sợi nano Pt 27

Hình 4.4 Mô hình liên kết giữa phân tử cysteamine và bề mặt sợi nano Pt 28

Hình 4.5 Mối quan hệ giữa thời gian và cường độ peak trong quá trình hình thành SAM CA trên sợi nano Pt ở các nồng độ CA khác nhau 29

Hình 4.6 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde và thời gian

phản ứng giữa sợi Pt và glutarldehyde 31

Hình 4.7 Mối quan hệ giữa thời gian và cường độ peak trong quá trình

biến đổi bề mặt sợi nano Pt ở các nồng độ glutaraldehyde khác nhauError! Bookmark not defined Hình 4.8 Enzyme được cố định qua liên kết chéo hóa trị với GAD 33

Hình 4.9 Kết quả quá trình gắn enzyme và khử nối đôi C=N 34

Hình 4.10 Đồ thị quét thế của chip nano Pt sau mỗi giai đoạn 35

Hình 4.11 Đồ thị quét thế của chip sau khi cố định enzyme trong dung dịch

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh tim mạch là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới cho loài người Hiện nay, tỷ lệ người mắc bệnh tim mạch ngày càng gia tăng trên thế giới Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2004 số người tử vong do bệnh tim mạch trên toàn thế giới là 17,1 triệu người Năm 2008, ước tính có 17,3 triệu người đã chết vì bệnh tim mạch và dự đoán đến năm 2030 sẽ có gần 24,6 triệu người sẽ chết vì các bệnh liên quan đến tim mạch (www.who.int) Bệnh tim mạch bao gồm các bệnh như: xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não, tim mạch vành, nhồi máu cơ tim, Nguyên nhân đặc trưng nhất của các bệnh tim mạch là do sự gia tăng vượt ngưỡng bình thường nồng độ cholesterol trong máu do cơ thể tiêu thụ nhiều thực phẩm có hàm lượng cholesterol cao như mỡ động vật, thịt, phủ tạng động vật Hiện nay, ở nước ta nhu cầu phân tích, định lượng hàm lượng cholesterol trong máu là rất lớn Tuy nhiên, các thiết bị cảm biến cholesterol đa phần đều được nhập khẩu với giá thành cao, chi phí tốn kém vì thế gây ra nhiều khó khăn và hạn chế trong nghiên cứu chẩn đoán và ứng dụng lâm sàng Do đó, hiện nay nhiều công ty, trung tâm nghiên cứu đang đầu tư nghiên cứu để tạo nên những thiết bị có thể được ứng dụng trong phân tích, xác định hàm lượng cholesterol một cách nhanh chóng, chính xác, tiện dụng và có độ nhạy cao để đáp ứng nhu cầu thực tiễn

Công nghệ nano là ngành khoa học công nghệ mới và đang phát triển nhanh chóng nhờ những tiến bộ về khoa học kỹ thuật Khả năng ứng dụng công nghệ nano vào trong y sinh học là rất cao, con người có thể can thiệp tại kích thước nanomet từ

đó giúp quá trình nghiên cứu chẩn đoán, định lượng nhanh chóng và chính xác

Ứng dụng công nghệ nano sinh học vào trong quá trình định lượng nhanh chóng

sự thay đổi nồng độ cholesterol trong máu sẽ tạo ra những cảm biến sinh học siêu nhanh, siêu nhạy, dễ bảo quản và có thể tái sử dụng nhiều lần để kiểm tra định lượng nồng độ cholesterol trong dung dịch Trên cơ sở đó, đề tài “Nghiên cứu cố định enzyme cholesterol oxydase trên cảm biến nano sinh học dựa trên cấu trúc sợi nano Platin để định lượng cholesterol trong dung dịch” được thực hiện

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng quy trình biến đổi bề mặt chip với trình tự lớp đơn tự ghép cysteamine

và hợp chất hữu cơ trung gian glutaraldehyde

Cố định được enzyme cholesterol oxydase trên sợi nano Platin

Xây dựng đường chuẩn theo nồng độ cholesterol trong dung dịch PBS dựa trên chip nano sợi Platin đã được cố định enzyme

1.3 Nội dung thực hiện

Xây dựng quy trình tối ưu biến đổi bề mặt chip sinh học sợi nano Pt và cố định enzyme cholesterol oxydase trên bề mặt sợi nano Pt trong cảm biến sau khi đã được biến đổi bề mặt

 Khảo sát nồng độ dung dịch cysteamine và thời gian ngâm chip để đơn lớp cysteamine hình thành trên sợi nano platin

 Khảo sát nồng độ dung dịch glutaraldehyde và thời gian ngâm chip để đơn lớp glutaraldehyde gắn lên trên lớp cysteamine

 Cố định enzyme cholesterol oxydase trên sợi nano Platin sau khi chip đã được biến đổi bề mặt

Kiểm tra hoạt tính của enzyme sau khi cố định, kiểm tra ngưỡng phát hiện của cảm biến và xây dựng đường chuẩn theo nồng độ cholesterol trong dung dịch PBS dựa trên cảm biến sinh học sợi nano Pt đã được cố định enzyme cholesterol oxydase

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cholesterol và ảnh hưởng của cholesterol đến sức khỏe

Cholesterol là chất béo steroid kém tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ và có thể tạo este với acid béo Cholesterol là thành phần cấu trúc thiết yếu của màng tế bào ở động vật có vú Công thức phân tử của cholesterol là C27H46O

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử cholesterol (www.eccentrix.com).

Cholesterol không tan trong máu và không di chuyển tự do trong máu mà được vận chuyển nhờ các lipoprotein Có 2 loại lipoprotein vận chuyển cholesterol trong máu Loại thứ nhất là lipoprotein trọng lượng phân tử cao (High Density Lipoprotein hay HDL), HDL khi kết hợp với cholesterol sẽ mang cholesterol dư thừa trong máu

về gan để loại thải, giúp cơ thể chống lại xơ vữa động mạch nên còn được gọi là

“cholesterol tốt” Loại thứ 2 là lipoprotein có trọng lượng phân tử thấp (Low Density Lipoprotein hay LDL), LDL khi kết hợp với cholesterol di chuyển trong máu và bám lên thành mạch máu dẫn đến máu khó lưu thông và có thể gây tắc nghẽn mạch máu nên còn được gọi là “cholesterol xấu”

Cholesterol trong cơ thể đến từ 2 nguồn: do chính cơ thể tạo ra hay còn gọi là cholesterol nội sinh (endogenous cholesterol) và được cung cấp thông qua thức ăn hay còn gọi là cholesterol ngoại sinh (exogenous cholesterol) Gan và các tế bào trong

cơ thể tạo ra khoảng 80% tổng lượng cholesterol từ đường, đạm,…; 20% còn lại do thức ăn cung cấp như trứng, bơ, phomat, thịt mỡ,

Vai trò của cholesterol trong cơ thể: cơ thể cần cholesterol để xây dựng nên màng tế bào khỏe mạnh, giúp gan tổng hợp acid mật và cần thiết để tiêu hóa acid béo, hấp thụ các sinh tố A, D, E, K Ngoài ra, cholesterol còn tham gia vào dây chuyền sản xuất một số nội tiết tố quan trọng như testosterone, estrogen, progesterone và là tiền dẫn xuất của vitamine D (Shyam và ctv, 2006)

Như vậy, ở nồng độ bình thường cholesterol có vai trò rất quan trọng đối với cơ thể Trong máu người trưởng thành bình thường, tổng lượng cholesterol khoảng 5,2 mM/L (200 mg/dL), trong đó khoảng 30% ở dạng sterol và 70% ở dạng este hóa với acid béo (Parra, 2007) Khi trong cơ thể tích tụ hàm lượng cholesterol cao hơn mức bình thường chúng sẽ di chuyển và bám lên các thành động mạch dẫn đến hiện tượng xơ vữa động mạch và làm tắc mạch, gây nên các biến chứng nguy hiểm và làm tăng nguy cơ mắc các bệnh như tim mạch, xơ vữa động mạch, huyết áp cao, nhồi máu

cơ tim, tai biến mạch máu não, đột quị, Nồng độ cholesterol tổng số được tìm thấy trong máu và mức độ cho phép đối với một cơ thể người trưởng thành bình thường được thể hiện như hình 2.2

Hình 2.2 Thang nồng độ cholesterol trong cơ thể (Shyam và ctv, 2007)

2.2 Một số phương pháp cố định enzyme trong sinh học

Cố định enzyme là những phương pháp giữ hoặc nhốt enzyme trong một vùng nhất định, enzyme không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường, vẫn giữ được hoạt tính xúc tác và có thể được tái sử dụng nhiều lần Các chất dùng để gắn hoặc giữ enzyme thường được gọi là chất mang (carrier) hay giá thể (support) (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006)

Ưu điểm của enzyme được cố định (enzyme không tan) so với enzyme ở dạng hòa tan là có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định Do đó, làm giảm đáng kể giá thành chế phẩm enzyme, có thể sử dụng liên tục trong các hệ thống dòng chảy và có độ bền với các yếu tố hóa lý lớn hơn khi ở dạng hòa tan Toàn bộ phương pháp cố định enzyme được tóm tắt và thể hiện qua hình 2.3

Hình 2.3 Các phương pháp cố định enzyme (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2010) 2.2.1 Phương pháp nhốt enzyme

2.2.1.1 Phương pháp nhốt enzyme trong gel

Dựa trên cơ sở tạo ra một màng bao bọc, một polymer hay sử dụng các sợi nhân tạo bền với acid, kiềm, các loại ion và các dung môi hữu cơ để nhốt enzyme Các chất tham gia phản ứng và sản phẩm phản ứng có thể thẩm thấu vào trong hoặc ra ngoài thông qua màng bao bọc Enzyme vẫn được giữ nguyên trong màng bọc

Ưu điểm của phương pháp này là enzyme không bị biến đổi nghiêm trọng Tuy nhiên, diện tích tiếp xúc bề mặt giữa enzyme và cơ chất bị hạn chế bởi màng bao bọc Một số gốc tự do được tạo thành trong quá trình trùng hợp có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Ngoài ra, trong một số trường hợp kích thước của mắc lưới không được đồng nhất nên enzyme sẽ thoát ra ngoài môi trường một phần

Hình 2.4 Enzyme được nhốt trong gel

(Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2010)

2.2.1.2 Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi

So với enzyme được nhốt trong gel, enzyme nhốt trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn Các hệ sợi dùng để nhốt enzyme thường là các sợi nhân tạo có

độ bền với acid, kiềm, các loại ion và với các dung môi hữu cơ hòa tan

Hình 2.5 Enzyme được nhốt trong hệ sợi a) nhốt enzyme trong sợi có lỗ;

b) nhốt enzyme trong sợi bông (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2010).

2.2.1.3 Phương pháp tạo màng bọc nhốt enzyme

Enzyme có thể được bọc bằng các loại màng khác nhau và tạo thành các dạng khác nhau Có thể phân biệt các kiểu màng bọc như sau:

 Microcapsule: màng dùng để bọc enzyme là màng bán thấm tổng hợp và có những lỗ nhỏ để các chất phân tử thấp có thể đi qua nhưng enzyme vẫn được giữ trong màng bọc và không thoát ra ngoài môi trường

 Liposome: màng lỏng, được tạo thành từ các phospholipid

 Các sợi có các lỗ rỗng (hollow – fiber)

Phương pháp này hầu như không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tử enzyme và có thể cùng lúc bọc nhiều enzyme xúc tác cho một dãy phản ứng trong cùng một màng bọc

Hình 2.6 Enzyme được nhốt trong vi nang (Twyman, 2005)

2.2.2 Phương pháp tạo liên kết

2.2.2.1 Phương pháp tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme

Phương pháp này hoàn toàn không dùng chất mang mà dùng các chất có nhóm chức năng kép (bifunctional reagent) Những chất này có 2 nhóm chức ở hai đầu hoàn toàn giống nhau, phản ứng với các nhóm chức của phân tử enzyme khác nhau từ đó tạo nên liên kết chéo giữa chúng, liên kết các phân tử enzyme lại thành phần tử có kích thước lớn và không hòa tan (Phạm Thị Trân Châu và ctv, 2006)

Cơ chất thường dùng phổ biến nhất là glutaraldehyde (CHO-(CH2)3-CHO) Các nhóm chức của cơ chất sẽ liên kết với các nhóm chức trong phân tử enzyme như nhóm amine (-NH2), nhóm carboxyl (-COOH), nhóm thiol (-SH)

Hình 2.7 Sử dụng glutaraldehyde để tạo liên kết chéo giữa các phân tử

enzyme (Phạm Thị Trân Châu và ctv, 2006)

Hạn chế của phương pháp này là cấu trúc phân tử enzyme có thể bị phá hỏng và làm giảm hoạt độ enzyme trong quá trình tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme

2.2.2.2 Phương pháp tạo liên kết giữa enzyme và chất mang

Đây là phương pháp gắn enzyme vào chất mang Chất mang là những chất có những tính chất đặc biệt như: bền với acid hoặc kiềm; phải gắn được với enzyme theo những cơ chế nhất định; không tham gia phản ứng với cơ chất (Nguyễn Đức Lượng

và ctv, 2010) Các phương pháp gắn enzyme với chất mang như phương pháp hấp phụ, phương pháp tạo liên kết ion, phương pháp liên kết với kim loại và phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị

 Phương pháp hấp phụ: nhờ vào khả năng hấp phụ của bề mặt các nguyên liệu làm chất mang, enzyme sẽ gắn vào bề mặt chất mang Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và thường ít ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme Lực liên kết trong phương pháp này cao, khả năng tái sử dụng lớn Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần enzyme có thể hòa tan trở lại Một số nguyên liệu thường được dùng làm chất mang như cellulose, agarose, chitin, nylon, thủy tinh

 Phương pháp tạo liên kết ion: dựa trên khả năng tạo liên kết ion giữa chất mang và enzyme, enzyme sẽ được gắn vào chất mang Một số nguyên liệu dùng làm chất mang như DEAE-sephadex, DEAE-cellulose, cellulose phosphate, nylon Liên kết ion giữa chất mang và enzyme thường không bền bằng phương pháp hấp phụ enzyme vào chất mang

 Phương pháp liên kết với kim loại: sử dụng những hợp chất kim loại để làm tăng hoạt tính bề mặt của chất mang Từ đó enzyme sẽ gắn chặt vào chất mang

 Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị: dựa trên cơ sở sự tương tác đồng hóa trị giữa phân tử enzyme và chất mang để cố định enzyme

Hình 2.8 Sơ đồ gắn enzyme với chất mang

(Phạm Thị Trân Châu và ctv, 2006)

2.3 Giới thiệu cảm biến sinh học cholesterol

2.3.1 Cảm biến sinh học (Biosensor)

2.3.1.1 Tổng quan về cảm biến sinh học

Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi

Phần tử nhận biết sinh học trong thiết bị cảm biến sinh học như enzyme, kháng thể, protein, acid nucleic được sử dụng như cơ chế sinh hóa dùng để nhận biết Phần

tử chuyển đổi thường dùng gồm quang học, điện hóa và đo độ nhạy khối phổ Cảm biến sinh học sẽ cho kết quả nhanh, nhạy trong phân tích hóa chất, đo đạc các mẫu bệnh phẩm và chất độc hại nhờ những phần tử nhận biết sinh học

2.3.1.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của một cảm biến sinh học

Một cảm biến sinh học dùng trong phân tích, định lượng được mô tả một cách khái quát như sau:

Hình 2.9 Sơ đồ cấu trúc và nguyên lý hoạt động của một cảm biến sinh học

(Pratima và ctv, 2011)

Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm 4 bộ phận chính: đầu thu sinh học; tác nhân cố định; bộ phận chuyển đổi tín hiệu và bộ phận xử lý, đọc tín hiệu

 Tác nhân cần phát hiện, định lượng: dựa vào cấu tạo, tác nhân cần được phát

hiện, định lượng được phân loại như các vi khuẩn (vi khuẩn Escherichia coli, vi

khuẩn bệnh than); các phân tử nhỏ (glucose, cholesterol, ure, CO, CO2, amino acid, aspirin, penicilin); các phân tử lớn (enzyme, protein, DNA, RNA, các hormone)

 Đầu thu sinh học: đầu thu sinh học bao gồm những phần tử phản ứng trực tiếp với tác nhân cần được định lượng, phát hiện Đầu thu sinh học thường là các enzyme, kháng thể, acid nucleic, protein hoặc các chất sinh học trong cơ thể

 Tác nhân cố định: để gắn được các đầu thu sinh học lên trên đế cần phải có một bộ phận trung gian là tác nhân cố định Nhờ tác nhân cố định này mà đầu thu sinh học có thể gắn lên trên đế nền vô cơ

 Bộ phận chuyển đổi: đây là bộ phận quan trọng trong một cảm biến sinh học

Bộ phận chuyển đổi sẽ biến đổi các tín hiệu thu nhận được thành những tín hiệu khác

có thể phân tích được Các dạng chuyển đổi trong bộ phận chuyển đổi như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang học, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hay chuyển đổi bằng các hệ vi cơ

 Bộ phận xử lí và ghi nhận tín hiệu: bộ phận này sẽ chuyển hóa thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị khác xử lí

2.3.2 Cảm biến sinh học cholesterol

Nguyên lý hoạt động của cảm biến cholesterol: enzyme cholesterol oxydase

được cố định trên sợi nano Platin Enzyme cholesterol oxydase sẽ xúc tác quá trình oxy hóa cholesterol Quá trình định lượng cholesterol dựa vào các phản ứng sau:

 Xác định hydrogen peroxide dựa trên kết quả phản ứng oxy hóa cholesterol được xúc tác bởi cholesterol oxydase:

Cholesterol + O2Pt /CA /GAD /COx 4-cholesten- 3-one + H2O2

 H2O2 được phát hiện bởi các phản ứng tại điện cực enzyme:

H2O2quá trình oxy hóa O2 + 2H+ + 2e

-Cường độ dòng điện đo được tỷ lệ thuận với lượng H2O2 bị oxy hóa, do đó sẽ tỷ

lệ thuận với nồng độ cholesterol có trong dung dịch

2.3.2.1 Giới thiệu sợi nano Platin

Sợi nano được định nghĩa là vật liệu ở dạng sợi với đường kính sợi trong khoảng

1 – 100 nm Đây là những sợi siêu nhỏ và để quan sát được cần phóng đại dưới kính hiển vi hàng trăm nghìn lần Khi ở dạng siêu nhỏ sợi nano, phần lớn các lớp nguyên

tử cấu tạo nên sợi sẽ nằm trên bề mặt sợi, dẫn đến các tính chất của sợi, đặc biệt là điện trở của sợi rất nhạy với các thay đổi của môi trường bên ngoài (Xia và ctv, 2003)

Platin hay còn gọi là bạch kim (kí hiệu Pt) là một kim loại chuyển tiếp, không bị oxy hóa trong không khí và ổn định trong phổ điện thế rộng đối với hầu hết dung môi Sợi nano Platin có độ dày 25 nm, chiều ngang 40 – 50 nm, chiều dài 5 – 20 m

và dòng điện làm việc trong khoảng A tương ứng với điện thế -1 đến 1 Volt

Hình 2.10 Ảnh SEM của sợi nano Platin (Tong Duy Hien và ctv, 2010)

2.3.2.2 Giới thiệu enzyme cholesterol oxydase

Cholesterol oxydase (COx) (EC.1.1.3.6) là enzyme thuộc nhóm enzyme nhân flavin đặc trưng với flavin adenine dinucleotide (FAD) hoạt động như nhóm ngoại tham gia vào quá trình oxy hóa - khử và được tìm thấy ở 2 dạng khác nhau Dạng thứ nhất, đồng yếu tố FAD hấp lực hóa học, liên kết với protein thông qua liên kết giữa nhóm 8-methyl của hệ thống vòng isoalloxazine trên FAD với chuỗi bên của phân tử histidine trong chuỗi polypeptide Dạng thứ hai là các đồng yếu tố FAD không liên kết vào protein (Alice Vrielink, 2010)

COx chỉ được tìm thấy trong vi sinh vật Một số vi khuẩn như Mycobacterium,

Rhodococcus và Nocardia, enzyme được tìm thấy bên trong tế bào còn gọi là enzyme

nội bào Một số vi khuẩn khác như Arthrobacter, Schizopyllum, Streptoverticillium

Brevibacterium và Streptomyces enzyme thu được từ bên ngoài tế bào còn gọi là

enzyme ngoại bào (MacLachlan và ctv, 2000)

Đặc tính sinh học của COx là xúc tác cho quá trình oxy hóa phân giải

cholesterol thành 4-cholesterol-3-one trong sự hiện diện của oxygen để thành dạng

hydrogen peroxide Enzyme được sử dụng trong nghiên cứu thường được thu nhận từ

streptomyces hygroscopicus (SCO) và brevibacterium sterolicum (BCO) được tạo

dòng trong vi khuẩn Escherichia coli có cấu trúc như hình 2.11

Hình 2.11 Cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử COx a) Enzyme thu nhận

từ Streptomyces sp; b) Enzyme thu nhận từ Brevibacterium sterolicum; màu đỏ là

trung tâm hoạt động, màu vàng là đồng yếu tố FAD (Alice Vrielink, 2010)

Phản ứng xúc tác thủy phân cholesterol bởi enzyme cholesterol oxydase được

mô tả khái quát như hình 2.12 Bước đầu tiên trong chu trình phản ứng được gọi là

bán phản ứng khử, nhóm 3β-hydroxyl của hệ thống vòng steroid được oxy hóa thành

dạng ketone tương ứng dưới sự xúc tác của đồng yếu tố FAD Trong bước thứ hai,

enzyme xúc tác phản ứng đồng phân hóa liên kết đôi trong quá trình oxy hóa hệ thống

vòng steroid từ vị trí 5 – 6 thành vị trí 4 – 5 để tạo thành sản phẩm cuối cùng là 4-cholesterol-3-one Bước cuối cùng trong phản ứng enzyme được gọi là bán phản

ứng oxy hóa, đồng yếu tố FAD phản ứng với dioxygen và bị oxy hóa trong khi O2 bị

khử thành H2O2

Hình 2.12 Sơ đồ phản ứng thủy phân cholesterol được xúc tác bởi

cholesterol oxydase (Sunil và ctv, 2008)

2.3.3 Một số nghiên cứu ứng dụng cảm biến sinh học để định lượng cholesterol

Năm 2001, Sean Brahim và cộng tác viên đã nghiên cứu xác định nồng độ cholesterol trong dung dịch bằng cách sử dụng cảm biến nano sinh học với enzyme cholesterol oxydase được cố định trong màng polypyrrole – hydrogel Kết quả cho thấy ngưỡng phát hiện nồng độ cholesterol là 120 µM, kết quả định lượng tương quan đến 99,8% so với phương pháp xác định nồng độ cholesterol bằng kỹ thuật hóa phân tích được sử dụng trong bệnh viện

Năm 2005, Katrlík và cộng tác viên đã nghiên cứu và ứng dụng điện cực vàng sửa đổi với enzyme peroxidase, cholesterol oxydase và hợp chất trung gian, đơn lớp acetate cellulose Kết quả định lượng được nồng độ cholesterol từ 1,1 – 40 µM/L trong dung dịch đệm

Năm 2007, Aravamudhan và cộng tác viên đã nghiên cứu ứng dụng cảm biến nano sinh học dựa trên cấu trúc sợi vàng được sửa đổi với enzyme cholesterol oxydase và cholesterol esterase để định lượng cholesterol trong máu Kết quả cho thấy có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ cholesterol và cường độ peak Cảm biến đạt độ nhạy 0,85 nA/µM và có tính ổn định cao

Năm 2007, Parra và cộng tác viên đã nghiên cứu định lượng cholesterol bằng cách sử dụng điện cực sợi vàng được sửa đổi bằng cách gắn trực tiếp enzyme cholesterol oxydase lên trên bề mặt Kết quả cho thấy ngưỡng phát hiện nồng độ cholesterol là 60 µM, độ nhạy của cảm biến là 0,13 µA/mM

Năm 2011, Jeng và cộng tác viên đã nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học dựa trên enzyme cholesterol oxydase và ống nano carbon nhiều vách để định lượng nồng

độ cholesterol trong dung dịch Kết quả cho thấy ngưỡng phát hiện được nồng độ cholesterol là 46,8 µM Độ nhạy của cảm biến là 1261,74 µA/mM.cm2

2.3.4 Cố định enzyme COx vào sợi nano Pt trong cảm biến sinh học cholesterol

Quá trình cố định enzyme cholesterol oxydase vào sợi nano Pt trong cảm biến sinh học sợi nano platin được thực hiện thông qua lớp đơn tự ghép cysteamine và lớp hợp chất hữu cơ glutaraldehyde Trên phân tử cysteamine, một đầu sẽ liên kết với sợi nano Platin thông qua nhóm thiol (–SH), đầu còn lại mang nhóm amine (–NH2) sẽ liên kết với nhóm –CHO trong phân tử GAD Đầu mang nhóm –CHO còn lại của phân tử GAD sẽ liên kết với phân tử enzyme thông qua nhóm –NH2

2.3.4.1 Kỹ thuật tạo lớp đơn tự ghép (self-assembled monolayer - SAM)

Lớp đơn tự ghép (SAM) là một lớp các chất hữu cơ được hình thành bởi sự hút bám của các phân tử ở thể gas hay thể lỏng trên một bề mặt nào đó bởi ái lực đặc biệt của nhóm chức tận cùng của phân tử và bề mặt đó (Frretti và ctv, 2000) Cấu trúc lớp đơn tự ghép gồm 3 thành phần cơ bản: phần đầu (head group), mạch ankyl và phần cuối (terminal group) (Nguyễn Đức Nghĩa, 2007)

 Phần đầu: đây là phần quan trọng nhất trong cấu trúc SAM, phần này có khả năng hấp thụ và tạo liên kết với đế phủ, là tiền đề để tạo màng mỏng nano đơn lớp

 Mạch alkyl: nhờ cấu trúc mạch alkyl nên tạo được màng mỏng nano nhờ lực liên kết Van der Waals

 Phần cuối: là nhóm chức năng có vai trò hoạt hóa bề mặt màng mỏng nano Nhóm chức này sẽ liên kết với các thành phần phân tử hữu cơ tùy theo nhu cầu ứng dụng của màng mỏng

2.3.4.2 Nguyên lý hình thành lớp đơn tự ghép

Lớp đơn tự ghép được hình thành dựa trên một phân tử mà thường là một mạch ankyl với khoảng từ 10 đến 20 đơn vị methyl với một đầu có ái lực mạnh hấp phụ vào

bề mặt chất mang và đầu mang nhóm chức còn lại sẽ hướng ra bên ngoài Ví dụ như đầu nhóm -SH và bề mặt vàng (Au), nhóm –SH đầu mạch từ dung dịch sẽ hấp thụ vào bề mặt vàng tạo ra một lớp màng và hướng ra ngoài những nhóm đuôi mang gốc chức năng như gốc amine (-NH2), gốc carbocyl (-COOH)

Bằng cách sử dụng đầu –SH hoặc những đầu khác, bề mặt vật liệu nền sẽ được gắn những nhóm đuôi có khả năng tương tác trong một phạm vi rộng Điều đó giúp cho việc thao tác trên những bề mặt vật liệu dễ dàng và thuận lợi hơn đặc biệt là đối với những kim loại bền Nhóm chức hóa học ở đầu mạch hay cuối mạch là phần cung cấp những nhóm chức năng cho các phản ứng cần nghiên cứu

Nhóm đuôi tận cùng là –CH3 ngày nay được thương mại rộng rãi Ngoài ra, một

số nhóm chức khác cũng được sử dụng và có thể tổng hợp được trong phòng thí nghiệm như: -CH3, -OH, -(C=O)OCH3, -O(C=O)CH3, -O(C=O)CF3

2.3.4.3 Đặc tính của lớp đơn tự ghép

Bề mặt kim loại sạch có khả năng hấp phụ một cách ngẫu nhiên những chất hữu

cơ có trong môi trường xung quanh vì sự hấp phụ này có năng lượng thấp hơn năng lượng tự do của bề mặt lớp tiếp xúc giữa kim loại hay oxide kim loại và môi trường xung quanh Những chất được hấp phụ này khi bám trên bề mặt có khuynh hướng làm thay đổi tính ổn định cấu trúc nano của kim loại, oxide kim loại và gây cản trở các phản ứng giữa các phân tử bề mặt Có thể kiểm tra tính chất bề mặt của lớp đơn tự ghép bằng một số kỹ thuật như: điện hóa, quét phổ hồng ngoại, quét phổ quang điện tử tia X Tùy thuộc vào lĩnh vực áp dụng của lớp đơn tự ghép, trong nghiên cứu ta có thể lựa chọn những nhóm chức đầu mạch khác nhau Bề mặt cơ chất thích hợp được lựa chọn để tương tác với nhóm đầu mạch có thể là bề mặt phẳng như silicon hay kim loại hoặc bề mặt cong như hạt phân tử nano Sơ đồ sự gắn kết các phối tử để tạo thành lớp đơn tự ghép được mô tả chi tiết như trong hình 2.13

Thiol và disulfure là những nhóm chức đầu mạch thường hay được sử dụng cho những bề mặt kim loại trơ và bền như vàng (Au), bạch kim (Pt), titan,… Trong nghiên cứu này, lớp đơn tự ghép được hình thành trên bề mặt sợi nano Pt bởi các phân tử cysteamine sau đó được biến đổi gốc chức năng với phân tử glutaraldehyde

để liên kết với các phân tử enzyme cholesterol oxydase

Hình 2.13 Sơ đồ sự gắn kết các phối tử tạo thành lớp đơn tự ghép - SAM

(Christopher và ctv, 2005)

2.3.5 Kỹ thuật quét thế dòng tuần hoàn (CV – cyclic voltammetry)

2.3.5.1 Giới thiệu về kỹ thuật quét thế dòng tuần hoàn

Phương pháp quét thế dòng tuần hoàn là phương pháp đo dòng điện hóa được sử dụng để nghiên cứu cơ chế các phản ứng oxy hóa - khử khống chế bởi quá trình khuếch tán Đây là phương pháp thực nghiệm điện hóa được điều khiển bằng thế Áp điện thế biến thiên theo thời gian lên một điện cực và quan sát đáp ứng điện tương ứng Hệ thiết bị điện hóa đa năng Autolab được sử dụng trong hầu hết quá trình làm sạch bề mặt sợi nano Platin, tạo chất trung gian, đồng thời kiểm tra phân tích cảm biến sau quá trình cố định enzyme

Trong quá trình quét thế, dòng tuần hoàn tiến đến giá trị thế cố định sẵn thì chiều của dòng điện trong điện cực làm việc sẽ thay đổi ngược lại Sự đảo chiều của dòng điện có thể xảy ra nhiều lần trong thí nghiệm Dòng của điện cực làm việc được ghi lại kết hợp với dòng thế áp tạo thành một đồ thị dòng tuần hoàn

Thông thường, phương pháp quét thế dòng tuần hoàn được sử dụng trong phân tích tính chất của dung dịch để thu nhận thông tin nhiệt động học và động lực học của

sự truyền điện tích giữa điện cực và dung dịch, cũng như động lực học và cơ chế của phản ứng hóa học gây ra do sự chuyển dời điện tích này (Wang, 2006)

2.3.5.2 Nguyên lý tiến hành

Một nguồn phân thế (potentiostat) làm nhiệm vụ điều khiển các thông số thực nghiệm Mục đích của nó là quét một điện thế tuần hoàn tuyến tính biến thiên theo thời gian trên một điện cực (gọi là điện cực làm việc WE – working electrode) và xuất ra kết quả là một đường cong dòng – thế (Gosser, 1993) Quá trình quét thế được thực hiện từ thế đầu (Eđ) đến thế cuối (Ec) và ngược lại với vận tốc quét là v (V/s) Nếu quá trình quét thế từ phía dương đến phía âm thì:

và động học của phản ứng điện cực thông qua đồ thị quét thế dòng tuần hoàn - CV Xét quá trình oxy hóa - khử O + ne ⇆ R Nếu quét từ điện thế đầu tiên Eđdương hơn điện thế điện cực tiêu chuẩn danh nghĩa E0’ thì chỉ có dòng không Faraday đi qua Khi điện thế đạt đến giá trị E0’ thì sự khử bắt đầu xảy ra và có dòng Faraday đi qua Điện thế càng dịch về phía âm thì nồng độ chất O càng giảm xuống và sự khuếch tán tăng lên do đó dòng điện cũng tăng lên Khi nồng độ chất O giảm đến 0 ở sát bề mặt điện cực thì cường độ dòng điện đạt đến giá trị cực đại, sau đó lại giảm xuống vì nồng độ chất O trong dung dịch giảm xuống Khi quét thế ngược lại về phía

dương, chất R bị oxy hóa thành chất O khi điện thế quay về đến E0’ và dòng anod đi qua Phản ứng điện hóa xảy ra ở điện cực WE

Hình 2.15 Quan hệ giữa dòng và điện thế trong quét thế dòng

thuận nghịch (Monk, 2001)

Sự chuyển dời điện tử sẽ hình thành nên cường độ dòng điện ở điện cực WE Dòng điện tử này chính là dòng điện cảm ứng Nguồn điện thế sẽ cung cấp điện thế cho điện cực đối (Counter electrode - CE) để cân bằng dòng điện cảm ứng ở điện cực

WE bằng cách tạo ra dòng điện tử chuyển động ngược hướng với dòng điện trên điện cực WE, nghĩa là nếu sự khử xảy ra ở điện cực WE thì sự oxy hóa sẽ xảy ra trên điện cực so sánh (Reference electrode – RE)

2.3.5.3 Đồ thị quét thế dòng tuần hoàn

Trong quá trình đo đạc, tương ứng với mỗi giá trị điện thế máy đo sẽ ghi nhận giá trị cường độ dòng và sẽ cho kết quả là một đồ thị thể hiện cường độ dòng điện (mật độ dòng) theo hiệu điện thế Tùy theo tính chất động học của phản ứng khảo sát, hình và dạng của đồ thị có thể biến đổi khác nhau Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, đồ thị CV sẽ có các dạng như sau:

 Hệ bất thuận nghịch: phản ứng chỉ xảy ra một chiều oxy hóa hoặc khử, đồ thị

CV sẽ xuất hiện một peak oxy hóa hoặc khử tương ứng

 Hệ giả thuận nghịch: hệ này thường gặp trong các nghiên cứu thực tế, ở hệ này so với thế cân bằng, dạng oxy hóa sẽ bị khử khi phân cực về phía âm và ngược lại dạng khử sẽ bị oxy hóa khi phân cực về phía dương Tuy nhiên, tốc độ của các quá trình này không bằng nhau vì vậy đồ thị CV hệ này hoàn toàn không đối xứng như trong hệ thuận nghịch

 Hệ thuận nghịch: phản ứng oxy hóa khử xảy ra ở bề mặt điện cực là thuận nghịch Đồ thị CV ở hệ này xuất hiện cả peak khử và peak oxy hóa rất đối xứng Tuy nhiên, đồ thị CV hệ này thường ít gặp trong thực tế

Hình 2.16 Đồ thị CV của quá trình oxy hóa (A) bất thuận nghịch,

(B) thuận nghịch, (C) giả thuận nghịch (Jianzhong và ctv, 2002)

2.3.5.4 Đặc điểm của quét thế dòng tuần hoàn và các tham số đặc trưng

Đồ thị của quét thế dòng tuần hoàn là sự phối hợp giữa điện thế và cường độ dòng ghi nhận được trong quá trình quét thế Kết quả của quá trình quét thế phụ thuộc rất nhiều vào dung dịch điện li cần phân tích Dung dịch điện li phải có khả năng oxy hóa trong toàn bộ vùng làm việc của điện cực trong suốt quá trình quét thế

Trên đồ thị CV hình 2.15 cho thấy chiều dương của dòng (dòng anod) tương ứng với quá trình oxy hóa (cường độ I > 0), chiều âm của dòng (dòng catod) ứng với quá trình khử (cường độ I < 0) Các điểm cực trị trên đồ thị được gọi là peak anod -

Ipa hay peak catod – Ipc Từ đồ thị hình 2.15 ta có các thông số peak như sau:

 Ipa và Ipc là các điểm giá trị cực đại của dòng anod và dòng catod

 Epa và Epc là giá trị cực đại thế tương ứng với cực đại cường độ dòng anod và dòng catod

Các giá trị về thế của peak cung cấp những thông tin về động lực học của phản ứng oxy hóa - khử Các thông số dòng của peak cung cấp thông tin về nồng độ và độ bền của các chất có trong hệ

2.3.6 Hệ thiết bị phân tích điện hóa đa năng Autolab

Hệ thiết bị phân tích điện hóa đa năng Autolab được sử dụng trong các bước kiểm tra các quá trình làm sạch, biến đổi bề mặt chip, gắn enzyme và quá trình kiểm

tra phân tích cảm biến sau khi đã được cố định enzyme Phương pháp quét thế dòng tuần hoàn sử dụng hệ thống 3 điện cực bao gồm một điện cực đối (reference electrode – RE), một điện cực làm việc (working electrode – WE) và một điện cực đo đạc (counter electrode – CE) Hệ thiết bị phân tích điện hóa đa năng Autolab được sử dụng trong quá trình nghiên cứu bao gồm: điện cực đối (RE) là Ag/AgCl; điện cực làm việc (WE) là chip sinh học sợi nano Pt và điện cực đo đạc (CE) là sợi Pt có đường kính 0,5 mm, chiều dài 5 cm

Hình 2.17 Hệ điện cực của máy điện hóa đa năng Autolab (a) WE:

điện cực làm việc – chip nano Platin; (b) RE: điện cực đối Ag/AgCl; (c) CE: điện cực đo đạc sợi Pt; (d) cốc chứa dung dịch (Phòng thí

nghiệm Công nghệ Nano – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh)

Hình 2.18 Hệ đo điện hóa Autolab ((Phòng thí nghiệm Công nghệ

Nano – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 07/2012 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, khu phố 6, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và hóa chất nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Chip điện cực sợi nano Platin được thiết kế và chế tạo bởi Tiến sĩ Tống Duy Hiển, Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Chip bao gồm 1 đầu tiếp xúc với dòng điện, liên kết với dãy sợi nano platin thông qua các đường dẫn bằng Crom được thiết kế trên đế nền Silic Thông số kỹ thuật của chip sinh học nano Pt được mô tả trong bảng 3.1

Hình 3.1 Chip sinh học sợi nano Platin (Phòng thí nghiệm

Công nghệ Nano Đại học Quốc gia TP Hồ CHí Minh)

Bảng 3.1 Thông số kỹ thuật chip sinh học sợi nano Platin

Chip sinh học sợi nano Pt Thông số kỹ thuật

Dòng điện làm việc sợi nano Pt µA

Điện trở của sợi nano Pt 30 – 40 

Khoảng thế đo của sợi nano Pt -1V đến +1 V

Dãy sợi nano Pt liên kết thông qua đường dẫn Crom (5 nm)

3.2.2 Hóa chất

Acid sulfuric – H2SO4; K3Fe(CN)6; NaBH4 (Meck – Đức); nước cất (Meck – Đức); ethanol 99% (Meck – Đức); Triton – 100 X (Sigma-Aldrich – Hoa Kỳ)

Glutaraldehyde – GAD 25% (Meck – Đức); cholesterol (Sigma-Aldrich – Hoa Kỳ); cysteamine – CA > 98% (Sigma-Aldrich – Hoa Kỳ); dung dịch đệm muối phosphate (PBS) 0,1 M; enzyme cholesterol oxydase (COx: EC 1.1.3.6): được thu

nhận từ Streptomyces sp – C8649 với hoạt lực ≥ 20 units/mg protein (Sigma-Aldrich

– Hoa Kỳ)

3.2.3 Thiết bị

 Máy điện hóa Autolab PGSTAT 12/30/302 (Hà Lan)

 Tủ sấy khô (Sanyo – Nhật Bản)

 Tủ mát 40C dùng để lưu trữ mẫu (Sanyo – Nhật Bản)

 Tủ lạnh -200C dùng để bảo quản enzyme (Sanyo – Nhật Bản)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị hóa chất và vật liệu thí nghiệm

3.3.1.1 Chuẩn bị hóa chất thí nghiệm

Có hai loại nước được sử dụng trongquá trình thí nghiệm: nước khử ion (de-ion)

và nước cất Nước DI được sử dụng để rửa chip trong quá trình làm sạch bề mặt chip Nước cất được sử dụng để làm dung môi trong quá trình pha các loại hóa chất liên quan trong thí nghiệm

Bảng 3.2 Các loại dung môi dùng để pha hóa chất trong các thí nghiệm

Dung dịch cần pha Dung môi Cách bảo quản dung dịch

khi chưa sử dụng

Cholesterol Nước cất và Triton

100X

Lưu trữ ở 40C, tránh tiếp xúc với ánh sáng

Cysteamine Ethanol 99% Lưu trữ trong lọ màu, tránh

tiếp xúc với ánh sáng Glutaraldehyde Nước cất Lưu trữ ở nhiệt độ phòng

tránh tiếp xúc với ánh sáng Enzyme cholesterol oxydase PBS lạnh 0,1 M pH 7,0 Lưu trữ ở -200C

Dung dịch đệm muối phosphate (PBS): là dung dịch đệm dùng để tạo môi trường điện ly trong phản ứng điện hóa để dung dịch có đủ tính dẫn truyền điện tử và

tạo môi trường có pH tương tự như pH trong máu người khi pha loãng để khảo sát nồng độ cholesterol và xây dựng đường chuẩn Dung dịch PBS được tạo ra bởi nước cất và Na2HPO4, KH2PO4, NaCl, KCl nồng độ 1 mM theo tỷ lệ tương ứng để đạt

pH 7,0 Cách chuẩn bị các dung dịch khác được sử dụng trong thí nghiệm và cách bảo quản khi chưa sử dụng được tóm tắt theo bảng 3.2

3.3.1.2 Làm sạch bề mặt chip

Chip sau khi được chế tạo và lưu trữ trên bề mặt đế Silic sẽ có những thành phần không mong muốn như bụi và các chất bẩn hữu cơ tồn tại trong quá trình chế tạo và bảo quản Những chất này bám trên bề mặt chip gây cản trở cho quá trình cố định enzyme cũng như quá trình định lượng cholesterol trong dung dịch Vì vậy, trước khi thực hiện các thí nghiệm, chip cần được loại bỏ bụi và các chất bẩn hữu cơ bám trên

bề mặt đế Silic Quy trình làm sạch bề mặt và kiểm tra đặc tính của chip được tiến hành theo các bước như sau:

Bước 1: Ngâm chip trong ethanol 99% trong 5 phút Sau đó rửa lại chip bằng nước khử ion (DI) và làm khô

Bước 2: Quét kiểm tra chip trong dung dịch H2SO4 0,01 M với khoảng thế quét

từ -1 V đến 0 V, tốc độ quét 0,1 V/s, trong thời gian 5 giây đến thế ổn định

Bước 3: Quét kiểm tra chip trong dung dịch K3Fe(CN)6 5 mM được hòa tan trong dung dịch PBS 0,1 M, pH 4,0 với khoảng thế quét từ +0,6 V đến -0,2 V, tốc độ quét 0,1 V/s, trong thời gian 5 giây đến thế ổn định

Bước 4: Quét chip trong dung dịch H2SO4 0,01 M với khoảng thế quét từ -1 V đến 0

V, tốc độ quét 0,1 V/s, trong thời gian 5 giây đến thế ổn định để làm sạch lại bề mặt chip

3.3.2 Quá trình cố định enzyme cholesterol oxydase

Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian ngâm chip và nồng độ dung dịch Cysteamine tối ưu dùng để biến đổi bề mặt chip

 Chip sau khi được làm sạch bề mặt sẽ ngay lập tức ngâm trong dung dịch cysteamine (CA) với các nồng độ: 0,1 M; 0,3 M; 0,5 M ở 40C trong điệu kiện tối (vì cysteamine bị phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng)

 Ngâm chip với những khoảng thời gian: 2 – 4 – 6 – 8 – 16 giờ

 Sau mỗi mốc thời gian ngâm trong dung dịch CA, chip được rửa 2 – 3 lần với ethanol và nước DI để loại bỏ các phân tử cysteamine dư thừa Tiến hành quét