NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THỦY PHÂN NHAU HEO TẠO PHÂN BÓN LÁ Ngành

Trong lĩnh vực vi sinh, vi khuẩn Bacillus subtilis có nhiều tính chất rất ưu việt để sản xuất các chế phẩm sinh học và đặc biệt là chúng có khả năng sinh enzyme protease với hoạt độ rấ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THỦY PHÂN NHAU HEO TẠO PHÂN BÓN LÁ

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN CÔNG PHÁT Niên khóa : 2008 – 2012

Tháng 7/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THỦY PHÂN NHAU HEO TẠO PHÂN BÓN LÁ

KS NGUYỄN MINH QUANG

Tháng 7/2012

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm

Bộ môn Công nghệ Sinh Học cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kiến thức quí báu cho tôi trong suốt thời gian theo học tại trường

ThS Võ Thị Thúy Huệ, KS Nguyễn Minh Quang, ThS Trương Phước Thiên Hoàng đã luôn theo sát hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Anh Nguyễn Văn Út, Phan Hữu Tín, chị Nguyễn Trường Ngọc Tú, Trương Thị Ngọc Hân tại trại Thực Nghiệm viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường -Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Các bạn Lê Văn Hiếu, Quách Văn Thiệu, Hồ Đức Quyết, Võ Đức Tuấn và các bạn trong tập thể lớp DH08SH đã giúp đỡ, động viên và chia sẽ mọi khó khăn, vui buồn trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ và anh chị đã nuôi nấng, dạy

dỗ con khôn lớn, luôn động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho con trong suốt thời gian học tập ở Trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Công Phát

TÓM TẮT

Ngày nay vấn đề an ninh lương thực đang là một thách thức đối với ngành nông nghiệp của các nước trên thế giới Trong khi đó, đất nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp, môi trường bị ô nhiễm, thiên tai, biến đổi khí hậu cho nên yêu cầu bức thiết được đặt ra là phải tạo ra các sản phẩm phân bón phục vụ cho trồng trọt nhằm cải thiện năng suất cây trồng và đặc biệt là phải thân thiện với môi trường Dựa trên cơ sở đó đề tài “nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thủy phân nhau heo tạo phân bón lá” đã được thực hiện

Nội dung bao gồm phân lập vi khuẩn từ các mẫu bùn đáy ao, ruột cá, đất, sau đó sử

dụng các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn Bacillus subtilis Khảo sát khả năng

sinh enzyme protease của vi khuẩn phân lập và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme protease do vi khuẩn sản sinh Khảo sát các điều kiện tối ưu nhằm xây dựng quy trình thủy phân nhau heo để tạo phân bón lá hữu cơ sinh học Ứng dụng thử nghiệm phân bón lá trên rau cải bẹ xanh nhằm tìm ra nồng độ sử dụng thích hợp nhất của chế phẩm phân bón lá tự tạo

Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 5 chủng Bacillus subtilis, trong đó có 2

chủng từ mẫu đất và 3 chủng từ ruột cá Chủng Ba17 phân lập từ đất có khả năng phân giải casein tốt nhất và tổng hợp enzyme protease với hoạt độ cao nhất ở điều kiện tối ưu

500C và pH 7,6 là 31,95 UI/g

Quy trình tối ưu cho quá trình thủy phân nhau heo bằng enzyme protease được thiết lập với điều kiện pH 7,6, nồng độ enzyme so với cơ chất là 2 UI/g, lượng nước so với cơ chất là 150%, nhiệt độ thủy phân là 500C và thời gian là 48 giờ

Nồng độ chế phẩm 8‰ khi sử dụng trên cây cải bẹ xanh cho năng suất 29,214 tấn/ha là nồng độ thích hợp nhất trên cải bẹ xanh

SUMMARY

Today, the issue of food security is a challenge for the agricultural sector of many countries in the world The decreasing of, agricultural land environmental polluted, natural disasters and climate change has woged the demand of fertilizer products for farming which can improve both crop yields, especially, friendly to the environment Thus, the subject of "applied research protease enzyme hydrolyzed pig placenta fertilizer" was performed

Isolation of bacteria from the pond mud, gut fish and soil sample was done The

biochemical reactions were applied to identify Bacillus subtilis Study of protease enzyme

synthesis ability of isolated bacteria and other factors affecting the activity of the protease enzyme produced by bacteria Examined the optimal conditions for building protocols pig

placenta hydrolyzed bio-organic fertilizer trials of fertilizer on Brassica juncea were

performed in order to find the most appropriate concentration of fertilizer product

As a result, 5 strains Bacillus subtilis were isolated, including 2 strains from soil

samples and three strains from fish intestine The best strain that cuold best resolve casein and synthesite protease with high activity (31.95 UI/g) at 500C under optimum conditions and pH 7.6 was Ba17 strain isolated from soil

Optimization process for the hydrolysis of pig placenta by protease was set to pH 7.6 conditions, 2UI/g enzyme levels compared to the substrate, water content compared to the substrate 150%, at 500C for 48 hours

Appropriate concentration for use on Brassica juncea were identified as 8 ‰ to

yield 29.214 tons/ha

Keywold: pig placenta, Bacillus subtilis, enzyme protease, Brassica juncea

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các từ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các sơ đồ và hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.1 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.1.4 Đặc điểm sinh hoá 4

2.1.5 Một số ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis 4

2.2 Sơ lược về enzyme protease 4

2.2.1 Lịch sử phát hiện enzyme protease 5

2.2.2 Phân loại protease 5

2.2.3 Đặc điểm của protease thu nhận từ nguồn vi sinh vật 6

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme protease 7

2.2.5 Cơ chế thủy phân của enzyme protease 8

2.2.6 Ứng dụng của enzyme protease 8

2.3 Sơ lược về phân bón lá hữu cơ sinh học 10

2.3.1 Xu hướng nghiên cứu phân hữu cơ sinh học trong và ngoài nước 10

Các nghiên cứu trong nước 10

2.3.1.1 Các nghiên cứu ngoài nước 11

2.3.1.2 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

3.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 13

3.3 Nôi dung và phương pháp nghiên cứu 13

3.3.1 Phân lập và thử các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis 13

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn, đất và ruột cá 13

3.3.1.1 Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn phân lập 14

3.3.1.2 3.3.2 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho hoạt động của enzyme protease 15

3.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 15

3.3.4 Khảo sát nồng độ sử dụng chế phẩm thích hợp trên cây cải bẹ xanh 17

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 17

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 18

4.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nghi nghờ là Bacillus subtilis 18

4.1.2 Đặc điểm hình thái của 21 khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis 18

4.1.3 Đặc điểm sinh hóa của 14 chủng trực khuẩn bắt màu Gram dương 19

4.1.4 Hoạt độ enzyme protease của các chủng được chọn 21

4.2 Các điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme protease 21

4.2.1 Nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động 21

4.2.2 Xác định pH tối ưu cho enzyme hoạt động của enzyme protease 22

4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân nhau heo bằng enzyme protease 23

4.3.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân 23

4.3.2 Ảnh hưởng nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân 24

4.3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân 25

4.3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng nước đến quá trình thủy phân 26

4.3.5 Hoàn thiện quy trình thủy phân nhau heo 26

4.4 Khảo nghiệm hiệu quả của chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng 28

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

5.1 Kết luận 30

5.2 Đề nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

CRD Completely Randomized Design

IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng sinh hóa của 14 chủng bắt màu Gram dương 19

Bảng 4.2 Kết quả định tính vòng phân giải casein của 6 chủng Bacillus subtilis 20

Bảng 4.3 Kết quả định lượng hoạt độ enzyme protease 21

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính protease do chủng Ba17 tổng hợp 22

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ protease do chủng Ba17 tổng hợp 23

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme lên quá trình thủy phân 24

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân 24

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân 25

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của hàm lượng nước lên quá trình thủy phân 26

Bảng 4.10 Thành phần dinh dưỡng trong nhau heo và dịch thủy phân 28

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm lên năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất trên cây cải bẹ xanh 28

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Trang

Sơ đồ 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 17

Sơ đồ 3.2 Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis 18

Sơ đồ 3.4 Bố trí thí nghiệm dùng các nồng độ khác nhau của chế phẩm phân bón lá 22

Sơ đồ 4.1 Qui trình thủy phân nhau heo trên hệ thống bioreactor 30

Hình 2.1 Vi Khuẩn Bacillus subtilis 3

Hình 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 18

Hình 4 2: Tiêu bản nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi cấy 24 giờ 19

Hình 4.3 Vòng phân giải casein của chủng Ba17 20

Hình 4.3 Phần dịch sau thủy phân 27

Hình 4.4 Phần bã sau thủy phân 29

Hình 4.5 Cây cải đƣợc phun ở các nồng độ phân khác nhau 29

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, dân số thế giới đã 7 tỉ người cùng với tốc độ tăng dân số đáng báo động

và vấn đề môi trường đang ngày càng bị suy thoái, thiên tai, lũ lụt, biến đổi khí hậu đặc biệt là đất nông nghiệp đang bị thu hẹp một cách nhanh chóng làm cho sản lượng lương thực có nguy cơ bị sụt giảm nghiêm trọng do đó vấn đề an ninh lương thực đang trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết Trong ngành trồng trọt, để phát triển một nền nông nghiệp bền vững thì nhiệm vụ cấp bách là phải thay thế dần việc sử dụng phân bón hóa học có nguồn gốc vô cơ gây ô nhiễm môi trường, làm giảm độ phì nhiêu của đất sang các loại phân bón

vi sinh, hữu cơ vi sinh, compost, phân bón lá Trong lĩnh vực vi sinh, vi khuẩn Bacillus

subtilis có nhiều tính chất rất ưu việt để sản xuất các chế phẩm sinh học và đặc biệt là

chúng có khả năng sinh enzyme protease với hoạt độ rất cao Enzyme protease của vi

khuẩn Bacillus subtilis được ứng dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực công nghiệp, y

dược với hàng loạt các sản phẩm phục vụ cho con người Trong lĩnh vực nông nghiệp, enzyme protease với khả năng phân cắt các chuỗi axit amin dài tạo thành những chuỗi ngắn hoặc các axit amin đơn lẻ sẽ tạo tiền đề cho việc ứng dụng để sản xuất các loại phân bón lá giúp cho cây trồng dễ dàng hấp thu dinh dưỡng hơn và sẽ cải thiện được năng xuất cây trồng góp phần vào ổn định vấn đề an ninh lương thực

Nhau thai là một thành phần kỳ diệu trong bào thai, là nơi nuôi dưỡng và bảo vệ phôi thai phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Hầu như nhau thai có chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết cho phôi thai phát triển như: các axit amin thiết yếu, các chất khoáng đa trung vi lượng, hormon, chất kích thích tăng trưởng, các axit nucleotid Tuy có chứa một hàm lượng dinh dưỡng cao như vậy nhưng nhau thai heo vẫn là một phụ phẩm trong ngành chăn nuôi heo Từ thực tế trên nhận thấy khả năng ứng dụng nhau thai heo để sản sản xuất phân bón lá là rất thực tế và có triển vọng nên đề tài “nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thủy phân nhau thai heo tạo phân bón lá” được thực hiện

1.2 Yêu cầu của đề tài

Phân lập chủng Bacillus subtilis sản sinh enzyme protease có hoạt tính cao ứng

dụng trong thủy phân nhau heo nhằm tạo được phân bón lá sử dụng trong trồng trọt cũng như ứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học Xây dựng được quy trình sản xuất phân bón lá và điều kiện thủy phân tối ưu cho nhau heo Tạo được chế phẩm phân bón lá chất lượng tốt và khả năng ứng dụng cao

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn từ các mẫu bùn đáy ao, ruột cá, đất Thử các phản ứng sinh hóa

để định danh vi khuẩn Bacillus subtilis Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của vi

khuẩn tự phân lập và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme protease do vi khuẩn sản sinh Khảo sát các điều kiện tối ưu nhằm xây dựng quy trình thủy phân nhau heo để tạo phân bón lá hữu cơ sinh học Ứng dụng thử nghiệm phân bón lá trên rau cải bẹ xanh nhằm tìm ra nồng độ sử dụng thích hợp nhất của chế phẩm phân bón lá tự tạo

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương được tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho

đến thời điểm hiện nay Bộ gen của loài này đã được giải mã toàn bộ, khoảng 4 Mbp với trọng lượng của bộ gen khoảng 2,4×109 đến 2,6×109 dalton Đặc biệt, trong gen của

Bacillus subtilis có chứa nhiều gen qui định cho khả năng kháng kháng sinh như gen

kháng thiostrepton, streptomycin, erythromycin, spectinomycin, penicilin,

chloramphenicol Nhờ đó vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng kháng lại các vi sinh vật

gây bệnh khác

2.1.1 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis

Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương có kích thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, nội

bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8µm Ở điều kiện 1000C, bào tử của vi khuẩn

Bacillus subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn,

tác động của hóa chất, tia bức xạ (Kerovuo và cs, 2000)

Hình 2.1 Vi Khuẩn Bacillus subtilis

(isciencemag.co.uk)

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Trong môi trường nuôi cấy, Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết

các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm) Màng sinh học giúp cho Bacillus

subtilis có ưu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi trường tự nhiên đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt môi trường giúp cho vi khuẩn có thể tiếp xúc

trực tiếp với oxy trong không khí Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis có khả năng

hình thành bào tử Bào tử của chúng tồn tại rất lâu trong tự nhiên có thể đến hàng ngàn năm và phát triển lại thành tế bào sinh dưỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi

2.1.4 Đặc điểm sinh hoá

Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), phân giải tinh bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose

2.1.5 Một số ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis được ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác nhau

như amylase, protease đồng thời cũng được ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên men truyền thống natto của Nhật Bản

Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang được quan tâm để sản xuất ra các

vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gen qui định độc tố thương hàn vào

Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gen này cũng được biểu hiện để sản xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử

2.2 Sơ lược về enzyme protease

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thủy phân các liên kết peptid của protein hay polypeptide (-CO - NH-) tạo thành các sản phẩm peptide, pepton, tri – dipeptide, axit amin Nhiều enzyme protease có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester, liên kết amid và các phản ứng chuyển vị gốc axit amin Phản ứng như phương trình sau:

- CH – C – N – CH - + H2O  - CH – C – OH + NH – CH-

R O N R’ R O H R’

2.2.1 Lịch sử phát hiện enzyme protease

Enzyme protease được nghiên cứu đầu tiên là các enzyme tiêu hóa ở động vật Từ đầu thế kỉ 18, nhà tự nhiên học người Pháp Reomur phát hiện dạ dày chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt Năm 1836, Swann quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch

vị Nhưng mãi đến hơn 20 năm sau (1857), Corvisart mới tách được trypsin từ dịch tụy Đây là protease đầu tiên được thu nhận dưới dạng chế phẩm tuy vẫn còn lẫn nhiều enzyme và protein khác Đến nữa đầu thế kỉ 20, người ta mới phát hiện thêm nhiều loại protease khác như: bromelin – p có trong các bộ phận cây, catepsin – protease của mô cơ động vật (Willstatter và cs 1926) Từ 1930 đến nay, sau khi Sumner (1926) kết tinh được protease từ đậu tương, hàng loạt các protease khác ra đời Năm 1950, nhờ sử dụng được một số phương pháp mới tinh chế protein, người ta thu nhận được chế phẩm protease tinh khiết hơn và cũng từ đấy các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu protease từ vi sinh Năm

1971 đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những nghiên cứu về protease kiềm ở

Bacillus Horikoshi là người đầu tiên công bố thu nhận và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ

bản và tính chất lý hóa của protease kiềm từ Bacillus (Horikoshi, 1971; Markland và cs,

1971) Sang năm 1972, người ta đã nghiên cứu và đưa vào sản xuất trên quy mô lớn các

protease kiềm ở một vài loài Bacillus Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease kiềm của Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị trường thương mại Các vi khuẩn Bacillus ưa kiềm trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo

“quan điểm công nghiệp (Horikoshi và Akiba, 1982; Horikoshi, 1996) Đến nay protease

đã được nghiên cứu kỹ hơn và ứng dụng rất nhiều lĩnh vực khác nhau

2.2.2 Phân loại protease

Dựa vào cơ chế xúc tác Theo IUBMB “International Union of Biochemistry and Molecular Biology” peptidase chia thành hai nhóm: Exopeptidase (còn gọi là enzyme peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch) có khả năng thủy giải liên kết –CO – NH ở đầu tận cùng chuỗi polypeptide, bao gồm amino – peptidase (xúc tác đầu có gốc amin tự do gọi là enzyme aminopeptidase), carboxyl – peptidase (xúc tác cắt liên kết – CO – NH ở đầu có gốc carboxyl tự do gọi là enzyme carboxypeptidase) Endopeptidase (còn gọi

proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch) có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide nằm bên trong chuỗi polupeptidase

Dựa vào mức hoạt động trong dung dich có trị số pH khác nhau nên protease được chia làm ba nhóm: Protease aicid với pHopt trong khoảng 2 – 5 và chúng được thu nhận từ

các loài nấm mốc đen: A niger, A awmori, A saitoi, và các loài Mucor pusillus,

Rhizopus, Trametes sanguineara Protease trung tính có pHopt khoảng hẹp 6,0 – 7,5 không bền ở nhiệt độ cao và mất hoạt tính khi có hiện diện protease kiềm, chúng được thu nhận

từ những loài nấm mốc khác nhau, nhưng chủ yếu là các loài nấm mốc vàng như A

oryzae, A flavus, A fumigatus, A tericola Protease kiềm có pHopt trong khoảng 8 – 11

được thu nhận từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Bacillus subtilis, những protease kiềm

là nhóm được quan tâm khá nhiều gần đây vì có thể sử dụng chúng như những chất phụ gia trong qua trình thuộc da, trong chất giặt tẩy, xử lý chất thải môi trường Dù có sự phân biệt protease kiềm tính, trung tính và axit tính như trên, nhưng cả ba đều tìm thấy có trong

A oryzae Protease trung tính là enzyme có trung tâm hoạt động là kim loại chứa kẽm,

kém bền nhiệt nhất trong ba loại trên Trái lại, protease axit từ nấm mốc có khả năng bền nhiệt tốt và pH thấp (Keay, 1971)

Dựa vào đặc điểm cấu tạo của trung tâm hoạt động thì enzyme protease được chia làm bốn nhóm chính: Serin – proteinase (EC 3.4.21), cystein – protease (EC 3.4.22), aspaetic – protease (EC 3.4.23), metallo – protease (EC 3.4.24)

2.2.3 Đặc điểm của protease thu nhận từ nguồn vi sinh vật

Thông thường enzyme protease được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhưng hiện nay được thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn Bao

gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyses và một

số loại nấm loại nấm men Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn ước tính khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng, protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao; chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein Trong các chủng vi khuẩn có

khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus

thermopoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium; có thể nói vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998) Các

vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu, các protease này có ái lực cao với các amino axit ưu béo và thơm Protease của

Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử 20.000 – 30.000 dalton

Ổn định ở khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 – 12 Khác với protease thưc vật (ficin, papain, bromeline) và động vật (tripsin, pepsin, renin) protease vi sinh vật là những enzyme ngoại bào có tính đặc hiệu rộng, chúng tổng hợp hai dạng enzyme có khả năng thủy phân khác nhau như: protease thủy phân protein thành polypeptide, pepton và peptidase thủy phân tiếp các hợp chất này thành các axit amin

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme protease

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Trong các phản ứng enzym, sự hoạt hóa cơ chất được thực hiện do sự tạo thành phức hợp trung gian enzym - cơ chất Khi kết hợp với phân tử enzym do sự chuyển dịch các điện tử và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng nên cơ chất trở nên hoạt động và tham gia phản ứng dễ dàng Cơ chất càng lớn vận tốc phản ứng càng lớn Như thế, khi tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng sẽ tăng theo và đạt giá trị cưc đại sau đó sẽ ổn đinh mặc dù nồng độ cơ chất vẫn tăng

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Vận tốc phản ứng enzym tăng khi nhiệt độ tăng, tuy nhiên do enzym có bản chất là protein nên không thể bền với tác dụng nhiệt, đa số enzym

bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC Nhiệt độ ứng với khả năng hoạt động cao nhất của enzym được gọi là nhiệt tối ưu và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ enzym, nồng

độ cơ chất, đặc biệt là thời gian tác dụng Thời gian tác dụng càng dài, nhiệt tối ưu của enzym càng thấp Nói chung, enzym ở dạng dung dịch loãng, không có cơ chất thường kém bền Trái lại khi có cơ chất, enzym khá bền với nhiệt độ

Ảnh hưởng của pH: Enzym rất nhạy đối với sự thay đổi pH của môi trường Mỗi enzym chỉ hoạt động mạnh ở một vùng pH xác định gọi là vùng pH tối ưu của enzym pH tối ưu của đa số enzym nằm trong vùng axit yếu, bazơ yếu hoặc trung tính Hoạt động của enzym còn chịu ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng là cho enzym từ trạng thái không hoạt động trở nên hoạt động hoặc từ hoạt động yếu trở thành họat động mạnh hơn Các chất hoạt hóa có bản chất rất khác nhau như các coenzym NAD+, NADP+, các vitamin làm nhiệm vụ chuyển hyrogen, ADP chuyển phosphate Có thể nói chất hoạt hóa có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử enzym, loại bỏ một vài đoạn peptide và giải phóng nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động của enzyme giúp cho enzym trở nên hoạt động mạnh hơn

Ảnh hưởng của chất ức chế: chất ức chế là chất có khả năng làm yếu hoặc chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzym Các chất ức chế có bản chất hóa học khác nhau có thể

là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ hoặc các protein

2.2.5 Cơ chế thủy phân của enzyme protease

Việc thủy phân của enzyme protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng hoạt động của chúng được chia làm hai loại như sau: Sự thủy phân giới hạn nghĩa là enzyme thủy phân có giới hạn đối với một hay một số các liên kết peptide có trong phân tử protein

và tạo thành các peptide có phân tử nhỏ Sự thủy phân không giới hạn nghĩa là phân tử protein bị thủy phân thành các axit amin; dưới tác dụng của protease liên kết peptide –CO –NH sẽ bị thủy phân thành các axit amin và một ít peptide có phân tử nhỏ

2.2.6 Ứng dụng của enzyme protease

Protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ đời sống đến sản xuất công nghiệp Trong đó ứng dụng protease từ nguồn vi sinh vật hiện phát triển rất mạnh, đạt hiệu quả kinh tế cao và có vai trò thương mại rộng rãi Vào năm 1987 protease được sản xuất với giá trị khoảng 254,6 triệu USD, 75% enzyme được sử dụng trong sản xuất chất tẩy, khoảng 10% sản xuất pho mát và các sản phẩm sữa, còn lại dùng trong thuộc da và sản xuất thực phẩm (bia rượu, nước chấm, chao, tương, trà)

Trong công nghiệp thực phẩm: Trong công nghệ sản xuất nước chấm enzyme protease có vai trò rất quan trọng Các loại nước chấm lên men như tương, chao, nước mắm là sản phẩm của quá trình lên men phân giải nguyên liệu giàu protein động vật, thực vật nhờ tác dụng của axit, base, hoặc nhờ enzyme xúc tác quá trình lên men Sản phẩm tạo thành có hàm lượng axit amin rất cao Phương pháp lên men có những ưu điểm như

thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, vốn đầu tư ban đầu không lớn, không gây độc cho người sản xuất và môi trường xung quanh Ứng dụng protease trong chế biến thịt: Trong chế biến thịt, người ta bổ sung 0,002% chế phẩm protease tinh khiết và đem ướp lạnh, bằng cách này thịt sẽ giữ màu tự nhiên lâu hơn Mặt khác, thịt dược xử lý bằng protease có hiệu suất hấp thụ cao hơn với thịt không xử lý Ứng dụng trong chế biến sữa: Trong chế biến sữa (đặc biệt là trong sản xuất phomat) người ta sử dụng một khối lượng rất lớn enzyme đông

tụ sữa Trước dây, ở các nước châu Âu thường sử dụng các loại protease động vật, đến nay người ta sử dụng các loại protease từ nhiều nguồn khác nhau Chính sự thay thế các loại enzyme từ vi sinh vật đã làm giảm giá thành sản phẩm chế biển từ sữa (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Ứng dụng trong công nghiệp thức ăn gia súc: Protease phân cắt liên kết peptid của phân tử protein, giúp tăng khả năng hấp thu lượng protein có trong thức ăn Việc kết hợp giữa protease với các enzyme khác như: amylase, phytase, cellulose giúp vật nuôi tăng trọng nhanh đạt hiệu quả kinh tế cao

Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa: Từ năm 1913, enzyme đã được ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa tại nhà máy hóa chất Otto Rohm (Đức) Chế phẩm Bio 40 là enzyme protease từ vi khuẩn và được ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa từ năm 1959 tại nhà máy Gebruder Schuyder ở Thụy Điển (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Trong công nghiệp da: Việc sản xuất da động vật hiện nay hoàn toàn là thủ công Enzyme protease

có thể được ứng dụng vào một vài công đoạn của công nghiệp da bằng cách ngâm da chìm trong dịch chứa enzyme ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10-20 giờ nhằm tách lông thú ra khỏi da và làm sạch da

Sản xuất insulin cho người từ insulin heo: Insulin của người và heo chỉ khác nhau một axit amin (threonin hay alanin) Trong công nghiệp sản xuất insulin cho người từ insulin từ heo người ta sử đụng hai loại enzyme là carboxypeptidase A và trypsine Các enzyme này tham gia quá trình chuyển hóa axit amin cho thành phần, số lượng và trình tự của chúng giống như insulin của người (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Dịch thủy phân vi sinh vật: Người ta sử dụng phức hợp nhiều enzyme trong đó

có sự tham gia của protease để phá hủy tế bào nhằm giải phóng một số chất có giá trị

bên trong tế bào Với việc phân giải vách tế bào nấm men giải phóng dịch chiết nấm men là nguyên liệu để sản xuất cao nấm men và một số sản phẩm có giá trị

2.3 Sơ lược về phân bón lá hữu cơ sinh học

Phân hữu cơ sinh học (HCSH) là loại phân được chế biến từ các nguyên liệu có nguồn gốc hữu cơ với quy trình chế biến được áp dụng bằng các tác nhân hoặc bằng các

kỹ thuật công nghệ sinh học nhằm nâng cao chất lượng và hiệu lực của phân thương phẩm (Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Phân bón lá là loại phân bón được tưới hoặc phun trực tiếp vào lá hoặc thân để cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng thông qua thân lá Phân bón lá có tác dụng cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng một cách trực tiếp nhờ khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng qua lá của cây trồng ( 90 – 95%) so với việc hấp thu chất dinh dưỡng qua rễ (thấp hơn 10%) Do đó phân bón lá có khả năng cải thiện đáng kể năng suất cây trồng và đặc biệt quan trọng trong những trường hợp cây trồng bị thiếu hụt dinh dưỡng nặng và cần phải cung cấp một cách nhanh chóng cho cây Thông thường sau khi bón phân thì sau khoảng 60 phút là cây đã bắt đầu hấp thu các chất dinh dưỡng trên lá nhờ đó phân bón lá giúp giảm đáng kể lượng phân bón cho đất khoảng 30% Ngoài ra, phân bón lá còn chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng từ đa lượng cho đến vi lượng và các hormon tăng trưởng

2.3.1 Xu hướng nghiên cứu phân hữu cơ sinh học trong và ngoài nước

Các nghiên cứu trong nước

2.3.1.1

Trong những năm gần đây, đã có rất nhiều những nghiên cứu về hiệu lực của phân bón lá được sản xuất trong nước cũng như nước ngoài trên các đối tượng như cây bắp, các loại hoa, các loại rau và trên cây công nghiệp đã đem lại lợi ích kinh tế rất cao Việc sử dụng các loại phân bón lá để thử nghiệm trên cây bắp, rau xà lách, hành, cây hoa cúc và hoa vạn thọ của đã cho năng suất cao hơn nghiệm thức đối chứng (NTĐC) từ 5% đến 20,9% (Nguyễn Thị Kim Thanh, 2008) Bên cạnh đó, việc phối trộn các phế thải nông nghiệp với các chế phẩm sinh học để sản xuất phân bón gốc cũng mang lại những lợi ích

to lớn trong sản xuất nông nghiêp như hàm lượng dinh dưỡng được tăng cao, giảm thiểu

sự ô nhiễm môi trường, sản phẩm tạo ra không có mùi hôi và giúp cây hấp thụ tốt Theo kết quả nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học E.I.P để ủ phân chuồng và khảo sát ảnh

hưởng của phân bón lá được điều chế trên cơ sở phân ủ lên sinh trưởng phát triển và năng suất của cải bẹ xanh (Brassica juncea L) Kết quả nghiên cứu đề tài cho thấy sử dụng phân bò tươi + tro trấu + 1/20 liều lượng chế phẩm EIP cho phân hoai nhanh hơn 25 ngày

và cho trọng lượng cải cao hơn (Nguyễn Lê Thanh, 2005)

Sử dụng các phế thải từ nông nghiệp như xác vỏ tiêu, bánh dầu đậu phộng, bánh dầu đậu nành, xác cá chết, bột thịt để sản xuất phân bón lá đã mang lại những thành tựu to lớn Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Đức (2006) cho thấy việc sử dụng chế phẩm ENT ủ bã vỏ tiêu với nồng độ 0,1% đã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 25 ngày, vỏ tiêu không còn mùi hôi

Các nghiên cứu ngoài nước

2.3.1.2

Các báo cáo của công ty Enviromental Choise cho thấy ở Costa Rica đã có nhiều thí nghiệm về ủ phân như: “Ủ phân trùng và Encoenzyme”, “Ủ vỏ quả cà phê và zymplex” , “Ủ phân gà dùng chất độn mạc cưa và Encoenxzyme” Kết quả cho thấy thời gian ủ phân được rút ngắn, hàm lượng dinh dưỡng bảo toàn và mùi giảm một cách đáng

kể Cũng theo nguồn này, ở Zambia, Tây phi cũng có thí nghiệm về ủ phân như “Ủ phân

bò khô với Enchoice dùng chất độn vỏ đậu phộng nghiền nhỏ”

Theo mô hình nghiên cứu phương pháp sản xuất phân bón hữu cơ bằng cách sử dụng đầu cá ngừ làm nguyên liệu thô Nghiên cứu này đã sử dụng enzyme từ vi khuẩn và thử nghiệm bổ sung phân hữu cơ này trong môi trường nuôi hạt phấn cây trà Kết quả thí nghiệm cho thấy phân này đã làm tăng tốc độ lăng trưởng 180% so với hạt phấn cây trà trong môi trường nuôi cấy đối chứng (Iizuka, 1995)

Quá trình nghiên cứu việc chuyển đổi các chất thải hữu cơ từ cá và các loại thực vật ở biển và động vật thành dạng bột ổn định mà không sử dụng nhiệt độ cao Chất thải

từ cá tươi được nghiền và sau đó được thủy phân để tạo thành một dịch thủy phân Dịch thủy phân được ấn định bằng cách thêm axit và được đun để tách dầu mỡ và nước để tạo thành một bánh sản phẩm Bánh này được chuyển sang một máy trộn nhằm trộn dinh dưỡng tạo thành một sản phẩm thô Sản phẩm thô này được sấy khô trong một máy sấy khô vận tốc cao (Connell, 2006) Bên cạnh đó, Lee và Lian (2006) đã xây dựng quy trình

sản xuất sinh học dịch thủy phân từ các phụ phẩm trong quá trình chế biến mực để làm phân bón hữu cơ mà không sử dụng hóa chất mà chỉ sử dụng enzyme nội sinh

Theo nghiên cứu sản xuất phân hữu cơ từ chất thải rắn và sử dụng nó trong sản xuất rau hữu cơ của Nenita và ctv năm 2008 cho thấy kết quả nghiên cứu việc áp dụng phân bón hữu cơ này cung cấp đủ các dưỡng chất cho các loại rau như cà chua, rau diếp

Sử dụng phương pháp thủy canh để sản xuất cây con thuốc lá theo hướng hữu cơ bằng cách sử dụng phân cá hòa tan hoặc các sản phẩm từ rong biển và một số vật liệu thích hợp khác thay cho việc sử dụng các loại phân bón vô cơ (George Kuepper và Raeven Thomas, 2008)

Như vậy, với những tổng hợp về tình hình sản xuất và ứng dụng phân bón lá thì đã

có hàng loạt các nghiên cứu về sản xuất thử nghiệm phân bón lá hữu cơ sinh học đa số các nghiên cứu đều cho thấy hiệu quả của phân bón lá là rất tốt cho cây trồng Việc sử dụng các nguồn nguyên liệu mới như nhau heo là rất cần thiết để đa dạng nguồn nguyên liệu cho sản phẩm phân bón lá Từ đó, sản xuất phân bón được dễ dàng, hứa hẹn phân bón

lá sẽ được ứng dụng rộng rãi và phổ biến trong tương lai gần

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2012 đến thàng 6/2012 tại trại thực nghiệm Công nghệ Sinh học và Môi trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh; Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tự phân lập và enzyme protease tự thu nhận, nhau

heo được lấy ở một trại heo Đồng Nai, chế phẩm phân bón lá

Các hóa chất sử dụng: Hóa chất dùng để pha thuốc thử và môi trường phản ứng sinh hóa (Trung Quốc): D- glucose, peptone, agar, NaCl, CaCO3, DAP, NaOH, K2SO4,

KH2PO4, CuSO4, NaCO3, TCA, casein, albumin, tyrosine, trisodim citrate, thuốc thử Folin, Lugol, Safranine, napthol, methylred, phenolphthalein Hóa chất dùng để xác định đạm tổng số (Đức): H2SO4 đâm đặc, CuSO4, K2SO4, parafin, NaOH, H3BO3, HCl

Các thiết bị như: tủ sấy, nồi hấp áp suất (autoclave), tủ lạnh, cân tiểu li và cân phân tích, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, hệ thống máy Kjeldahl, máy đo OD, lò vi sóng, kính hiển

vi, tủ cấy, … cùng với tất cả các dụng cụ cơ bản được sử dụng trong phòng thí nghiệm

3.3 Nôi dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập và thử các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn, đất và ruột cá

3.3.1.1

Mẫu bùn sau khi lấy về dùng muỗng gạn bỏ phần nước, trộn đều rồi cân 10 g mẫu cho vào 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, tương tự mẫu ruột cá rửa nước sơ qua rồi sau đó cân 10 g mẫu và dùng kéo cắt nhỏ ra rồi cho vào 90 ml nước muối sinh lý, mẫu đất cân 10 g cho vào 90 ml nước rồi đun sôi được nồng độ pha loãng 10-1 Chuẩn bị

4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4 Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu cần phân lập có nồng độ pha loãng 10-1cho vào ống nghiệm 1 và trộn đều bằng micropipete, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm như vậy cho đến ống nghiệm cuối cùng Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng

độ pha loãng 10-3,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên

đĩa môi trường nutrient agar (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa NA này vào tủ ấm ủ ở 370C/24 giờ Sau đó quan sát khuẩn

lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis,

dùng que cấy vòng làm thuần và cấy giữ giống lại trên môi trường NA nghiêng

Sơ đồ 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis sử dụng trong nghiên cứu

Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn phân lập

3.3.1.2

Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi bằng cách lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống NA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại

1000 lần Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn,

có hay không có bào tử Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù

hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis (như: là trực khuẩn, hai đầu tròn,

G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định

Mẫu bùn, đất và ruột cá

Hút 0,1ml từ mỗi ống, cho vào đĩa pettri chứa môi trường NA

Trang đều dich vi khuẩn, ủ ở 370

C trong thời gian 24 giờ

Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1g mẫu + 9 ml

dung dịch NaCl 9 0/00

Dung dịch pha loãng mẫu 10-1, 10-2, 10-3…

Chọn khuẩn lạc điển hình, làm thuần, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa

Giữ giống trên môi trương thạch nghiêng (cấy chuyển hàng tuần)

Sơ đồ 3.2 Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis

(Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006) 3.3.2 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho hoạt động của enzyme protease

Thu nhận enzyme trên môi trường bán rắn và đo hoạt tính enzyme: sau khi chọn được chủng vi khuẩn tốt nhất cho việc tổng hợp enzyme protease tiến hành cấy 1 ml dịch

tăng sinh Bacillus subtilis vào môi trường bán rắn cảm ứng tổng hợp enzyme protease sao

cho mật độ vi khuẩn đạt 107 tế bào/g môi trường Ủ ở 370C trong 48 giờ Sau đó, hoạt độ enzyme được xác định theo phương pháp Anson

Xác định nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động: để xác định nhiệt độ tối ưu cho

hoạt động của enzyme protease do các chủng Bacillus subtilis tổng hợp, tiến hành hòa tan

0,5g chế phẩm enzyme thô vào 50 ml dung dịch Sorensen pH 7,6 Sau đó, xác định hoạt

độ enzyme theo phương pháp Anson ở các giá trị nhiệt độ 300C, 350C, 400C, 450C, 500C,

550C, 600C, 650C, 700C và 750C

Xác định pH tối ưu cho enzyme hoạt động: sau khi xác định được nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease, tiến hành xác định pH tối ưu cho enzyme hoạt động

ở nhiệt độ tối ưu với các giá trị pH 6,8; 7,2; 7,6; 8,0 và 8,4

3.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Sau khi xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình thủy phân, tiếp tục khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân nhằm ứng dụng trong thủy phân nhau heo bao gồm các yếu tố sau: nồng độ enzyme và cơ chất, lượng nước, thời gian thủy phân

Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới

kính hiển vi

Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+),

Voges-Proskauer (+), Citrat (+), glucose (+)

Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis

Thử phản ứng sinh hóa

Xác định nồng độ enzyme thủy phân được tiến hành 50 g cơ chất nhau heo đã xay nhuyễn với và các nồng độ enzyme sử dụng là 25 UI, 50 UI, 75 UI, 100 UI, 125 UI, 150

UI, tỉ lệ nước tương ứng là 100% so với lượng cơ chất, tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ và được tiến hành với các điều kiện pH, nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động đã xác định ở các thí nghiệm trước Dịch thu được sau thủy phân sẽ được ly tâm ở 4000 vòng/phút và tiến hành phân tích hàm lượng đạm tổng số nhằm chọn ra nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân

Xác định nồng độ cơ chất sử dụng nồng độ enzyme thích hợp đã xác định sẽ được

sử dụng để tiến hành thủy phân với lượng cơ chất nhau heo là 25 g, 50 g, 75 g, 100 g, 125

g, 150 g đã say nhuyễn, tỉ lệ nước là 100% so với lượng cơ chất, thời gian là 24 giờ, tốc

độ lắc 200 vòng/phút cùng với các điều kiện pH, nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động đã xác định ở các thí nghiệm trên Dịch thu được sau thủy phân sẽ được ly tâm ở 4000 vòng/phút và tiến hành phân tích hàm lượng đạm tổng số nhằm chọn ra nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình thủy phân

Khảo sát tỉ lệ nước sử dụng nồng enzyme và lượng cơ chất thích hợp đã xác định

sẽ được sử để tiến hành thủy phân với tỉ lệ nước tương ứng là 25%, 50%, 70%, 100%, 125%, 150%, 175% và 200% so với cơ chất, thời gian là 24 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút cùng với các điều kiện pH, nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động đã xác định ở các thí nghiệm trên Dịch thu được sau thủy phân sẽ được ly tâm ở 4000 vòng/phút và tiến hành xác định lượng đạm tổng số nhằm chọn ra tỉ lệ nước thích hợp cho quá trình thủy phân

Khảo sát thời gian thủy phân sử dụng nồng độ enzyme, lượng cơ chất và tỉ lệ nước thích hợp đã xác định sẽ được sử dụng để tiến hành thủy phân trong các mốc thời gian tương ứng là 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 56 giờ và 72 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút cùng với các điều kiện pH, nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động đã xác định ở các thí nghiệm trên Dịch thu được sau thủy phân sẽ được ly tâm ở 4000 vòng/phút và tiến hành xác định lượng đạm tổng số nhằm chọn ra thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân

3.3.4 Khảo sát nồng độ sử dụng chế phẩm thích hợp trên cây cải bẹ xanh

Sau khi xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, tiến hành thử nghiệm thủy phân với thể tích lớn Dịch thu được sau thủy phân được dùng để sản xuất thử nghiệm phân hữu cơ sinh học và thử nghiệm trên cây cải bẹ xanh

Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức có ba lần lặp lại, các nghiệm thức được bố trí thí nghiệm theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) với diện tích của mỗi nghiệm thức là 5 m2 gồm: Nghiệm thức đối chứng (NT1) không phun chế phẩm phân bón lá, NT2 phun phân dạng lỏng với nồng độ pha loãng 40/00, NT3 phun phân dạng lỏng với nồng độ pha loãng 80/00, NT4 phun phân dạng lỏng với nồng độ pha loãng 120/00 với khoảng cách giữa các cây và các hàng đều là 15 cm, thời gian phun lần lượt là 7 ngày, 12 ngày, 17 ngày sau khi trồng Sau khi thu hoạch mỗi nghiệm thức chọn

ra 5 cây đại diện để lấy số liệu như: Trọng lượng tươi, số lá, chiều cao của mỗi cây được chọn, năng suất lý thuyết, năng suất thực tế

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis

4.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nghi nghờ là Bacillus subtilis

Giữ lại những khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis (hình 4.1): khuẩn lạc có bề

mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám Số lượng khuẩn lạc được chọn là 21 khuẩn lạc trong đó có 8 khuẩn lạc phân lập từ mẫu ruột cá, 5 khuẩn lạc từ mẫu bùn đáy ao và 8 khuẩn lạc từ mẫu đất

Hình 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis Ủ

ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ trên môi trường NA

4.1.2 Đặc điểm hình thái của 21 khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis

Các chủng vi khuẩn nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis là những trực

khuẩn bắt màu tím, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng Tiêu bản nhuộm Gram gồm: 14 chủng là trực khuẩn và bắt màu Gram dương, 5 chủng là trực khuẩn bắt màu Gram âm và 1 chủng là cầu khuẩn bắt màu Gram âm

Hình 4 2 Tiêu bản nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi cấy 24 giờ (A) chủng Ba1 dưới vật kính X100, (B) chủng Ba17 dưới vật kính X100

4.1.3 Đặc điểm sinh hóa của 14 chủng trực khuẩn bắt màu Gram dương

Thử phản ứng sinh hóa của 14 chủng nghi ngờ, đã xác định được 6 chủng là vi

khuẩn Bacillus subtilis là chủng Ba1, Ba3, Ba10, Ba13, Ba17, Ba20 Kết quả được trình

Bảng 4.2 Kết quả định tính vòng phân giải casein của 6 chủng Bacillus subtilis

D: Đường kính vòng phân giải, d: Đường kính khuẩn lạc

Hình 4.3 Vòng phân giải casein của chủng Ba17

Bảng 4.2 cho thấy khả năng phân giải casein giữa 6 chủng có sự khác biệt rõ ràng Trong đó chủng Ba17 có tỉ lệ D/d cao nhất là 11,25, chủng Ba13 có tỉ lệ D/d thấp nhất là 2,855 Kết quả khả năng phân giải casein trong thí nghiệm trên cao hơn khảo sát của Nguyễn Trường Ngọc Tú (2009) với tỉ lệ D/d của chủng Ba43 là 8,00 và chủng Ba44 là 1,778 Từ phân tích trên có thể giải thích nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt trên là do đường kính khuẩn lạc trong thí nghiệm (bảng 4.2) nhỏ hơn so với thí nghiệm của Nguyễn