NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG Bacillus subtilis TRONG BẢO QUẢN THANH LONG

Vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis để kiểm soát một số nấm bệnh gây hư hỏng quả thanh long trong quá trình bảo quản.. Từ những quả than

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG Bacillus subtilis TRONG

BẢO QUẢN THANH LONG

Sinh viên thực hiện : HOÀNG MỘNG THÚY NHI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG Bacillus subtilis TRONG

BẢO QUẢN THANH LONG

Tháng 7/ 2012

i

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Ban Giám hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm

Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

Xin cảm ơn quý Công ty TNHH Gia Tường đã tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Như Nhứt, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, góp ý và không ngừng quan tâm, động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh chị đang làm việc tại Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Các bạn lớp CNSH 34 đã luôn bên em, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng em trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua Đồng cảm ơn những bạn sinh viên đang thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên, chia sẻ cùng em trong suốt thời gian thực tập

Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng em, các anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ em học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn

Sinh viên thực hiện

HOÀNG MỘNG THÚY NHI

ii

TÓM TẮT

Thanh long là một loại trái cây có giá trị kinh tế cao Hiện nay, quá trình trồng, sản xuất thanh long còn gặp nhiều vấn đề, trong đó có sự thất thoát hư hỏng trong quá trình bảo quản do nhiều loại nấm bệnh Vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục tiêu

nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis để kiểm soát một số nấm bệnh gây hư hỏng quả

thanh long trong quá trình bảo quản

Từ những quả thanh long bị hư hỏng sau khi bảo quản, phân lập các nấm bệnh trên môi trường Potato Glucose Agar (PGA) và kiểm tra khả năng gây hư hỏng bằng

cách gây nhiễm nhân tạo Sau đó sử dụng các chủng Bacillus subtilis (Ba01, Ba02,

Ba06, Ba23 và Ba36) đối kháng với các chủng nấm bệnh trên đĩa thạch môi trường

PGA để chọn chủng Bacillus subtilis thích hợp và nuôi cấy tăng sinh chủng này trên

môi trường nước chiết giá đậu đường peptone với các thay đổi thành phần môi trường

đã làm giảm mức độ hư hỏng, thất thoát thanh long trong quá trình bảo quản

iii

SUMMARY

Pitahaya is a fruit with high economic value Nowadays, the process of planting and producing pitahaya is having many problems, including loss or damaged by fungal diseases during storage So this research was carried in order to find out the

application of Bacillus subtilis to control some fungal diseases on pitahaya during

storage

From pitahaya was damaged after the storage, the fungus was isolated on Potato Glucose Agar medium (PGA) and tested capable of causing damage by artificial

infection Then, we used Bacillus subtilis strains (Ba01, Ba02, Ba06, Ba23, and Ba36)

was used compete the fungus strains on PGA agar medium to select a appropriate

Bacillus subtilis strain and proliferate this strain on peptone sugar bean extract water

medium with and varied shaking speed

The results of isolation showed that 6 different fungal strains (NB 3.6, NB 4.2, NB 4.7, NB 5.3, NB 5.5 and NB 5.6) might cause the damage of pitahaya The fungal

strains (NB 5.3, NB 5.5 and NB 5.6) were well controlled by B subtilis strain Ba02 Suitable conditions to proliferate B subtilis strain Ba02 were cultured peptone sugar

bean extract water medium supplemented with 0.1% NH4H2PO4 in 48 hours and agitated at 175 rpm Bacterial broth obtained having density of 65,3 x 107 CFU/ml could inhibit the development of the above pathogens during storage of pitahaya This has reduced the extent of damage, loss of pitahaya during the storage

PGA: Potato Glucose Agar

TSA: Trypticase Soya Agar

TSB: Tryticase Soya Broth

ALG: tốc độ tăng trưởng của sợi nấm

MT1: môi trường PGA

MT3: môi trường nước chiết giá đậu đường peptone

v

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về thanh long 3

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của thanh long 3

2.1.2 Các giống thanh long hiện có ở Việt Nam 3

2.1.3 Đặc tính sinh thái của thanh long 4

2.1.4 Lợi ích của thanh long 5

2.1.5 Một số bệnh hại thanh long 5

2.1.6 Bảo quản thanh long 6

2.1.6.1 Các hiện tượng vật lý xảy ra khi bảo quản 6

2.1.6.2 Các hiện tượng sinh lý, sinh hóa xảy ra trong quá trình bảo quản 7

2.1.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản thanh long 7

2.2 Sơ lược về nấm bệnh hại thanh long 8

2.2.1 Nguồn gốc phát sinh của nấm bệnh 8

2.2.2 Sự lan truyền và xâm nhiễm của nấm gây bệnh 9

2.2.2.1 Sự lan truyền của nấm gây bệnh 9

2.2.2.2 Quá trình xâm nhiễm của nấm gây bệnh 9

2.2.3 Chu trình gây bệnh của nấm 10

2.2.4 Một số loại nấm gây hư hỏng trong quá trình bảo quản thanh long 10

vi

2.2.4.1 Fusarium sp 10

2.2.4.2 Colletotrichum gloeosporioides 11

2.2.4.3 Nấm Phomopsis sp 12

2.2.4.4 Nấm Alternaria sp 12

2.3 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 13

2.3.1 Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis 13

2.3.2 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus subtilis 13

2.3.2.1 Vị trí phân loại Bacillus subtilis 13

2.3.2.2 Đặc điểm phân bố Bacillus subtilis 13

2.3.3 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis 14

2.3.4 Đặc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis 14

2.3.5 Khả năng kiểm soát sinh học của Bacillus subtilis 15

2.3.6 Một vài ứng dụng của Bacillus subtilis 15

2.3.6.1 Ứng dụng B subtilis trong công nghệ sản xuất enzyme và kháng sinh 15

2.3.6.2 Ứng dụng Bacillus subtilis trong thực phẩm 16

2.3.6.3 Ứng dụng Bacillus subtilis trong y học 16

2.3.7 Ứng dụng của Bacillus subtilis trong bảo quản nông sản sau thu hoạch 16

2.4 Các biện pháp bảo quản thanh long 18

2.4.1 Biện pháp vật lý 18

2.4.2 Biện pháp sinh học 18

2.4.3 Biện pháp hóa học 19

Chương 3 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 20

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

3.2 Vật liệu nghiên cứu 20

3.2.1 Chủng giống nghiên cứu 20

3.2.2 Vật liệu sử dụng 20

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 20

3.3 Phương pháp 20

3.3.1 Phương pháp phân lập nấm bệnh 20

3.3.1.1 Môi trường phân lập 20

3.3.1.2 Mẫu phân lập 21

3.3.1.3 Cách tiến hành 21

vii

3.3.2 Phương pháp kiểm tra khả năng gây hư hỏng của nấm bệnh 21

3.3.2.1 Nguyên tắc 21

3.3.2.2 Cách tiến hành 21

3.3.3 Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng của sợi nấm 22

3.3.4 Phương pháp cấy trung gian Bacillus lên đĩa thạch 22

3.3.5 Phương pháp cấy trung gian nấm bệnh lên đĩa thạch 22

3.3.6 Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng của Bacillus đối với nấm bệnh 22

3.3.6.1 Nguyên tắc 22

3.3.6.2 Cách tiến hành 23

3.3.7 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm

khuẩn lạc 23

3.3.7.1 Nguyên tắc 23

3.3.7.2 Cách tiến hành 23

3.3.7.3 Cách tính 24

3.3.8 Phương pháp ly tâm thu nhận sinh khối của Bacillus subtilis 24

3.3.8.1 Cách thực hiện 24

3.3.8.2 Cách tính 24

3.3.9 Phương pháp nuôi cấy lỏng để thu nhận sinh khối Bacillus subtilis 24

3.3.10 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự nuôi cấy tăng sinh B subtilis 25

3.3.10.1 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc 25

3.3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose 25

3.3.10.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ peptone 25

3.3.10.4 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen vô cơ bổ sung 26

3.3.11 Thử nghiệm khả năng kiểm soát nấm bệnh trên quả thanh long của

canh trường Bacillus subtilis 26

3.3.11.1 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 26

3.3.11.2 Tiến hành thí nghiệm 26

3.3.12 Thử nghiệm bảo quản canh trường chứa sinh khối vi khuẩn B subtilis 28

3.4 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1 Phân lập nấm gây hư hỏng từ trái thanh long bị nhiễm bệnh qua quá

trình bảo quản 28

3.4.2 Kiểm tra khả năng gây bệnh của các nấm phân lập được 28

viii

3.4.3 Khảo sát tốc độ tăng trưởng của các nấm phân lập được 28

3.4.4 Khảo sát khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng Bacillus subtilis 28

3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển

của chủng Bacillus subtillis chọn lọc 28

3.4.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc 28

3.4.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose 29

3.4.5.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ peptone 29

3.4.5.4 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen vô cơ bổ sung 29

3.4.6 Đánh giá hiệu quả kiểm soát nấm bệnh của canh trường chứa sinh khối

Bacillus chọn lọc trên trái thanh long 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Phương pháp phân lập nấm bệnh 30

4.2 Tốc độ tăng trưởng của các chủng nấm gây bệnh 30

4.3 Khảo sát khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng Bacillus subtilis 34

4.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự tăng sinh của

chủng Bacillus subtilis Ba02 35

4.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 35

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 36

4.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ peptone 36

4.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ bổ sung 37

4.5 Thử nghiệm bảo quản thanh long 38

4.6 Thử nghiệm bảo quản canh trường chứa sinh khối B subtilis Ba02 41

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Các chủng B subtillis được dùng trong nghiên cứu 20

Bảng 3.2 Thí nghiệm thử nghiệm khả năng kiểm soát nấm bệnh trên trái thanh

long của canh trường Bacillus subtilis 27

Bảng 4.2 Tốc độ tăng trưởng của các chủng nấm bệnh trên môi trường PGA 30

Bảng 4.1 Đặc điểm của các chủng nấm bệnh qua quá trình phân lập nấm bệnh

trên trái thanh long 31

Bảng 4.1 (tt) Đặc điểm của các chủng nấm bệnh qua quá trình phân lập

nấm bệnh trên trái thanh long 32

Bảng 4.3 Hiệu quả kiểm soát nấm bệnh của chủng B subtilis Ba02 trên quả

thanh long sau 10 ngày bảo quản 39

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây, trái và hoa thanh long 3

Hình 2.2 Các giống thanh long hiện có ở Việt Nam 4

Hình 2.3 Sơ đồ biểu thị sự lan truyền của nấm bệnh 9

Hình 2.4 Sơ đồ biểu thị chu trình gây bệnh của nấm 10

Hình 2.5 Thanh long bị thối do Fusarium sp 11

Hình 2.6 Thanh long bị bệnh thán thư 11

Hình 2.7 Thanh long bị thối do nấm Phomopsis sp 12

Hình 2.8 Thanh long bị thối do nấm Alternaria sp 13

Hình 2.9 Tế bào Bacillus subtilis được nhuộm Gram 14

Hình 2.10 Một số dạng hình thái tế bào và khuẩn lạc của Bacillus subtilis 14

Hình 4.1 Hiệu quả đối kháng của các chủng B subtilis34với các chủng nấm bệnh 34

Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào Bacillus subtillis trongquá trình

tăng sinh do ảnh hưởng của tốc độ lắc 35

Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào Bacillus subtillis trong quátrình

tăng sinh do ảnh hưởng của nồng độ glucose 36

Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào Bacillus subtillis trong quátrình

tăng sinh do ảnh hưởng của nồng độ peptone 37

Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào Bacillus subtillis trong quátrình

tăng sinh do ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ bổ sung 38

Hình 4.6 Hiệu quả kiểm soát nấm bệnh của chủng B subtilis Ba02 40

Hình 4.7 Hiệu quả kiểm soát nấm bệnh của chủng B subtilis Ba02 40

Hình 4.8 Hình biểu hiện sự thay đổi mật độ tế bào theo thời gian bảo quản

chế phẩm chứa canh trường B subtilis Ba02 41

đối kháng Trichoderma sp., Chaetomium spp đã quản lý được nhiều nấm gây bệnh như Helminthosporium, Fusarium, Pyricularia, Pythium, Phytophythora Ngoài ra, các loài nấm men (Saccharomyces cerevisiae), vi khuẩn (Bacillus subtilis) và xạ khuẩn đã

được thử nghiệm và ứng dụng khả năng ức chế hoạt động gây hư hỏng, giảm chất

lượng nông sản trên thế giới Trong đó, Bacillus subtilis là vi sinh vật được ứng dụng

rộng rãi nhất và đã cho những kết quả rất khả quan Tuy nhiên, ở nước ta việc ứng

dụng Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học dùng trong bảo quản thanh long còn hạn chế Vì vậy, đề tài được thực hiện với mục tiêu “Nghiên cứu ứng dụng Bacillus

subtilis trong bảo quản thanh long”

1.2 Yêu cầu đề tài

Nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis để kiểm soát một số nấm bệnh gây hư hỏng

quả thanh long trong quá trình bảo quản

2

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập chủng nấm bệnh gây hư hỏng trên quả thanh long qua quá trình bảo quản Kiểm tra khả năng gây hư hỏng của các nấm bệnh đã được phân lập trên quả thanh long và xác định tốc độ tăng trưởng của các chủng nấm bệnh đã phân lập được

Xác định khả năng đối kháng của một số chủng Bacillus subtilis đối với nấm bệnh trên môi trường thạch đĩa nhằm tìm ra chủng Bacillus subtilis thích hợp có thể kiểm

soát các nấm bệnh đã phân lập được

Khảo sát các ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự tăng sinh của chủng Bacillus

subtilis đã chọn lọc

Thử nghiệm ứng dụng canh trường chứa sinh khối chủng Bacillus subtilis chọn lọc

để ức chế sự phát triển của các nấm bệnh đã phân lập được trên quả thanh long

Xác định mật độ tế bào có trong canh trường Bacillus subtilis sau khi nuôi cấy theo

thời gian bảo quản

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về thanh long

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của thanh long

Cây thanh long (tên tiếng Anh là Pitahaya hay còn gọi là Dragon fruit) thuộc họ xương rồng, có nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mêhico và Colombia (Nguyễn Văn Kế, 1997) Theo Vũ Công Hậu (1987), họ xương rồng có tới 250 loài đã được

trồng để lấy trái Trong đó có 3 chi quan trọng nhất là Opuntin (xương rồng hình vợt),

Hylocereus và Lemairecereus, có nguồn gốc ở các sa mạc Mêhico

Thanh long được du nhập vào Việt Nam cách nay trên 100 năm bởi người Pháp nhưng chỉ mới bắt đầu được sản xuất như hàng hóa từ năm 1990 Hiện nay thanh long được trồng nhiều ở Bình Thuận, Long an, Tiền Giang và xuất khẩu ra các thị trường Trung quốc, Đài Loan, Singapore, Thái Lan, Malaysia, Campuchia, Lào, Nhật Bản, một số nước Châu Âu, Nam Mỹ, Canada (Đỗ Quốc Tấn, 2006)

Hình 2.1 Cây, trái và hoa thanh long (lucdien.com, bbc.co.uk)

2.1.2 Các giống thanh long hiện có ở Việt Nam

Tại Việt Nam, giống thanh long hiện nay được trồng phổ biến ở một số địa phương có vỏ đỏ ruột trắng và giống vỏ đỏ ruột đỏ (Phan Ngọc Liễu và ctv, 2000)

Thanh long ruột trắng Hylocereus undatus là loại giống được trồng phổ biến tại

Bình Thuận, Tiền Giang và Long An Đây cũng là giống được tiêu thụ phổ biến trên thị trường nội địa và xuất khẩu Giống này có thịt trắng, chắc, khá ngọt, ít chua năng suất cao, phẩm chất ngon và có trọng lượng trung bình từ 200 – 500 g Khi trái chín

có vỏ màu hồng hoặc đỏ thẩm Vỏ có những vảy dài, phân bố đều khắp (gọi là tai) Khi quả chín, vỏ có thể bóc đi dễ dàng như vỏ chuối Thịt quả là một khối trắng như thạch, vị ngọt hơi chua, khi ăn hạt bị nhai vỡ nên có vị xương rồng (Đoàn Hữu Tiến và

Tạ Minh Tuấn, 2000)

4

Thanh long ruột đỏ H polyrhizus là giống nhập nội, sinh trưởng mạnh, trái hơi dài,

kích thướt trái trung bình, nhiều tai, thịt trái có màu đỏ đậm, hạt đen, to, thịt trái hơi mềm và vỏ dày (Đoàn Hữu Tiến và Tạ Minh Tuấn, 2000)

Thanh long vỏ vàng ruột trắng Selenicereus magalani cũng là giống nhập nội, sinh

trưởng mạnh hơn thanh long ruột đỏ Trái có dạng tròn, kích thướt trung bình, có nhiều tai, thịt trái có màu trắng ngà hơi vàng, hạt nhiều, to, có màu đen và năng suất thấp

Hình 2.2 Các giống thanh long hiện có ở Việt Nam Thanh long ruột trắng Hylocereus undatus (a), (s4.zetaboards.com); thanh long ruột đỏ H polyrhizus (b), (ards.com); thanh long vỏ vàng ruột

trắng Selenicereus magalani (c), (s4.zetaboards.com.)

2.1.3 Đặc tính sinh thái của thanh long

Cây thanh long có nguồn gốc nhiệt đới, chịu hạn giỏi, nhưng không chịu được giá lạnh, được trồng ở những vùng nóng Một số loài chịu được nhiệt độ từ 50oC đến

55oC, thích hợp khi trồng ở những nơi có cường độ ánh sáng mạnh, khi bị che nắng cây sẽ ốm yếu và lâu cho quả Cây mọc được trên nhiều loại đất khác nhau như đất xám, bạc màu (Bình Thuận), đất phèn (Tp.Hồ Chí Minh), đất đỏ latosol (Đồng Nai) Chúng có khả năng thích ứng với các độ chua (pH) khác nhau nhưng chịu đựng độ mặn kém (Nguyễn Văn Kế, 1997; Mai Văn Quyền và ctv, 2005)

Khi trồng thanh long nên chọn các đất có tầng canh tác dày tối thiểu 30 – 50 cm

để có năng suất cao nên tưới và giữ ẩm cho cây vào mùa nắng (Vũ Công Hậu, 1996; Nguyễn Đăng Nghĩa và ctv, 2006)

Theo Obregon (1996), Nerd và Mizrahi (1997) và Paull (2000) Trên thế giới, thanh long thường được trồng thương phẩm với các loại khác nhau là thanh long ruột

trắng (Hylocereus undatus) và thanh long ruột đỏ hay tím (H costaricensis) được trồng ở Nicaragua và Guatemala, thanh long ruột đỏ (H polyrhizus) trồng ở Israel Giống thanh long vàng (H undatus) trồng ở Mexico và châu Mỹ Latin Một giống thanh long vàng khác (Selenicereus magalani) có nguồn gốc Trung và Nam Mỹ, được

trồng với diện tích nhỏ

5

2.1.4 Lợi ích của thanh long

Thanh long là loại cây ăn trái nhiệt đới rất phù hợp với điều kiện ngoại cảnh và xã hội ở nước ta Chúng là cây chịu hạn, không kén đất, là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao, đầu tư thấp, nhanh cho thu hoạch, tận dụng được sức lao động nhàn rỗi

Do đó, thanh long còn được mệnh danh là là cây xóa đói giảm nghèo Sản phẩm trái thanh long có ưu thế cạnh tranh cao vì đây là loại cây ăn trái chưa phát triển nhiều ở ngay trong nước và khu vực Châu Á Mặt khác, cây thanh long ít bị sâu bệnh tấn công

so với các cây trồng khác nên việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật rất hạn chế Đây chính là lợi thế đảm bảo mức độ an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng, cho người

sản xuất và hạn chế ô nhiễm môi trường (Nguyễn Đăng Nghĩa, 2006)

Thanh long là loại cây ăn quả xuất khẩu có mức thời gian đầu tư thấp, trong chỉ một năm trồng cây đã cho trái Trái thanh long có nhiều ưu điểm như ngon, đẹp mắt, dễ ăn, bảo quản

lâu, được chế biến thành nhiều sản phẩm, có trái quanh năm và có lợi cho sức khỏe

Các sản phẩm từ trái thanh long khá đa dạng như thanh long đóng hộp, thanh long nha đam, rượu vang thanh long Ngoài ra, vỏ thanh long ruột đỏ có thể chế ra màu thực phẩm để sản xuất rượu vang và son môi Hạt khô ép lấy dầu để phục vụ cho

ngành y dược Phần thịt trái có thể dùng để chế ra nước giải khát cao cấp

Thành phần dinh dưỡng có trong 100 g phần ăn được của trái thanh long có cacbohydrat

9 - 14 g, protein 0,16 - 0,5 g, chất béo 0,1 - 0,6 g, chất xơ 0,3 - 0,9 g, canxi 6 – 10 mg, sắt 0,3 - 0,7 mg, phosphor 13 - 16 mg, vitamin B3 0,2 - 0,45 mg và vitamin C4 4 – 25 mg

Thanh long có tác dụng mát gan, nhuận trường, bổ sung chất xơ thích hợp cho người ăn kiêng, trị bệnh cao huyết áp, bệnh tiểu đường, béo phì, viêm phế quả Trong thanh long ruột đỏ chứa hợp chất trị ung thư và các độc tố gây bệnh khác Hoa thanh

long phơi khô nấu nước uống dùng chữa bệnh tiểu đường

2.1.5 Một số bệnh hại thanh long

Ở Hoa Kỳ, trên thanh long thường xuất hiện một số loại bệnh gây hư hại như thối

thân do vi khuẩn Xanthomonas campestris và bệnh thán thư do nấm Colletotrichum

gây hại trên cành và trái thanh long làm thất thoát năng suất, chất lượng Các loại nấm

như Fusarium oxyporum, Dothiorella sp gây nên các bệnh trên cành (Crane, 2006,

trích dẫn bởi Nguyễn Mạnh Hùng và ctv, 2008)

Trên cành thanh long thường xuất hiện những đốm màu nâu, vết bệnh khi già có

đường kính khoảng 0,5 cm bệnh do nấm Botryosphahaeria dothidea gây nên, nấm này

6

cũng gây nên bệnh đốm vàng trên trái nhưng ít phổ biến Ngoài ra, trên thanh long còn

có các bệnh như chết cây do tác nhân là nấm Fusarium spp., Pythium spp (Valencia,

2003, trích dẫn bởi Nguyễn Mạnh Hùng và ctv, 2008)

Theo Phạm Văn Biên và ctv (2005), trên trái thanh long, ở phần bên ngoài và bên trong có một số vi sinh vật ký sinh gây hại sẽ làm giảm phẩm chất và thời gian bảo

quản Bệnh thối đốm trái do nấm Fusarium lateritium là đối tượng gây hại quan trọng

cho trái thanh long ở giai đoạn chín và giai đoạn sau thu hoạch

Theo Nguyễn Mạnh Hùng và ctv (2008), bệnh đốm nâu do nấm là bệnh rất phổ

biến Bệnh ảnh hưởng nhiều đến sự sinh trưởng và ra hoa đậu trái của thanh long

Theo Nguyễn Văn Hòa và ctv ( 2006), trên cây thanh long thường xuất hiện các

bệnh: thán thư (Collectotrichum), thối trái (Fusarium sp.), thối bẹ (Alternaria sp.), thối

bẹ (Fusarium sp.), nám cành (Macssonina agaves), đốm nâu (Gloeosporium agaves), đốm đen (Ascochyta sp.), nấm bồ hóng (Capnodium sp.), đốm vòng vàng mùa mưa,

trong đó phổ biến nhất là các bệnh thán thư, thối bẹ, thối trái

Theo Trần Thị Việt Hà (2004), trên trái thanh long sau thu hoạch thường xuất hiện

bệnh thối trái do các nấm khác nhau như nấm Alternaria sp., Phomopsis sp., Vollutela sp., Diplodia sp và Fusarium sp

Theo Lê Văn Tố và ctv (2000), trên trái thanh long sau thu hoạch có một số nấm

bệnh sau: Alternaria alternate; A cheiranth; Aspergillus avenaceus; A awamori; A

clavatus; A flavu; A fumigates; A oryzae; A niger; A tubingensis; Curvularia lunna;

C oryzae; Cladosporium oxysporium; Corynespora abelvata; Fusarium semitectum;

F lateritium; Haplariopsis fagicola; Mucor hiernalis; Penicillium charlesii

2.1.6 Bảo quản thanh long

Thanh long là trái hô hấp ít biến đổi nên bảo quản được lâu Theo Lê Văn Tố và ctv (2000), nhiệt độ thịt trái thanh long 280C, độ ẩm 70%, thời gian tồn trữ là 7 ngày

Ở nhiệt độ thịt trái 50

C, thanh long có thể bảo quản được 30 ngày

2.1.6.1 Các hiện tượng vật lý xảy ra khi bảo quản

Bay hơi nước là một trong những nguyên nhân làm thanh long bị héo tai, héo trái, giảm khối lượng, chất lượng, rút ngắn thời gian bảo quản (tổ chức Lương Thực và Nông Nghiệp Liên Hiệp Quốc, 1992) Sự mất nước thay đổi trong quá trình bảo quản: giai đoạn đầu mạnh, giai đoạn giữa chậm lại, giai đoạn cuối trái càng chín nên càng mất hơi nước mạnh Độ ẩm, nhiệt độ, độ chín của trái, thương tật do côn trùng, nấm

2.1.6.2 Các hiện tượng sinh lý, sinh hóa xảy ra trong quá trình bảo quản

Sự chín của quả là sự là sự chuyển từ trạng thái chưa ăn được sang trạng thái ăn được, là nguyên nhân gây hư hỏng và rút ngắn thời gian bảo quản trái tươi (Nguyễn Văn Thoại và ctv, 1982) Trong quá trình chín tinh bột và protopectin bị thủy phân, lượng acid và chất chát đều giảm, protein tăng lên (Trần Minh Tâm, 2002)

Các thành phần hóa học của rau quả luôn luôn thay đổi trong quá trình bảo quản như: vị ngọt, vị chua, mùi thơm và hợp chất khoáng Sự thay đổi này tùy thuộc vào từng loại rau quả khác nhau Hàm lượng đường thay đổi nhiều trong quá trình chín của quả Lượng acid tổng số sẽ giảm dần trong quá trình chín do quá trình decarboxy hóa Hàm lượng tannin giảm, hương thơm tăng và các chất màu được tạo thành (Nguyễn Văn Thoại và ctv, 1982) Lượng đường trong trái tăng, những chất có hoạt tính kháng bệnh như alkaloid, phenol và tannin đều bị giảm, nên trái cây rất dễ bị nhiễm bệnh (Agrios, 1988; Karban và Kue, 2000)

Tốc độ biến đổi các thành phần hóa học tỷ lệ thuận với cường độ hô hấp (Nguyễn Văn Thoại và ctv, 1982) Thanh long là loại trái cây có cường độ hô hấp thấp (Nguyễn Văn Thoại và ctv, 1982), nên tốc độ biến đổi thành phần hóa học không nhanh như các loại trái cây khác như chuối, bơ (Hopkirk và ctv, 1994)

2.1.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản thanh long

Nhiệt độ: Trái thanh long có nhiệt độ bảo quản thích hợp là 5 - 100C, theo Lê Văn

Tố và ctv (1999) nhiệt tối ưu là 50C và Thái Thị Hòa (2001) là 6 - 70C Do đó, trong quá trình bảo quản lạnh sau xử lý, nên chọn nhiệt độ bảo quản là 50C

Ẩm độ: Theo Lê Văn Tố và ctv (1999), với thanh long ẩm độ bảo quản tối ưu nhất

ở nhiệt độ thịt trái 50

C là 90 - 95%, nhiệt độ thịt trái 280C là 70% Theo Nguyễn Thị Hòa, (2002), bảo quản thanh long ở ẩm độ 95 - 100% Trái thanh long được bao trái bằng bao PE có đục lỗ thì bảo quản lâu hơn so với trái thanh long không bao trái (Nguyễn Vũ Hồng Hà, 2002; Lê Văn Tố và ctv, 2000)

8

Ảnh hưởng của vi sinh vật: Giai đoạn trước thu hoạch nếu đồng ruộng không được

vệ sinh (Darvas, 1982), có nhiều nguồn bệnh (Hallman, 1990) và đồng thời trái cây bị thương do côn trùng, chim, chuột, canh tác không đúng cách (Nguyễn Thơ, 2002; Ana, 1990; Cooke, 2002; Jacobi và Wong, 1992) thì khi thời tiết thuận lợi cho bệnh (ẩm độ cao là điều kiện cho nấm phát triển, nhất là khi trời mưa) đồng ruộng có mầm bệnh sẵn

sẽ bám vào trái đến khi thu hoạch (Coastes, 1993) Giai đoạn trong khi thu hoạch, các yếu tố gây ảnh hưởng đến chất lượng thanh long trong quá trình bảo quản như thời gian thu hoạch (Darvas, 1982; Hopkirk và ctv, 1994) trước và khi thu hoạch gặp trời mưa, cách thức thu hoạch, điều kiện vệ sinh trong thu hoạch (Nguyễn Thơ, 2002; Ana, 1990; Cooke, 2002; Jacobi và Wong, 1992) giai đoạn sau thu hoạch, việc vệ sinh kém, làm tổn thương cơ học do vận chuyển, nhiệt độ, ẩm độ, hóa chất xử lý, đóng gói không thích hợp, thời gian bảo quản quá lâu (Nguyễn Thơ, 2002; Ana, 1990; Cooke, 2002; Johnson và Sangchote, 1993)

Sự tổn hại vật lý, hóa học: Tổn hại vật lý là những ảnh hưởng của các tác nhân như côn trùng châm chích, chim chóc, chuột (Booth và Burden, 1983) hay những va đập, rung lắc trong quá trình thu hái, vận chuyển và đóng gói Tổn hại hóa học là những ảnh hưởng do hóa chất phun từ đồng ruộng như thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, dinh dưỡng, chất điều hòa tăng trưởng và chất bảo quản Những tổn thương này ảnh hưởng đến quá trình hô hấp, dẫn đến tăng hô hấp và sinh nhiệt làm mỹ quan trái giảm và trái

dễ bị hư hỏng trong bảo quản do vi sinh vật gây ra (Ana,1990)

2.2 Sơ lược về nấm bệnh hại thanh long

2.2.1 Nguồn gốc phát sinh của nấm bệnh

Vi sinh vật tồn tại khắp mọi nơi trong môi trường; tùy vào điều kiện ngoại cảnh

mà chúng có thể có nhiều hay ít Với những vi sinh vật gây bệnh trên cây trồng thì chúng có thể tồn tại trong không khí ngoài môi trường dưới những dạng bào tử thể; hoặc tồn tại sẵn trong đất; hay trong chính cây con cây giống kí chủ Khi gặp điều kiện thuận lợi nấm bệnh sẽ lan truyền gây bệnh, ngoài ra chúng còn tồn tại trên một cơ thể trung gian (từ cá thể trung gian sẽ truyền bệnh qua cây kí chủ chính khi có điều kiện thuận lợi)

9

2.2.2 Sự lan truyền và xâm nhiễm của nấm gây bệnh

2.2.2.1 Sự lan truyền của nấm gây bệnh

Nấm lan truyền bằng cách phát tán bào tử Sự lan truyền chủ động hay bị động phụ thuộc vào đặc điểm sinh học của mỗi loại nấm và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường theo hình sau đây:

Hình 2.3 Sơ đồ biểu thị sự lan truyền của nấm bệnh (Trịnh Thị Hồng, 2007)

Sự lan truyền chủ động của túi bào tử được diễn ra nhờ sự tăng cao áp suất trong túi bào tử, đẩy nắp nhỏ ở đỉnh túi và phóng vào không khí Trong khi đó, sự lan truyền thụ động của bào tử hoàn toàn phụ thuộc vào cường độ, tốc độ mưa, gió Sự lan truyền của nấm chịu ảnh hưởng của các yếu tố đất, hạt giống, cây giống, cây nhiễm bệnh, tàn

dư bệnh

2.2.2.2 Quá trình xâm nhiễm của nấm gây bệnh

Đầu tiên bào tử tiếp xúc bề mặt ký chủ và nảy nầm bằng cách sinh ra ống mầm sau

khi phát triển thành sợi nấm (nảy mầm trực tiếp) hoặc nảy mầm từ một bào tử ban đầu tạo ra nhiều bào tử nhỏ, các bào tử nhỏ tiếp tục nảy ra ống mầm và theo kiểu bào tử

nảy mầm sinh ra cơ quan sinh sản Tiếp theo ống mầm tiến hành xâm nhập bề mặt mô

ký chủ qua bề mặt nguyên vẹn, qua vết thương cơ giới, khí khổng hay thủy khổng Sau

đó, nó phân hủy cấu trúc tế bào, các hợp chất hữu cơ khó tan của mô ký chủ thành chất dễ tan để hấp thụ dinh dưỡng bằng các loại enzyme, chất sinh trưởng và độc tố của chính nấm bệnh

Bào tử nấm

Lan truyền chủ động

Lan truyền thụ động

Bào tử hữu tính từ quả thể đĩa, quả thể tự phóng vào trong không khí

Mưa và nước tưới làm bào tử bắn tung tóe ra

10

2.2.3 Chu trình gây bệnh của nấm

Quá trình gây bệnh của nấm được biểu hiện theo hình dưới đây:

Hình 2.4 Sơ đồ biểu thị chu trình gây bệnh của nấm (Trịnh Thị Hồng, 2007)

2.2.4 Một số loại nấm gây hư hỏng trong quá trình bảo quản thanh long

2.2.4.1 Fusarium sp

Fusarium sp có kích thước khuẩn lạc trên môi trường Potato Glucose Agar (PGA)

là 0,9 - 1,6 cm sau 3 ngày nuôi cấy Đại bào tử dài có hình cong lưỡi liềm hay thẳng,

có một mỏ nhọn tại đỉnh đầu Có hay không có bàn chân Tiểu bào tử ít được thấy,

hình elip Kích thước của bào tử ban đầu là: 64 - 72 x 5 - 7 µm (69,23 x 5,82 µm), tiểu

bào tử là: 2 - 3 x 5 - 6 µm (2 - 5 µm) trên môi trường để lâu ngày có màu cam nhạt Bệnh ít thấy vào mùa khô, thường gặp vào mùa mưa Trái càng neo lâu trên cây tỷ

lệ bệnh càng cao Thích hợp với thời tiết ấm, môi trường ẩm ướt Triệu chứng bệnh do nấm này gây ra trên quả thanh long là gây các vết bệnh hình tròn nhỏ màu trắng xám,

có hoặc không có đốm màu đen nằm rải rác trên mặt và trong vỏ quả Bệnh phát triển

ăn sâu vào mô quả gây thối quả

Gây bệnh

Sản sinh tạo ra cá thể mới Xâm nhiễm

Phát tán, tiếp xúc

Kiểu bảo tồn

Nguồn bệnh

Giai đoạn ký sinh

Giai đoạn bảo tồn

11

Hình 2.5 Thanh long bị thối do Fusarium sp (a); đại bào tử của nấm Fusarium sp (b);

tiểu bào tử của nấm Fusarium sp (c) (Trần Thị Việt Hà, 2004)

2.2.4.2 Colletotrichum gloeosporioides

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra là một bệnh quan

trọng và rất phổ biến trên nhiều loại trái cây như xoài, cam, đu đủ, bơ, dâu tây, chuối,

nho, thanh long, đặc biệt trên trái xoài Nấm C gloeosporioides thuộc ngành nấm bất

toàn, sinh sản bằng bào tử, trên môi trường PGA có khuẩn lạc màu trắng xám đến xám đậm Mặt dưới khuẩn lạc có màu trắng đến xanh đậm khi già thì màu trở nên đậm hơn

Bào tử nấm C gloeosporioides có màu hồng da cam nhạt Bào tử thẳng, trong suốt,

thường đơn nhân, dài 9 – 24 µm (Sutton, 1980) rộng 3 - 4,5 µm (Sutton, 1980) hoặc lên đến 6 µm (von Arx, 1957)

Bệnh phát triển và lây lan mạnh trong điều kiện thời tiết mưa và ấm Nó là tác nhân gây bệnh quan trọng và phức tạp trên quả dâu tây, quả xoài, thanh long cũng như nhiều loại trái khác

Triệu chứng bệnh do nấm này gây ra trên các loại trái cây thường là ban đầu làm cho trái có những vết bệnh màu nâu đen, sau đó phát triển lớn dần và lẫn vào nhau Thịt trái phần bên dưới chỗ bị bệnh chai đi và dính với vỏ khi lột Bệnh làm cho trái chín háp, hoặc làm hư hỏng trong thời gian tồn trữ, bảo quản, và thu hoạch (Nguyễn Danh Vàn, 2008) Bệnh biểu hiện triệu chứng thường thấy đặc trưng khi trái chín (M.B Dickman, 1993)

Hình 2.6 Thanh long bị bệnh thán thư (a), (kythuatnuoitrong.com) ; Bào tử của Colletotrichum

gloeosporioides (b) , (weedimages.org)

12

2.2.4.3 Nấm Phomopsis sp

Khuẩn lạc nấm Phomopsis longicolla khi được nuôi cấy trên môi trường PGA có

tơ giống như lông, màu trắng, mặt dưới môi trường nuôi cấy thì không màu Cơ quan sinh sản lớn, có màu đen và trải rộng Cơ quan sinh sản điển hình có đặc điểm không kết chặt và có thể nằm sâu hoàn toàn trong một trong môi trường Bào tử sơ khởi của nấm trong suốt, dạng hình thoi đến hình elip hoặc dạng giọt Khi được nhuộm với DAPI (4 ,6 - diamidino – 2 - phenylindole) cho thấy bào tử sơ khởi của nấm là bào tử đơn nhân Bào tử thứ phát và quả thể dạng chai của nấm không xuất hiện cả trong môi trường PGA lẫn môi trường nước yến mạch agar từ một đến mười tuần ở 250C ở chu

kỳ sáng là 12 giờ (Li và Bradley, 2001)

Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện thời tiết ẩm ướt và có độ ẩm cao Triệu

chứng bệnh do nấm này gây ra là trên vỏ xuất hiện một số lượng lớn các đốm nhỏ, song chúng không sắp xếp theo một kiểu riêng biệt nào

Hình 2.7 Thanh long bị thối do nấm Phomopsis sp (a) (Trần Thị Việt Hà, 2004); bào tử anpha

của nấm Phomopsis (b) kiểu 1, (c) kiểu 2 , (Li và Bradley, 2001)

2.2.4.4 Nấm Alternaria sp

Alternaria sp là tác nhân gây bệnh thối trên thanh long và gây ra hiện tượng trái

sớm đổi màu Triệu chứng bệnh không hình thành cho đến sau khi thu hoạch và bắt đầu phát triển trở thành vấn đề trong lưu trữ

Bệnh phát triển tốt nhất trong suốt thời kỳ có thời tiết mát và ẩm Bệnh trải qua mùa đông trong đất hoặc trên cây sống bị nhiễm bệnh và có thể tồn tại trong vòng một năm Triệu chứng bệnh do nấm này gây ra là những đốm màu nâu và đen trên đầu của trái cây và gây thối bên trong Bệnh bám trên những mảnh vỡ thực vật để vượt qua mùa đông, sau đó bệnh được phát tán bằng gió, mưa

c

b

a

13

Hình 2.8 Thanh long bị thối do nấm Alternaria sp (a);

bào tử nấm Alternaria sp (b) (Trần Thị Việt Hà, 2004)

2.3 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis

2.3.1 Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y

học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi

Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó

“subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được

sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (Lý Kim Hữu, 2005)

2.3.2 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus subtilis

2.3.2.1 Vị trí phân loại Bacillus subtilis

Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis

2.3.2.2 Đặc điểm phân bố Bacillus subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis hầu hết là vi khuẩn hoại sinh, chúng phân bố hầu hết

trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU / g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang

thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996)

14

2.3.3 Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0,5 - 0,8 m x

1,5 - 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000)

Hình 2.9 Tế bào Bacillus subtilis được nhuộm Gram ( en.wikipedia.org)

2.3.4 Đặc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis

Bacillus subtilis phát triển ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C, có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy, thích hợp nhất với pH bằng 7,0 - 7,4

và phát triển không giống nhau trên nhiều môi trường khác nhau như:Trên môi trường thạch đĩa TSA khuẩn lạc của nó dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu

Trên môi trường thạch nghiêng TSA thì Bacillus subtilis dễ mọc, tạo thành màu xám,

rìa nhăn gợn sóng Trên môi trường gelatin nó phát triển và làm tan chảy gelatin Trên môi trường thạch khoai tây nó phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.Trên môi trường

canh TSB Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết

lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều

Hình 2.10 Một số dạng hình thái tế bào và khuẩn lạc của Bacillus subtilis

(A) B subtilis dưới kính hiển vi; (B) Các dạng khuẩn lạc B subtilis

trên môi trường LB agar (Zhang và ctv, 2008)

15

2.3.5 Khả năng kiểm soát sinh học của Bacillus subtilis

Các vi sinh vật đối kháng có nhiều phương thức đối kháng khác nhau bao gồm việc tiết ra hợp chất kháng sinh hoặc cạnh tranh dinh dưỡng và không gian (Charles L Wilson và ctv, 1991; Mari và ctv, 1996) Ngoài ra, chúng cũng có thể ký sinh trực tiếp

và cảm ứng sự kháng cự của vật chủ đối với mầm bệnh làm, giảm hoạt động enzyme của mầm bệnh (Zimad và ctv, 1996)

Cơ chế kháng của các loại nấm và vi khuẩn đối với nấm bệnh rất đa dạng Chẳng

hạn hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm bệnh được Weindling gọi hiện tượng

“Giao thoa sợi nấm” (Cyder, 1976) Nấm Trichoderma còn có khả năng tiết ra các chất

kháng sinh có khả năng gây độc cho nấm gây bệnh (Agrowcal và ctv, 1979)

Đối với vi khuẩn Bacillus sp., hoạt động kháng chủ yếu do vi khuẩn có khả năng

tiết ra các chất kháng sinh, đa số là các amino acid dạng chuỗi và dạng vòng (Loeffler

và ctv, 1986) Các dòng Bacillus sp còn có khả năng sản xuất ra chất kháng sinh như: fentcin, zwittermycin, kanosamin Đối với B subtilis, việc ức chế nấm và tác nhân gây

bệnh khác là do chúng có khả năng tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptide (được gọi là Serenade) để làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của các nhân gây bệnh, do đó, ngăn chặn sự phát triển nấm và tác nhân gây bệnh

Bên cạnh đó, Bacillus sp còn có khả năng tạo ra các enzyme thủy phân bao gồm

các enzyme cellulase, chitinase và β - 1,3 - glucanase (Marten và ctv, 2000) Chính các enzyme này có thể phân giải vách tế bào và thành phần bệnh trong nấm gây hại

2.3.6 Một vài ứng dụng của Bacillus subtilis

2.3.6.1 Ứng dụng B subtilis trong công nghệ sản xuất enzyme và kháng sinh

Bacillus có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống để

thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như: amylase, hemicellulase, glucanase, protease, phytase Do đó, nó có thể được dùng để sản xuất và ứng dụng các enzyme này với quy mô công nghiệp

Từ Bacillus có thể thu được nhiều kháng sinh chống được nhiều loại vi trùng gây

bệnh như: Subtilin (Zuber và ctv, 1993), Bacillin (Foster và Woodruff, 1946), Fengycin (Vanittanakom và ctv, 1986), Aminopoluols (Milner và ctv, 1996)

16

2.3.6.2 Ứng dụng Bacillus subtilis trong thực phẩm

Trong công nghệ thực phẩm, B subtilis được dùng để lên men thực phẩm và tạo nhiều thực phẩm chức năng Trong đó, B subtilis Natto được dùng để len men đậu

tương, tạo sản phẩm Natto, một loại thực phẩm truyền thống ở Nhật

2.3.6.3 Ứng dụng Bacillus subtilis trong y học

Trong y học thì B subtilis được ứng dụng để làm thuốc nhỏ mũi BASUBIN có khả

năng điều trị 85 - 100% bệnh nhân đỡ bệnh nhiều hoặc hết triệu chứng bệnh so với nhóm PLACEBO chỉ có 33 - 40% sau hai tuần theo dõi (Đỗ Thị Hồng Tươi, Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Tuổi Trẻ Các Trường Đại Học Y Dược Việt Nam lần thứ XIII) Năm 1971, khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai (Hà Nội) đã nghiên cứu sản xuất

B subtilis dùng để trị bệnh tiêu chảy tốt ở người

2.3.7 Ứng dụng của Bacillus subtilis trong bảo quản nông sản sau thu hoạch

Tổn thất rau xanh và trái cây sau thu hoạch thì khá cao khoảng từ 10 - 40 % phụ thuộc vào từng loại rau quả và kỹ thuật được sử dụng để bảo quản ở các công ty sản xuất lương thực thực phẩm (Arras và Arru, 1999; Wilson và Wisniewski, 1994) Nhiều tổn thất mà nguyên nhân chủ yếu là do nấm bệnh (Wilson và Wisniewski, 1989), Chúng lây nhiễm vào vật chủ thông qua vết thương trong quá trình thu hoạch, vận chuyển và chế biến Như trong trường hợp đối với trái táo, tổn thất sau thu hoạch phần

lớn là do nấm Penicillium expansum (mốc xanh) và Botrytis cinerea (mốc xám)

Trước đây, các thuốc diệt nấm hóa học như Benomyl và Iprodione đã được sử dụng để kiểm soát các nấm bệnh này Tuy nhiên, hiệu quả của các thuốc diệt nấm ngày càng giảm do sự xuất hiện ngày càng tăng các mầm bệnh có khả năng kháng thuốc Hơn nữa, chúng còn tồn đọng lại trong tàn dư cây trồng và sản phẩm Mặt khác, về vấn đề môi trường, nó chứa đựng các mối nguy hiểm khó kiểm soát và lường trước được Chính vì vậy mà cần phải tìm biện pháp thay thế để giải quyết vấn đề này (Smilanick, 1994)

Trong những năm gần đây, biện pháp kiểm soát bằng sinh học đã được nghiên cứu tìm hiểu như là một biện pháp thay thế hiệu quả và phù hợp với xu hướng phát triển bền vững vì có thể khắc phục được nhược điểm của biện pháp hóa học và bước đầu đã

có những kết quả khả quan và hứa hẹn mang lại những kết quả to lớn hơn nữa trong tương lai

17

Có nhiều loài vi sinh vật đƣợc sử dụng để kiểm soát nấm bệnh nhƣ nấm men, nấm

mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn Trong đó, Bacillus sp là vi khuẩn đã đƣợc nghiên cứu, sử

dụng nhiều và đã có những kết quả nhất định Năm 1984, Pursey và Willson đã sử

dụng thành công B subtilis để kiểm soát bệnh thối nâu trên một số trái có hạt B

subtilis đã kiểm soát đƣợc nấm Lasiodiplodia theobromae gây bệnh thối nâu trên quả

mơ, quả đào, quả mận và quả xuân đào Cũng năm này, Singh và Deverall đã sử dụng

B subtilis để kiểm soát nấm Penicillium digitatum gây ra bệnh mốc xanh, Geotrichum candidum Link gây bệnh thối chua; Botryodiplodia theobromae, Phomopsis citri

Fawc và Alternaria citri Ell.&Pierce gây bệnh thối cuốn trên trái cam, quýt; nấm

Penicillium italicum và mốc xám trên trái cam và quýt Utkhede và Sholberg (1986) đã

sử dụng B subtilis để kiểm soát nấm Botrytis cinerea gây ra bệnh thối trái trên quả anh

đào

Năm 1995, Korsten và De Jager tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng

của một số chủng Bacillus chọn lọc đối với một số nấm bệnh gây bệnh trên trái bơ Báo cáo kết quả cho thấy bốn chủng Bacillus (B246, B247, B248 và B249) cho đối kháng làm ức chế sự phát triển của các nấm bệnh Colletrichum gloeosporioides,

Phomopsis perseae, Drechslera setariae, Psetalotiopsis versicolor và Fusarium solani

gây hại cho quả bơ

Năm 1996, Mari và cộng sự đã thành công trong việc kiểm soát nấm Botrytis

cinerea là tác nhân gây bệnh mốc xám trên quả lê Đến năm 2001, Jiang và cộng sự đã

sử dụng B subtillis kiểm soát thành công nấm Alternaria alternatr (Er.Keissler) gây ra bệnh thối trái vải Govender và cộng sự (2005) đã sử dụng B subtillis để kiểm soát nấm Collectotrichum gloeosporioides gây ra bệnh thán thƣ và nấm Dothiorella

gregaria gây bệnh thối cuống trên xoài

Năm 2006, Yang và cộng sự đã thành công khi dùng B subtillis kiểm soát nấm

Alternaria alternate gây ra bệnh thối quả dƣa xạ; Demoz và Korsten cũng dùng B subtillis để kiểm soát nấm Botryodiplodia theobromae Pat gây ra bệnh thối cuốn trên

trái bơ

Năm 2009, Kim và cộng sự đã phân lập đƣợc dòng B subtillis CMB32 từ đất có khả năng kiểm soát bệnh thán thƣ do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây ra

là kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm, an toàn cho người tiêu dùng và góp phần ngăn chặn sự lây lan nhiều dịch bệnh và nhược điểm của phương pháp này là khó vận hành, giá cả cao và không làm mất các độc tố vi sinh (Dương Phú Sĩ, 2011)

Đối với thanh long phương pháp vật lý đang được sử dụng hiện nay là phương pháp chiếu xạ Phương pháp chiếu xạ là công nghệ sử dụng năng lượng bức xạ ion hóa

để xử lý thực phẩm nhằm nâng cao chất lượng vệ sinh và an toàn thực phẩm Thực phẩm chiếu xạ đã được chứng minh là lành tính và mang lại những lợi ích kinh tế - xã hội to lớn Tuy nhiên cũng giống như các công nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm bằng hoá học hoặc bằng nhiệt, công nghệ chiếu xạ thực phẩm cũng đòi hỏi cơ sở chiếu

xạ và cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm phải tuân thủ những yêu cầu nhất định về liều chiếu, quy cách sản phẩm và điều kiện lưu kho, vận chuyển và chế biến thực phẩm sau khi chiếu xạ (www.tcvninfo.org.vn)

Ví dụ hiện nay đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đối kháng để kiểm soát nấm bệnh gây hư hỏng nông sản trong quá trình bảo quản Podile và Prakash (1996) đã

dùng Bacillus subtilis AF 1 để kiểm soát nấm Aspergillus niger, Biles và ctv (1990) dùng nấm men US-7 để kiểm soát nấm Bostrytis, Momein và ctv (2011) đã khảo sát

19

hiệu quả đối kháng của hai chủng Trichoderma harzianum đối với Lycopersicon

esculentum là tác nhân gây hại trên quả cà chua Ưu điểm của phương pháp này là an

toàn cho con người khi sử dụng và ít gây ô nhiễm môi trường tuy nhiên bên cạnh những ưu điểm trên phương pháp này vẫn có một số nhược điểm là khó có thể sử dụng kết hợp với các phương pháp khác, hiệu lực chậm, không ổn định, khó áp dụng do điều kiện thời tiết và chi phí cao (Dương Phú sĩ, 2011)

2.4.3 Biện pháp hóa học

Đây là phương pháp cũng thường được ứng dụng để bảo quản nông sản do ưu điểm của chúng là cho tác dụng nhanh và hiệu quả cao khi sử dụng Song, hiện nay chúng có xu hướng hạn chế sử dụng do những nguy hiểm tiềm ẩn do làm mất an toàn cho sản phẩm Phương pháp này sử dụng các hợp chất hóa học như: chất kháng sinh, chất oxy hóa (SO2, acid propionic), CO2 Ưu diểm cho tác dụng nhanh, hiệu quả cao, giá thành rẻ, dễ sử dụng và sản xuất Tuy nhiên mang tính tự phát, chưa có hệ thống,

có thể tạo ra những vi sinh vật đối kháng mạnh với các kháng sinh sử dụng tạo ra những dịch bệnh khó điều trị, sự tồn đọng trong sản phẩm gây mất an toàn thực phẩm

đó là những nhược điểm của phương pháp này (Dương Phú sĩ, 2011)

Đối với thanh long phương pháp bảo quản bằng ozon là phương pháp hóa học đang được sử dụng rộng rãi Nước ozon hay còn gọi là dung dịch anolyte được tạo từ hợp chất muối, nước, qua điện phân, có tác dụng làm sạch, giữ tươi và khử các chất độc hại trong thực phẩm Từ lâu nó đã được các nước tiên tiến sử dụng trong việc bảo quản hoa quả, trong chế biến thủy sản, vô khuẩn bệnh viện, khử trùng giống Ở Việt Nam, công nghệ bảo quản sử dụng anolyte cũng đã được áp dụng ở một số nơi (trong bảo quản hoa quả, phòng dịch cúm gà, vô trùng bệnh viện) Một trong những ứng dụng thành công nhất của anolyte là bảo quản thanh long ở Bình Thuận và nho ở Ninh Thuận Anh Tô Văn Hòa, người đi tiên phong trong công nghệ này ở xã Hàm Hiệp, huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận, cho biết quả thanh long được phun anolyte

có thể tươi lâu đến 20 ngày, so với chỉ 5 ngày nếu không bảo quản, quả chín sớm hơn bình thường một chút, lại không bị ruồi đục (loại sâu mà khách hàng Nhật Bản rất dị ứng) (www.dost-dongnai.gov.vn)

20

Chương 3 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ 31/1/2012 đến 30/06/2012 tại Chi nhánh Cty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương, kho C2 – lô D – tổng kho Sóng Thần – Dĩ An – Bình Dương

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Chủng giống nghiên cứu

- Các chủng Bacillus subtillis được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Chi nhánh

công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương

Bảng 3.1 Các chủng B subtillis được dùng trong nghiên cứu

Ba01 Bacillus subtilis

Ba02 Bacillus subtilis

Ba06 Bacillus subtilis

Ba23 Bacillus subtilis

Ba36 Bacillus subtilis

- Các chủng nấm được phân lập từ mẫu trái thanh long có triệu chứng nhiễm bệnh trong quá trình bảo quản

3.2.2 Vật liệu sử dụng

- Trái thanh long không có biểu hiện bệnh

- Trái thanh long đã có nhiễm bệnh qua quá trình bảo quản

3.3.1.3 Cách tiến hành

Mô tả đặc điểm bệnh của trái và chụp hình mẫu bệnh trước khi phân lập Khử trùng vị trí cần phân lập bằng cồn 70% trong 5 giây Dùng dao cắt mẫu thành những miếng nhỏ khoảng 25 mm² Sau đó rửa lại mẫu với nước cất khử trùng 2 - 3 lần Thấm lên khăn giấy vô trùng Cấy lên môi trường thạch đĩa PGA có bổ sung kháng sinh rồi đem ủ đĩa ở 28oC trong 2 - 3 ngày để nấm bệnh mọc lên

Các khuẩn lạc riêng biệt trên đĩa được cấy lên các đĩa petri chứa môi trường PGA riêng biệt và được làm thuần bằng cách cấy chuyền từ đĩa chứa môi trường PGA này qua đĩa chứa môi trường PGA khác Sau khi nấm bệnh đã được làm thuần thì chụp hình ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc và cấy chuyền qua môi trường thạch nghiêng PGA

3.3.2.2 Cách tiến hành

Mẫu thanh long không bị bệnh được khử trùng bề mặt với cồn 70ºC trong 5 giây Sau đó dùng kim chích vô trùng châm vào bề mặt trái khoảng 10 lỗ trên một vùng khoảng 3 x 3 mm Lỗ có độ sâu khoảng 0,5 - 1 mm

Tiến hành thu dịch huyền phù bào tử bằng cách dùng nước cất vô trùng hòa vào đĩa nấm bệnh sau một vài ngày nuôi cấy tùy theo từng loại nấm bệnh, dùng que cấy móc cạo bề mặt khuẩn lạc để hòa bào tử vào nước Pha loãng bào tử để đạt mật độ 107

tế bào / ml Sau đó dùng pipet hút 100 µl dịch này cho vào ngập vết thương đã được

3.3.3 Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng của sợi nấm

Nuôi cấy nấm bệnh trên đĩa chứa môi trường PGA bằng cách cấy khối thạch chứa sinh khối nấm bệnh từ đĩa nấm bệnh ngay giữa đĩa chứa môi trường PGA mới Đo đường kính khuẩn lạc của nấm bệnh cho đến khi nấm bệnh sau 6 ngày nuôi cấy

Cách tính tốc độ tăng trưởng đường kính trung bình (ALG, average linear growth) theo công thức:

ALG = (F3 - F1) / ΔT (mm/ngày)

Trong đó:

ALG: tốc độ tăng trưởng của sợi nấm

F1: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình sau 1 ngày nuôi cấy

F3: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình sau 6 ngày nuôi cấy

ΔT: khoảng thời gian khác nhau giữa 2 lần xác định đường kính (ngày), 5

ngày

3.3.4 Phương pháp cấy trung gian Bacillus lên đĩa thạch

Các đĩa chứa môi trường nước chiết giá đậu - đường peptone agar được chuẩn bị (được khử trùng)

Từ giống B subtilis trên thạch nghiêng, cho 9 ml nước cất vô trùng vào ống để tạo

dịch huyền phù rồi đem đi vortex, sau đó hút 100 µl dịch huyền phù này cho vào đĩa chứa 20 ml môi trường giá đậu trải đều rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng trong hai ngày

3.3.5 Phương pháp cấy trung gian nấm bệnh lên đĩa thạch

Dùng que cấy móc lấy sinh khối nấm bệnh cấy vào chính giữa đĩa petri chứa môi trường PGA Sau đó đem ủ trong khoảng thời gian thích hợp cho từng loại nấm

3.3.6 Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng của Bacillus đối với nấm bệnh

23

3.3.6.2 Cách tiến hành

Đĩa đối kháng (chứa môi trường PGA) được cấy nấm bệnh (đã chuẩn bị ở mục

3.3.5) và Bacillus (đã chuẩn bị ở mục 3.3.4) cùng một lúc bằng cách đục khối thạch chưá sinh khối nấm bệnh và khối thạch chứa sinh khối Bacillus Sau đó, cấy hai khối

thạch vào đĩa cách mép đĩa petri 1,5 cm và đối xứng với nhau qua tâm đĩa petri

Đĩa đối chứng được tiến hành tương tự nhưng chỉ cấy nấm bệnh chứ không cấy vi sinh vật

Các đĩa nuôi cấy được ủ ở nhiệt độ phòng cho đến khi khuẩn lạc nấm bệnh ở địa đối chứng đã mọc đấy đĩa

Cách tính hiệu quả đối kháng của vi sinh vật với nấm bệnh:

Hiệu quả ức chế được tính theo công thức:

Dđc – D I(%) = x 100

Dđc Trong đó:

I: hiệu quả ức chế (%)

D: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình trên đĩa đối kháng (cm)

Dđc: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình trên đĩa đối chứng (cm)

3.3.7 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

3.3.7.1 Nguyên tắc

Cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Mỗi

tế bào sống là một tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc

3.3.7.2 Cách tiến hành

Dùng nước muối sinh lý vô trùng pha loãng mẫu tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7) Dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển dịch chứa giống đã pha loãng vào bề mặt đĩa pettri chứa môi trường nước chiết giá đậu đường peptone agar

Dùng que cấy trang để trang cho dịch khuẩn đều trên bề mặt của môi trường Đậy nắp rồi ủ ở nhiệt độ phòng Sau 48 giờ, tiến hành quan sát và đếm khuẩn lạc

V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong môi trường đĩa (ml) fi: độ pha loãng tương ứng

i: trung bình các đĩa tại một nồng độ

3.3.8 Phương pháp ly tâm thu nhận sinh khối của Bacillus subtilis

3.3.8.1 Cách thực hiện

Đầu tiên cân khối lượng không của các ống ly tâm bằng cân phân tích Thực hiện

cân dịch canh trường vi khuẩn sau khi tăng sinh bằng cân phân tích và các ống ly tâm sao cho khối lượng của các ống ly tâm là như nhau ở tất cả các ống Sau đó, cho vào máy ly tâm với tốc độ 4000 vòng/10 phút Khi ly tâm xong đổ bỏ phần nước bên trên

và lấy phần cặn phía dưới đem cân sinh khối

3.3.8.2 Cách tính

Khối lượng sinh khối của Bacillus subtilis được tính theo công thức:

A = C - B Trong đó:

A: khối lượng sinh khối tươi (g)

B: khối lượng ống ly tâm không chứa dịch vi khuẩn

C: khối lượng ống ly tâm có chứa cặn sinh khối vi khuẩn

3.3.9 Phương pháp nuôi cấy lỏng để thu nhận sinh khối Bacillus subtilis

Lấy 10ml dung dịch nước muối sinh lý 0,85% vô trùng để huyền phù tế bào trong ống giống được giữ trên môi trường thạch nghiêng Pha loãng huyền phù tế bào sao cho đạt 107 CFU/ml Cấy 1 ml huyền phù tế bào đã pha loãng ở trên vào các erlen chứa 50 ml môi trường nước chiết giá đậu - đường peptone (đã được hấp khử trùng)

25

Mẫu thử không cũng tương tự mẫu thử thật nhưng thay 1 ml dịch huyền phù bằng

1 ml nước muối sinh lý vô trùng

Nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng trong hai ngày Sau khi nuôi cấy lắc, đem đi ly tâm

ở 4000 vòng/10 phút rồi cân sinh khối để xác định khối lượng vi sinh vật có trong canh trường

3.3.10 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự nuôi cấy tăng sinh Bacillus subtilis

3.3.10.1 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc

Tiến hành nuôi cấy lỏng vi khuẩn Bacillus subtilis chọn lọc theo mục 3.3.9 để thu

nhận sinh khối ở chế độ nuôi cấy lắc liên tục trong 48 giờ, với tốc độ lắc được thay đổi như sau: 125 vòng/phút, 150 vòng/phút, 175 vòng/phút, 200 vòng/phút và 225 vòng/phút Sau đó thu nhận dịch canh trường và đem cân khối lượng sinh khối theo mục 3.3.8 Dựa vào khối lượng sinh khối có trong canh trường để chọn ra tốc độ lắc thích hợp Thí ngiệm lặp lại 3 lần ở mỗi tốc độ lắc

3.3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose

Các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể vi sinh vật đều là các hợp chất có chứa

carbon Glucose là nguồn cung cấp carbon cho Bacillus subtilis trong môi trường nên

nó sẽ có ảnh hưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn này Đối với

Bacillus subtilus ở nồng độ glucose 4,5% thì vi khuẩn này có khả năng tăng sinh là cao

26

3.3.10.4 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen vô cơ bổ sung

Nguồn nitrogen vô cơ bổ sung có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển

và tăng sinh của các chủng Bacillus subtilis Do đó, tôi tiến hành nuôi cấy chủng

Bacillus subtilis chọn lọc theo phương pháp nuôi cấy lỏng để thu nhận sinh khối trên

môi trường có bổ sung các nguồn nitrogen vô cơ bổ sung ở dạng muối vô cơ như

NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4 và NH4H2PO4 với tỷ lệ 0,1% Mẫu thử không là mẫu chỉ chứa nguồn peptone mà không bổ sung các nguồn nitrogen vô cơ bổ sung Sau khi nuôi cấy 48 giờ, thu canh trường và đem xác định khối lượng sinh khối bằng phương pháp ly tâm theo mục 3.3.8 Dựa vào khối lượng sinh khối có trong canh trường để chọn ra nguồn nitrogen vô cơ bổ sung thích hợp Thí nghiệm lặp lại 3 lần ở mỗi nguồn nitrogen vô cơ bổ sung

3.3.11 Thử nghiệm khả năng kiểm soát nấm bệnh trên quả thanh long của canh

trường Bacillus subtilis

3.3.11.1 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm

Các quả thanh long tốt, không có triệu chứng bệnh, được rửa với cồn 700C trong

30 giây Sau đó, ngâm thanh long trong nước ấm 550C trong 5 phút

Thí nghiệm tạo vết thương + xử lý + nấm bệnh: các trái đã chuẩn bị được tạo vết thương bằng cách dùng kim chích vô trùng châm vào bề mặt trái khoảng 10 lỗ trên một vùng khoảng 3 x 3 mm Lỗ có độ sâu khoảng 0,5 - 1 mm Tiếp tục dùng kim vô trùng lấy 20 l bào tử nấm bệnh của 3 chủng nấm bệnh là NB 5.3, NB 5.5, NB 5.6 vào vết thương đã được tạo (mỗi chủng nấm bệnh đều tiến hành các thí nghiệm xử lý như bảng 3.2)

Đem tất cả các trái này cho vào bịch nilon cột chặt và bảo quản ở nhiệt độ lạnh (100C) Hàng ngày kiểm tra triệu chứng bệnh của các quả thanh long, chụp hình và ghi nhận kết quả