NHÂN GIỐNG CÂY TỎI TA (Allium sativum L.) THÔNG QUA PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ CHÓP RỄ in vitro

thông qua phát sinh phôi vô tính từ chóp rễ in vitro” đã được thực hiện thông qua nuôi cấy chóp rễ, qua quá trình cảm ứng tạo mô sẹo, phát sinh phôi vô tính, hình thành cây con và tạo c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NHÂN GIỐNG CÂY TỎI TA (Allium sativum L.)

THÔNG QUA PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NHÂN GIỐNG CÂY TỎI TA (Allium sativum L.)

THÔNG QUA PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH

TỪ CHÓP RỄ CÂY TỎI in vitro

KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 07/2012

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Thầy Lê Đình Đôn, người gợi ý cho con những định hướng trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học

Xin cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn Hằng, Thảo, Vân, Tú và các bạn cùng phòng người đã chia sẽ những khó khăn, vui buồn trong suốt quá trình thực hiện

Con xin thành kính ghi ơn ba má, hai người suốt đời trăn trở, dốc hết công lao, động viên, che chở cho con được ngày hôm nay Chị xin ghi khắc ơn sâu của em, người luôn dành mọi điều kiện tốt đẹp cho chị ăn học nên người

Sau cùng tôi xin cảm ơn bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học DH08SH, và đặc biệt là nhóm G11 đã chia sẽ cùng tôi trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu xót Chúng tôi rất mong sự đóng góp của thầy cô và các bạn

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

ĐỖ NGỌC THANH MAI

ii

TÓM TẮT

Tỏi ta (Allium sativum L.) là cây trồng rất quan trọng Củ tỏi được sử dụng phổ

biến để làm gia vị và thảo dược Bởi vì nó có khả năng cải thiện mùi vị cho các món

ăn và chứa các chất có hoạt tính sinh học (như Allicin) có khả năng kháng sinh, ngăn ngừa ung thư, giảm cholesterol Tỏi thường được trồng theo phương pháp truyền thống sinh dưỡng vì nó không có khả năng sinh sản hữu tính; do đó tỏi dễ có nguy cơ mắc các bệnh do virus

Nhằm đáp ứng nhu cầu về giống đạt được yêu cầu về sản lượng và giữ được chất

lượng của giống tỏi ta vốn có, nghiên cứu “Nhân giống tỏi ta (Allium sativum L.) thông qua phát sinh phôi vô tính từ chóp rễ in vitro” đã được thực hiện thông qua nuôi

cấy chóp rễ, qua quá trình cảm ứng tạo mô sẹo, phát sinh phôi vô tính, hình thành cây con và tạo củ trong ống nghiệm

Mẫu chóp rễ in vitro được sử dụng cho quá trình cảm ứng mô sẹo, phát sinh phôi

vô tính, tái sinh chồi con và tạo củ Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với 1,0 mg/l BA Mô sẹo phát sinh sau 4 tuần nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn Chuyển mẫu sang nuôi cấy ở điều kiện có ánh sáng, mô sẹo phát triển và phát sinh phôi vô tính với tỉ lệ 32,85% trong 3 tuần Chồi con hoàn chỉnh

được tái sinh với tỉ lệ 33,26% trong 3 tuần tiếp theo Trong 4 tuần nuôi cấy, củ tỏi ta in

vitro được tạo ra với tỉ lệ cao 91,67% và đường kính lớn (trung bình 4,37 mm) khi

nuôi cấy chồi con trên môi trường bổ sung 80 g/l sucrose sau 4 tuần nuôi cấy Cây tỏi

in vitro được trồng ngoài vườn ươm, sinh trưởng tốt sau 15 ngày

iii

SUMMARY

Garlic (Allium sativum L.) is an important which widely used for both culinary

and medicinal purposes because of its ability to improve the taste of food and its biological activities (as allicin) that include antibiotic, antitumor, cholesterol lowering Garlic has been traditionally cultivated vegetatively because of its sexual sterility; consequently, viral diseases are a very serious problem

To supply the necessitude of breeding garlic, acquired characteristics about yield and the preservation of natural genius, wherefore the study "Micropropagation of

garlic (Allium sativum L.) via somatic embryogenesis from in vitro root-tip" was

performed Through processing of callus induction, somatic embryogenesis, shoots regeneration and whole plant production

The in vitro root-tip explants were used for callus induction, somatic

embryogenesis, plantlets regeneration, and bulbs formation process Explants were cultured in MS media supplemented with 1.0 mg/l NAA and 1.0 mg/l BA Callus was induced in the dark after 4 weeks Then, they were grown under the light, developed and fromed into somatic embryo with rate 32.85% in 3 weeks Plantlets were formed

at the rate of 33.26% in 3 weeks later Garlic bulbs in vitro were produced with high

rate (91.67%) and pretty bulb diameter (4.37 mm) in culture medium supplemented with 80 g/l sucrose in 4 weeks Plantlets were planted in the arboretum, which were

growth after 15 days

Keywords: Garlic, in vitro, Root-tip, somatic embryo

iv

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cần của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Giới thiệu chung về cây tỏi 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm sinh học của tỏi 4

2.1.3.1 Cấu tạo, hình thái cây và củ tỏi 4

2.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây tỏi 5

2.1.4 Thành phần và hoạt tính sinh học các hợp chất trong tỏi 6

2.1.5 Tình hình sản xuất, xuất và nhập khẩu tỏi 6

2.2 Giới thiệu chung về kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 8

2.3 Kỹ thuật nuôi cấy phôi vô tính 9

2.3.1 Giới thiệu về phôi vô tính 9

2.3.2 Con đường phát sinh phôi vô tính 10

2.3.3 Sự biệt hóa mô của phôi vô tính 11

2.3.4 Những nhân tố ảnh hưởng đến sự cảm ứng và hình thành phôi vô tính 12

2.3.4.1 Ảnh hưởng của nhân tố auxin 12

2.3.4.2 Ảnh hưởng của nhân tố cytokinin 12

2.3.4.3 Ảnh hưởng của nhân tố các nhân tố khác 13

v

2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô in vitro cây tỏi 14

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.2 Vật liệu 16

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.2.2 Hóa chất khử trùng mẫu cấy 16

3.2.3 Môi trường nuôi cấy 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Tạo cây tỏi in vitro 17

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA lên mẫu chóp rễ 18

3.3.3 Quan sát hình thái giải phẫu của quá trình tạo mô sẹo 19

3.3.4 Khảo sát hàm lượng sucrose đến sự hình thành củ tỏi in vitro 20

3.3.5 Cây tỏi con in vitro ngoài vườn ươm 20

3.3.6 Điều kiện nuôi cấy in vitro 20

3.3.7 Xử lý số liệu 20

Chương 4 Kết quả và thảo luận 21

4.1 Nuôi cấy tép tỏi tạo cây con in vitro 21

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA 22

4.2.1 Khả năng đáp ứng của các mẫu mô trên các môi trường nuôi cấy 22

4.2.2 Phát sinh hình thái của mẫu chóp rễ trên các môi trường nuôi cấy 24

4.2.3 Quan sát hình thái giải phẫu của mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính 29

4.2.4 Số lượng chồi con in vitro được hình thành từ phôi vô tính 32

4.3 Khảo sát hàm lượng sucrose đến sự hình thành củ tỏi in vitro 35

4.4 Cây tỏi in vitro ngoài vườn ươm 35

4.5 Quy trình nhân giống cây tỏi ta in vitro và tính kinh tế 35

Chương 5 Kết luận và đề nghị 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Đề nghị 37

Tài liệu tham khảo 38 PHỤ LỤC

DNA : Deoxyribonucleic acid

EDTA : Ethylene diamine tetra acetate

FAOSTAT : Food and Agriculture Organization of the United Nations IAA : 3 – indol acetic acid

MS : Murashige and Skoog, 1992

NAA : α – Naphthalene acetic acid

TDZ : Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea)

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Cách chẻ mẫu tép tỏi trong nuôi cấy in vitro 18

Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật 19

Bảng 3.3 Khảo sát hàm lượng sucrose đến sự hình thành củ tỏi in vitro 20

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của cách chẻ mẫu tép tỏi 21

Bảng 4.2 Sự đáp ứng của các mẫu lá, chóp rễ và đoạn sau chóp rễ 23

Bảng 4.3 Sự đáp ứng của mẫu chóp rễ trên môi trường nuôi cấy theo thời gian 25

Bảng 4.4 Tỉ lệ hình thành mô sẹo, phôi vô tính và chồi con 29

Bảng 4.5 Số lượng chồi con in vitro hình thành từ phôi vô tính 32

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát củ trên các môi trường nuôi cấy tạo củ 33

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu tạo cây tỏi ta 4

Hình 2.2 Cấu trúc củ tỏi ta 5

Hình 2.3 Tình hình sản xuất tỏi thế giới năm 2009 7

Hình 2.4 Tình hình xuất khẩu tỏi thế giới năm 2009 7

Hình 2.5 Tình hình nhập khẩu tỏi thế giới năm 2009 8

Hình 2.6 Hai con đường phát sinh phôi vô tính 10

Hình 2.7 Các giai đoạn phát sinh hình thái của phôi vô tính ở cây loquat 11

Hình 3.1 Củ tỏi giống 16

Hình 4.1 Các mẫu tép tỏi nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản sau 15 ngày 22

Hình 4.2 Đáp ứng của mẫu lá và mẫu chóp trên môi trường nuôi cấy 24

Hình 4.3 Sự kéo dài và nhân rễ 26

Hình 4.4 Sự phát sinh hình thái từ mô sẹo 27

Hình 4.5 Giải phẫu mô sẹo từ chóp rễ tỏi sau 5 tuần nuôi cấy 30

Hình 4.6 Giải phẫu mô sẹo từ chóp rễ tỏi sau 7 tuần nuôi cấy 30

Hình 4.7 Khối mô sẹo phát sinh phôi vô tính 31

Hình 4.8 Các giai đoạn phát triển phôi vô tính cây tỏi ta 32

Hình 4.9 Chồi con sinh ra từ phôi vô tính từ chóp rễ sau 10 tuần nuôi cấy 32

Hình 4.10 Kích thước củ tỏi in vitro 34

Hình 4.11 Cây tỏi con in vitro 34

Hình 4.12 Cây tỏi in vitro ngoài vườn 35

Hình 4.13 Quy trình nhân giống cây tỏi ta bằng phương pháp nhân giống in vitro 36

1

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Tỏi (Allium sativum L.) là một cây trồng quan trọng trong đời sống hằng ngày

của con người Củ tỏi được sử dụng làm gia vị và làm thuốc vì khả năng cải thiện mùi

vị thực phẩm và các hoạt tính sinh học của nó, bao gồm tính kháng sinh (Ekweney và Elegalan, 2005; Cellini và ctv., 1996), chống ung thư (Pan và ctv, 1985), giảm lượng cholesterol trong máu (Yeh và Yeh, 1994) và các ảnh hưởng chống đông máu trên các

tế bào động vật (Fujiwara và Natata, 1967) Củ tỏi ta chứa hàm lượng kháng sinh cao

và sinh loại kháng sinh mạnh như allicin (Shobana và ctv, 2009)

Nghề trồng hành tỏi tại một số vùng ở Việt Nam nói chung đã có từ lâu đời

Nó được xem như một nghề truyền thống của nông dân vùng đất ven biển Tỏi ta được xem như một đặc sản có hương vị thơm nồng đặc biệt nên được người tiêu dùng rất ưa chuộng Trong những năm 80 của thế kỷ trước hành tây và tỏi ta một thời được xuất khẩu sang các nước Đông Âu, được người tiêu dùng các nước này rất ưa chuộng mùi thơm cay nồng đặc trưng của nó Vài năm gần đây do tình hình

về khí hậu và kinh tế biến động nên thị trường này giảm sút và mất dần Tỏi thường được trồng theo phương pháp truyền thống sinh dưỡng vì nó không có khả năng sinh sản hữu tính Việc nhân giống cây trồng theo hình thức này gặp một số khó khăn như tỉ lệ mọc mầm của giống kém, không đồng đều, việc bảo quản giống từ

vụ này sang vụ khác qua thời gian dài gặp nhiều khó khăn, làm giống rất dễ bị hỏng nếu như khâu bảo quản không tốt, không loại bỏ được các mầm bệnh đặc biệt là các bệnh do virus, tỉ lệ thoái hóa của các giống là rất cao Tỏi bị nhiễm một số virus làm giảm sản lượng, khoảng 70% tại Nhật Bản (Nagakubo và ctv, 1993)

Những vấn đề được đưa ra cần giải quyết là nguồn giống cây trồng dần bị thoái hóa ở một số địa phương chuyên trồng tỏi cần phải được thay thế bởi một nguồn giống mới, mà vẫn giữ nguyên tính trạng di truyền của cây mẹ, không bị nhiễm mầm bệnh, đặc biệt là virus; rút ngắn thời gian chọn và lai tạo giống; đồng thời có thể duy trì và bảo quản nguồn gene quý nhằm thúc đẩy quá trình phục tráng giống Vì vậy, nhân

2

dòng vô tính cây tỏi ta có chất lượng và năng suất cao trở thành một vấn đề cấp thiết Nhằm giải quyết được những khó khăn nêu trên, đạt được yêu cầu về sản lượng và giữ được chất lượng của giống tỏi ta vốn có, nghiên cứu “Nhân giống tỏi

ta (Allium sativum L.) thông qua phát sinh phôi vô tính từ chóp rễ in vitro” đã

được thực hiện thông qua nuôi cấy chóp rễ cảm ứng tạo mô sẹo, phát sinh phôi vô tính, tái sinh cây con và tạo củ trong ống nghiệm

1.2 Yêu cầu của đề tài

Xác định cách chẻ mẫu tép tỏi trong công đoạn vô mẫu hiệu quả

Xác định môi trường tối ưu cho quá trình tạo mô sẹo, phát sinh phôi vô tính và tái sinh chồi con Đồng thời, theo dõi và ghi nhận tỷ lệ phát sinh phôi vô tính , số chồi con được hình thành

Thuần thục thao tác giải phẫu mô, tế bào thực vật

Xác định nồng độ sucrose trong giai đoạn tạo củ in vitro

Cây con in vitro trồng ngoài vườn phát triển bình thường

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát ảnh hưởng của cách chẻ mẫu tép tỏi đến sự hình thành và sinh trưởng cây con, nhằm xác định cách thức vô mẫu tép tỏi trong thời gian ngắn có thể sử dụng

rễ và lá được hình thành làm vật liệu cho các thí nghiệm tiếp sau

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự cảm ứng tạo mô sẹo, hình

thành phôi vô tính và tái sinh cây con in vitro từ chóp rễ, nhằm xác định nồng độ chất

kích thích sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS và điều kiện thích hợp cho

sự tạo mô sẹo, phát sinh phôi vô tính và tái sinh chồi con

Khảo sát hàm lượng sucrose đến sự hình thành củ tỏi in vitro từ cây con đã được

tái sinh, nhằm xác định nồng độ sucrose thích hợp cho sự hình thành cây con hoàn chỉnh và củ từ cây con được tái sinh từ phôi vô tính

Khảo nghiệm khả năng phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm Hoàn thiện quy trình nhân giống từ in vitro đến ex vitro

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây tỏi

2.1.1 Phân loại tỏi ta (Allium sativum L.)

Lớp (Class): Liliopsida

Phân lớp (Subclass): Liliidae

Liên bộ (superorder): Liliianae

Bộ (Order): Asparagales

Họ (Family): Alliaceae

Tông (Tribe): Allieae

Phân họ (Subfamily): Allioideae

Giống (Genus): Allium

Loài (Species): Allium sativum L

Cây tỏi ta có tên khoa học là Allium sativum L., tiếng Anh gọi là garlic

Theo Stearn (1992), chi Allium được ước tính có khoảng 750 loài Số lượng

lớn loài này được Hanelt và ctv (1992) chia thành 6 phân giống và 56 phân chi

Đề xuất phân loại gần đây nhất là năm 2006, theo Friesen và ctv đã dựa trên trình

tự gốc của vùng đoạn đệm phiên mã bên trong của DNA ribosome nhân, có khoảng 780 loài nhóm thành 15 phân giống và 56 phân chi (Stavelikova, 2008)

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố cây tỏi

Người ta tin rằng, cách đây hơn 5000 năm, tỏi có nguồn gốc ở các nước Trung Á Do vậy tỏi ưa nhiệt độ mát và là cây chịu lạnh Cây tỏi được lan truyền nhanh chóng về các hướng phía tây Địa Trung Hải, phía đông giáp khắp Trung Quốc, phía nam là Ấn Độ, và các nước Châu Âu

Ở Việt Nam, tỏi được trồng ở khắp mọi miền nhưng tập trung nhiều ở huyện ven biển như Kim Môn (Hải Dương), Gia Lâm (Hà Nội), Lý Sơn (Quảng Ngãi), Khánh Hòa, Ninh Thuận

4

2.1.3 Đặc điểm sinh học của tỏi

2.1.3.1 Cấu tạo, hình thái cây và củ tỏi

Tỏi ta (Allium sativum L.) có bộ nhiễm sắc thể 2n=16 Cây nhỏ mọc từ thân củ

lên, là cây thân thảo cao khoảng 20 - 40 cm Thân giả mang nhiều lá như cây cỏ, dài, hẹp và nhẵn Giữa củ mọc lên cuống mang một số hoa ở đỉnh, bọc trong một mô mỏng

có màu trắng hay phớt hồng Dưới thân hành có rễ chùm, sợi rễ mảnh Phần trong củ tỏi ăn được, các múi tỏi được bao bọc bằng một màng trắng và được bọc thành một nhóm múi tỏi tạo thành củ Thân hành, gồm nhiều hành con (múi tỏi, tép tỏi)

Hình 2.1 Cấu tạo cây tỏi ta (a), (b) Hoa tỏi, (c) Thân, lá tỏi, (d) Tép (múi) tỏi, (e) Củ tỏi

(vietnambranding.com; planetmattersandmore.com; uni-graz.at; blogdivvy.com)

Bản chất của mỗi tép tỏi là một củ hoàn chỉnh (Hình 2.2) Tại phần gốc của tép tỏi là khối mô dày, nó có thể là một mảnh mô hóa gỗ gắn với mầm tỏi bên trong phần thịt tép Dưới kính hiển vi, hình dạng hoàn chỉnh của lá có thể được nhìn thấy nhưng kích thước khá nhỏ Các lá nhỏ trong tép tỏi được bao bọc bởi một lớp thịt tỏi màu trắng có chứa tinh bột, để nuôi rễ và lá phát triển khi trồng vào đất Những củ tỏi sau một thời gian lưu trữ, ở phần gốc tép tỏi có thể có nhiều rễ bất định được hình thành Bên trong tép tỏi chứa những lá mầm bao bọc chặt xung

5

quanh mầm chồi tỏi rất nhỏ Giữa 2 hoặc 3 lá mầm đầu tiên (bên trong tép tỏi), một số chồi nách gắn với phần gốc của tép Chồi nách là vị trí mọc lên và phát triển thành cây và tạo thành tép tỏi mới Mỗi tép tỏi có thể có từ 9-14 chồi nách tạo thành 9-14 tép mới và được liên kết thành một củ tỏi

Hình 2.2 Cấu trúc củ tỏi ta (Stavelikova, 2008)

2.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây tỏi

Tỏi thuộc loại cây ưa sáng, ngày dài; số giờ chiếu nắng 12 - 13 giờ/ngày sẽ kích thích cây hình thành củ sớm; khi trời mát, ngày ngắn thì cây đâm mầm, ra lá mạnh hơn Độ ẩm đất tùy giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây, cần ở mức 70% đến 80% cho phát triển thân lá, mức 60% cho củ lớn Nếu thiếu nước cây tỏi phát triển kém, tạo củ nhỏ Ngược lại, nếu thừa nước cây dễ phát sinh các bệnh thối ướt, thối nhũn, ảnh hưởng tới quá trình bảo quản củ Cây tỏi ưa đất phì nhiêu nhiều chất hữu cơ, đặc biệt đất hơi kiềm Nên đất trồng tỏi phải là đất thịt nhẹ, tơi xốp, giàu mùn, dễ thoát nước, độ pH thích hợp là 6 - 6,5 Mỗi năm chỉ trồng một vụ tỏi vào mùa thu đông từ tháng 9 đến tháng 10 và thu hoạch củ vào tháng 1 và 2

Phương pháp nhân giống truyền thống của cây tỏi là trồng bằng cách tách tép, đây là con đường sinh sản vô tính Tỏi có thể được tạo hạt nhưng trường hợp trồng bằng hạt rất hiếm, chỉ có ở loài hoang dại trong tự nhiên Hiện nay, nhân

giống tỏi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro là phương pháp hiện đại mang lại hiệu

quả sản xuất và đang được quan tâm nghiên cứu

6

2.1.4 Thành phần và hoạt tính sinh học các hợp chất trong tỏi

Trong tỏi ta có chứa các nhóm hoạt chất gồm saponin steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường khử, polysacharid, sterol và tinh dầu Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector PDA, đã xác định được hàm lượng allicin trong tỏi tỏi ta là 0,670% (Nguyễn Minh Chính và ctv, 2000)

Thành phần chủ yếu là chất kháng sinh allicin (C6H10OS2) có tác dụng diệt khuẩn rất mạnh Đông y và Tây y dùng tỏi để chữa cảm cúm, sát trùng Khi được cắt hoặc nghiền nát, một enzyme allinase trong tỏi liên kết với một amino acid, tạo ra một hợp chất mới được gọi là allicin Hợp chất này được biết là giết chết 23 loại vi khuẩn, bao gồm cả salmonella và staphylococcus Một hợp chất khác được hình thành khi tỏi được làm nóng Hợp chất này có thể ngăn chặn các động mạch làm tắc nghẽn, giảm huyết áp và mức độ cholesterol Tỏi có chất chống đông máu có thể hữu ích trong việc ngăn ngừa các cơn đau tim và đột quỵ Tinh dầu từ tỏi giàu glucogen và aliin, fitonxit

có công dụng diệt khuẩn, sát trùng, chống viêm nhiễm

Ngoài ra, tỏi còn chứa hàm lượng lớn vitamin A, B, C, D, PP, hiđrát cacbon, polisaccarit, inulin, fitoxterin và các khoáng chất khác cần thiết cho cơ thể như: iốt, canxi, phốt pho, magiê, các nguyên tố vi lượng (dongtayy.com) Có thể ngăn ngừa ung thư bằng cách kích thích hệ thống miễn dịch để loại bỏ độc tố và chống lại những chất gây ung thư Bởi vì vậy, nó có thể trở thành một phương thức điều trị cho AIDS Người dân Trung Quốc với mức độ dùng tỏi cao trong chế độ ăn uống làm giảm nguy cơ ung thư dạ dày (allotmentheaven.blogspot.com)

2.1.5 Tình hình sản xuất, xuất và nhập khẩu tỏi

Tỏi được dùng rộng rãi trên thế giới như là một loại gia vị và dược liệu Những nhà cung cấp tỏi cho thế giới chủ yếu là Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Nga, Pháp, Tây Ban Nha, Ý và Mexico Có rất nhiều loại tỏi được trồng ở nhiều khu vực khác nhau và sự phát triển của nó cũng không như nhau Tỏi có khả năng tiêu thụ được trên toàn thế giới vì nó vẫn giữ được độ tươi trong suốt cả năm Trung Quốc được biết đến là nhà sản xuất tỏi lớn nhất thế giới với khoảng 10,5 triệu tấn mỗi năm, chiếm 77% (2005) sản lượng thế giới Ấn Độ (4,1%), Hàn Quốc (2%) theo sau đó là Ai Cập

và Nga (1,6%) gắn ở vị trí thứ tư Hoa Kỳ, nơi mà tỏi được trồng ở mỗi tiểu bang

7

ngoại trừ Alaska ở vị trí thứ sáu (1,4%) Phần lớn tỏi được sản xuất ở Hoa Kỳ tập trung ở Gilroy, California, và nơi này tự gọi mình là "thủ đô tỏi của thế giới" 16% còn lại là sản lượng tỏi của các nước khác có ít hơn 2% sản lượng toàn cầu

Đến năm 2009, sản lượng tỏi được sản xuất ở Trung Quốc vẫn chiếm tỉ lệ cao nhất thế giới (81%) Và theo kết luận của FAOSTAT, sản lượng sản xuất và xuất khẩu tỏi của Trung Quốc so với thế giới là tỉ lệ thuận

Hình 2.3 Tình hình sản xuất tỏi thế giới năm 2009 ( Leandro Más, 2011)

Hình 2.4 Tình hình xuất khẩu tỏi thế giới năm 2008 (Leandro Más, 2011)

China 85%

Arab Emirates 1%

México 1% France

1% Italy 0% Other

2%

Các nước khác Châu Âu -27

8

Hình 2.5 Tình hình nhập khẩu tỏi thế giới năm 2008 (Leandro Más, 2011)

Theo đánh giá tình hình sản xuất, xuất và nhập khẩu tỏi thế giới của FAOSTAT Năm 2008, Việt Nam là nước nhập khẩu tỏi với tỉ lệ khá cao (8%) đứng hàng thứ 2 thế giới Tỏi Trung Quốc là một trong những mặt hàng được Việt Nam nhập khẩu nhiều nhất thông qua một số cửa khẩu chủ yếu như Tân Thanh, Lào Cai Theo số liệu của Tổng cục Hải quan, lượng nhập khẩu tỏi tăng khá mạnh theo từng tháng như: tháng 4/2007, lượng tỏi Trung Quốc nhập về là 7 ngàn tấn Tháng 6/2007 là 14,877 ngàn tấn, tăng hơn so với tháng 5/2007 gần 5 tấn Tính 9 tháng năm 2008 lượng tỏi nhập lên tới 2612,5 tấn đạt 627 nghìn USD, tăng 190% so với cùng kỳ tháng 8 Năm 2009 chỉ tính riêng trong 1 tuần đầu của tháng 5/2009, lượng tỏi nhập vào Việt Nam là 119 tấn Đến nay, lượng tỏi nhập khẩu vào Việt Nam vẫn đạt ở mức cao

2.2 Giới thiệu chung về kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật được sử dụng cho việc nuôi các tế bào thực

vật đơn, mô và cơ quan trong điều kiện vô trùng (in vitro) để tái sinh và nhân thành

cây Điều này dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật, tế bào đơn có khả năng phân chia, biệt hóa thành các loại, các tế bào của các mô khác nhau và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Thuật ngữ “nuôi cấy mô” được dùng rộng rãi để mô tả tất cả các hình thức nuôi cấy thực vật, cụ thể là nuôi cấy tế bào, mô sẹo, dịch huyền phù, protoplast, bao phấn, mô phân sinh, phôi và cơ quan (George, 2008)

Indonesia

8%

Viet Nam8%

Pakistan6%

USA5%

Malaysia4%

Philippines4%

Bangladesh3%

Russian Fed

2%

Arab Emirates2%

Other25%

Việt Nam

Mỹ Liên bang Nga

Hà Lan

Thái Lan

9

Nuôi cấy mô thực vật là ngành khoa học bao gồm kỹ thuật và phương pháp sử dụng trong nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản về thực vật học, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống Hệ thống nuôi cấy mô thực vật nghiên cứu về tất cả các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hóa học,

di truyền học và cấu trúc thực vật Nhân giống vô tính các loài cây quan trọng có giá trị kinh tế, thương mại và bảo tồn loài là tiềm năng to lớn của kỹ thuật này

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật hiện nay được ứng dụng mạnh

mẽ vào thực tiễn đời sống Nhiều phương pháp đã được phát triển để nhân giống, chọn lọc các đặc điểm mong muốn khác nhau, tạo dòng tế bào, nhân nhanh các kiểu di truyền, tạo các cây đơn bội từ nuôi cấy noãn và túi phấn, đa dạng hóa các kiểu di truyền bằng cách tạo đột biến và nhân dòng soma, tạo ra các mô sẹo cô lập và nuôi cấy

tế bào để nghiên cứu những ảnh hưởng của khoáng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nguồn carbon trên sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, nuôi cấy mô đã trở thành một trong những lĩnh vực được quan tâm trong ngành trồng trọt Nuôi cấy mô đã và đang có những đóng góp to lớn trong việc phục tráng, nhân giống và chọn giống cây trồng, góp phần vào sự phát triển của ngành khoa học nông, lâm nghiệp (Trần Đức Lượng, 2006)

2.3 Kỹ thuật nuôi cấy phôi vô tính

2.3.1 Giới thiệu về phôi vô tính

Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng một khái niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Trong hầu hết hệ thống sinh phôi được mô tả cho đến bây giờ, tế bào sinh phôi chỉ ra những đặc điểm thông thường giống của tế bào mô phân sinh như có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng mạnh mẽ, tốc độ phân chia cao, tế bào chất đậm đặc với những hạt tinh bột, nhân lớn, hạch nhân giãn nở, không bào nhỏ, vách tế bào mỏng (Halperin và ctv, 1967; Williamsn và ctv, 1986; trích dẫn bởi Francisco và ctv, 2006) Dựa vào những đặc điểm trên để phân biệt các tế bào có khả năng sinh phôi với các tế bào không có khả năng sinh phôi

10

Steward (1958) và Reinert (1959) là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình thành

phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota) Đến năm 1977, Murashige cho rằng phôi vô tính có thể trở thành một biện pháp nhân giống in

vitro Ở một số loài, sự phát sinh phôi vô tính hình thành trực tiếp từ những phôi

bất định nằm trong phôi tâm Đến nay, công nghệ phôi vô tính được coi là công nghệ rất có triển vọng cho nông nghiệp trong thế kỷ 21

2.3.2 Sự phát sinh phôi vô tính

Có hai con đường phát sinh phôi vô tính: phát sinh phôi trực tiếp (direct somatic

embryogensis) và phát sinh phôi gián tiếp (indirect somatic embryogensis)

Hình 2.6 Hai con đường phát sinh phôi vô tính (Francisco và ctv, 2006)

Phát sinh phôi trực tiếp là quá trình phôi vô tính được hình thành trực tiếp trên bề mặt của mẫu cấy ban đầu không qua giai đoạn trung gian mô sẹo Trong trường hợp này vẫn có sự hình thành mô sẹo trên bề mặt mẫu cấy nhưng mô sẹo tăng sinh không đáng kể và xuất hiện trước sự hình thành phôi Nếu mô cấy có các tế bào của phôi hợp tử đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gene, thì chỉ cần một sự kích thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi (Dương Tấn Nhựt, 2007)

11

Phát sinh phôi gián tiếp là quá trình phôi vô tính được phát sinh thông qua

mô sẹo và thông thường mô sẹo sẽ được tăng sinh dồi dào trước khi được cảm ứng hình thành phôi Những tế bào đã phân hóa, không còn khả năng sinh phôi thì chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt quá trình để được tái lập trình đi vào con đường sinh phôi (Bùi Trang Việt, 2002; trích dẫn bởi Dương Tấn Nhựt, 2007 )

2.3.3 Sự biệt hóa mô của phôi vô tính

Phôi vô tính được hình thành sau khi được cảm ứng thì sẽ trải qua những giai đoạn phát triển như phôi hợp tử Đối với phôi của thực vật hai lá mầm thì sau giai đoạn tiền phôi sẽ là giai đoạn phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình cá đuối, phôi trưởng thành và giai đoạn hai lá mầm tương tự như phôi hữu tính (Hình 2.7) Phôi của thực vật một lá mầm sẽ trải qua giai đoạn hình cầu, bao lá mầm và lá mầm (một lá mầm) Sự tạo cơ quan phôi một lá mầm về cơ bản giống ở cây hai lá mầm, trừ vài khác biệt về số diệp tử (một thay vì hai) hay tính đối xứng của phôi (một thay vì hai mặt phẳng đối xứng như ở hai lá mầm) (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Hình 2.7 Các giai đoạn phát sinh hình thái của phôi vô tính ở cây loquat

(Eriobotrya japonica Lindl.) (A) Giai đoạn mô sẹo, (B) Giai đoạn hình cầu,

(C) Giai đoạn hình tim, (D) Giai đoạn hai lá mầm (Juan và ctv, 2012).

12

Nhìn chung, sự biệt hóa mô của phôi vô tính sau giai đoạn tiền phôi hay giai đoạn hình cầu cần có sự loại bỏ các chất điều hòa sinh trưởng khỏi môi trường, hoặc ít nhất là phải làm giảm chất điều hòa sinh trưởng đến một nồng độ cho phép để có thể đáp ứng cho sự tăng sinh của phôi và sự phát triển hoàn chỉnh sau đó Một số nhân tố khác cũng có ảnh hưởng đến sự biệt hóa mô phôi (Dương Tấn Nhựt, 2007)

2.3.4 Những nhân tố ảnh hưởng đến sự cảm ứng và hình thành phôi vô tính 2.3.4.1 Ảnh hưởng của nhân tố auxin

Auxin thường gây ra sự tạo bướu các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng của huyền phù tế bào (Pierik, 1987) Auxin là yếu tố cần thiết cho sự phát triển của phôi, nó có ảnh hưởng khác nhau trong từng giai đoạn của quá trình phát sinh phôi Sự hiện diên của auxin cần thiết cho sự thành lập các tế bào hay nhóm tế bào có khả năng sinh phôi từ các tế bào hay nhóm tế bào cô lập (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Sự hiện diện của auxin riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin là cần thiết cho sự thành lập các tế bào hay nhóm các tế bào có khả năng sinh phôi, tuy nhiên auxin lại cản sự sinh phôi ở các pha tiếp theo Nhu cầu về loại auxin cũng như nồng độ auxin cho sự cảm ứng phôi thay đổi tùy thuộc vào kiểu gene thực vật và loại mô sử dụng trong nuôi cấy Tuy nhiên, 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) và NAA (napthalen acetic acid) được sử dụng nhiều nhất, 2,4-D chiếm 50% và NAA chiếm 25% trong tổng số các trường hợp phát sinh phôi (Dương Tấn Nhựt, 2007) Auxin liên quan đến

sự khơi mào khả năng sinh phôi, chủ yếu trong giai đoạn sớm của phôi, sau đó sẽ quay lại ức chế sự phát triển của phôi Khi loại bỏ auxin ra khỏi môi trường nuôi cấy, các khối tế bào sinh phôi sẽ trải qua quá trình biệt hóa từ dạng hình cầu sang dạng hình tim, dạng cá đuối và thành cây con Ở giai đoạn phôi hình tim, người ta cho rằng, hàm lượng auxin là lớn nhất (Yin và ctv, 2009) Vai trò của auxin trong sự cảm ứng tạo phôi thông qua sự acid hóa vách tế bào và tế bào chất

2.3.4.2 Ảnh hưởng của nhân tố cytokinin

Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng thực vật cần thiết cho sự sinh phôi vô tính

ở một số loài thực vật (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Cytokinin có tác dụng kích thích

sự tăng trưởng tế bào với điều kiện có mặt auxin trong môi trường Cytokinin tác động

13

trên cả hai bước phân nhân và phân bào của sự phân chia tế bào Trong sự nuôi cấy các

mô nghèo cytokinin, auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách Sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh (Bùi Trang Việt, 2000)

Cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin (kích thích tạo chồi), sự cân bằng giữa hai hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển Nhiều tác giả ghi nhận rằng “việc kết hợp cytokinin và auxin được cảm ứng tạo phôi ở nhiều loài thực vật”

Sự bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy đã tăng cảm ứng tạo phôi ở dưa đỏ Loại cytokinin rất thích hợp đối với cây thân gỗ là TDZ (thidiazuron) Chỉ với hàm lượng TDZ rất nhỏ cũng đủ kích thích quá trình phát sinh phôi Ở tiêu, phôi vô tính được tạo ra trên môi trường có 2,4-D và TDZ nhưng nếu môi trường chỉ có chứa 2,4-D thì quá trình tạo phôi không xảy ra (Binzel và ctv, 1996)

2.3.4.3 Ảnh hưởng của các nhân tố khác

Bên cạnh nồng độ auxin và cytokinin một số nhân tố khác như nguồn gốc của vật liệu nuôi cấy, nguồn carbohydrate, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng… cũng có vai trò trong

sự hình thành và phát triển của phôi vô tính

Sucrose là loại đường thường được sử dụng để cung cấp nguồn carbohydrate cho

sự phát sinh phôi vô tính; bên cạnh đó, một số đường đơn, đường đôi khác cũng có thể

áp dụng thành công Galactose và lactose tốt hơn sucrose cho việc cảm ứng tạo phôi từ

mô sẹo của cây cam, trong khi đó sucrose tốt hơn là glucose và fructose (Kochba và ctv, 1982; trích dẫn bởi Dương Tấn Nhựt, 2007)

Phôi vô tính có thể được tạo ra trong những điều kiện sáng và tối khác nhau Có những loài có nhu cầu ánh sáng cao nhưng cũng có những loài sự hình thành phôi lại xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn (Bùi Trang Việt, 2005; trích bởi Dương Tấn Nhựt, 2007) Theo Trần Văn Minh (1997), ánh sáng kích thích sự nảy mầm của phôi, do đó trong nuôi cấy phôi còn non chưa trưởng thành thường thực hiện trong tối để kích thích quá trình phát sinh phôi và khi cần tái sinh thì phôi được chuyển ra ánh sáng Loại mẫu cấy, tuổi sinh lý và giai đoạn phát triển của mô cấy cũng quan trọng Đối với một số mô và kiểu gene, trạng thái không sinh phôi là không kiểm soát

14

được bằng các kỹ thuật cảm ứng phôi hiện nay Một nguyên nhân là ở những mô không có khả năng đáp ứng sinh phôi thì không có các thụ quan nhận biết auxin hoặc có giả thuyết là các phân tử truyền tín hiệu không đồng nhất với nhau (Merkle

và ctv, 1995; trích dẫn bởi Dương Tấn Nhựt, 2007)

2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây tỏi

Trong nhiều thế kỷ, công dụng của tỏi được con người biết đến và khai thác sử dụng Ở những thập niên gần đây, người ta mới quan tâm chú trọng đến vấn đề nhân giống và bảo tồn nguồn giống quý này Khởi xướng chủ yếu là các nước Châu Á như

Ấn Độ, Nhật Bản, Bangladesh (Nam Á), Mexico…đã có nhiều nghiên cứu về nhân

giống cây tỏi (Allium sativum L.) từ những năm 90, nhưng phương pháp phát sinh phôi gián tiếp từ chóp rễ cây tỏi in vitro nuôi cấy qua hai giai đoạn thay đổi chiếu sáng và

tạo củ thì chưa có nghiên cứu nào thực hiện

Năm 1993, ở Nhật Bản, nhóm nghiên cứu Takayuki và ctv đã thực hiện nghiên cứu “Vi nhân giống cây tỏi thông qua sự hình thành củ trong ống nghiệm” Họ phát

triển phương pháp vi nhân giống mới cho cây tỏi (Allium sativum L.) kết hợp việc nuôi cấy chồi đỉnh sơ khởi, sự nhân chồi và tạo củ in vitro Năm 1994, cũng ở Nhật

Bản, nhóm nghiên cứu của Kiyoshi và ctv cũng thực hiện nghiên cứu vi nhân giống

cây tỏi ta (Allium sativum L.), họ nghiên cứu sự tái sinh từ những mẫu được cắt từng

phần của củ của những cây con, rồi nuôi cấy trên môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA Nghiên cứu này đưa ra kết luận phần mẫu cấy có khả năng tái sinh cao nhất là đĩa mầm của tép tỏi Cùng năm, Luis và ctv thực hiện nghiên cứu tái sinh cây tỏi thông qua nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng tạo mô sẹo, huyền phù tế bào lỏng, tái sinh cây và hình thành củ Chồi được hình thành trên môi trường

MS có hoặc không chứa BA phát triển thành củ khi chuyển sang môi trường có bổ sung 5 g/l than hoạt tính và 120 g/l sucrose trong điều kiện chiếu sáng ngày dài ở

28oC là kết quả được công bố năm 1995 của nhóm tác giả Yasseen và ctv

Những năm sau đó, Nhật Bản cũng như một số nước khác tiếp tục công bố những nghiên cứu về nhân giống cây tỏi thông qua tạo chồi trực tiếp từ chóp rễ (Muhammad

và ctv, 1997), sự cảm ứng hình thái mô sẹo nuôi cấy từ những mảnh lá cây tỏi (Akitsu

và ctv, 1988), phương pháp hiệu quả điều khiển sự nhân chồi và tạo củ tăng lên gấp

15

bội của tỏi (Xabier và ctv, 1999) ở Tây Ban Nha Năm 2000, nghiên cứu hiệu quả tái sinh cây tỏi bằng nuôi cấy chóp rễ được công bố bởi nhóm nghiên cứu Alejandrina Robledo-Paz và ctv Nghiên cứu này sử dụng chóp rễ nuôi cấy hình thành mô sẹo, phát sinh cơ quan và phát triển thành cây hoàn chỉnh Đến năm 2001, ở Ấn Độ, nhóm nghiên cứu Sata và ctv đã công bố nghiên cứu phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ họ tỏi

(Allium sativum L.) Năm 2003, Muhammad và ctv công bố kết quả nghiên cứu tái

sinh chồi và hình thành củ từ mô phân sinh chồi và rễ tỏi địa phương Bangladesh Kết quả nghiên cứu này đạt tỉ lệ tái sinh từ mô phân sinh chồi trên môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng là cao nhất với 95,55%, và 40% chồi được tái sinh từ mô phân sinh rễ trên môi trường MS bổ sung 1 FM NAA và 10 FM BA Đến năm 2006, nghiên cứu hiệu quả mẫu cấy và chất điều hòa sinh trưởng trong sự hình thành mô sẹo

và tái sinh cây tỏi được công bố bởi Gabriela và ctv Salam và ctv, 2008 công bố kết quả nghiên cứu sự kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng (2,4-D, NAA và BA) cho sự hình thành mô sẹo và tái sinh cơ quan từ phần mô đĩa lá của tép tỏi Tái sinh cây tỏi thông qua sự hình thành phôi vô tính cũng được tác giả Sook và ctv công bố năm

2009 Cho đến nay, tỏi vẫn đang ngày càng được quan tâm và có nhiều kết quả công

bố và nhiều công trình đang thực hiện

Ở Việt Nam, việc sử dụng tỏi cho các bữa ăn và dùng làm thảo dược được phổ biến trong cuộc sống của con người từ xưa đến nay Có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược liệu, thành phần sinh dưỡng, dược phẩm được chú trọng quan tâm, nhưng chưa

có sự quan tâm về vấn đề nhân giống bảo tồn nguồn gene vốn có của loài tỏi quý này

Do đó chưa có kết quả nghiên cứu thực hiện nuôi cấy in vitro cây tỏi, đặc biệt là giống tỏi ta (Allium sativum L.) tại Việt Nam

16

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2012 đến hết tháng 6 năm 2012 tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm

Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Củ tỏi ta (Allium sativum L.) giống được lựa chọn từ ruộng tỏi tại thôn Mỹ

Tường, xã Thanh Hải, huyện Ninh Hải, tỉnh Ninh Thuận Củ giống có thời gian sinh trưởng trên 140 ngày (4,5 tháng) Chọn những củ có màu trắng, đường kính 3,5 – 4

cm, có 10 - 12 nhánh tương đối đều nhau, tròn, không bị nấm bệnh bó thành chùm treo

phơi dưới ánh nắng mặt trời trong 1,5 tháng, sau đó bảo quản nơi khô thoáng

Hình 3.1 Củ tỏi ta 3.2.2 Hóa chất khử trùng mẫu cấy

Xà phòng là chất tẩy rửa làm sạch bề mặt mẫu Có tính lưỡng cực (RCOONa) một đầu ái nước, một đầu ái chất béo Các phân tử xà phòng dễ nhũ tương hóa chất béo trên bề mặt vật đồng thời làm cho các vi khuẩn bám dính ở đó bị “treo”, khi rửa bằng nước sẽ bị trôi đi Có tác dụng trên vi khuẩn Gr dương và kháng acid nhưng không có tác dụng trên vi khuẩn Gr âm (Võ Thị Trà An, 2010) Xà phòng làm cho các hạt chất bẩn trở thành trơn, do đó dễ dàng bị nước cuốn đi Nước có lực căng bề mặt

17

nghĩa là bề mặt của nước tựa như một lớp che phủ mỏng có tính đàn hồi Lực căng bề mặt này khiến cho nước không thể thấm vào bên trong hoặc vào xung quanh các hạt của chất bẩn bám trên vật Khi xà phòng hòa tan trong nước nó sẽ làm giảm sức căng

bề mặt đó cho nên dung dịch nước – xà phòng có thể bao quanh các hạt của chất bẩn, làm cho nó tách rời khỏi vật, nhờ thế nà bị nước cuốn đi (bachkhoatrithuc.vn)

Ethanol làm biến tính protein và làm giảm sức căng bề mặt Loại thường sử dụng nhất là ethanol 70% Thời gian áp dụng khoảng 3 phút Có tác dụng trên các tế bào dinh dưỡng (kể cả trực khuẩn lao, virus có vỏ, nấm) nhưng không có tác dụng trên bào

tử (Võ Thị Trà An, 2010) Dùng ethanol 70% để sát trùng da tay, lau tủ cấy và khử trùng mẫu cấy Ethanol 96% được dùng để đốt đèn cồn và khử trùng dụng cụ

Nước Javen (NaClO) là chất ôxy hóa mạnh được tạo ra bởi quá trình điện phân nước muối Nó được sử dụng thay thế cho khí Clo để khử trùng với chức năng hạn chế

sự phát triển của vi sinh vật

3.2.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm trong nghiên cứu này là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) (thành phần môi trường xem ở phụ lục bảng 22) có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar

Trong các thí nghiệm khác nhau, tùy vào từng mục đích mà môi trường MS được biến đổi, bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau, hay bổ sung hàm lượng sucrose khác nhau Môi trường nuôi cấy được chứa trong các chai thủy tinh loại 500 ml (thể tích môi trường là 50 ml) Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh đến pH 5,7 bằng NaOH 1N hoặc HCl 10% trước khi hấp khử trùng trong autoclave tại nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm trong 25 phút

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Tạo cây tỏi in vitro

Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của cách chẻ mẫu tép tỏi đến sự hình thành và sinh trưởng cây con

Củ tỏi giống được rửa sạch, tách một lớp vảy bên ngoài và rửa tiếp bằng nước Khử trùng trong điều kiện vô trùng và cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy Củ tỏi được tách bỏ lớp vỏ bao bên ngoài, được khử trùng bằng cồn 70% và dung dịch Javen 30%

18

Mẫu tép tỏi đã được khử trùng sẽ không chẻ đôi, cắt ngang ½ tép, chẻ đôi dọc hay cắt ngang ½ tép và chẻ đôi được cấy trong môi trường nuôi cấy MS Các mẫu rễ,

lá của cây tỏi in vitro tạo ra trong thí nghiệm này được dùng làm vật liệu cho những

nghiên cứu tiếp theo sau

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cách chẻ mẫu tép tỏi đến sự hình

thành và sinh trưởng cây con

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến sự cảm ứng tạo mô sẹo, hình thành phôi vô tính và tái sinh cây con in vitro từ chóp rễ

Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến

sự cảm ứng tạo mô sẹo, hình thành phôi vô tính và tái sinh cây con in vitro từ chóp rễ Mẫu chóp rễ, mẫu lá và mẫu đoạn rễ của cây tỏi in vitro sau khi nuôi cấy 15 ngày

được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm này Chóp rễ được cắt với kích thước 2-2,5

mm, mẫu lá được cắt khoảng từ 3-4 mm, mẫu đoạn rễ được cắt từ đoạn sau chóp rễ với kích thước 3-4 mm Các mẫu được nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung NAA (0, 0,5; 1,0; 2,0 mg/l) và BA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l)

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 20 mẫu cho một nghiệm thức Các mẫu cấy được nuôi với điều kiện tối hoàn toàn trong thời gian 4 tuần để cảm ứng tạo tạo mô sẹo, sau đó chuyển mô sẹo sang nuôi cấy dưới ánh sáng trắng trong thời gian 3 tuần để tái sinh hình thái từ mô sẹo

19

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng

thực vật đến sự cảm ứng tạo mô sẹo, hình thành phôi vô tính và tái sinh cây con in vitro

Nghiệm

thức

Môi trường NAA (mg.l

Chỉ tiêu theo dõi: ghi nhận sự đáp ứng của các mẫu chóp rễ, mẫu lá và mẫu đoạn

rễ trên các môi trường nuôi cấy theo thời gian nuôi cấy sau 2 tuần, 4 tuần và 7 tuần Tỉ

lệ (%) mẫu cảm ứng tạo mô sẹo, hình thái mô sẹo, tỉ lệ (%) mẫu mô sẹo phát sinh phôi

vô tính, tỉ lệ (%) mẫu hình thành chồi con sau thời gian nuôi cấy, số lượng chồi con hình thành từ phôi và chồi con

3.3.3 Quan sát hình thái giải phẫu của quá trình tạo mô sẹo

Những biến đổi của mẫu chóp rễ (MCR) trong quá trình tạo mô sẹo, biến đổi của

mô sẹo được quan sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm mẫu bằng thuốc nhuộm 2 màu

đỏ carmin và xanh iod Nhân tế bào được nhuộm bằng aceto carmin

Phương pháp nhuộm tế bào: ngâm lát cắt vào dung dịch javel pha loãng trong 10– 15 phút, rửa bằng nước cất nhiều lần Ngâm lát cắt trong dung dịch acid acetic 1% trong 2 phút để tẩy sạch javel còn sót lại Rửa lại nhiều lần bằng nước cất Ngâm lát cắt trong dung dịch thuốc nhuộm 2 màu đỏ carmin và xanh iod, rửa bằng nước cất cho đến khi rửa hết màu của dung dịch Vi phẫu sau khi nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi với các vật kính 4X, 10X, 40X

20

3.3.4 Khảo sát hàm lượng sucrose đến sự hình thành củ tỏi in vitro

Thí nghiệm 3: khảo sát hàm lượng sucrose đến sự hình thành củ tỏi in vitro

Các cây tỏi in vitro hình thành từ phôi vô tính được cuôi cấy vào môi trường nuôi cấy

MS có bổ sung sucrose với các hàm lượng thay đổi lần lượt 20 g/l, 40 g/l, 60 g/l và 80 g/l

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát hàm lượng sucrose đến sự hình thành củ tỏi in vitro

Nghiệm thức Môi trường Hàm lượng

sucrose (g.l-1) Số mẫu/chai Tổng mẫu

3.3.5 Cây tỏi con in vitro ngoài vườn ươm

Sau thời gian nuôi cấy in vitro, cây tỏi con hoàn chỉnh được trồng khảo nghiệm

ngoài vườn ươm Điều kiện nuôi trồng hoàn toàn giống với điều kiện trồng tỏi bình thường ở địa phương về nhiệt độ, ẩm độ, dinh dưỡng, tưới tiêu… Theo dõi sự phát

triển của cây tỏi con in vitro

3.3.6 Điều kiện nuôi cấy in vitro

Các mẫu cấy được nuôi ở phòng tăng trưởng với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt

độ 26 ± 2 oC, cường độ chiếu sáng là 3000 lux dưới ánh sáng trắng, ẩm độ 60 – 65%

Ở giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo, các mẫu cấy được nuôi trong điều kiện tối hoàn toàn, các điều kiện về nhiệt độ và độ ẩm không thay đổi

3.3.7 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC, kết quả được đọc dựa trên bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp LSD