NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia Jack)

24 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của một số chất ĐHSTTV trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy ở điều kiện tối.... 34 Bảng 4.13 Ảnh hưởng của một số chất ĐH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH MÔ SẸO TỪ

MẪU LÁ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia Jack)

Sinh viên thực hiện : ĐỖ QUỐC TRƯỜNG

Tháng 07/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH MÔ SẸO TỪ

MẪU LÁ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia Jack)

ThS TRẦN TRỌNG TUẤN

Tháng 07/2012

LỜI CÁM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự quan tâm giúp đỡ tận tình c ủa các thầy, các anh chị và sự động viên từ gia đình và các bạn

Chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn là ThS Đỗ Đăng Giáp cùng ThS Tr ần Trọng Tuấn đã cho tôi cơ hội thực hiện đề tài này và đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi có thể hoàn thành luận văn này

Cảm ơn chân thành đến các anh chị trong Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ, hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Cảm ơn các quý Thầy cô trong và ngoài bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ và cung cấp những kiến thức tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cảm ơn các bạn sinh viên thực tập tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Cảm ơn các bạn trong tập thể lớp DH08SH đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Cuối cùng xin cảm ơn và luôn ghi nhớ công ơn dưỡng dục, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và thực hiện luận văn này

Đỗ Quốc Trường

TÓM TẮT

Cây Bá bệnh là cây thuốc quý hiếm với khả năng trị nhiều bệnh được biết đến như là nhân sâm Malaysia với tên nổi tiếng Tongkat ali Nghiên cứu sự phát sinh mô sẹo từ mẫu lá cây Bá bệnh, làm nguyên liệu và tiền đề cho các nghiên c ứu nhằm ứng dụng vào sản xuất sinh khối thu nhận các hợp chất thứ cấp quý có trong cây

Chế độ khử trùng thích hợp với mẫu cấy lá là lắc bằng cồn 70° trong 30 giây và 0,1% HgCl2 trong 12 phút Môi trường khoáng sử dụng là môi trường MS, B5, DKW với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là 2,4-D, NAA, IBA (0,0 mg/l – 3,0 mg/l), TDZ (0,0 mg/l – 1,0 mg/l) được bổ sung riêng lẻ và 2,5 mg/l 2,4-D hoặc 2,5 mg/l NAA kết hợp với BA ho ặc kinetin nồng độ từ 0,0 mg/l đến 6,0 mg/l

Sau 45 ngày khảo sát, môi trường có bổ sung 2,4-D, NAA hay TDZ đều có khả năng cảm ứng tạo sẹo Mẫu cấy được nuôi cấy ở cùng nồng độ chất cảm ứng trong điều kiện tối có tỷ lệ tạo sẹo và trọng lượng tươi cao hơn trong điều kiện sáng Mẫu cấy trên môi trường bổ sung IBA không tạo sẹo TDZ tạo sẹo chắc đạt tỷ lệ 100% ở nồng độ 0,6 mg/l trên môi trường MS và ở nồng độ 0,2 mg/l; 0,4 mg/l trên môi trường DKW Môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l 2,4-D và môi trường B5 hoặc DKW bổ sung 2,5 mg/l NAA c ảm ứng tạo sẹo hiệu quả với tỷ lệ tạo sẹo 100% và trọng lượng tươi của mẫu lần lượt là 98,8 mg; 143,1 mg và 457,6 mg

Sự kết hợp với BA/kinetin giúp gia tăng tỷ lệ tạo sẹo và trọng lượng mẫu cấy ở tất cả các nghiệm thức khảo sát và đạt giá trị lớn nhất ở nghiệm thức 2,5 mg/l NAA kết hợp 2,0 mg/l BA có trọng lượng tươi mẫu là 511,0 mg ở điều kiện sáng và 601,1 mg ở điều kiện tối

SUMMARY

Eurycoma longifolia is rare medicinal plants with the ability to treat many

diseases are known as Malaysian Ginseng with famous names Tongkat ali Study

the callus incurred from leaf samples of the E longifolia, as materials and the

premise for the research to apply to biom ass production received your secondary compounds in plants

Regime suitable for sterilization of culture-shaking leaves with alcohol 70°

in the 30s and 0.1% HgCl2 for 12 minutes Mineral environment used is the environment MS, B5, DKW substances nature of plant growth regulators as 2,4-D, NAA, IBA (0.0 mg/l – 3.0 mg/l), TDZ (0.0 mg/l – 1.0 mg/l) was single supplement and 2.5 mg/l 2,4-D or 2.5 mg/l NAA in combination with BA or kinetin concentration from 0.0 mg/l to 6.0 mg/l

After 45 days of surveying, environment supplemented with 2,4-D, NAA or TDZ are able to induced callus Culture samples were cultured in the same concentration induced in the dark callus rate and fresh weight higher in light conditions Culture samples on environmental supplement IBA does not create callus TDZ make callus secure to reach rate of 100% at a concentration of 0.6 mg/l on MS medium and at concentrations of 0.2 mg/l and 0.4 mg/l on DKW environment MS medium supplemented 2.5 mg/l 2,4-D and environmental B5 or DKW additional 2.5 mg/l NAA induced callus efficiently with rate of callus 100% and fresh weight of sample 98.8 mg, 143.1 mg and 457.6 mg, respectively

The combination with BA/kinetin help increase the rate of callus and weight in all cultures treatments examined and achieve maximum value in the treatments 2.5 mg/l NAA combined 2.0 mg/l BA with fresh weight in the sample is 511.0 mg in light conditions and 601.1 mg in dark conditions

MỤC LỤC

Trang

LỜI CÁM ƠN 1

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) 3

2.1.1 Phân lo ại học 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật 4

2.1.3.1 Đặc điểm sinh học 4

2.1.3.2 Đặc điểm sinh thái, sinh trưởng và phát triển 5

2.1.4 Thành phần hóa học và công dụng 5

2.2 Một số nghiên cứu về cây Bá bệnh 6

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 8

2.3 Mô sẹo và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo 8

2.3.1 Mô sẹo và sự hình thành mô sẹo 8

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo 9

2.3.2.1 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 9

2.3.2.2 Vai trò của cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng đến sự hình thành mô sẹo 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu 15

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 15

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 15

3.2.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm 15

3.2.4 Điều kiện thí nghiệm 16

3.3 Nội dung nghiên cứu 16

3.3.1 Khảo sát chế độ khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá cây Bá bệnh 16

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy 17

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy 18

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên môi trường DKW đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy 19

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D; NAA kết hợp với kinetin hay BA trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy 19

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 20

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Chế độ khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá cây Bá bệnh 21

4.2 Ảnh hưởng của CĐHSTTV trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá cây Bá bệnh 22

4.3 Ảnh hưởng của CĐHSTTV trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá cây Bá bệnh 27

4.4 Ảnh hưởng của CĐHSTTV trên môi trường DKW đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá cây Bá bệnh 32

4.5 Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá cây Bá bệnh 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetix acid

2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxy) acetic acid

B5 Môi trường Gamborg và ctv (1968)

BAP hay BA 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine

Chất ĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

DKW Môi trường Juglans medium (1984)

IAA 3-indol-acetic acid

IBA Indol-3-butyric acid

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Nghiệm thức chế độ khử trùng mẫu cấy lá cây Bá bệnh 16

Bảng 3.2 Nghiệm thức các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường MS 17

Bảng 3.3 Nghiệm thức các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường B5 18

Bảng 3.4 Nghiệm thức các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường DKW 19

Bảng 3.5 Nghiệm thức các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường MS 20

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian và chất khử đến mẫu cấy lá cây Bá bệnh 21

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của 2,4-D trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy 22

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của NAA trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy 23

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của TDZ trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy 24

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của một số chất ĐHSTTV trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy ở điều kiện tối 25

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của 2,4-D trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy 27

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của NAA trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy 28

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của TDZ trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy 29

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của một số chất ĐHSTTV trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy ở điều kiện tối 30

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của 2,4-D trên môi trường DKW đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy 32

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của NAA trên môi trường DKW đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy 33

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của TDZ trên môi trường DKW đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy 34

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của một số chất ĐHSTTV trên môi trường DKW đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy ở điều kiện tối 35

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với kinetin và BA đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy 37

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của NAA kết hợp với kinetin và BA đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy 41

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của auxin và cytokinin đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây Bá bệnh 3

Hình 2.2 Bộ phận cây Bá bệnh .4

Hình 4.1 Mẫu cấy sau 45 ngày trên môi trường MS .26

Hình 4.2 Mẫu cấy sau 45 ngày trên môi trường B5 .31

Hình 4.3 Mẫu cấy sau 45 ngày trên môi trường DKW 36

Hình 4.4 Mẫu cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D kết hợp kinetin 38

Hình 4.5 Mẫu cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D kết hợp BA 39

Hình 4.6 Mẫu cấy trên môi trường MS bổ sung NAA kết hợp kinetin .42

Hình 4.7 Mẫu cấy trên môi trường MS bổ sung NAA kết hợp BA .43

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay trên thế giới nói chung và cũng như Việt Nam nói riêng tỷ lệ nam giới gặp vấn đề về khả năng sinh lý ngày càng gia tăng, đặc biệt là nam giới sau 40 tuổi khi lượng hormon trong cơ thể giảm Nhưng chỉ có một số ít người trong đó tìm đến bác

sĩ, còn lại là tự tìm cách chữa trị bằng các bài thuốc dân gian, mà những bài thuốc này thì chưa được khoa học nghiên cứu và chứng minh rõ ràng, cũng như có thể xảy ra các phản ứng phụ không mong muốn khi sử dụng chúng

Tuy nhiên trong hệ thống thế giới thực vật rất đa dạng và phong phú, đã có rất nhiều loài trong số đó được con người sử dụng làm nguồn thực phẩm và dùng trong việc chữa bệnh do những hợp chất có trong thực vật Ngày nay có rất nhiều các hợp chất đã được các nhà khoa học tìm thấy và nghiên cứu Trong số các cây thảo dược được nghiên cứu thì cây Bá bệnh có nguồn gốc từ các nước khu vực Đông Nam Á có chứa các hợp chất như quassinoid, triterpen, các alkaloid,… trong đó đặc biệt là hợp chất quassinoid có khả năng tăng cường sinh lý ở nam giới Hợp chất này có tác dụng kích thích cơ thể sản sinh nội tiết tố nam testosterone một cách tự nhiên, đây là một trong những công dụng được nghiên cứu nhiều nhất ở cây Bá bệnh Ngoài ra trong cây còn có nhiều tác dụng dược lý khác nhờ vào các hợp chất khác có trong cây

Các hợp chất này được thu nhận từ rễ của cây Bá bệnh trong tự nhiên và cũng như cây được trồng Tuy nhiên, thời gian sinh trưởng của cây là khá dài do đó sẽ ảnh hưởng lớn đến khả năng thu nhận các hợp chất này Ngoài ra việc khai thác quá mức cũng làm cho số lượng của các cây trong tự nhiên cũng suy giảm một cách đáng kể

Mặt khác, việc thu nhận các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu và cho kết quả tốt Như saponins từ cây Agave amaniensis bởi Andrijany và ctv (1999), alkaloids cây Ailanthus altissima bởi Anderson và ctv (1987), saikosaponins cây Bupleurum falcatum bởi Wang and Huang (1982),… (Mulabaggal và Tsay, 2004).

Ưu thế của phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một lượng lớn các ho ạt chất mà nó không làm ảnh hưởng đến nguồn cây ngoài tự nhiên

Từ những vấn đề trên thì đề tài ―Nghiên cứu quá trình phát sinh mô sẹo từ mẫu

lá cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack)‖ được tiến hành, nhằm khảo sát một số yếu

tố ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo Đây là nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào, hướng đến nuôi cấy thu sinh khối nhằm sản xuất các hợp chất thứ cấp quý

có trong loài cây này Cũng như khảo sát bước đầu của quá trình nghiên cứu phát sinh

hình thái cây Bá bệnh trong nuôi cấy in vitro, đặc biệt là sự phát sinh rễ bất định nguồn

nguyên liệu chính cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp

1.2 Yêu cầu của đề tài

Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng, nồng độ của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật (chất ĐHSTTV), điều kiện ánh sáng nuôi cấy đến sự phát sinh mô sẹo của nuôi cấy mẫu lá cây Bá bệnh

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu cấy từ mẫu lá cây Bá bệnh

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của 2,4-D; NAA; IBA và TDZ bổ sung vào môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy mẫu lá c ủa cây Bá bệnh

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của 2,4-D; NAA; IBA và TDZ bổ sung vào môi trường B5 (Gamborg và ctv, 1968) đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy mẫu

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack)

Loài : Eurycoma longifolia

Cây Bá bệnh có tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Thanh thất

(Simaroubaceae) Ngoài ra cây Bá bệnh còn có các tên gọi khác nhau như Bá bịnh, Bách bệnh, Mật nhân, Lồng bẹt, Nho nan (Tày), Tongkat Ali ở Malaysia, Pasakbumi hoặc Bidara Pahit ở Indonesia, Lan-don ở Thái Lan và tiếng Anh là Longjack

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Bá bệnh có mặt trong các khu r ừng tự nhiên ở các nước trong khu vực Đông Nam Á và một số khu vực lân c ận Phân bố rộng rãi từ Myanmar đến các nước Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, đảo Samatra, Bornco (Indonesia) và Philippin Loài này còn xuất hiện ở phía nam Trung Quốc, Ấn Độ (Đỗ Huy Bích và ctv, 2006)

Ở Việt Nam, cây Bá bệnh đã được phát hiện tại Vườn quốc gia Bái Tử Long từ năm 2000, đến năm 2006 các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và công bố cây Bá bệnh ở Việt Nam có tác dụng dược lý tương đương, có phần vượt trội so với cây có nguồn gốc từ các nước khác Cây Bá bệnh được phân bố rãi rác ở các tỉnh vùng núi thấp và trung du, tập trung ở các tỉnh Tây Nguyên và miền Trung được thấy nhiều hơn là ở các tỉnh phía Bắc

Hình 2.1 Cây Bá bệnh

(Viện Sinh Học Nhiệt Đới).

Hình 2.2 Bộ phận cây Bá bệnh.(a): Quả; (b): Hoa; (c): Rễ; (d): Thân (Viện Sinh Học Nhiệt Đới).

2.1.3 Đặc điểm thực vật

2.1.3.1 Đặc điểm sinh học

Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2006), cây Bá bệnh là cây thân gỗ nhỏ, có chiều cao trung bình từ 2 – 8 m Cây không có cành ho ặc ít phân cành và thường mọc dưới tán của những cây lớn Cây Bá bệnh là loài đơn tính khác gốc nên mỗi cây thường chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái

Lá cây có dạng hình kép, lông chim lẻ, mọc theo kiểu so le, gồm từ 21 – 25 lá chét không có cuống, mọc như sánh đôi nhau Lá cây có dạng hình mác hoặc bầu dục, với góc lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên lá có màu xanh sẵm bóng còn mặt dưới lá có màu trắng xám và có lông, cuống lá kép có màu nâu đỏ

Cây Bá bệnh có cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kép hoặc chùm rộng, cuống hoa có lông và có màu rỉ sắt Hoa có màu đỏ nâu, đài hoa được chia thành năm thùy hình tam giác; tràng hoa có năm cánh hình thoi, nhị có lông dày và hai vảy ở gốc, bầu

có 5 noãn, đầu nhụy rời

Quả có dạng hình trứng hơi dẹt, nhẵn, có rãnh dọc ỡ giữa dài từ 1  2 cm, ngang khoảng 0,5  1 cm, chứa một hạt, trên mặt hạt có nhiều lông ngắn Quả khi còn non có màu xanh và chuyển dần sang màu đỏ sẫm khi chín

Cây ra hoa thường là từ tháng 1 đến tháng 2 hàng năm và kết quả vào khoảng từ tháng 3 đến tháng 4 Cây thường bắt đầu ra quả sau 2 – 3 năm trồng và cây hoàn toàn trưởng thành sau 25 năm

2.1.3.2 Đặc điểm sinh thái, sinh trưởng và phát tri ển

Bá bệnh có thể được tìm thấy ở những khu rừng có độ cao lên đến 500 m trên mực nước biển Cây có thể chịu được bóng râm nên thường gặp ở dưới tán rừng còn tương đối nguyên sinh, rừng thứ sinh và đôi khi cả ở đồi cây bụi ở vùng trung du Cây mọc ở vùng đồi thường có chiều cao thấp, trong khi đó những cây mọc dưới tán rừng

ấm có thể cao tới 5 hoặc 7 m hoa quả nhiều Tuy ra hoa quả nhiều nhưng lượng cây con tái sinh từ hạt Bá bệnh khá hạn chế, do quả chín rụng vào mùa mưa thường bị lũ cuốn trôi mất Trong tự nhiên gặp nhiều cây chồi, điều đó chứng tỏ Bá bệnh có khả năng tái sinh tốt sau khi bị chặt phá (Đỗ Huy Bích và ctv, 2006)

2.1.4 Thành phần hóa học và công dụng

Các ho ạt chất của Bá bệnh tập trung hầu hết ở rễ Cho đến nay gần 65 hợp chất được tìm thấy ở rễ cây Bá bệnh, phần lớn trong các hoạt chất của này là các hợp chất quassinoid, triterpen, các alkaloid loại canthin, các alkaloid carbolin,… trong đó nổi bật là glycosaponin và eurypeptides có tác dụng làm tăng tiết testosterone nội sinh một cách tự nhiên ở động vật thí nghiệm và ở người

Từ nhiều năm qua các dân tộc Đông Nam Á cũng như Việt Nam đã sử dụng rễ của cây Bá bệnh để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau và được khoa học hiện đại lâm sàng chứng minh như chữa sốt rét, làm hạ sốt, giảm đau nhức, hạ cao huyết áp, chống nhiễm trùng da, nhiễm trùng đường ruột, giảm mệt mỏi tinh thần và thể chất, tăng sức chịu đựng và dẻo dai, giảm nguy cơ loãng xương ở người cao tuổi, tạo hồng cầu, cải

thiện tuần hoàn và tăng cường hệ miễn dịch, đặc biệt là tính tráng dương rất mạnh Trong những năm gần đây, một số phát hiện mới được công bố cho thấy cây Bá bệnh

có khả năng kháng tế bào ung thư, chố ng oxy hóa (chống lão hóa) và an thần

Công dụng chính từ các bộ phận của cây như quả dùng chữa lỵ Vỏ thân cây Bá bệnh được dùng để chữa các trường hợp ăn uống không tiêu, nôn mửa, đầy bụng, tiêu chảy, chữa sốt rét, giải độc do uống nhiều rượu và c hữa lưng đau mỏi do thấp Rễ dùng chữa sốt, ngộ độc, say rượu và tẩy giun Ngoài ra, trong rễ còn có chứa hợp chất được cho là có hoạt tính kích thích sinh dục nam bằng cách giúp cơ thể sản sinh nội tiết tố testosterone một cách tự nhiên sau khi được sử dụng Đây chính là tác dụng độc đáo và nổi bật nhất đang được nghiên cứu nhiều nhất ở cây Bá bệnh Lá nấu nước tắm chữa ghẻ lở, chàm ở trẻ em

2.2 Một số nghiên cứu về cây Bá bệnh

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2005, Hussein và ctv đã thành công trong việc hình thành lượng lớn chồi trong nuôi cấy chồi đỉnh cây Bá bệnh Kết quả tỷ lệ tái sinh của mẫu cấy cao nhất là 90% và số lượng chồi được hình thành nhiều nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 5,0 mg/l kinetin Rễ được cảm ứng hình thành sau 14 ngày nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản có bổ sung 0,5 mg/l IBA Cây được tái sinh từ nuôi cấy chồi đỉnh

trong nuôi cấy in vitro sau khi được chuyển ra ngoài môi trường đất tự nhiên thì cũng

không có sự khác biệt về hình thái so với cây mẹ sau khi được trồng 2 tháng

Năm 2006, Hussein và ctv đã thành công trong việc tạo chồi bất định từ nuôi cấy rễ và thân của cây Bá bệnh – một cây dược liệu nhiệt đới quan trọng Nhìn chung, mẫu thân nuôi cấy có khả năng tái sinh thấp khi chỉ có một mình cytokinin so với mẫu nuôi cấy là rễ Với mẫu nuôi cấy là mẫu rễ, môi trường tốt nhất được xác định môi trường Juglan medium (DKW) có bổ sung 1,0 mg/l kinetin kết hợp với 1,0 mg/l zeatin

Tỷ lệ phần trăm cao nhất tạo chồi là 90%, ngày bắt đầu hình thành chồi sớm nhất là 15 ngày nuôi c ấy, với số lá là 25,1  1,5; chiều dài thân là 3,1  0,5 cm Trong khi mẫu nuôi cấy là mẫu thân, môi trường nuôi cấy tốt nhất là DKW được bổ sung 2,0 mg/l BAP và 2,0 mg/l zeatin Tỷ lệ phần trăm cao nhất tạo chồi là 70%, ngày bắt đầu hình

thành chồi là 16 ngày, với số lá là 38,9  1,5; chiều dài thân là 4,3  0,5 cm Mẫu thân

và rễ sử dụng để nuôi cấy được lấy ở vị trí cách xa gốc 2,0 cm thì được xác định là vị trí phù hợp nhất để đạt được tỷ lệ tối đa của hình thành chồi bất định Rễ con được cảm ứng từ chồi bất định cũng được hình thành sớm nhất và nhiều nhất trên môi trường có MS cơ bản có bổ sung 0,5 mg/l IBA Chồi bất định hình thành từ mẫu rễ, tỷ

lệ phần trăm cao nhất của rễ con là 70% và thời gian để rễ con hình thành là 19 ngày,

sau hai tháng nuôi thì rễ có chiều dài là 7,0  1 cm Trong khi, chồi bất định hình thành từ mẫu thân, tỷ lệ phần trăm cao nhất của rễ con là 60%, thời gian hình thành rễ

con là sau 18 ngày, với chiều dài của rễ là 6,0  1,5 cm Khi cây con đã thích nghi với

điều kiện in vitro và không có sự khác biệt về hình thái so với cây mẹ thì sau hai tháng

có thể chuyển cây ra ngoài đất

Vào năm 2010, Mahmood và ctv đã báo cáo về việc cảm ứng tạo mô sẹo từ các

cơ quan của cây Bá bệnh Các cơ quan được sử dụng làm nguồn nguyên liệu như lá, cuống lá, cuống, thân, rễ chính, rễ xơ, lá mầm được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung các chất ĐHSTTV khác nhau như 2,4-D, IAA, NAA, picloram và dicamba Kết quả thu được, với mẫu cấy là mẫu lá auxin cho sự hình thành sẹo tốt nhất là 2,4-D với

tỷ lệ 81,76% ở nồng độ 1,0 mg/l Đối với mẫu cuống lá thì có hai loại auxin là 2,4-D

và picloram cho kết quả tốt nhất là 78,33% và cùng ở nồng độ là 4,0 mg/l Mẫu thân kết quả tốt nhất là 88,33% ở 2,0 mg/l 2,4-D Lá mầm thì kết quả là 85% ở 4,0 mg/l 2,4-D Ở các loại mẫu còn lại có tỷ lệ tạo mô sẹo tốt với các loại auxin sử dụng, trong

đó ở mẫu rễ thì không có sự tạo mô sẹo với IAA và NAA Qua các thí nghiệm cho thấy rằng sự hiện diện của 2,4-D là auxin phù hợp nhất cho việc cảm ứng mô sẹo và sự phát triển tùy từng loại mẫu mà tỷ lệ hình thành mô sẹo và nồng độ khác nhau

Năm 2012, Hussein và ctv đã công bố ảnh hưởng của auxin, nồng độ đường (sucrose) và nguồn carbon lên khả năng hình thành rễ bất định từ nuôi cấy mẫu lá của cây Bá bệnh Kích cỡ của mẫu cấy là 5 x 5 mm và môi trường khoáng được sử dụng là môi trường MS cơ bản Kết quả từ nghiên cứu này cho rằng loại auxin và nồng độ tốt nhất để cảm ứng tạo rễ bát định từ mẫu cấy được xác định là 3,0 mg/l NAA nồng độ này cho tỷ lệ hình thành rễ là 28,9% trên mẫu cấy và số rễ hình thành trên mẫu cấy là 3,5 và thời gian hình thành rễ là 20 ngày sau khi nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho kết quả ở nồng độ đường 50 g/l

có hiệu quả kích thích thình thành rễ bất định cao hơn so với nồ ng độ đường là 30 g/l,

tạo được số rễ là 3,2 trên mỗi mẫu cấy so với số rễ là 1,7 Ảnh hưởng của nguồn carbon được nghiên cứu thì cho thấy rằng môi trường được bổ sung sucrose ghi được

tỷ lệ mẫu cấy hình thành rễ là 42,2%; môi trường có bổ sung sucrose cho số rễ cao nhất là 3,0 trên mỗi mẫu cấy (Hussein và ctv, 2012)

Ngoài ra còn những nghiên cứu về các hợp chất trong cây có tác dụng dược lý như Miyake và ctv (2010) đã công bố hoạt tính gây độc đối với tế bào của quassinoids

từ Eurycoma longifolia Có 24 quassinoids cô lập từ Eurycoma longifolia Jack được

khảo sát là có khả năng gây độc với các tế bào ung thư khác nhau Erasmus và ctv

(1012) đã công bố ảnh hưởng của dịch chiết Eurycoma longifolia Jack (Tongkat ali)

lên tinh trùng của con người trong ống nghiệm

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Trong lúc thực hiện đề tài này, thì chưa có tài liệu nào nghiên cứu về cây Bá

bệnh trong in vitro mà chỉ có những công bố về thành phần hợp chất trong cây có tác

dụng dược lý Nghiên c ứu của các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội

năm 2006 Định tính và định lượng alkaloid có trong rễ cây Bá bệnh (Eurycoma

longifolia Jack) (Vũ Thị Phương Thảo, 2010)

2.3 Mô sẹo và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo

2.3.1 Mô sẹo và sự hình thành mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định

do không có nhu mô Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm các

tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ) khi nơi đó có vết cắt

Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy Tiếp đến tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối Cuối cùng tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Mô sẹo thường có màu

vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây,… hơn nữa hình thành vùng

mô phân sinh, trung tâm c ủa sự tạo nên chồi và rễ

Một vấn đề cần quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào Sự biến tính này xảy ra do độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể

có số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhất là chất ĐHSTTV

Mô sẹo được hình thành trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất ĐHSTTV Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất sinh trưởng thêm vào có khác nhau Chất ĐHSTTV thường tổ hợp thành 4 nhóm: auxin; cytokinin; auxin kết hợp cytokinin; dịch chiết

Sau khi mô sẹo hình thành sẽ được cấy truyền, lên môi trường cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất sinh trưởng được giảm nồng độ Kích thước tách

mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô sẹo có kích thước

5 – 10 mm và có trọng lượng 20 – 100 mg, thời gian giữa 2 lần cấy truyền là 20 – 30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào: loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng; loại

tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đ ậm đặc Mô sẹo cấy truyền càng nhiều lần khả năng tái sinh càng gi ảm (Trần Văn Minh, 1997)

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo

2.3.2.1 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Auxin là một nhóm chất ĐHSTTV được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong nuôi cấy mô để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi c ấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng ho ặc sự phát triển cần nghiên cứu Hàm lượng auxin nội sinh trong mẫu cấy Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ: tuổi của cây mẹ, vị trí thu mẫu cấy, thời gian thu mẫu trong năm Khả năng tổ ng hợp auxin tự nhiên của mẫu

cấy Sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh (Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Auxin thường là nguyên nhân: của sự kích thích s ự tăng trưởng, kéo dài tế bào và sự trương của mô; có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào (cảm ứng mô sẹo)

và cảm ứng của rễ bất định; ức chế sự hình thành của chồi bất định và chồi nách; thường phát sinh phôi trong nuôi cấy huyền phù Với nồng độ thấp auxin sẽ kích thình hình thành mô sẹo và không có khả năng c ảm ứng tạo rễ bất định (Pierik, 1998)

Ảnh hưởng của auxin trong nuôi cấy tế bào thực vật

Cảm ứng sự tăng trưởng của mô sẹo: auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy Loại auxin thường được sử dụng cho mục đích này là 2,4-D, nhưng nếu tiếp tục duy trì mô sẹo trong môi trường có 2,4-

D này thì tế bào dễ bị đột biến Vì vậy, người ta có thể cảm ứng sự tạo mô sẹo bằng NAA hay IAA hoặc sau khi c ảm ứng mô sẹo bằng 2,4-D thì mẫu cấy sẽ chuyển sang môi trường có NAA hoặc IAA Để cảm ứng mô sẹo từ mẫu cấy của cây lá rộng, người

ta thường dùng 2,4-D với nồng độ từ 1,0 – 3,0 mg/l Cần chú ý là để cảm ứng mô sẹo

từ cây hai lá mầm, thường kết hợp auxin với cytokinin, nhưng cytokinin thì l ại không cần thiết trong sự tạo mô sẹo từ cây một lá mầm và auxin phải được sử dụng với một nồng độ cao như 2,0 – 10,0 mg/l (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Ngoài ra auxin còn có ảnh hưởng khác như ảnh hưởng lên sự phát sinh hình thái (sự tạo chồi hay rễ), ảnh hưởng lên phát sinh phôi soma Nồ ng độ của auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự phát sinh phôi soma từ các tế bào có khả năng sinh phôi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Auxin được phân loại thành 2 nhóm là auxin tự nhiên và auxin nhân tạo Auxin tự nhiên như 3-indol-acetic acid (IAA) đây là auxin được biết đến chủ yếu,

có tác động sinh lý nổi bật nhất trong các loại auxin tự nhiên Ngoài ra còn có các loại khác như: 4-cloroindol-3-axetic acid (A4-Cl-IA) và indol-3-butyric acid (AIB) Auxin nhân t ạo đây là lo ại auxin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi c ấy mô tế bào thực vật như indol-3-butyric acid (IBA), naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4 -dichlorophenoxyacetix acid (2,4-D) Ngoài ra còn có một số auxin khác ít được sử dụng hơn như (2,4,5-trichlorophenoxy) acetic acid (2,4,5-T); 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CP A); 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MPCA) ; 2-naphthyloxyacetic

acid (NOA); 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba); trichloropicolinic acid (picloram)

4-amino-3,5,6-Tính ổn định trong môi trường nuôi c ấy: IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt độ

và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA không ổn định trong môi trường nuôi cấy cho dù nó được lọc qua màng lọc vô trùng Nồng độ của IAA có thể giảm đi

10 lần trong 4 tuần nuôi cấy ở trong tối nếu không được bổ sung thêm Tốc độ phân hủy của auxin ở ngoài sáng nhanh hơn đ ặc biệt trong môi trường MS Trong môi trường MS lỏng ở nhiệt độ 25C, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, IAA nồng độ 10

M (1,75 mg/l) sẽ giảm ít hơn giới hạn được nhận biết là 0,05 mg/l trong 14 ngày IBA

ổn định trong môi trường hơn là IAA, nồng độ IBA giảm đi 25% sau 30 ngày trong tối, 60% sau 30 ngày ngoài sáng Các loại auxin khác như NAA và 2,4-D không bị biến tính trong môi trường nuôi cấy nhưng một khi đã được mô tế bào thực vật hấp thu vào thì tốc độ phân tách xảy ra nhanh không chỉ do tác nhân vật lý mà còn do tác động của các enzyme (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Các loại auxin thường được sử dụng trong nuôi c ấy mô thực vật

Trong thực vật IAA được tổng hợp từ tryptophan và được sản xuất tại mô phân sinh chồi ngọn nhưng thường lại góp phần vào sự hình thành và phát triển của rễ (Sathyanarayana và Varghese, 2007) IAA được sử dụng trong nuôi cấy mô nhưng nó lại dễ bị biến tính trong môi trường nuôi cấy và nhanh chóng thoái biến trong mô Tuy nhiên, những đặc tính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây IAA (cùng với cytokinin) sau khi cảm ứng sự hình thành mô sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phôi khi hàm lượng của auxin trong mô giảm IAA thường được sử dụng phối hợp với các chất ĐHSTTV khác để kích thích sự phát sinh hình thái trực tiếp và trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chồi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Trong nuôi cấy mô thì IAA thường được bổ sung vào trong môi trường ở nồ ng độ từ 0,01 – 10,00 mg/l (Pierik, 1998) Nhưng IAA không được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật do dễ bị phân hủy trong quá trình nuôi mẫu

2,4-D thường sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứng sự tạo mô sẹo, huyền phù tế bào và nó sẽ được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) IBA và NAA là loài auxin được sử dụng phổ biến cho sự hình thành rễ và khi kết hợp thêm với một số cytokinin

thì thích hợp cho việc phát sinh chồi trong nuôi cấy, còn 2,4-D và 2,4,5-T thì rất có hiệu quả cho việc cảm ứng tạo mô sẹo (Sathyanarayana và Varghese, 2007) Tương tự như IAA thì các auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D) cũng được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy ở nồng độ từ 0,01 – 10,00 mg/l (Pierik, 1998)

Cytokinin là một nhóm các phenyl urea dẫn xuất của adenine, các cytokinin được xác định đầu tiên vào năm 1913 Cytokinin chủ yếu liên quan tới phân chia tế bào, cảm ứng hình thành chồi (Sathyanarayana và Varghese, 2007) Chúng thường được hòa tan trong dung dịch HCl hoặc NaOH đã được pha loãng Tỷ lệ auxin và cytokinin là quan trọng đối với phát sinh hình thái trong hệ thống nuôi cấy mô Đối với cảm ứng tạo phôi, cảm ứng mô sẹo và cảm ứng rễ thì đòi hỏi tỷ lệ của auxin cao hơn cytokinin trong khi ngược lại sẽ phát sinh chồi (Sathyanarayana và Varghese, 2007)

Năm 1998, Pierik cho rằng các loại cytokinin thường được sử dụng phổ biến

để kích thích tế bào tăng trưởng và phát triển Chúng thúc đẩy sự phân chia tế bào, đặc biệt nếu thêm vào cùng với một auxin Trong môi trường nuôi cấy cytokinin ở nồng độ cao (1,0 – 10,0 mg/l) có thể cảm ứng sự hình thành chồi, nhưng lại ức chế việc hình thành rễ Các cytokinin thúc đẩy hình thành chồi nách bằng cách giảm ưu thế chồi ngọn và chúng làm chậm quá trình lão hóa

Cytokinin được phân thành 2 lo ại là cytokinin tự nhiên và cytokinin tổng hợp Các cytokinin tự nhiên được biết đến trong nuôi c ấy mô như: 4-hydroxy-3-methyl—trans-2-butenylaminopurine ho ặc 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl)-aminopurine ho ặc 2-methyl-4-(1H-purine-6-ylamino)-2-buten-1-ol (zeatin), N6-(2-isopentyl)adenine hoặc N6-( 2

-isopentenyl)adenosine hoặc butenylamino)purine hoặc 6-(,-dimethylallylamino)purine (2iP hay IPA), 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl)aminopurine (dihydrozeatin) Tuy nhiên chúng ít được sử dụng trong nuôi cấy mô vì giá thành cao Các cytokinin tổng hợp: 6-furfurylaminopurine hoặc N-(2-furanylmethyl)-1H-purin(e)-6-amine (kinetin), 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine ho ặc N-(phenylmethyl)-1H-purin(e)-6-amine (BAP hay BA), 1-phenyl-3-(1,2,3 thiadiazol-5-yl) (TDZ)

6-(3-methyl-2-Ngày nay, người ta cho rằng kinetin không phải là chất tự nhiên mà nó được tạo thành do sự tái sắp xếp lại cấu trúc của một hợp chất khác, có ít nhất hai loại

cytokinin tự nhiên có cấu trúc tương tự như c ấu trúc của kinetin đã được xác định, đó

là những hợp chất tự do hay những hợp chất có gắn với nhóm glucoside hoặc riboside

Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong hình thành mô sẹo:

Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường tạo bướu ở các mô cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), sự tạo rễ bất định và sự phát sinh phôi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1998)

Auxin được sử dụng để tạo mô sẹo với loại và nồng độ thay đổi khác nhau tùy thuộc vào vật liệu được dùng trong nuôi cấy Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song

tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có

sự phối hợp giữa cytokinin và auxin

Trong tăng trưởng mô sẹo và phát sinh hình thái từ mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại và nồng độ của chất ĐHSTTV hiện diện trong môi tường nuôi cấy Qua thí nghiệm cho thấy nếu môi trường có auxin cao thì mô sẹo tăng nhanh, nếu chuyển sang môi trường không có auxin mà có đầy đủ chất dinh dưỡng thì mô sẹo tăng sinh rất chậm Còn nếu giữ nguyên lo ại và nồ ng độ của auxin nhưng thay đổi cytokinin trong môi trường nuôi cấy thì việc phát sinh hình thái cũng có sự thay đổi Trong đa số các trường hợp, sự hiện diện của BAP trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và có khả năng sinh phôi; mô sẹo trên môi trường có sự hiện diện của kinetin có dạng bở và thường không có khả năng sinh phôi Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo

có dạng nốt và chắc (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

2.3.2.2 Vai trò của cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng đến sự hình thành mô sẹo

Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo dưới tác động thích hợp nào đó và chỉ có rất ít cơ quan thực vật không thể hiện được khả năng này Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào tình trạng sinh lý, sinh hóa và kiểu gen Sự tăng sinh c ủa mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất ĐHSTTV ngo ại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Vai trò của lo ại cơ quan thực vật thường sử dụng để tạo mô sẹo: người ta có thể tạo được mô sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật Tuy

nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất ĐHSTTV với loại

và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan thực vật đó Các mô và các cơ quan khác nhau của một thực vật có thể được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo như rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chưa trưởng thành, phôi hợp tử trưởng thành, tượng tầng libe-mộc…

Vai trò của tuổi cơ quan thực vật trong sự tạo mô sẹo: tuổi của những mảnh

mô hay cơ quan có ảnh hưởng rất lớn trong khả năng tạo mô sẹo Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo Ngược lại, cây non (còn nguyên vẹn hay cắt đoạn) hay những mảnh thân còn rất non c ủa cây trưởng thành có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất ĐHSTTV, đặc biệt là auxin

Vai trò của ánh sáng trong quá trình t ạo mô sẹo: tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo Trong đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt là đối với mẫu lá (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành trong thời gian 5 tháng, từ ngày 14/01/2012 đến ngày 30/6/2012, tại Phòng công nghệ thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP.6, P Linh Trung, Quận Thủ Đức, TP.HCM

Dụng cụ: dao cấy, kẹp cấy, kéo, đèn cồn, đĩa cấy, bông gòn, ống đong các loại

1000 ml, 100 ml, 50 ml, 10 ml; pipetman 1000 l, erlen,…

3.2.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm

Hóa chất: javel 25%, thủy ngân clorua (HgCl2) 0,1%, cồn 96, cồn70, agar (Công ty cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quảng Ninh), đường sucrose (Công ty cổ phần Đường Biên Hòa, Đồng Nai), các hóa chất pha môi trường (phụ lục), NaOH, HCl, nước cất vô trùng, các chất ĐHSTTV,…

Môi trường thí nghiệm: môi trường MS, B5, DKW được bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và chất ĐHSTTV Môi trường được điều chỉnh pH nằm trong

khoảng 5,7 – 5,8 bằng NaOH và HCl trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 121C, 1atm trong 20 phút Tùy theo các nghiệm thức của từng thí nghiệm mà bổ sung vào môi trường chất ĐHSTTV gồm 2,4-D; NAA; IBA; TDZ; kinetin và BA theo nồng độ thích hợp ở dạng riêng lẻ hay kết hợp

3.2.4 Điều kiện thí nghiệm

Mẫu cấy được nuôi trong tối và nuôi trong sáng với cường độ là 2500 lux, thời gian chiếu sáng 12 h/ngày

Nhiệt độ: 26  2C

Độ ẩm: 70 – 80%

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát chế độ khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá cây Bá bệnh

Mục đích: xác định loại chất khử trùng là javel 25% ho ặc HgCl2 0,1% và thời gian khử trùng mẫu tốt nhất

Cách tiến hành: mẫu lá được lấy từ vườn ươm được rửa bằng nước xà phòng loãng trong 15 – 20 phút sau đó rửa sạch lại với nước rồi đặt ở dưới vòi nước chảy nhỏ trong 15 – 30 phút trước khi đưa vào tủ cấy Mẫu lá sẽ được khử trùng với chế độ khử

trùng là lắc trong cồn 70 trong 30 giây, rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần, tiếp theo mẫu được lắc với javel 25% ho ặc HgCl2 0,1% theo các nghiệm thức được trình bày trong bảng 3.1 và rửa sạch lại bằng nước vô trùng 5 lần

Cách c ắt mẫu: mẫu lá sau khi khử trùng sẽ loại bỏ các phần hư hại do quá trình khử trùng Sau đó được cắt với kích thước 3 x 6 mm, dùng đường gân chính của lá làm trục đối xứng; đ ặt ngửa mẫu lên môi trường nuôi cấy

Bảng 3.1 Nghiệm thức chế độ khử trùng mẫu cấy lá cây Bá bệnh

Nghiệm thức

Thời gian khử trùng (phút) Javel 25% HgCl2 0,1%

Chế độ khử trùng tốt nhất sẽ được sử dụng để khử trùng mẫu cho các thí nghiệm tiếp theo trong báo cáo

Chỉ tiêu theo dõi: thời gian theo dõi 30 ngày sau khi cấy mẫu

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%): là tỷ lệ mẫu bị nhiễm sau khử trùng so với tổng số mẫu cấy ban đầu

Tỷ lệ mẫu sống (%): là tỷ lệ mẫu sống và không bị nhiễm sau khi khử trùng so với tổng số mẫu cấy ban đầu

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng c ủa chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy

Mục đính: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất 2,4-D; NAA; IBA và TDZ đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá cây Bá bệnh, được bổ sung vào môi trường khoáng MS cơ bản ở dạng đơn chất

Cách tiến hành: mẫu cấy được khử trùng với chế độ khử trùng là kết quả của thí nghiệm 1 và cắt với kích thước 3 x 6 mm, đặt ngửa lên môi trường

Bảng 3.2 Nghiệm thức các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường MS

Nồng độ (mg/l)

Nghiệm thức

Nồng độ (mg/l)

Nghiệm thức

Nồng độ (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi: thời gian theo dõi là 45 ngày sau khi c ấy mẫu

Đặc điểm hình thái của mô sẹo: vị trí hình thành mô sẹo, màu sắc mô sẹo (trắng nâu, vàng,…), độ chắc/xốp của mô sẹo

Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo: là tỷ lệ mẫu tạo sẹo sau khi nuôi cấy so với tổng

số mẫu ban đ ầu

Trọng lượng tươi mẫu: là trọng lượng của của mô sẹo kể cả mẫu cấy ban đ ầu

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng c ủa chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy

Mục đính: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất 2,4-D; NAA; IBA và TDZ đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá của cây Bá bệnh, được bổ sung vào môi trường khoáng B5 ở dạng đơn chất

Cách tiến hành: mẫu cấy được khử trùng với chế độ khử trùng là kết quả của thí nghiệm 1 và cắt với kích thước 3 x 6 mm, đặt ngửa lên môi trường

Môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường khoáng B5, bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và một trong các loại chất ĐHSTTV 2,4-D; NAA; IBA hay TDZ với nồng độ theo các nghiệm thức được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Nghiệm thức các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường B5

Nồng độ (mg/l)

Nghiệm thức

Nồng độ (mg/l)

Nghiệm thức

Nồng độ (mg/l) BD0 0,0 BN0 0,0 BI0 0,0 BT0 0,0 BD1 0,5 BN1 0,5 BI1 0,5 BT1 0,1 BD2 1,0 BN2 1,0 BI2 1,0 BT2 0,2 BD3 1,5 BN3 1,5 BI3 1,5 BT3 0,4 BD4 2,0 BN4 2,0 BI4 2,0 BT4 0,6 BD5 2,5 BN5 2,5 BI5 2,5 BT5 0,8 BD6 3,0 BN6 3,0 BI6 3,0 BT6 1,0

Chỉ tiêu theo dõi: đặc điểm hình thái của mô sẹo; tỷ lệ hình thành mô sẹo; trọng lượng mẫu sau 45 ngày nuôi cấy tương tự như thí nghiệm 2

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng c ủa chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên môi trường DKW đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy

Mục đính: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất 2,4-D; NAA; IBA và TDZ đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá của cây Bá bệnh, được bổ sung vào môi trường khoáng DKW ở dạng đơn chất

Cách tiến hành: mẫu cấy được khử trùng với chế độ khử trùng là kết quả của thí nghiệm 1 và cắt với kích thước 3 x 6 mm

Môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường khoáng DKW, bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và một trong các loại chất ĐHSTTV 2,4-D; NAA; IBA hay TDZ với nồng độ theo các nghiệm thức được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Nghiệm thức các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường DKW

Nồng độ (mg/l)

Nghiệm thức

Nồng độ (mg/l)

Nghiệm thức

Nồng độ (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi: đặc điểm hình thái của mô sẹo; tỷ lệ hình thành mô sẹo; trọng

lượng mẫu sau 45 ngày nuôi cấy tương tự như thí nghiệm 2

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D; NAA kết hợp với kinetin; BA trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy

Mục đính: khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp giữa 2,5 mg/l 2,4-D và 2,5 mg/l NAA với kinetin; BA đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá của cây Bá bệnh trên môi trường khoáng MS

Cách tiến hành: mẫu cấy được khử trùng với chế độ khử trùng là kết quả của thí nghiệm 1 và cắt với kích thước 3 x 6 mm

Môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường khoáng MS, bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 2,5 mg/l 2,4-D hay 2,5 mg/l NAA kết hợp với kinetin hay BA ở nồng độ được bổ sung theo các nghiệm thức trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Nghiệm thức các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường MS

2,4-D (mg/l)

NAA (mg/l)

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Chế độ khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá cây Bá bệnh

Trong các chất khử trùng mẫu thì javel là một chất rẻ tiền, ít độc hại, trong khi đó HgCl2 là một chất khử trùng tốt nhưng có khả năng gây độc cho người Do đó chúng tối tiến hành thí nghiệm với 2 loại chất khử trùng này nhằm tìm ra chế độ khử trùng thích hợp nhất đối với mẫu cấy lá cây Bá bệnh Kết quả được ghi nhận sau 30 ngày nuôi c ấy thể hiện ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian và chất khử đến mẫu cấy lá cây Bá bệnh

Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Javel 25% HgCl2 0,1% Sl gốc Sl biến đổi Sl gốc Sl biến đổi

4.2 Ảnh hưởng của CĐHSTTV trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá cây Bá bệnh

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của 2,4-D trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của

mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy

Nghiệm thức

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Trọng lượng tươi (mg)

Sáng Tối

Sl gốc Sl biến đổi Sl gốc Sl biến đổi

MD1 16,7 23,8d 66,7 54,8c 12,5i 18,9hi MD2 16,7 23,8d 66,7 54,8c 12,6i 29,7gh MD3 66,7 54,8c 100 89,0a 32,3fg 62,8cd MD4 79,2 63,1b 100 89,0a 41,9ef 68,8bc

MD6 83,5 66,2b 100 89,0a 51,9de 50,6e

Các chữ cái a, b, c,… thể hiện sự khác biệt của các kết quả ở cả 2 điều kiện nuôi mẫu sáng

và tối có ý nghĩa ở mức p = 0,01 trong phép thử LSD

Kết quả sau 45 ngày nuôi cấyở nghiệm thức đối chứng (ĐCM) thì mẫu cấy không

có sự hình thành mô sẹo trên môi trường khoáng MS Ở tất cả các nghiệm thức có bổ sung 2,4-D mẫu cấy đều có khả năng tạo sẹo Tỷ lệ mẫu tạo sẹo và trọng lượng tươi của mẫu có sự khác biệt về mặt thống kê ở các nghiệm thức khảo sát Mô sẹo được hình thành tốt hơn khi mẫu được nuôi ở điều kiện tối với tỷ lệ mẫu tạo sẹo trung bình đều đạt trên 60% ở tất cả các nồng độ khảo sát Trong khi với điều kiện nuôi cấy sáng thì mẫu cấy có phát sinh sẹo đạt trên 60% chỉ trong khoảng nồng đô 1,5 mg/l đến 3 mg/l Nghiệm thức bổ sung 2,5 mg/l 2,4-D (MD5) cho tỷ lệ mẫu tạo sẹo đạt 100% ở cả điều kiện nuôi cấy sáng và tối Còn các nghiệm thức MD3, MD4, MD6 với nồng độ 2,4-D lần lượt là 1,5 mg/l, 2,0 mg/l và 3,0 mg/l cũng cho tỷ lệ mẫu tạo sẹo là 100% ở điều kiện nuôi cấy tối và giá trị thấp hơn ở điều kiện nuôi cấy sáng

Đồng thời với sự gia tăng tỷ lệ mẫu tạo sẹo, trọng lượng tươi của mẫu cũng tăng khi nồng độ của 2,4-D được bổ sung vào môi trường tăng lên và đ ạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức MD5 có bổ sung 2,5 mg/l 2,4-D lần lượt ở điều kiện sáng và tối là 87,4

mg và 98,8 mg Kết quả này có sự khác biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức

khảo sát còn lại ở cùng điều kiện nuôi cấy Trọng lượng tươi của mẫu khi nuôi trong tối cho kết quả cao hơn khi mẫu nuôi ở điều kiện sáng (bảng 4.2)

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của NAA trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của

mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy

Các chữ cái a, b, c,… thể hiện sự khác biệt của các kết quả ở cả 2 điều kiện nuôi mẫu sáng

và tối có ý nghĩa ở mức p = 0,01 trong phép thử LSD

Kết quả sau 45 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA mẫu cấy đều

có khả năng hình thành mô sẹo ở các nghiệm thức trừ nghiệm thức MN1 được nuôi ở điều kiện sáng Tỷ lệ mẫu tạo sẹo ở điều kiện nuôi cấy tối cao hơn ở điều kiện nuôi cấy sáng, song sự khác biệt là không đáng kể ở cùng nghiệm thức Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trung bình ở cả hai điều kiện nuôi cấy mẫu cho kết quả thấp Ở nghiệm thức MN5 bổ sung 2,5 mg/l NAA thì có tỷ lệ mẫu tạo sẹo cao nhất trong các nghiệm thức là 75% ở điều kiện nuôi tối Đây cũng là nồng độ có tỷ lệ mẫu tạo sẹo lớn nhất ở điều kiện sáng là 66,7% Trọng lượng tươi của mẫu có sự khác biệt về mặt thống kê nhưng các giá trị không có sự khác biệt quá lớn Trọng lượng của mẫu cũng không có nhiều khác biệt ở

2 điều kiện nuôi cấy mẫu, duy chỉ có nghiệm thức bổ sung 2,5 mg/l NAA (MN5) thì trọng lượng tươi của mẫu sau 45 ngày nuôi cấy có giá trị lớn nhất trong các nghiệm thức khảo sát và có khác biệt với nhau về mặt thố ng kê (trọng lượng tươi ở điều kiện sáng là 15,9 mg và điều kiện tối là 20,5 mg) Nhưng kết quả này thấp hơn môi trường

có bổ sung 2,5 mg/l 2,4-D kho ảng 4,8 lần

Ngoài 2,4-D, NAA và TDZ thì IBA cũng được sử dụng làm chất cảm ứng tạo sẹo trong thí nghiệm này với các nồng độ khảo sát tương tự 2,4-D và NAA Nhưng ở tất cả các môi trường có bổ sung IBA thì mẫu cấy đều không có khả năng hình thành mô sẹo trong thời gian khảo sát Mẫu cấy hóa nâu ở điều kiện nuôi mẫu sáng và có màu xanh

ở điều kiện nuôi tối (hình 4.1)

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của TDZ trên môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu

cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy

Các chữ cái a, b, c,… thể hiện sự khác biệt của các kết quả ở cả 2 điều kiện nuôi mẫu sáng

và tối có ý nghĩa ở mức p = 0,01 trong phép thử LSD

Môi trường bổ sung TDZ sau 45 ngày nuôi cấy, mẫu đều có khả năng hình thành

mô sẹo ở các nghiệm thức khảo sát Kết quả khi nuôi mẫu ở điều kiện tối cho tỷ lệ hình thành sẹo và trọng lượng tươi của mẫu cao hơn nhiều khi nuôi mẫu ở điều kiện sáng Về tỷ lệ mẫu tạo sẹo ở điều kiện nuôi là tối cao hơn nuôi mẫu ở sáng là kho ảng 3,8 lần và cao nhất là ở nồ ng độ 1,0 mg/l TDZ là 5,7 lần Tuy nhiên ở nồng độ 0,6 mg/l lại cho tỷ lệ hình thành sẹo cao nhất là 100% ở điều kiện tối và cũng có sự khác biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại ở cả 2 điều kiện nuôi cấy Trọng lượng tươi của mẫu khi nuôi ở điều kiện sáng không có sự khác biệt về mặt thống kê

so với nghiệm thức đối chứng (ĐCM) Và kết quả này cũng thấp hơn khi mẫu được nuôi ở điều kiện tối trung bình là 8,9 lần, cao nhất là 15,1 lần nghiệm thức MT4 bổ sung 0,6 mg/l TDZ Ở nghiệm thức MT4 này trọng lượng tươi của mẫu cũng cho kết quả cao nhất là 266,5 mg (bảng 4.4)

Bảng 4.5 Ảnh hưởng c ủa một số chất ĐHSTTV trên môi trường MS đến sự phát sinh

mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy ở điều kiện tối

Chất ĐHSTTV Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%)

lệ mẫu tạo sẹo tốt nhất đạt 100% Trọng lượng tươi của mẫu đ ạt tốt nhất ở 0,6 mg/l TDZ là 266,5 mg Tuy nghiên mô sẹo hình thành trên môi trường có TDZ cho sẹo chắc không thích hợp cho nuôi c ấy huyền phù

Quan sát sự phát sinh của mẫu cấy trong thời gian khảo sát, mô sẹo hình thành sớm nhất trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D sau khoảng 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ Đây cũng là môi trường có tỷ lệ mẫu hình thành sẹo cao ở nhiều nghiệm thức

so với môi trường có bổ sung các chất ĐHSTTV khác được sử dụng trong thí nghiệm Các môi trường có bổ sung NAA và TDZ có sự cảm ứng tạo sẹo chậm hơn lần lượt là sau kho ảng 10 và 13 ngày nuôi cấy Kết quả này tương đồng với báo cáo của Mahmood và ctv (2010) về khảo sát ảnh hưởng của auxin lên khả năng hình thành mô sẹo từ các cơ quan khác nhau của cây Bá bệnh Trong báo cáo này, Mahmood đã tiến hành khảo sát trên nhiều loại mẫu cấy khác nhau với nhiều loại chất cảm ứng Kết quả

mà ông ghi nhận được với mẫu cấy từ lá khi c ảm ứng với chất ĐHSTTV là 2,4-D cũng cho tỷ lệ tạo sẹo cao nhất so với các chất cảm ứng khác cùng khảo sát (81,67%)

Trong thí nghiệm mẫu cấy cho tỷ lệ mẫu tạo sẹo và trọng lượng tươi của mẫu đều tốt hơn khi mẫu được nuôi ở trong tối Trong điều kiện nuôi cấy thì mẫu nuôi cấy trong điều kiện tối thường cho khả năng tạo mô sẹo tốt hơn khi nuôi mẫu ở sáng và đặc biệt là mẫu lá (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Mô sẹo hình

thành tại vết cắt phần gân chính của mẫu cấy từ lá cây Bá bệnh, sau đó tiếp tục hình thành ở những vết cắt khác của mẫu cấy Trên môi trường bổ sung 2,4-D mẫu cấy cho

mô sẹo có màu vàng nhạt, xốp và bở; môi trường bổ sung NAA mẫu cấy sau khi hình thành mô sẹo thì mô sẹo không có sự phát triển, điều này chứng tỏ vì sao trọng lượng tươi của mẫu không có sự khác biệt so với mẫu đối chứng; mẫu cấy trên môi trường bổ sung TDZ cho mô sẹo có màu vàng, chắc (hình 4.1)

Hình 4.1 Mẫu cấy sau 45 ngày trên môi trường MS

(a), (b): Mẫu nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D và tối; (c), (d): Mẫu nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D sáng; (e), (f): Mẫu nuôi cấy trên môi trường bổ sung NAA tối và sáng; (g), (h): Mẫu nuôi trên môi trường bổ sung IBA tối và sáng; (i), (j): Mẫu nuôi trên môi trường

bổ sung TDZ tối và sáng; Nồng độ 2,4-D, NAA, IBA bổ sung theo thứ tự là 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/l; Nồng độ TDZ bổ sung theo thứ tự là 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l.

Môi trường MS là môi trường cơ bản phù hợp cho nhiều đối thực nuôi cấy khác nhau, do đây là môi trường giàu chất dinh dưỡng và cũng đã được Hussenin và ctv (2005), Mahmood và ctv (2010) sử dụng trong nuôi cấy cây Bá bệnh Trong các chất ĐHSTTV được sử dụng thì 2,4-D và TDZ cho khả năng cảm ứng tạo mô sẹo tốt vì đây

là chất cảm ứng tạo mô sẹo mạnh Trong khi NAA và IBA thì thích hợp cho việc cảm ứng tạo rễ bất định Với 2 môi trường cảm ứng tạo sẹo hiệu quả nhất trong thí nghiệm này thì sẹo hình thành l ại có đặc điểm khác nhau Môi trường bổ sung TDZ mẫu cấy

có trọng lượng tươi lớn nhưng sẹo hình thành là sẹo chắc Trong khi môi trường có chất cảm ứng là 2,4-D cho sẹo bở, đây là lo ại sẹo thích hợp làm nguyên liệu cho nuôi cấy dịch treo tế bào cho việc sản xuất hợp chất thứ cấp

4.3 Ảnh hưởng c ủa CĐHSTTV trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy lá cây Bá bệnh

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của 2,4-D trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu

cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy

Các chữ cái a, b, c,… thể hiện sự khác biệt của các kết quả ở cả 2 điều kiện nuôi mẫu sáng và tối có ý nghĩa ở mức p = 0,01 trong phép thử LSD

Kết quả sau 45 ngày nuôi cấy ở nghiệm thức đối chứng (ĐCB) mẫu cấy không

có khả năng hình thành sẹo ở cả hai điều kiện nuôi cấy Các nghiệm thức có bổ sung 2,4-D mẫu cấy đều có khả năng tạo mô sẹo ở tất cả nghiệm thức ở cả 2 điều kiện nuôi cấy Kết quả có sự khác biệt về mặt thống kê ở các nghiệm thức nhưng tỷ lệ mẫu tạo sẹo và trọng lượng tươi của mẫu có giá trị thấp hơn khi nuôi mẫu trên môi trường MS

ở cùng điều kiện Mẫu cấy tạo mô sẹo tốt hơn khi được nuôi ở điều kiện tối, tuy nhiên

trọng lượng tươi của mẫu thì không có khác biệt nhiều ở hai điều kiện nuôi cấy Tỷ lệ mẫu tạo sẹo cao nhất là 79,2% ở nghiệm thức BD3 có ở điều kiện tối Trọng lượng tươi của mẫu tốt nhất là 21,3 mg ở nghiệm thức BD3 ở điều kiện sáng, không có sự khác biệt so với 20,5 mg ở nghiệm thức BD5 ở điều kiện tối (bảng 4.6)

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của NAA trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu

cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy

tỷ lệ mẫu tạo sẹo rất cao là 100% ở cả 2 điều kiện nuôi cấy Ngoài ra ở điều kiện tối thì các nghiệm thức BN2 và BN3 cũng cho tỷ lệ mẫu tạo sẹo là 100% Các mẫu khi nuôi

ở điều kiện tối cho kết quả tốt hơn khi nuôi mẫu ở điều kiện sáng Trọng lượng tươi của mẫu cấy khi được nuôi ở điều kiện tối cho kết quả cao hơn khi ở cùng nghiệm thức Trọng lượng tăng khi tăng nồng độ NAA bổ sung vào môi trường nuôi cấy và đạt trọng lượng cao nhất ở nồng độ 2,5 mg/l là 143,1 mg ở điều kiện tối Kết quả này cũng

có sự khác biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại ở cả 2 điều kiện nuôi cấy Mẫu cấy ngoài khả năng hình thành mô sẹo, còn có sự hình thành của rễ bất định

ở các nồng độ khác nhau ở cả 2 điều kiện nuôi cấy sau khoảng 21 ngày nuôi cấy, nhưng mẫu nuôi ở điều kiện tối cho chiều dài rễ tốt hơn (hình 4.2)

Năm 2012, Hussein và ctv đã báo cáo việc cảm ứng rễ từ mẫu lá của cây Bá bệnh trên môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l NAA Trong báo cào này thì mẫu tạo rễ trên môi trường B5 có bổ sung NAA ở nồng độ thấp hơn 3,0 ng/l NAA cũng đã được

sử dụng để cảm ứng tạo rễ bất định từ mẫu lá của cây Morinda citrifolia (Abdullahil Baque và ctv, 2010), cây Gynura procumbens (Saiman và ctv, 2012)

Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung IBA thì mẫu cấy không có khả năng hình thành mô sẹo trong thời gian khảo sát Tương tự như trên môi trường khoáng MS

cơ bản, mẫu cấy có màu nâu sau 45 ngày nuôi cấy ở điều kiện sáng và có màu xanh khi mẫu nuôi ở điều kiện tối (hình 4.6)

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của TDZ trên môi trường B5 đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu

cấy lá sau 45 ngày nuôi cấy

sự khác biệt ở các nghiệm thức khảo sát, nhưng không có sự khác biệt khi mẫu nuôi ở

2 điều kiện sáng và tối của cùng nồng độ Tỷ lệ mẫu đạt cao nhất là 87,5% ở nồng độ 0,8 mg/l ở điều kiện sáng, không có sự khác biệt khi nuôi mẫu ở điều kiện tối cùng nồng độ là 79,2% Tuy nhiên khi nồng độ TDZ bổ sung vào môi trường cao làm trọng lượng tươi của mẫu cấy có chiều hướng giảm xuống Trọng lượng tươi của mẫu đạt giá trị cao hơn khi nuôi trong điều kiện tối so với điều kiện sáng ở cùng nghiệm thức và

đạt kết quả tốt nhất ở nghiệm thức BT1 là 253,5 mg Trọng lượng trung bình của mẫu khi nuôi ở điều kiện tối cao gấp 1,9 lần so với mẫu nuôi ở điều kiện sáng và cao nhất

là 13,1 lần ở nồng độ 0,1 mg/l TDZ (bảng 4.8)

Bảng 4.9 Ảnh hưởng c ủa một số chất ĐHSTTV trên môi trường B5 đến sự phát sinh

mô sẹo của mẫu cấy lá sau 45 ngày nuôi c ấy ở điều kiện tối

Chất ĐHSTTV Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%)

Quan sát mẫu trong thời gian khảo sát, mô sẹo hình thành sớm nhất trên môi trường có bổ sung 2,4-D sau khoảng 14 ngày nuôi cấy ở các nồng độ Các môi trường khảo sát khác có sự hình thành mô sẹo chậm hơn sau 17 và 20 ngày nuôi cấy lần lượt

là NAA và TDZ Trên môi trường B5 thì tỷ lệ mẫu hình thành không có nhiều khác biệt ở 2 điều kiện nuôi mẫu Tuy nhiên, trọng lượng tươi của mẫu đạt giá trị tốt hơn khi mẫu nuôi trong tối, cao nhất là trên môi trường TDZ và NAA Mô sẹo cũng được hình thành từ vết cắt của phần gân chính của mẫu cấy từ lá cây Bá bệnh Trên môi trường có bổ sung 2,4-D mẫu cấy sau khi hình thành mô sẹo có sự tăng sinh chậm, trên môi trường bổ sung TDZ mẫu cấy trương lên có màu vàng xanh, r ất chắc Trên môi trường có bổ sung NAA thì mô sẹo hình thành từ mẫu cấy ở điều kiện sáng có màu vàng nhát, xốp và bở; ở điều kiện tối mô sẹo có màu vàng đ ậm, xố p, bở Và trên môi trường này mẫu cấy có khả năng tạo rễ bất định ở cả 2 điều kiện nuôi cấy, nhưng mẫu nuôi ở điều kiện tối rễ hình thành tốt hơn (hình 4.2)